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TÍTULO: MODULAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE MACRÓFAGOS RESIDENTES POR MICROVESÍCULAS DERIVADAS DE CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS NA LESÃO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO RENAL
TÍTULO:
CATEGORIA: EM ANDAMENTO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): GABRIELA SAMPAIO DA SILVA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): REGIANE APARECIDA CAVINATO ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): MARCOS ANTONIO CENEDEZE, NIELS OLSEN SARAIVA CAMARA COLABORADOR(ES):
1. Resumo
A Lesão de Isquemia e Reperfusão(LIR) é considerada um conjunto de lesões decorrentes da privação e do restabelecimento de oxigênio após isquemia. Um dos principais agravantes deste insulto é a inflamação e entre as células inflamatórias envolvidas destacamos os macrófagos. Estas células são heterogêneas entre um subtipo clássico denominado M1, que contribui para a inflamação; e o alternativo M2, que é pró-resolutivo na regeneração renal. Desta forma, a polarização macrofágica é um evento decisivo no desfecho das lesões renais agudas e crônicas. Logo, uma terapia que consiga educar e reprogramar macrófagos M1 em M2 transformaria estas células em aliadas na regulação da resposta imune inflamatória e na regeneração do enxerto após a LIR. As Células Estromais Mesenquimais(CEMs) podem reger esta terapia por seus efeitos na reprogramação de macrófagos. Microvesículas(MVs) liberadas pelas CEMs têm participação nos seus efeitos terapêuticos e a substituição de CEMs por MVs pode propiciar maior segurança. Deste modo, nossa hipótese é que as MVs-CEMs podem modular os danos de LIR através da diferenciação de macrófagos renais para um fenótipo anti-inflamatório e reparador (M2) controlando assim, a resposta inflamatória.
2. Introdução
A LIR é decorrente de hipóxia tecidual seguida de reoxigenação após período de isquemia(1). Este processo é muito associado com o desenvolvimento de Doença Renal Crônica(2). No transplante renal a LIR é uma das principais causas de Retardo na Função do Enxerto(RFE)(1). O RFE está associada à rejeição aguda, disfunção crônica e dificulta a sobrevivência no pós-transplante(3). O índice de RFE no Brasil chega a 80%(4), aumentando assim o tempo de hospitalização e outros custos(5).
A LIR renal gera alteração do metabolismo celular, dano tecidual nas células endoteliais, necrose/apoptose de células epiteliais tubulares e uma ampla inflamação. Observa-se aumento da expressão de receptores toll-like, os quais medeiam à produção de citocinas e quimiocinas alterando os leucócitos. Ocorre também um recrutamento de células natural killer T, células B, células T, neutrófilos e macrófagos que se ativam e liberam Espécies Reativas de Oxigênio(6-8).
Neste ambiente inflamatório os macrófagos são células de grande importância e heterogeneidade fenotípica como descrita em monócitos murinos (Sunderkotter C J Immunol 2004) e humanos(12). Dois tipos diferentes de monócitos são descritos em
camundongos, os CD115 Ly6c+(M1) que possuem caráter inflamatório com alta expressão do receptor CCR2 e diferencia-se no tecido lesionado em macrófagos produtores de IL-1β, iNOS, e TNF-α; e os CD115 Ly6c-(M2), com caráter resolutivo para a lesão, com maior expressão do receptor CX3CR1 e secreção de fatores de crescimento e moléculas anti-inflamatórias(9-11).
Uma terapia que consiga reprogramar o macrófago é de grande interesse terapêutico.
3. Desenvolvimento
As CEMs possuem fenótipo bem estabelecido e capacidade imunomoduladora comprovada, por liberação de fatores de crescimento e citocinas que influenciam na inflamação(12). Diante disso, existem evidências que as CEMs também promovem a polarização M2 dos macrófagos principalmente pela secreção de fatores bioativos no meio extracelular (13, 14). Recentemente, os grupos de G. Camussi, S.K.Lim e D. de Klei(15) mostraram MVs extracelulares destas células (MVs-CEMs) como responsáveis por parte da sua ação parácrina, passando a serem cogitadas para uso terapêutico(16). Estas MVs podem ser exossomos (40 a 100nm de diâmetro) e partículas maiores (50 a 1000 nm de diâmetro)(17, 18).
Por conseguinte, a substituição das CEMs pelas MVs é importante devido à maior segurança no tratamento(19), evitando chances de má diferenciação em longo prazo e geração de tumores (20). Além disso, as MVs são mais estáveis(21) e seu tamanho reduzido e flexibilidade permitem que atravessem membranas biológicas, facilitando o alcance da célula alvo (22).
Nossa hipótese é que as MVs-CEMs podem modular os danos da LIR através da diferenciação de macrófagos renais para um fenótipo anti-inflamatório e reparador. Os conhecimentos obtidos neste modelo poderão futuramente ser transferidos para a clínica e a modulação macrofágica no enxerto renal poderá auxiliar a reduzir a porcentagem de incidência de RFE nos pacientes transplantados.
4. Objetivo
Avaliar o efeito in vivo do tratamento com MVs provenientes de CEMs na função e no fenótipo dos macrófagos em um modelo experimental de LIR renal após 24 horas e 6 semanas, e sua correlação com os danos renais.
5.Metodologia
Animais duplo positivos para CX3CR1-green fluorescent protein(GFP) e CCR2-red fluorescent protein(RFP), nos quais o receptor CX3CR1 está relacionado à M2 e
o receptor CCR2 à M1 serão divididos em 5 grupos: grupo 1 controle, com eutanásia e sem intervenção; grupo 2, para o procedimento de LIR bilateral por 45 minutos e eutanásia após 24 horas; grupo 3, para o procedimento de LIR bilateral por 45 minutos e tratamento de MVs com eutanásia após 24 horas; grupo 4, para LIR unilateral de 1 hora e eutanásia após 6 semanas; grupo 5, para LIR unilateral de 1 hora e tratamento de MVs com eutanásia após 6 semanas.
Soro sanguíneo e rins serão coletados para confirmação da lesão renal e inflamação. Para isso serão realizadas análises bioquímicas de ureia e creatinina por kit comercial(Labtest, Sete Lagoas, Brasil), expressão gênica dos fatores IL-6, TNFα, IL-1β, iNOS e Arginase-1 por PCR quantitativo em Tempo Real, Western Blot contra colágeno I, FSP-1 e Arginase-1 para detecção de proteína e lâminas histológicas de coloração Hematoxilina-Eosina e Sirius Red para análise da necrose/regeneração tubular e fibrose.
As células linfocitárias serão obtidas através do método Percoll e o perfil monocitário dos animais será analisado por citometria de fluxo com identificação dos receptores CX3CR1 e CCR2 diretamente e das moléculas CD11b, CD86, CD206 e F4/80 por marcação com anticorpos fluorescentes.
6. ReferênciasBibliográficas
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