RITA DE CÁSSIA SIQUEIRA SOARES
CRESCIMENTO E LIGNIFICAÇÃO DE RAÍZES DE MILHO SOB AÇÃO DE L-DOPA (L-3,4-DIIDROXIFENILALANINA)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (área de concentração Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas.
Maringá Agosto – 2008
CRESCIMENTO E LIGNIFICAÇÃO DE RAÍZES DE MILHO SOB AÇÃO DE L-DOPA (L-3,4-DIIDROXIFENILALANINA)
Profª Drª Maria de Lourdes Lucio Ferrarese Orientadora
"A ciência é a procura da verdade;
não é um jogo no qual uma pessoa tenta derrubar seus oponentes,
BIOGRAFIA
AGRADECIMENTOS
A Deus, o amigo verdadeiro e precioso, que me deu força e persistência para cumprir mais uma etapa de minha vida.
À Profa. Dra. Maria de Lourdes Lúcio Ferrarese, por ter me recebido tão bem no laboratório, pela orientação deste trabalho, pela confiança, amizade, incentivos e pelo exemplo de profissionalismo.
Ao Prof. Dr. Osvaldo Ferrarese Filho, co-orientador deste trabalho, pela disposição de ensinar, incentivo e serenidade.
As funcionárias e amigas, Aparecida e Flausina pela constante convivência e ajuda.
Especialmente, ao meu esposo, Anderson, pelo amor, companheirismo, incentivo e ajuda indispensável.
Aos meus pais, Ari e Maria, por me incentivar e me apoiar sempre, pela confiança, e exemplo de vida.
Aos meus irmãos, André, Andréia e Glória, pelo carinho, amor e amizade. A todos os amigos do Laboratório, pela convivência diária e ajuda constante na realização deste trabalho, pela amizade e momentos de descontração.
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação é composta de uma Revisão e de um Artigo científico que trata dos efeitos do L-DOPA na lignificação de raízes de soja. O artigo foi redigido de acordo com as normas da revista Allelopathy Journal (JCR 2007 = 0,672).
RESUMO GERAL
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS – As plantas superiores regularmente liberam compostos orgânicos no ambiente os quais são adicionados ao solo. Alguns destes compostos têm sido citados como agentes de interações entre plantas, fenômeno conhecido como alelopatia. Estes compostos são liberados por vários mecanismos incluindo a lixiviação pela água pluvial, exsudação pelas raízes, decomposição natural de partes das plantas na superfície ou no próprio solo. A ação primária dos compostos alelopáticos ainda não foi estabelecida, mas alguns efeitos fisiológicos são conhecidos. Tipicamente os aleloquímicos interferem nas plantas superiores suprimindo a germinação, causam injúrias durante o crescimento da raiz e meristemas e, então, inibem o crescimento das plantas. Embora as plantas de cobertura do solo fornecem valor à colheita quando adicionado em sistemas agronômicos, muitas espécies utilizadas como coberturas são tóxicas devido às altas concentrações de fitoquímicos, próprios da alelopatia.
Mucuna pruriens (L.) DC. var. utilis é um exemplo de planta de cobertura do solo bem sucedida e com vários produtos naturais altamente ativos. Mucuna tem sido amplamente cultivada em áreas tropicais como enriquecedora do solo, cobertura para controle de plantas daninhas e silagem. Tem sido relatado que vários agentes químicos secundários são produzidos pelas sementes, folhas e raízes de Mucuna. O principal composto fitotóxico encontrado é o aminoácido não-protéico L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), que é utilizado no tratamento sintomático da doença de Parkinson. Além disso, este composto é liberado das raízes de Mucuna para o solo e inibe o crescimento de espécies de plantas vizinhas. Esta ação alelopática tem sido relatada em um grande número de espécies de plantas, mas o conhecimento sobre o mecanismo de ação do L-DOPA é escasso.
L-DOPA nas atividades da PAL, TAL e peroxidases, nos conteúdos de compostos fenólicos e de lignina e no crescimento das raízes de milho.
MÉTODOS – Plântulas de três dias foram cultivadas em solução nutritiva, contendo ou não 0,1 a 2 mM de L-DOPA. Os experimentos foram efetuados em câmara de germinação, a 25ºC, em ciclo de 12 h claro/12 h escuro e irradiação de 280 µmol m-2 s-1,
por 24 horas. Após a incubação as raízes foram medidas e preparadas para os ensaios bioquímicos. As atividades das peroxidase, solúveis e ligadas à parede celular, os conteúdos de fenóis totais e de lignina foram determinados espectrofotometricamente, enquanto as atividades da PAL, da TAL e os teores de derivados hidroxibenzóicos e hidrocinâmicos foram determinados por HPLC. ANOVA foi aplicada para verificar a significância das variações observadas. Os resultados foram expresssos como valores médios de 3 a 6 experimentos independentes ± erro padrão da media. As diferenças entre os parâmetros foram avaliadas pelo teste de Dunnett e consideradas significativas quando apresentaram valor de P ≤ 0,05.
A redução do crescimento das raízes pelo L-DOPA foi relatada em várias espécies de plantas. Algumas plantas são tolerantes, outras não. Em alguns casos, a redução de raízes de plântulas tem sido associada com a lignificação precoce das paredes celulares induzida por diferentes aleloquímicos, acompanhada por aumento nos teores de compostos fenólicos e atividades da PAL e POD. Ao menos para milho, este parece não ser o caso já que os resultados obtidos revelaram reduções significativas nas atividades de enzimas relacionadas à via de fenilpropenóides, porém elevados teores de lignina nas raízes submetidas ao L-DOPA. Sabe-se que as paredes celulares se tornam lignificadas quando a expansão celular cessa, quando se diferenciam em xilema ou quando a célula está sob estresse abiótico ou biótico. Neste contexto, três possibilidades são descritas. Primeira, como os derivados hidroxibenzóicos e hidroxicinâmicos não foram significativamente alterados, é provável que esteja ocorrendo oxidação e/ou auto-oxidação do L-DOPA com formação de quinonas e melanina, com liberação de espécies reativas ao oxigênio (EROs). Segunda, com a redução das atividades da PAL, TAL e POD a produção de lignina ocorreria por meio de unidades de monolignóis biossintetizados incompletamente e várias outras unidades de fenilpropenóides como hidroxicinamaldeídos, acetatos, p-cumaratos, p-hidroxibenzoatos e ferulatos tiramínicos. Neste caso, monômeros não usuais seriam polimerizados formando lignina incomum. Terceira, a possível produção de EROs desencadearia respostas secundárias responsáveis pela redução do crescimento das raízes com possível lignificação da parede celular. Portanto, os resultados obtidos neste trabalho podem ser decorrentes de estresse oxidativo induzido pelo L-DOPA devido à liberação de EROs durante sua metabolização.
GENERAL ABSTRACT
METHODS – Three-day-old seedlings were cultivated in nutrient solution, pH 6.0, containing or not 0.1 to 2 mM L-DOPA. Experiments were carried out in a growth chamber (25°C, 12-h light/12-h dark cycle, irradiance of 280 µmol m-2 s-1) during 24 hours. Roots were then measured and prepared for assays. Soluble and cell wall-bound POD activities, total phenols and lignin contents were determined spectrophotometrically, whereas PAL and TAL activities and hydroxybenzoic and hydroxycinnamic derivatives were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). ANOVA was applied to test the significance of measured differences. Data are expressed as means of three to six independent experiments ± S.E. Whereas variance tested the significance of the observed differences, the difference between parameters was evaluated by Dunnett´s multiple comparison test and P values <0.05 were considered to be statistically significant.
RESULTS AND DISCUSSION – Results showed that 1) mean total root lengths were 26.9 to 52.9% less than controls for 1.0 and 2.0 mM treatments, respectively. Fresh root weights decreased 11.1 and 25.6% at 1.0 and 2.0 mM treatments, respectively. In similar concentrations, dry root weights decreased 9.5 and 16.2% less than those of controls. 2) L-DOPA decreased PAL activities from 16.2% to 79% after 0.1 to 2.0 mM treatments. The allelochemical decreased TAL activities from 43.3 to 77.6% after 0.5 to 2.0 mM treatments. In similar concentrations, soluble POD activities decreased 9.8 and 15.2%, in comparison to the control. On the other hand, cell wall-bound POD activities were decreased after all L-DOPA treatments, i.e, from 22.2 to 26.5%, when compared to the control. 3) Total phenolic compound content was significantly increased from 11.7% (at 0.1 mM of L-DOPA) to 25.6% (at 2.0 mM), in comparison to the control. However, after HPLC quantification no significant difference occurred among all treatments with L-DOPA and its controls. 4) Lignin content increased from 94 to 384% after all alelochemical treatments, in comparison to the control.
specialization, notably the xylem, or when the cell is under abiotic or biotic stresses. In this context, three possibilities have been described. First, since hydroxybenzoic and hydroxycinnamic derivatives were not changed it is possible that L-DOPA has been oxidized to form dopaquinone and, further, melanin. During this pathway, reactive oxygen species (ROS) are released and seedlings may be stressed. Second, due to the decrease in PAL, TAL and POD activities the lignin synthesis could occur by incomplete monolignols and/or by other phenylpropenoid metabolites, such as hydroxycinnamyl aldehydes, acetates, p-coumarates, p-hydroxybenzoates and tiramine ferulates. In this case, unusual components might be incorporated forming unsual lignin. Third, a possible production of EROs by the oxidation of L-DOPA causes side-off responses reducing the root growth and lignifying the cell wall. Therefore, results obtained herein may be due to the oxidative stress induced by L-DOPA associated with generation of ROS during its metabolism.
