UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
GUILHERME DE ALMEIDA SOUZA TEDRUS
EFEITO DO TIPO DE CULTURA SUPERFICIAL SOBRE AS
CARACTERÍSTICAS DO QUEIJO TIPO PETIT REBLOCHON
CAMPINAS
EFEITO DO TIPO DE CULTURA SUPERFICIAL SOBRE AS
CARACTERÍSTICAS DO QUEIJO TIPO PETIT REBLOCHON
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos, da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Tecnologia de Alimentos.
Orientadora:
MIRNA LÚCIA GIGANTEESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL. TESE: DEFENDIDA PELO ALUNO GUILHERME DE ALMEIDA SOUZA TEDRUS E ORIENTADA PELA PROFA. DRA.MIRNA LÚCIA GIGANTE.
CAMPINAS
___________________________________ Profa. Dra. Mirna Lúcia Gigante
(orientadora) FEA/UNICAMP
________________________________ Profa. Dra. Adriane Elisabete Antunes de Moraes
(membro titular) FCA/UNICAMP
___________________________________ Dra. Darlila Aparecida Gallina
(membro titular) ITAL/TECNOLAT
___________________________________ Profa. Dra. Míriam Dupas Hubinger
(membro titular) FEA/UNICAMP
___________________________________ Prof. Dr. Salvador Massaguer Roig
(membro titular)
FUND. TROPICAL PESQUISAS E TECNOLOGIA “ANDRÉ TOSELLO”
___________________________________ Dra. Adriana Torres Silva e Alves
(membro titular)
INSTITUTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS - ITAL
___________________________________ Profa. Dra. Eliana Paula Ribeiro
(membro suplente)
INST. MAUÁ DE TEC. - ESC. ENG. MAUÁ
___________________________________ Dra. Leila Maria Spadoti
(membro suplente) ITAL/TECNOLAT
À Profa. Dra. Mirna Lúcia Gigante pela orientação, apoio e demonstrações de que nunca devemos desistir dos nossos sonhos, independentemente das dificuldades que a vida profissional nos reserva.
Aos membros da banca examinadora, Profa. Dra. Adriane Elisabete Antunes de Moraes, Dra. Darlila Aparecida Gallina, Profa. Dra. Míriam Dupas Hubinger, Prof. Dr. Salvador Massaguer Roig, Dra. Adriana Torres Silva e Alves, Profa. Dra. Eliana Paula Ribeiro e Dra. Leila Maria Spadoti, pelas sugestões e contribuições apresentadas.
À Profa. Dra. Míriam Dupas Hubinger pelo apoio e acolhimento em todos os momentos dessa caminhada.
Aos professores do Departamento de Tecnologia de Alimentos pelos ensinamentos e colaboração durante todo este período, especialmente à Profa. Dra. Walkíria Hanada Viotto, ao Prof. Dr. Carlos Alberto Rodrigues Anjos e ao Prof. Dr. Marcelo Cristianini.
Aos funcionários do Departamento de Tecnologia de Alimentos, em especial, a mestre em Tecnologia de Alimentos e técnica do laboratório de leite, Bete, por todos os momentos, treinamentos, análises e diálogos.
Aos amigos da pós-graduação, Cecília, Clarice, Diogo, Karina, Lígia e Mônica, por todas as palavras e experiências compartilhadas no período.
À Profa. Dra. Carolina Merheb Dini pelos ensinamentos e auxílio nas análises de eletroforese.
À Profa. Dra. Márcia Regina Beux pelo apoio, amizade e por todos os ensinamentos e auxílio nas análises microbiológicas.
desenvolvimento do trabalho de pesquisa durante todo o transcorrer das atividades.
Ao Centro Mesorregional de Excelência em Tecnologia do Leite- CMETL-UEPG e à Escola Tecnológica de Leites e Queijos – ETL-UEPG por ceder os espaços e estruturas para a realização dos processamentos dos queijos e das análises físico-quimicas.
Aos bolsistas e estagiários do Centro Mesorregional de Excelência em Tecnologia do Leite- CMETL-UEPG e da Escola Tecnológica de Leites e Queijos – ETL-UEPG pelo auxílio nos processamentos dos queijos.
Aos professores e diretor da École Nationale d’ Industrie Laitière et de la Viande (ENILV), situada na cidade de La Roche- sur-Foron, região de Rhône Alpes na França, pelo acolhimento e ensinamentos durante o estágio realizado.
À Pontifícia Universidade Católica do Paraná, em especial, as professoras e os funcionários da Usina Piloto da Escola Politécnica por todo o apoio na realização das análises microbiológicas dessa pesquisa.
À minha irmã Dora por todo o incentivo e carinho em todos os momentos dessa caminhada.
À minha esposa, Márcia Rapacci, pelo total e absoluto incentivo, compreensão e apoio decisivo nos momentos mais difíceis, e, ao nosso filho, João Guilherme, pela alegria e felicidade que nos incentiva a continuar buscando a plena realização pessoal e profissional.
À minha querida mãe Maria Regina, in memoriam, que me orientou a desenvolver relações pessoais e profissionais com ética, respeito e diálogo. Como educadora me ensinou que sempre devemos lutar pelos nossos ideais e que nunca devemos desistir dos nossos educandos.
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do tipo de cultura superficial na maturação e nas características físico-química do queijo tipo Petit Reblochon. Foram realizados dois tratamentos: queijo adicionado de cultura pura de Geotrichum candidum (queijo G) e queijo adicionado de cultura mista composta de Geotrichum candidum,
Debaryomyces hansenii e Brevibacterium linens (queijo GDB); com três repetições para
cada tratamento. Os queijos foram avaliados com 1 dia de fabricação com relação ao pH, acidez titulável, gordura, umidade, cinzas, nitrogênio total, nitrogênio solúvel em pH 4,6, nitrogênio solúvel em TCA 12 %, sal e sal sobre a umidade. Os queijos foram avaliados quanto à composição físico-química, proteólise e quanto à contagem de
Geotrichum candidum e Brevibacteirum linens nos tempos 1, 3, 8, 15, 22 e 29 dias de
maturação. Os dados foram avaliados por Análise de Variância (ANOVA) e teste de Tukey para comparação de médias a um nível de significância de 5 %. Os resultados indicaram que os queijos não apresentaram diferença significativa em relação a nenhum dos parâmetros físico-químicos avaliados. Os tratamentos não afetaram significativamente nenhuma das variáveis avaliadas, enquanto o tempo de maturação afetou significativamente o pH da superfície e do interior do queijo, a umidade da superfície e do interior do queijo, a proteólise NS-pH 4,6(% NT) e NS-TCA 12 %(% NT) dos queijos e a contagem de Geotrichum candidum na superfície. A interação entre esses fatores não afetou nenhuma das variáveis estudadas. O efeito dos tratamentos sobre a proteólise indicou que os queijos G não diferiram dos queijos GDB. Com relação ao efeito dos tratamentos sobre a contagem de Geotrichum candidum na superfície, os queijos G não diferiram dos queijos GDB, apresentando, respectivamente, valores médios de contagem de 6,74 x 108 UFC/g e 6,80 x 108 UFC/g.
The aim of this study was to evaluate the effect of the strains of culture and surface -+maturation in the physico-chemical Petit Reblochon cheese in the physic chemical and sensory characteristics. Two treatments were performed: cheese pure culture of
Geotrichum candidum (cheese G) and cheese mixed culture of Geotrichum candidum, Debaryomyces hansenii and Brevibacterium linens (cheese GDB) with three replicates
for each treatment. The cheeses were evaluated 1 day after manufacturing for pH, titratable acidity, fat, moisture, ash, total nitrogen, soluble nitrogen at pH 4.6, soluble nitrogen in 12 % TCA, salt and salt on the humidity. The cheeses were evaluated for physical chemistry, composition and proteolysis as to count Geotrichum candidum and
Brevibacterium linens at time 1, 3, 8, 15, 22 and 29 days of maturation. Data were
evaluated by analysis of variance (ANOVA) and Tukey's test for comparison of means at a level of significance of 5 %. The results indicated that the cheeses showed no significant difference in relation to any of the evaluated physicochemical parameters. The treatments didn’t significantly affect any variable, while the maturation time significantly affect the pH of the surface and interior of the cheese, the moisture from the surface and interior of the cheese, proteolysis NS-pH 4.6 (% NT) and NS-12 % TCA (% NT) of cheeses and counting Geotrichum candidum on the surface. The interaction between these factors didn’t affect any of the variables studied. The effect of treatments on proteolysis indicated that the cheeses G didn’t differ from cheeses GDB. Regarding the effect of treatments on Geotrichum candidum count on the surface, cheeses G didn’t differ from cheeses GDB, presenting, respectively, averages count of 6.74 x 108 UFC/g and 6.80 x 108 UFC/g.
Figura 1. Mapa da área geográfica de produção do queijo Reblochon na França. ... 20 Figura 2. Mapa da área geográfica de produção do queijo Reblochon na França. ... 21 Figura 3. Ilustração do queijo Petit Reblochon (a), Reblochon... 24 Figura 4. Ilustração das raças Abondance (a) Tarine (b) Montbéliarde (c) utilizadas na produção de leite para a fabricação do queijo Reblochon. ... 25 Figura 5. Instalações da planta piloto de fabricação de queijos da Escola Tecnológica de Leite e Queijos.ermier (b), Reblochon Fruitier (c). ... 49 Figura 6. Fluxograma geral de fabricação dos queijos Petit Reblochon. ... 52 Figura 7. Morfologia das colônias de Geotrichum candidum (a) e de Brevibacterium
linens (b). As setas indicam as colônias de Brevibacterium linens ... 63
Figura 8. Efeito dos tratamentos sobre (a) acidez, expressa em % de ácido láctico e (b) pH na superfície e no interior dos queijos Petit Reblochon (n=3). a Letras minúsculas iguais em cada porção do queijo não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05). ... 65 Figura 9. Comparação dos valores médios de (a) acidez, expressa em % de ácido láctico e (b) pH entre a superfície e o interior dos queijos Petit Reblochon (n=3). a Letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05)... . ... ...66 Figura 10. Efeito dos tratamentos sobre (a) umidade, expressa em % e (b) Atividade de água (Aw) na superfície e no interior dos queijos Petit Reblochon (n=3). a Letras minúsculas iguais em cada porção do queijo não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05). ... 67
Letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05). ... 68 Figura 12. Efeito do tempo de maturação sobre o pH na superfície e no interior dos queijos Petit Reblochon (n=3). a Letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05).. ... 69 Figura 13. Efeito do tempo de maturação sobre a umidade dos queijos Petit Reblochon (n=3). a Letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05). ... 70 Figura 14. Efeito dos tratamentos sobre (a) NS pH 4,6 (% NT) e (b) NS TCA 12 % (% NT) na proteólise dos queijos Petit Reblochon (n=3). a Letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05). ... 71 Figura 15. Efeito dos tratamentos sobre a contagem de Geotrichum candidum na superfície do queijo (n=3). a Letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05). ... 72 Figura 16. Efeito do tempo de maturação (dias) sobre NS pH 4,6 (% NT), NS TCA 12 % (% NT) dos queijos Petit Reblochon. (n=3). a, b Letras minúsculas diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05). ... 73 Figura 17. Evolução do queijo Petit Reblochon durante a maturação (a) ao final da etapa de pré-maturação com 3 dias de fabricação, (b) no 8 º dia de maturação com superfície recoberta por Geotrichum candidum, (c) no 15 º dia de maturação com a superfície alaranjada e recoberta por Geotrichum candidum e (d) no 29 º dia de maturação com estrutura proteolisada ... 74 Figura 18. Eletroferograma capilar do queijo Petit Reblochon adicionado de Geotrichum
candidum durante o tempo de maturação. Identificação dos picos de acordo com Otte et al. (1997), Rehn et al. (2010) e Alves et al. (2013). AU: unidade arbitrária. ... 76
maturação. Identificação dos picos de acordo com Otte et al. (1997), Rehn et al. (2010) e Alves et al. (2013). AU: unidade arbitrária. ... 76
Figura 20. Efeito do tempo sobre a contagem de Geotrichum candidum na superfície dos queijos Petit Reblochon (n=3). a Letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05). ... 77 Figura 21. Efeito do tempo sobre a contagem de Brevibacterium linens na superfície dos queijos Petit Reblochon GDB (n=2). ... 78
Tabela 1. Valores médios dos conteúdos de proteína e de gordura do leite das raças
Abondance, Tarine e Montbéliarde produzido na região de Rhône Alpes. ... 26
Tabela 2. Valores médios de umidade, cloreto de sódio, atividade de água e condições de maturação de alguns queijos maturados por culturas de superfície. ... 45 Tabela 3. Composição físico-química e microbiológica do leite cru e tratado termicamente (n=3). ... 59 Tabela 4. Composição físico-química dos queijos Petit Reblochon após 1 dia de armazenamento refrigerado (n=3). ... 60 Tabela 5. Resumo da análise de variância (ANOVA) sobre o efeito dos tratamentos, do tempo de maturação e a interação desses fatores sobre as características dos queijos
RESUMO... 7 ABSTRACT ... 8 LISTA DE FIGURAS ... 9 LISTA DE TABELAS ... 12 1. INTRODUÇÃO ... 15 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 18 2.1. Queijo Reblochon ... 18
2.2. Características físico-químicas e sensoriais do queijo Reblochon ... 23
2.3. Tecnologia de fabricação do queijo Reblochon ... 24
2.4. Microbiota de queijos maturados por culturas de superfície... 29
2.5. Maturação ... 36
2.5.1. Efeito da microbiota sobre a formação da casca ... 37
2.5.2. Efeito da microbiota sobre o desenvolvimento da cor ... 38
2.5.3. Efeito da microbiota sobre a proteólise do queijo ... 39
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 48
3.1. Leite... 48
3.2. Coadjuvantes Tecnológicos ... 50
3.3. Preparo do fermento láctico ... 50
3.4. Processo de fabricação do queijo Petit Reblochon ... 50
3.5. Procedimento de amostragem e análises realizadas ... 54
3.6. Metodologia para as determinações analíticas ... 55
3.6.1. Análises físico-químicas ... 55
3.6.2. Análises microbiológicas ... 57
4.2.Caracterização físico-química e contagem de Geotrichum candidum e de
Brevibacterium linens dos queijos Petit Reblochon ... 60
4.2.1 Efeito dos tratamentos e do tempo de armazenamento sobre as características de maturação dos queijos Petit Reblochon ... 63 5. CONCLUSÃO ... 79 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 80
1. INTRODUÇÃO
Os queijos são produzidos no mundo inteiro a partir de leite de diferentes espécies de animais, apresentando grande diversidade de textura, sabor e aroma, sendo diferenciados desde os fatores relacionados à matéria-prima, ou seja, a raça do animal, o solo, o pasto, a alimentação, o clima específico da região de origem, e também pelo processo de produção, artesanal ou industrial (HARBUTT, 2009).
Na Europa, muitos queijos foram desenvolvidos com técnicas tradicionais de fabricação, específicas para cada região, apresentando um mercado importante e reconhecido pelos apreciadores que valorizam a dimensão sócio-cultural dos produtos e a sua identificação com a origem, a utilização de leite cru, além de existir um forte apelo institucional desenvolvido ao longo dos anos, com regulamentação governamental e comprometimento dos produtores. Esse mercado é estimado em 700.000 toneladas/ano de queijos maturados produzidos com leite cru na Europa, particularmente na Itália, França e Suíça, devido à excelente qualidade do leite cru, com contagens bacterianas e de células somáticas bastante reduzidas (GRAPPIN, 1997; REZENDE, 2004).
Entre os queijos desenvolvidos na Europa, os queijos maturados por culturas de superfície são produtos economicamente importantes em países como Áustria, Bélgica, Alemanha, Dinamarca e França (EPPERT et al., 1997, BURRI, 1999; BERESFORD et al., 2001; BRENNAN et al., 2004; MOUNIER et al., 2009). Estima-se que a produção desses queijos na Europa seja de 5 a 15 % da produção total de queijos maturados, sendo produzidos em menor escala e de forma artesanal na maioria dos países e industrialmente por empresas de médio e pequeno porte na França, Alemanha e Dinamarca (BOCKELMANN, 2002a). Na França, em 2014, a produção dos queijos maturados por cultura de superfície representou 55,7 % dos queijos beneficiados com a denominação AOC (Apellation d’Origine Contrôlé). Dentre os
queijos maturados por cultura de superfície encontra-se o Reblochon, um queijo de origem francesa, produzido desde a idade média na área montanhosa do vale de
Thônes, localizada na região de Rhône Alpes, no sul da França (ENGELMANN e
HOLLER, 2009). No processo de fabricação tradicional do queijo Reblochon, os micro-organismos iniciadores que compõem a microbiota são retirados da casca de queijos previamente maturados e transferidos para a casca de queijos jovens. Para a remoção da microbiota da casca, os queijos maturados são mergulhados em salmoura, de modo que os micro-organismos são transferidos para a salmoura que servirá, posteriormente, de inóculo para colonizar a superfície dos queijos jovens. (REPS, 1993; CORSETTI et
al., 2001; BOCKELMANN, 2002 a,b; BRENNAN et al., 2004).
Esse processo tradicional realizado na produção artesanal é simples e de baixo custo, mas há o risco de contaminação por micro-organismos indesejáveis e patogênicos da salmoura para o queijo novo e para a produção. Para evitar essa contaminação, muitos produtores de queijo maturados na superfície têm mudado seus hábitos de fabricação utilizando solução nova de lavagem, adicionando fermentos comerciais, puros e selecionados, constituídos por bactérias e leveduras, diretamente no leite ou aspergindo na superfície dos queijos, visando obter um desenvolvimento rápido, homogêneo e desejável da microbiota superficial (BOCKELMANN et al, 1997b, BOCKELMANN, 2002a).
O Brasil não apresenta tradição de produção artesanal de queijos, além do que a legislação brasileira impõe barreiras à produção de queijos com leite cru, tradicionalmente utilizado na produção artesanal em outros países. O queijo Serra da Canastra é um dos poucos exemplos em que se configura a produção artesanal no Brasil, cuja produção industrial foi crescente nos últimos anos. O consumo de queijo pelos brasileiros em 2015 ainda continua baixo (5,4 kg per capita) quando comparado ao consumo dos argentinos (11 kg per capita) e dos franceses (23 kg per capita), entretanto pesquisas indicam que houve um aumento de 56 % no consumo de queijos em geral, entre 2008 e 2013 e praticamente se estabilizou entre 2013 e 2015
(ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DAS INDÚSTRIAS DE QUEIJOS, 2013; MILKPOINT, 2015).
Os queijos Brie e Camembert são os principais queijos maturados por cultura de superfície produzidos e comercializados no Brasil, mas não são tão difundidos como na Europa, uma vez que o consumidor brasileiro não tem o hábito de consumir queijos de sabor e aroma pungente, no entanto, verificou-se que, entre 2008 e 2013, o volume de vendas desses tipos de queijos cresceu 50 % e no total da categoria de queijos especiais, a participação na produção se elevou em 26 % entre 2010 e 2015. (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DAS INDÚSTRIAS DE QUEIJOS, 2013; MILKPOINT, 2015).
Considerando a dificuldade legal existente no Brasil de utilização de leite cru para a produção de diferentes queijos de curta maturação, a pesquisa incipiente sobre a utilização de culturas de superfície, a expansão do mercado brasileiro de queijos finos e a possibilidade de incremento na produção de queijos maturados por cultura de superfície, neste estudo foi avaliado o efeito da adição de cultura pura de Geotrichum
candidum, e de cultura mista de Geotrichum candidum, Debaryomyces hansenii e Brevibacterium linens sobre o desenvolvimento da maturação, e sobre as
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Queijo Reblochon
O Reblochon é um queijo de origem francesa, produzido desde a idade média na região de Rhône Alpes, localizada no sul da França. Esse queijo é originário das montanhas do vale de Thônes, localizadas nas regiões de Haute Savoie e Savoie, regiões que pertencem ao departamento de Rhône Alpes, próximo à cidade de Annecy (ENGELMANN e HOLLER, 2009).
O nome do queijo tem origem na palavra do dialeto local “reblocher” que significa ordenhar a vaca outra vez. No século XIII, os agricultores da região de Rhône
Alpes eram tributados sobre a quantidade de leite produzida por seus rebanhos. Para
pagar menos impostos, os ordenhadores não retiravam todo o leite até a medição realizada pelo proprietário da terra. O leite enriquecido que sobrava no úbere era ordenhado e utilizado para a produção do queijo Reblochon, um queijo cremoso, aromático, muito apreciado pelos franceses (ENGELMANN e HOLLER, 2009; SERROY, 2009; HARBUTT, 2009; HARBUTT, 2010; BLOHORN, 2012).
Até o fim do século XIX a produção do Reblochon era concentrada no verão devido à abundância das pastagens típicas da região de Haute Savoie. Com a chegada da estrada de ferro à cidade de Annecy por volta de 1860, a integração da região de
Haute Savoie ao império francês contribuiu para o crescimento da produção e
comercialização do queijo Reblochon (BLOHORN, 2012).
Desde 1958, o queijo Reblochon é beneficiado pela denominação AOC (“Apellation d’Origine Contrôlée”) que delimita as áreas geográficas, estabelece os procedimentos tradicionais de criação de gado, de produção do leite, bem como do processamento e de maturação do queijo, garantindo as suas características sensoriais peculiares e, em 1996, ele se beneficiou de um reconhecimento europeu com a
denominação AOP (“Apellation d’Origine Contrôlée et Protegée”) (MARIANI, 2007; SERROY, 2009; HARBUTT, 2009; HARBUTT, 2010; CHESNEY et al., 2011; BLOHORN, 2012).
Na França, esse queijo é comercializado em formato cilíndrico, em peças de 450 a 550 g ou em peças menores de 230 a 280 g, denominado de Petit Reblochon. Independente do tamanho, a massa do queijo é homogênea, cremosa, untuosa, podendo apresentar pequenas olhaduras. Apresenta sabor ligeiramente salgado e amendoado. Sua casca é fina de coloração amarelo-alaranjada, sendo recoberta totalmente por uma camada branca aveludada com aspecto untuoso (FRANCE, 1987; FRANCE, 2007; ENGELMANN e HOLLER, 2009).
Quando produzido em propriedade rural, duas vezes ao dia, imediatamente após as ordenhas da manhã e da tarde, o queijo é denominado de “Reblochon
Fermier”, sendo identificado com um selo de caseína de cor verde, que garante que a
sua produção é inteiramente artesanal. Quando produzido em instalações industriais e com leite obtido de vários produtores da região, o queijo recebe a denominação de “Reblochon Fruitier ou Laitier”, sendo identificado com um selo de caseína de cor vermelha (MASUI e YAMADA, 1999; FRANCE, 1987; FRANCE, 2007; MARIANI, 2007; HARBUTT, 2009; HARBUTT, 2010).
A área geográfica de produção do queijo Reblochon se estende a ¾ do departamento de Haute Savoie e uma parte do departamento de Savoie. Esses dois departamentos franceses pertencem à região de Rhône-Alpes, que fazem fronteira com Itália e Suíça. É nesse território montanhoso que está situado o maciço do Montblanc (HARBUTT, 2009; HARBUTT, 2010). A Figura 1 ilustra as regiões de Savoie e Haute
Savoie e a região de Thônes que é conhecida como berço do queijo Reblochon
Fonte: CHESNEY et al., (2011).
Figura 1. Mapa da área geográfica de produção do queijo Reblochon na França.
Em 2010, a produção total do queijo Reblochon na França foi de 14.456 ton, sendo 2.297 ton de Reblochon fermier e 12.159 ton de Reblochon fruitier ou laitier. Entre 1987 e 2010, a produção total de queijo Reblochon apresentou um aumento de 60,6%, devido ao reconhecimento de suas características sensoriais numa região fortemente turística e que valoriza a tradição do processo de fabricação (CHESNEY et
al., 2011). A Figura 2 ilustra a produção total de queijo Reblochon de 2011 a 2014,
verificando-se que houve uma estabilização da produção em torno de 15.000 toneladas anuais (INSTITUT NATIONAL DE L’ORIGINE ET DE LA QUALITÉ, 2013; INSTITUT NATIONAL DE L’ORIGINE ET DE LA QUALITÉ, 2014).
Atualmente na França existem 45 queijos beneficiados com a denominação AOC (Apellation d’Origine Contrôlé), sendo que os queijos Cantal, Comté, Reblochon e
Roquefort representam 51,8 % do volume total dos queijos AOC comercializados em
2014. O queijo Reblochon ocupa o 3º lugar em produção, participando com 7,8 % da produção total de queijos certificados com a denominação AOC, enquanto que os queijos Brie e Camembert, que são os queijos maturados por cultura de superfície mais conhecidos mundialmente, participam, respectivamente, com 3,2 % e 2,6 % da produção total (INSTITUT NATIONAL DE L’ORIGINE ET DE LA QUALITÉ, 2014).
Fonte: INAO,(2013); INAO,(2014)
Figura 2. Produção do queijo Reblochon Laitier e Reblochon Fermier na França.
O queijo Reblochon é maturado por culturas de superfície, composta principalmente por bactérias e leveduras que exercem efeitos sobre as características físico-químicas e sensoriais (BÄRTSCHI et al., 1994; MARCELINNO et al., 2001; COGAN, 2002; MOUNIER et al., 2006a,b; MOUNIER et al., 2008; FRANCE, 2007). Os principais micro-organismos utilizados na produção do queijo Reblochon e responsáveis pela maturação são Geotrichum candidum, Debaryomyces hansenii e Brevibacterium
Queijos maturados por cultura de superfície são caracterizados pelo desenvolvimento de uma microbiota complexa, que é composta por bactérias, fungos e leveduras, a qual cresce na sua superfície durante o período de maturação, alterando consideravelmente as características físico-químicas e sensoriais dos queijos. Dependendo do tipo de micro-organismo que predomina na microbiota superficial esses queijos são subdivididos em dois grupos: queijos maturados por fungos e queijos maturados por bactérias (GALLI et al., 1996; FOX, et al., 2000; COGAN, 2002; BRENNAN et al., 2004; McSWEENEY et al., 2004).
Os queijos maturados por fungos de superfície mais conhecidos são os queijos Brie e Camembert enquanto o Beaufort, Brick, Comté, Epoisse, Gruyère,
Limburger, Livarot, Maroilles, Mont d’Ord, Münster, Pont l'Evêque, Port du Salut,
Serra da Estrela, Tilsit, e Reblochon são os queijos maturados por bactérias na superfície, menos conhecidos pelos consumidores de queijos finos (VALDÉS-STAUBER et al., 1997; CORSETTI et al., 2001; COGAN, 2002; BRENNAN et al., 2004; MOUNIER et al., 2006a,b; MONNET et al., 2006).
Queijos maturados por bactérias na superfície também são conhecidos por queijos de casca lavada, porque sua casca é lavada várias vezes com salmoura. São queijos de casca untuosa, devido à aparência molhada e brilhante da casca e aspecto gorduroso ou como queijos de casca untuosa alaranjada, porque algumas espécies de micro-organismos que crescem na superfície produzem pigmentos de coloração amarelo-avermelhada (VALDÉS-STAUBER et al., 1997; CORSETTI et al., 2001; BOCKELMANN, 2002a; BOCKELMANN, 2002b; COGAN, 2002; BRENNAN et al., 2004; MOUNIER et al., 2006a,b).
Os queijos maturados por culturas de superfície são produtos economicamente importantes em países como Áustria, Bélgica, Alemanha, Dinamarca e França (EPPERT et al., 1997, BURRI, 1999; BERESFORD et al., 2001; BRENNAN et
al., 2004; MOUNIER et al., 2009). Estima-se que a produção desses queijos na Europa
produzidos em menor escala e de forma artesanal na maioria dos países e de forma mais industrializadas por empresas de médio e pequeno porte na França, Alemanha e Dinamarca (BOCKELMANN et al., 2002a).
Segundo a Associação Brasileira das Indústrias de Queijos, o Brasil produz mais de 200 tipos de queijos e ocupa atualmente a sexta posição mundial na produção de queijos. Embora, o consumo de queijo pelos brasileiros seja baixo (5,4 kg per capita) quando comparado ao consumo dos franceses (23 kg per capita), houve um aumento de 26 % no consumo de queijos especiais entre 2010 e 2015 no Brasil (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DAS INDÚSTRIAS DE QUEIJOS, 2013; MILKPOINT, 2015). Como ocorre em outros países, os queijos Brie e Camembert são os mais conhecidos da população e os mais produzidos pelas indústrias brasileiras. Entretanto, um queijo maturado por cultura de superfície que vem despertando interesse das indústrias brasileiras nos últimos anos é o Reblochon, que é produzido em pequena escala por três empresas brasileiras: Fazenda Tamanduá, no município de Patos (PB), Laticínio Serra das Antas, em Bueno Brandão, (MG) e Cooperativa Witmarsun, no município de Palmeira, a 60 km da cidade de Ponta Grossa, no estado do Paraná. Os queijos produzidos por essas indústrias apresentam casca de coloração alaranjada, que é uma característica do
Reblochon original, mas aroma e textura bastante diferente do queijo original, uma vez
que a microbiota típica e as condições de maturação são diferentes do queijo francês. A coloração alaranjada é obtida pela imersão do queijo em solução de urucum como ocorre atualmente com o queijo Reblochon Laitier na França (COSTA et al., 2009).
2.2. Características físico-químicas e sensoriais do queijo Reblochon
Na França, conforme Decreto de 29 de dezembro de 1986, o Reblochon é classificado como um queijo macio de massa crua, sendo levemente prensado. Apresenta-se na forma de um cilindro plano com 14 cm de diâmetro e 3,5 cm de altura, pesando entre 450 a 550 g. Quando na forma de Petit Reblochon, apresenta-se com 9,0 cm de diâmetro, 3,0 cm de altura, pesando entre 230 a 280 g (FRANCE, 1987; FRANCE, 2007; MARIANI, 2007; ENGELMANN e HOLLER, 2009; HARBUTT, 2010). A
Figura 3 ilustra o queijo Petit Reblochon (a), o Reblochon Fermier (b) e o Reblochon
Fruitier (c).
(a) (b) (c)
Fonte: http://www.Reblochon.fr/
Figura 2. Ilustração do queijo (a) Petit Reblochon, (b) Reblochon Fermier, (c) Reblochon
Fruitier.
A massa do queijo é homogênea, cremosa, untuosa, podendo apresentar pequenas olhaduras. Quanto ao sabor apresenta-se ligeiramente salgado e com notas de amêndoas. Sua casca é fina de coloração amarelo-alaranjado, sendo recoberta totalmente por uma camada branca aveludada com aspecto untuoso (FRANCE, 1987; FRANCE, 2007; ENGELMANN e HOLLER, 2009).
Quanto à composição, o queijo Reblochon deve apresentar no máximo 55 % de umidade e no mínimo 45 % de gordura em base seca (LESEUR, 2011). Para Martin
et al., (1997b) o teor de umidade do queijo Reblochon pode variar de 54,5 a 55,4 % e
um teor de sal que pode variar de 1,1 a 1,9 %.
2.3. Tecnologia de fabricação do queijo Reblochon
O queijo Reblochon ou Reblochon de Savoie é fabricado com leite cru integral, não sendo permitido nenhum tipo de tratamento térmico antes do processo. O leite utilizado no processo de fabricação do queijo Reblochon deve ser proveniente
exclusivamente de rebanhos leiteiros compostos de vacas das raças bovinas
Abondance, Tarine e Montbéliarde, as quais são alimentadas no verão com pastagens
das regiões montanhosas e no inverno à base de feno (AGABRIEL et al., 1991; FRANCE, 2007; ENGELMANN e HOLLER, 2009; SERROY, 2009; BLOHORN, 2012).
As características zootécnicas dos animais, as condições de locomoção em regiões montanhosas, a facilidade de adaptação às condições climáticas foram os principais fatores que contribuíram para a escolha dessas três raças bovinas, além da importância que os consumidores franceses dão para a origem do queijo (COULON et
al., 2005).
A raça Abondance é originária do vale de Abondance localizado no
Haute-Savoie. Essa raça é facilmente reconhecida por sua cor avermelhada que remete a cor
de mogno. Ela apresenta manchas brancas na cabeça, pernas, cauda e barriga. A raça
Tarine é nativa da região de Tarentaise Savoie, situada no vale do Isère. Essa raça
apresenta cor avelã por todo corpo e uma sombra preta na região dos olhos. A raça
Montbéliarde é originária das montanhas denominadas de Jura situadas nos Alpes
franceses. Essa raça é branca com grandes manchas avermelhadas por todo corpo. A Figura 4 ilustra as características das raças Abondance, Tarine, Montbéliarde, (COULON et al., 2004).
(a) Raça Abondance (b) Raça Tarine (c) Raça Montbéliarde ) Fonte: http://www.Reblochon.fr/
Figura 3. Ilustração das raças (a) Abondance, (b) Tarine, (c) Montbéliarde utilizadas na produção de leite para a fabricação do queijo Reblochon.
A Tabela 1 apresenta os valores médios dos conteúdos de proteína e de gordura do leite das raças Abondance, Tarine e Montbéliarde produzido na região de
Rhône Alpes.
Tabela 1. Valores médios dos conteúdos de proteína e de gordura do leite das raças
Abondance, Tarine e Montbéliarde produzido na região de Rhône Alpes.
Raça Conteúdo de proteína
(g/100g leite) Conteúdo de gordura (g/100g leite) Abondance 3,33 ± 0,24 3,71 ± 0,43 Tarine 3,23 ± 0,25 3,60 ± 0,42 Montbéliarde 3,27 ± 0,22 3,79 ± 0,37
Fonte: COULON et al., (2005).
Segundo Martin e Coulon (1995b), os queijos produzidos na França no verão e em regiões montanhosas apresentam maior quantidade de compostos aromáticos quando comparados aos queijos produzidos no inverno e em áreas planas. As condições climáticas afetam a movimentação dos animais na região das montanhas de
Savoie e Haute-Savoie. Durante os meses de inverno, o gado leiteiro é protegido do frio
em estábulos e a alimentação oferecida nesse período aos animais é à base de feno e concentrado, enquanto que no verão o gado se alimenta das pastagens das regiões montanhosas que são ricas em ervas e flores de várias espécies de dicotiledôneas (MARTIN e COULON, 1994; MARTIN e COULON, 1995a,b; MARTIN et al.,2000).
Estudos realizados por DUMONT e ADDA (1978) identificaram os terpenos como sendo precursores de compostos aromáticos em leite obtido por vacas alimentadas com pastagens ricas em espécies dicotiledôneas. Esses mesmos autores verificaram que os terpenos são facilmente transferidos ao leite e depois aos queijos. As características do clima, tipo de alimentação e a região geográfica justificam as características sensoriais peculiares do queijo Reblochon (DUMONT e ADDA, 1978; URBACH, 1990; MARTIN e COULON, 1995b).
A primeira etapa do processo de fabricação do queijo Reblochon consiste em adicionar ao leite previamente pré-aquecido (35 ºC) uma mistura de culturas lácticas mesófilas e termófilas, a qual é composta basicamente por Lactobacillus delbrueckii
subsp. lactis e Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (MARIANI, 2007; MARIANI et al., 2007).
A microbiota superficial responsável pela maturação do queijo Reblochon é adicionada ao leite na forma de fermento comercial composto de Geotrichum candidum,
o Debaryomyces hansenii e o Brevibacterium linens ou também pode ser pulverizada
na superfície do queijo após a etapa de salga (MARTIN et al., 1997a; MARIANI, 2007; LESEUR, 2011).
A tecnologia geral de fabricação do queijo Reblochon, segundo MARTIN et
al.(1997a); LESEUR (2011) e BERTRAND (2013), é apresentada a seguir:
Na fabricação do queijo Reblochon emprega-se a coagulação enzimática, utilizando coalho rico em enzimas proteolíticas de origem animal ou microbiano. A temperatura de coagulação situa-se entre 33 a 35 ºC e o tempo de coagulação é de 30 a 40 minutos. Ao atingir o ponto final de coagulação, tem-se o ponto de corte, quando então, a massa é cortada empregando-se liras verticais e horizontais, obtendo-se grãos entre 0,5 a 0,8 cm de aresta, para que se consiga um produto com características ideais de queijo macio.
Após o corte inicia-se a agitação da massa com movimentos lentos devido à fragilidade dos grãos. À medida que os grãos da massa vão se tornando mais firmes devido à expulsão do soro do seu interior, aumenta-se gradativamente a velocidade da agitação.
O “ponto final” da massa é verificado por meio do procedimento tradicional, ou seja, quando os grãos se apresentarem ligeiramente firmes, individualizados e quando pressionados demonstrarem boa coesão e elasticidade. O tempo necessário
para os grãos atingirem essas características é de aproximadamente 10 minutos e quando o pH da massa alcançar valores inferiores a 6,45.
Após a massa atingir o “ponto”, massa e soro são transferidos para as formas perfuradas que são colocadas sobre uma mesa de aço-inoxidável. As formas cilíndricas do queijo Reblochon apresentam um diâmetro de 14,0 cm e altura de 6,0 a 8,0 cm e as formas do queijo Petit Reblochon apresentam um diâmetro de 9,0 cm e 6,0 cm de altura.
A prensagem dos queijos é realizada com auxílio de pesos individuais de 1,5 a 2,0 kg para o queijo Reblochon e 0,9 a 1,0 kg para queijo Petit Reblochon. O tempo de prensagem do queijo Reblochon Fermier é de 6 horas e de no mínimo 90 minutos para o queijo Reblochon Laitier. Os queijos são tradicionalmente salgados em salmoura gelada (12 a 14 ºC), com densidade entre 1.130 a 1.140 kg/m3 e pH de 5,45 por 1 hora e 30 minutos.
A pré-maturação do queijo Reblochon ocorre em câmara com condições controladas de temperatura (16-18 ºC) e umidade relativa (> 95 %), por um período de 3 a 8 dias, para ocorrer o desenvolvimento da microbiota da superfície, sendo virado diariamente nas prateleiras para favorecer as condições de crescimento da microbiota aeróbia. Decorrido esse tempo, os queijos são lavados com solução salina (1 % m/v) e em seguida imersos em solução de urucum para pigmentação da casca (0,05 % m/v).
Os queijos pré-maturados são transferidos para câmara de maturação com condições controladas de temperatura (12-14 ºC) e umidade relativa (> 90 %), por um período de no mínimo 12 dias, sendo virados, a cada dois dias, nas prateleiras para favorecer as condições de crescimento da microbiota aeróbia e ocorrerem as transformações químicas, bioquímicas e microbiológicas características do queijo
Reblochon.
O queijo Reblochon é caracterizado pelo crescimento externo de uma microbiota diversificada composta principalmente de Geotrichum candidum, Brevibacterium linens e Debaryomyces hansenii, que após uma semana de maturação
recobre a superfície do queijo (BÄRTSCHI et al., 1994; MARCELLINO et al., 2001; COGAN, 2002; MOUNIER et al., 2006a,b). O Reblochon é maturado por, no mínimo, 15 dias em câmara de maturação com condições controladas de temperatura e umidade relativa (FRANCE, 1987; FRANCE, 2007).
Dependendo do grau de maturação, pode-se observar entre o centro e a superfície do queijo uma camada de coloração mais amarelada, de consistência cremosa e untuosa devido ao efeito da proteólise (BOUTROU et al., 2006). Quando jovem, o Reblochon tem doçura de fruta. Ao maturar, deixa de ser doce, passando a apresentar sabor de amêndoas e um leve toque de flores das montanhas. A textura cremosa e untuosa desliza suavemente na boca (SERROY, 2009; MASUI e YAMADA, 1999; HARBUTT, 2010). O Reblochon Fermier tem sabor mais intenso e complexo, apresenta aroma de flores e de ervas silvestres similares às pastagens típicas da região de Haute Savoie (HARBUTT, 2010).
2.4. Microbiota de queijos maturados por culturas de superfície
No processo de fabricação tradicional de queijos maturados por culturas de superfície, os micro-organismos iniciadores que compõem a microbiota são retirados da casca de queijos previamente maturados e transferidos para a casca de queijos jovens. Para a remoção da microbiota da casca, os queijos maturados são mergulhados em salmoura preparada com 2 a 3 % de NaCl. Durante sucessivas lavagens, os micro-organismos presentes na casca desses queijos vão sendo transferidos para a salmoura que servirá posteriormente de inóculo para colonizar a superfície dos queijos jovens. Esse procedimento de lavagem da casca com salmoura é realizado várias vezes e isso ocorre logo após a fabricação dos queijos jovens. Entre três a cinco dias após a inoculação já é possível ver diferentes colônias de micro-organismos, que podem ser
coloridas ou não e que crescem distribuídas uniformemente na superfície dos queijos (REPS, 1993; CORSETTI et al., 2001; BOCKELMANN, 2002a,b; BRENNAN et al., 2004).
Diversos autores vêm demonstrando que embora o processo de lavagens sucessivas da casca dos queijos jovens com salmoura contendo micro-organismos retirados da casca dos queijos previamente maturados seja uma técnica simples e de baixo custo, há sempre o risco de ocorrer a transferência de micro-organismos indesejáveis ou patogênicos, como a Listeria monocytogenes e Staphyloccus aureus para a casca de queijos jovens ou mesmo propagar a contaminação da área de produção, com esses tipos de micro-organismos (BOCKELMANN, 1997a; BOCKELMANN et al., 1997c; EPPERT et al., 1997; CARNIO et al, 1999; BURRI, 1999).
Como a microbiota típica dos queijos maturados por cultura de superfície se origina do leite cru, da salmoura, das condições ambientais na câmara de maturação, das contaminações nos equipamentos das plantas de fabricação, assim como do manuseio dos queijos durante as etapas de fabricação, a qualidade desses queijos depende do controle intenso e simultâneo da qualidade microbiológica do leite, das espécies iniciadoras bem como dos procedimentos de higiene adotados nas etapas de fabricação e maturação dos queijos (LECLERCQ-PERLAT et al., 2000; BONAÏTI et al., 2004).
Bockelmann (2002a) ressalta a importância do controle microbiológico do leite, da salmoura de lavagem e das plantas de fabricação, porque a falta de higiene e a contaminação dos queijos jovens por bactérias patogênicas ou deterioradoras ou mesmo crescimento sem controle de fungos que fazem parte da microbiota típica das áreas de fabricação, podem persistir por longos períodos em ciclos de contaminação, comprometendo toda produção.
Para prevenir a contaminação dos queijos jovens, das áreas de produção e das câmaras de maturação, muitos produtores de queijos na Europa estão mudando os
seus hábitos e inovando os seus processos de fabricação com o emprego de fermentos comerciais, concentrados, puros ou mistos, os quais podem ser constituídos por cepas pré-selecionadas de bactérias, leveduras ou fungos. O emprego de fermentos comerciais além de prevenir a contaminação da casca do queijo ou da área de produção, torna o processo mais rápido, homogêneo e seguro (BOCKELMANN et al., 1997b, BURRI, 1999; BONAÏTI et al., 2004; MARIANI, 2007).
Hannon et al., (2004) pesquisando a composição e o índice de maturação do queijo Tilsit fabricado com misturas pré definidas de culturas selecionadas de
Brevibacterium linens, Microbacterium gubbeenense, Staphyloccus equorum e Debaryomyces hansenii observaram que há uma melhora significativa na qualidade e
segurança, quando se empregam fermentos comerciais na fabricação desse tipo de queijo. Além disto, os autores verificaram que o uso de fermentos comerciais diminuiu consideravelmente o problema de disseminação de micro-organismos indesejáveis na área de produção e que a redução das espécies que compõem a microbiota superficial contribuiu para aprimorar as características sensoriais do queijo.
Outro problema encontrado pelos fabricantes de queijos de casca lavada é crescimento fraco e lento da microflora típica na casca. Esse defeito resulta em um efeito negativo na qualidade dessa variedade de queijo, uma vez que micro-organismos indesejáveis como fungos e bactérias GRAM negativas podem predominar sobre a microbiota típica, resultando no aparecimento de uma camada branca e pegajosa comprometendo as características sensoriais do queijo (REPS, 1993).
A microbiota de todos os queijos maturados por cultura de superfície é composta principalmente por leveduras (Debaryomyces hansenii, Geotrichum
candidum), bactérias corineformes (Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium e Rhodococcus), Staphylococcus e alguns Micrococcus (CORSETI et al., 2001; BRENNAN et al., 2004).
A Debaryomyces hansenii é a levedura que predomina na superfície dos queijos semi-duros como o Tilsit. Nos queijos macios como o Reblochon e Limburger, a levedura que predomina na superfície é o Geotrichum candidum (WYDER e PUHAN, 1999; BOCKELMANN et al., 2005). Segundo Brennan et al., (2004) a contagem de leveduras pode alcançar aproximadamente 107 UFC/cm2 enquanto que a contagem de bactérias nesses tipos de queijos pode exceder 109 UFC/cm2 , durante o período da maturação.
Os fermentos comerciais que comumente são utilizados na produção de queijos maturados por cultura de superfície são compostos de Geotrichum candidum,
Debaryomyces hansenii e Brevibacterium linens (BERESFORD et al., 2001; BRENNAN et al., 2002; HANNON et al., 2004; McSWEENEY et al., 2004; MOUNIER et al., 2005).
Geralmente o Debaryomyces hansenii promove o crescimento do Geotrichum candidum que por sua vez reduz a ocorrência de fungos indesejáveis como as espécies de
Aspergillus spp, Mucor spp e Penicillum spp. (CHAMBA e IRLINGER, 2004).
As leveduras por serem tolerantes ao sal e à acidez crescem espontaneamente na superfície do queijo nos primeiros dias de maturação. Uma função importante das leveduras na maturação dos queijos é criar condições favoráveis para o desenvolvimento das bactérias na superfície dos queijos (BOCKELMANN, 1997a; VALDÉS-STAUBER et al., 1997; REPS, 1993). As leveduras por serem capazes de metabolizar o lactato a CO2 e H2O e por desaminar aminoácidos com produção de NH3, aumentam o pH da casca do queijo de 4,9 a 5,2 para valores maiores que 6,5, criando assim um gradiente de pH, no qual o interior do queijo se encontra mais ácido do que a sua superfície (CARNIO et al., 1999; CORSETTI et al.,2001;PETERSEN et al., 2002; BRENNAN et al., 2004; COSTA et al., 2009).
Essa desacidificação da superfície do queijo não apenas favorece o desenvolvimento de bactérias, como também modifica a textura, o sabor e o aroma do queijo, uma vez que o pH ótimo de atuação das enzimas proteolíticas e lipolíticas é
muitas vezes próximo à neutralidade (LENOIR et al., 1985; VASSAL et al., 1986; GRIPON, 1997; BRENNAN et al., 2004; LECLERCQ-PERLAT et al., 2004b).
Como todas as espécies de Debaryomyces spp são tolerantes ao sal, elas crescem rapidamente nas condições apresentadas pela casca nos primeiros dias de maturação causando rápida desacidificação da superfície do queijo (BREUR e HARMS, 2006). Leclercq-Perlat et al., (1999) avaliando o crescimento de Debaryomyces hansenii em queijos macios maturados por culturas de superfície observaram que essa levedura iniciou a desacidificou da superfície do queijo no 6º dia e que a desacidificação foi mais intensa entre o 7 º e 13 º dia de maturação a 12 ± 1 ºC.
Pesquisas realizadas por BONAÏTI et al., (2004) sobre o crescimento da
Debaryomyces hansenii e a desacidificação da massa em condições controladas de
maturação (temperatura e umidade relativa) mostraram que a melhor condição para se obter uma ótima desacidificação e melhor aparência do queijo é 12 ± 1 ºC e 94-95 % de umidade relativa.
Estudos sobre a evolução da população de leveduras em queijos como o
Tilsit e Reblochon demonstraram que nos primeiros sete dias de maturação a contagem
de leveduras é de 108 a 109 UFC/g. Após esse período, a contagem permanece constante nos queijos Tilsit e Reblochon. Independente do tipo de queijo, o que se observa é que de um modo geral as leveduras dominam a superfície nos primeiros cinco dias de maturação. Após a desacidificação da casca, quando o pH alcança valores próximos a 6,0, bactérias como Brevibacterium linens, Arthrobacter,
Micrococcus e Corynebacterium começam a crescer na superfície (BOCKELMANN et al., 1997b,c).
O Geotrichum candidum é uma levedura que coloniza facilmente a casca de queijos macios no início da etapa de maturação dos seguintes queijos Camembert,
Pont L’Evêque, Munster, Limburger, Livarot, Saint Nectaire e Reblochon, assim como,
(GREENBERG e LEDFORD, 1979; GUÉGUEN e LENOIR 1975; GUÈGUEN, 1984; LECOCQ e GUÉGUEN, 1994; BERTOLINI et al., 1995; ELISKASES-LECHNER e GINZINGER, 1995; MARCELLINO et al., 2001; GENTE et al., 2002).
Bärtschi et al. (1994) avaliando a evolução qualitativa e quantitativa da microbiota que cresce na superfície dos queijos Reblochon Fermier e Fruitier observaram que o Geotrichum candidum é a única levedura filamentosa que cresce na superfície desses queijos. A contagem total de Geotrichum candidum variou de 103 a 104 UFC/g no primeiro dia de maturação a 107 no 8 º dia, se mantendo nessa faixa entre 107 a 108 UFC/g até o 36 º dia de maturação.
O Geotrichum candidum foi por muitos anos classificado como um fungo, mas há 20 anos ele vem sendo classificado como uma levedura (LENOIR, 1984; BRENNAN et al., 2004; BOUTROU e GUÉGUEN, 2005). Essa dificuldade na sua classificação é devido às diferentes características morfológicas das espécies encontradas. Há espécies de Geotrichum candidum que formam colônias de coloração creme, que são típicas de leveduras. Essas crescem em temperatura ótima entre 22 a 25 ºC, apresentam atividade acidificante, crescimento lento e baixa atividade proteolítica. Outras espécies formam colônias brancas aveludadas, típicas de fungos. Essas apresentam alta atividade proteolítica, crescimento rápido em temperatura entre 25 a 30 ºC e atividade desacidificante (GUÉGUEN e SCHMIDT, 1992; WYDER, 1998; GUÉGUEN e LENOIR, 1975; GUÉGUEN e JACQUET, 1982; GUÉGUEN, 1984; BOUTROU e GUÉGUEN, 2005).
O Geotrichum candidum é um micro-organismo ácido tolerante, apresenta pH ótimo de crescimento entre 5,0 a 5,5, podendo crescer facilmente entre pH 4,4 a 6,7, que é o pH da massa da maioria dos queijos. Esse micro-organismo faz parte das leveduras menos resistentes ao sal, apresentando crescimento em concentração de sal inferior a 4 % (m/v) (VAN DEN TEMPEL e NIELSEN, 2000).
Assim como outras leveduras, o Geotrichum candidum causa a desacidificação da superfície dos queijos maturados por cultura de superfície. Isso ocorre porque quando as cepas Geotrichum candidum crescem na superfície dos queijos, elas metabolizam rapidamente o lactato produzindo CO2, água e NH3, que aumenta o pH da superfície do queijo de 5,0 para 7,0, favorecendo assim o crescimento de outros micro-organismos, como por exemplo, a Brevibacterium linens (GREENBERG e LEDFORD, 1979; EPPERT et al., 1997; DEMARIGNY et al., 2000; (LECOCQ e GUÉGUEN, 1994; LECOCQ et al., 1996; VILJOEN et al., 2003).
Embora o Geotrichum candidum seja aeróbio, ele é capaz de crescer em condições microaerófilas. Em queijos macios como o Camembert e Pont L’Évêque, essa levedura pode crescer no interior desses queijos, mas o número de células viáveis é aproximadamente 100 vezes menor do que o número presente na superfície (BOUTROU e GUÉGUEN, 2005).
Os fermentos comerciais de Geotrichum candidum são normalmente adicionados diretamente ao leite previamente pasteurizado no tanque de coagulação, na salmoura ou são aspergidos na superfície dos queijos imediatamente após a salga, desempenhando as seguintes funções nos queijos maturados: desacidificação, proteólise, lipólise, produção de aroma e habilidade para inibir o desenvolvimento do
Mücor spp. (CHAMBA e IRLINGER, 2004; BOUTROU e GUÉGUEN, 2005).
Brevibacterium linens é a bactéria responsável pela cor alaranjada
característica dos queijos duros, como Gruyère, Comtè, dos queijos semi-duros, como o Tilsit, Brick e Limburger e dos queijos macios, como o Münster, Livarot e Reblochon. Essa bactéria representa de 1 a 30 % do total de bactérias que compõem a microbiota característica desses tipos de queijos (BUSSE e SCHUMANN, 1999; ELISKASES-LECHNER e GINZINGER, 1995; BOCKELMANN et al., 1997b,c; RATTRAY e FOX, 1999). É aeróbica, tolera de 8 a 12 % de NaCl, apresenta temperatura ótima de crescimento de 20 a 37 ºC e pH ótimo de 6,5 a 8,5, mas na presença de 4 % de sal ela cresce bem em pH 6,0 e razoavelmente bem em pH 5,5 (FERGAL et al., 1999; COGAN,
2002). Embora, a faixa ótima de pH seja entre 6,5 a 8,5, essa bactéria começa a crescer em valores de pH igual a 5,6. O crescimento da Brevibacterium linens é estimulado por vitaminas que são produzidas pelas leveduras, as quais crescem na superfície dos queijos nos primeiros dias de maturação (BRENNAN et al., 2004).
A Brevibacterium linens apresenta proteinases extracelulares associadas à parede celular e intracelular que são importantes na maturação dos queijos, bem como apresenta a capacidade de produzir diferentes bacteriocinas e carotenoides de coloração alaranjados que contribuem para a cor característica dos queijos maturados por culturas de superfície (RATTRAY e FOX, 1999; BRENNAN et al, 2004; COGAN, 2002). No entanto, a produção de pigmentos alaranjados depende de alguns aminoácidos como fenilalanina, tirosina e metionina, que são produzidos e liberados no queijo por ação proteolítica. A adição desses aminoácidos na superfície dos queijos não resulta na formação da cor, já que a produção de carotenóides pela bactéria é um processo muito mais complexo (LECOCQ e GUÉGUEN, 1994; RATTRAY e FOX, 1999; 1999; BRENNAN et al., 2004).
2.5. Maturação
Os principais efeitos que a microbiota da superfície exerce sobre as características físico-químicas e sensoriais dos queijos maturados por cultura de superfície estão relacionados principalmente ao aumento do pH, à proteólise e lipólise, resultando no desenvolvimento da aparência do queijo, especialmente a formação da cor alaranjada, na aparência aveludada, na produção de compostos voláteis que contribuem para o aroma e sabor, assim como para o aumento da maciez (BOCKELMANN, 2002a,b; McSWEENEY, 2004a).
O crescimento microbiano e a atividade enzimática da microbiota reduzem o período de maturação de meses a poucas semanas em queijos maturados por cultura de superfície, resultando num processo de maturação acelerado quando comparado
com queijos maturados internamente por bactérias (BOCKELMANN e HOPPE-SEYLER, 2001). Observa-se que esse efeito acelerado é mais intenso em queijos de massa mole do que em queijos duros e semi-duros (REPS, 2004). Geralmente os queijos de massa mole apresentam um período de maturação de 14 a 30 dias (BRENNAN et al., 2004).
2.5.1. Efeito da microbiota sobre a formação da casca
A microbiota que cresce na superfície contribui diretamente para o desenvolvimento da aparência dos queijos, especialmente para a característica aveludada e untuosa da casca (GUÉGUEN e SCHMIDT, 1992; BRENANN et al.; 2004; MARIANI, 2007)
O Geotrichum candidum coloniza quase toda a superfície dos queijos no início da etapa de maturação (GUÉGUEN e SCHMIDT, 1992; BERGER et al., 1999). Em alguns queijos, como o Saint Marcellin, esse micro-organismo é responsável pelo aparecimento de uma superfície aveludada no queijo, dando uma aparência uniforme (GUÉGUEN e SCHMIDT, 1992). Colônias filamentosas contribuem para aparência dos queijos, proporcionando uma coloração branca ou branca acinzentada com aspecto aveludado, mas dependendo da cepa utilizada pode conferir a coloração creme com aspecto viscoso, resultando num defeito para essa variedade de queijo (BÄRTSCHI et
al., 1994; CHAMBA e IRLINGER, 2004). Esse tipo de defeito, segundo Boutrou e
Guéguen (2005), pode ser observado também quando há crescimento excessivo de
Geotrichum candidum na superfície de queijos macios. Segundo Marcellino et al.
(2001), a presença de Geotrichum candidum na casca dos queijos maturados por cultura de superfície ajuda a determinar a coloração e a densidade da casca.
2.5.2. Efeito da microbiota sobre o desenvolvimento da cor
Os queijos curados por cultura de superfície são caracterizados por apresentarem uma coloração alaranjada, que é decorrente da formação de pigmentos carotenoides produzidos especialmente por bactérias dos gêneros Brevibacterium e
Arthrobacter. Algumas cepas de Brevibacterium linens produzem pigmentos de
coloração vermelho-alaranjado, enquanto outras cepas não produzem esses pigmentos. Já as cepas de Arthrobacter são geralmente pigmentadas de amarelo e produzem uma típica coloração marrom avermelhada na superfície dos queijos (BOCKELMANN et al., 1997c; DE VALDEZ et al., 1986; GALAUP et al., 2007; RATTRAY e FOX, 1999).
Durante muitos anos, o desenvolvimento da cor alaranjada da casca dos queijos maturados por cultura de superfície foi atribuída somente às cepas da
Brevibacterium linens, no entanto, pesquisas realizadas por Galaup et al., (2005)
demonstraram que a cor da casca é formada por dois grupos de pigmentos, um produzido por cepas de Brevibacterium linens e outro por diferentes micro-organismos, incluindo os grupos de Micrococcus e Corynebacterium ssp.
A intensidade da cor da casca dos queijos está relacionada com o conteúdo de carotenóides que é produzido pelas bactérias durante a maturação do queijo. A produção desses carotenóides depende da presença do aminoácido L-metionina, principalmente quando esse aminoácido está na sua forma metanoetiol e da concentração de oxigênio dissolvido na casca do queijo (FERCHICHI et al., 1986).
Galaup et al., (2005) identificaram um total de 114 diferentes bactérias e 5 diferentes pigmentos produzidos por micro-organismos isolados de quatro tipos de queijos franceses, macios e maturados por cultura de superfície com designação de Origem Controlada (Livarot, Reblochon, Munster e Epoisses). No caso do Reblochon foram identificadas trinta cepas de micro-organismos produtoras de pigmentos, sendo seis cepas de Brevibacterium linens, vinte cepas de Corynebacterium ssp e quatro
cepas de Micrococcus spp. Os perfis de pigmentos obtidos por cromatografia líquida (HPLC) identificaram cinco diferentes tipos de pigmentos na casca do Reblochon que variaram de amarelo a laranja. Os pigmentos produzidos por cepas de Brevibacterium
linens são três carotenoides aromáticos identificados como: isoisorenieratene, 3-hidroxi
isorenieratene e 3,3’ dihidroxisorenieratene.
Masoud e Jakobsen (2003) sugerem que é possível controlar o crescimento das bactérias produtoras de pigmentos combinando as cepas de Debaryomyces
hansenii com as de Brevibacterium lines e de Corynebacterium spp em condições mais
favoráveis de pH e concentração de sal na superfície dos queijos. Estudos realizados por Leclercq-Perlat et al., (2004a) concluíram que a produção de pigmentos alaranjados na casca de queijos maturados por cultura de superfície é resultado da interação entre bactérias, bem como entre bactérias e leveduras.
2.5.3. Efeito da microbiota sobre a proteólise do queijo
Em queijos maturados por cultura de superfície, a proteólise contribui principalmente para o desenvolvimento do sabor, aroma e da textura, uma vez que, as proteases liberadas na casca penetram no queijo de fora para dentro modificando assim a matriz do paracaseinato de cálcio o qual é responsável pela estrutura do queijo (BRENNAN et al., 2004; LECLERCQ-PERLAT et al., 2000; McSWEENEY, 2004a).
Normalmente, com a extensão da proteólise há um aumento da cremosidade da massa devido à solubilidade de vários compostos de baixo peso molecular que são solúveis na umidade do queijo e que são resultantes da degradação de peptídeos a grupos α-carboxilicos e α-amino (BOCKELMANN e HOPPE-SEYLER, 2001; BRENNAN
et al., 2004; McSWEENEY, 2004a). A ação das enzimas proteolíticas sobre as frações
de caseína, além de modificarem a estrutura da massa do queijo, alteram o pH da casca e do interior do queijo devido à produção de amônia (NH3). Os micro-organismos
presentes nas culturas de superfície apresentam capacidade de desaminação, levando a produção de amônia (McSWEENEY, 2004a,b).
Nos primeiros dias de maturação, a maior parte do nitrogênio solubilizado é procedente da hidrólise da αs1-caseína devido à ação da renina. Posteriormente, a fração β-caseína começa a ser degradada mais lentamente e em menor quantidade devido, principalmente, ao aspecto inibidor do cloreto de sódio na fase aquosa do queijo, contribuindo com a fração de nitrogênio solúvel (SORENSEN e BENFELDT, 2001; McSWEENEY, 2004a,b).
Em queijos maturados por cultura de superfície, pode-se dizer que a proteólise está relacionada mais especificamente com a proteólise secundária, agindo sobre os compostos nitrogenados resultantes da proteólise primária, liberando peptídeos de baixo peso molecular e aminoácidos livres. Isto porque a microbiota responsável pela maturação dos queijos possui principalmente atividades aminopeptidase e, com menor intensidade, de endopeptidase, diferindo, assim, da ação do coalho que não produz ou libera aminoácidos livres, mas libera, principalmente, peptídeos de elevado peso molecular (DESMAZEAUD e GRIPON, 1977).
O Geotrichum candidum por apresentar forte atividade proteolítica e lipolítica é o micro-organismo que mais contribui para o processo de maturação de queijos maturados por cultura de superfície. Dependendo da atividade proteolítica extracelular, as cepas de Geotrichum candidum são classificadas em dois grupos, um que apresenta fraca atividade proteolítica e outro, característico dos queijos macios maturados por cultura de superfície, que apresenta uma forte atividade proteolítica. Entretanto, a atividade proteolítica extracelular é menor quando comparada com a sua atividade intracelular (GREENBERG e LEDFORD, 1979; GUÉGUEN e LENOIR, 1975; GUÉGUEN e LENOIR, 1976; MOLIMARD et al., 1994; AUBERGER et al., 1997; BOUTROU e GUÉGUEN, 2005).
A especificidade das proteinases é importante na maturação de queijos maturados por cultura de superfície. Chen e Ledford (1972) analisando o efeito da atividade proteolítica do Geotrichum candidum na superfície de queijo Limburger, observaram que as proteinases produzidas por esse micro-organismo degradam tanto a αs-caseína quanto a β-caseína, mas com maior atividade sobre a β-caseína.
Boutrou et al. (2006) analisando o efeito da atividade proteolítica do
Geotrichum candidum em uma variedade de queijo macio com 27 dias de maturação,
observaram que as proteinases hidrolisaram todas as frações de caseína no queijo adicionado de Geotrichum candidum quando comparado com o queijo controle, e que as frações αs-caseína e a β-caseína foram as mais degradadas, especialmente entre o 5 º e 15 º dias de maturação.
A Brevibacterium linens contribui para a maturação dos queijos maturados por cultura de superfície, especialmente por apresentar enzimas proteolíticas extracelulares e intracelulares que atuam sobre as frações de caseína resultando na formação de compostos de baixo peso molecular os quais contribuem para as características sensoriais dos queijos (BRENNAN et al., 2004). As enzimas aminopeptidase e peptidase que são produzidas pelas cepas de Brevibacterium linens atuam mais especificamente sobre os compostos nitrogenados de baixo peso molecular com formação de amônia, aldeídos, ácidos e aminas (RATTRAY e FOX, 1999; McSWEENEY, 2004a,b). Segundo Varnan e Sutherland (1994), outros compostos aromáticos podem ser formados pela ação das aminopeptidases e peptidases sobre os compostos nitrogenados, esses incluem: metil-1-butanol, feniletanol e 3-metiltiopropanol que são derivados, respectivamente, da leucina, fenilalanina e metionina.
Estudos sobre a ação das proteinases extracelulares produzidas por cepas de Brevibacterium linens vêm sendo realizados por diversos autores devido à elevada atividade proteolítica e importância que essas enzimas exercem na maturação de queijos. Embora as proteinases produzidas pela Brevibacterium linens apresentem
