EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL E SÍNTESE DE CDNA, DE GLÂNDULAS DE
VENENO DE SCELIPHRON ASIATICUM
Nome dos autores: Luana Andrade Coutinho; Berghem Morais Ribeiro. Luana Andrade Coutinho1; Berghem Morais Ribeiro2;
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Aluno do Curso de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi - TO; e-mail: luanaandrade@uft.edu.br “PIBIC/UFT”
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Orientador do Curso de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi - TO; e-mail: berghem@uft.edu.br RESUMO
Os objetivos deste trabalho foram a análise morfológica e a obtenção de sequencias de cDNA das suas glândulas de veneno das espécies Sceliphron asiaticum e Montezumia ferrugínea,. Para obtenção dos indivíduos foi utilizado rede entomológica e câmara mortífera os quais foram estocados em freezer sob temperatura -80°C. As glândulas de veneno foram isoladas por meio de pinças entomológicas com auxílio de microscópio estereoscópico. Para a extração de RNA total, parte das amostras foram acondicionadas em tubos de 1,5mL, submersas em solução de RNA later e enviadas para o Laboratório de Microscopia Eletrônica e Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília. Para analise morfológica das espécies, foram incubadas amostras em tampão de Cacodilato de sódio e fixadas em fixador Tetroxido de Ósmio e enviadas para o mesmo laboratório acima citado para obtenção de imagens por observação de microscópio eletrônico de varredura. Evidenciou-se a presença das glândulas de veneno em forma cilíndrica e o reservatório de veneno em forma esférica. A análise morfológica externa do abdômen através de microscopia eletrônica de varredura mostrou a morfologia do aparelho inoculador de veneno como também a presença de sensilas na porção final do abdômen. Pode-se notar uma diferença na quantidade de sensilas presentes entre as duas espécies sendo que a S. asiaticum apresenta uma quantidade menor de sensilas em relação a M. ferrugínea. A síntese de cDNA ainda está em andamento.
Palavras-chave: Extração de RNA total; Síntese de CDNA; Sceliphron asiaticum; Montezumia
INTRODUÇÃO
Há muito tempo o homem percebeu que os venenos produzidos pelos animais, assim como várias substâncias produzidas pelas plantas, poderiam ser utilizados com finalidades farmacológicas. (CATAE. et al).
Vários estudos apontam para uma grande variedade de substratos neurais que podem ser alvos de intervenção farmacológica no controle da dor. Nesse contexto, as neurotoxinas derivadas de venenos de animais fornecem uma fonte vasta e, ate certo ponto, inexplorada de compostos neuroativos. (MORTARI E FERREIRA, 2007).
Devido à alta afinidade e seletividade, varias dessas neurotoxinas vem sendo estudadas para a produção de drogas destinadas ao tratamento de diversos distúrbios neurológicos, tais como epilepsia, doença de Parkinson, doença Alzheimer, bem como para o desenvolvimento de novas e mais eficazes drogas analgésicas. (MORTARI E FERREIRA, 2007).
Sendo assim, essas neurotoxinas têm sido extremamente uteis tanto como ferramentas farmacológicas quanto na prospecção de novos fármacos para o tratamento de desordens neurológicas, como a epilepsia e a isquemia, e para o controle da dor (MORTARI E FERREIRA, 2007).
O Brasil é um país rico em espécies de Hymenopteros peçonhentos, o que nos dá uma imensa gama de misturas bioquimicamente ativas para estudar. (CATAE. et al). Alguns Hymenopteros da ordem Vespinae utilizam de veneno para paralisar ou matar outros artrópodes que lhes servirão de hospedeiros. A paralisação pode ser de curta duração (poucos minutos à uma hora) ou de longa duração (muitos dias a muitos meses). A paralisação do hospedeiro facilita a oviposição do parasitóide. (BARBALHO e DIAS, 1997).
Dentre os insetos sociais, os venenos das vespas apresentam grande potencial farmacológico, o que torna muito importante estudos comportamentais e morfológicos dessas espécies, pois o entendimento sobre estes componentes é fundamental para a compreensão da alergenicidade destes venenos, bem como para a produção de medicamentos.(ARÊDES et al, 2000)
Deve-se ressaltar que maioria dos estudos a respeito da composição e atividades dos venenos das vespas se restringe às espécies da subfamília Vespinae, de clima temperado. Por outro lado, as espécies brasileiras (mais de 400 espécies já descritas) são tipicamente neotropicais, sendo seus venenos diferentes daqueles encontrados nas espécies de clima temperado.(CARDOSO et al., 2009).
Além de enzimas como fosfolipases, hialuronidase e fosfatase ácida, os venenos de vespídios possuem uma série de peptídeos hidrofóbicos, como componentes peptidérgicos. O mais importante desses componentes são os mastoparanos, que causam degranulação dos mastócitos para liberação de histaminas. Agem também estimulando a liberação de catecolaminas e ácidos adenílicos pelas células cromafins adrenais. Alguns mastoparanos causam hemólise e liberação de serotonina das plaquetas.(CARDOSO et al., 2009)
Uma estratégia bastante utilizada para se estudar as substâncias que constituem os venenos de animais é a síntese e sequenciamento de cDNAs de glândulas de veneno de animais (VIEIRA et al.,2003; VEIGA et al.,2003). Dessa forma, este estudo tem como objetivo determinar sequências de cDNAs sintetizados a partir de RNA total de glândulas de veneno de
Sceliphron asiaticum e Montezumia ferrugínea e também sua analise morfológica o que
futuramente poderá facilitar pesquisas relacionadas ao estudo farmacológico dessas toxinas.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram coletados periodicamente, indivíduos de S. asiaticum e M. ferruginea nos fragmentos de mata e edificações situadas no Campus da UFT em GURUPI, bem como em áreas adjacentes a esse, por meio de rede entomológica e câmara mortífera entre 10:00 e 16:00 hs. Os indivíduos foram estocados em freezer sob temperatura de -800 C.
As glândulas de veneno foram isoladas por meio de pinças entomológicas com auxílio de microscópio estereoscópico. Foram obtidas fotografias das glândulas utilizando uma maquina fotográfica digital. Uma parte das amostras foram acondicionadas em tubos de 1,5mL, submersas em solução de RNA later, as quais foram enviadas para o Laboratório de Microscopia Eletrônica e Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília e submetidas à extração de RNA total. A outra parte das amostras foi incubada em tampão de Cacodilato de sódio e fixadas em fixador Tetroxido de Ósmio e enviadas para o
Laboratório de Microscopia Eletrônica e Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília para posterior analise das imagens obtidas por observação de um microscópio eletrônico de varredura.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados de análise morfológica das espécies S. asiaticum e M. ferruginea, em microscopia de luz, mostram uma estrutura padrão de morfologia de uma glândula de veneno de insetos da ordem Hymenoptera. O aparelho de ferrão é normalmente constituído por dois filamentos secretores que desembocam em um reservatório, que se liga ao ferrão por um duto excretor (SILVEIRA, 1990; CHAUD NETTO et al, 1994). Pode-se evidenciar a presença das glândulas de veneno em forma cilíndrica e o reservatório de veneno em forma esférica. A análise morfológica externa do abdômen através de microscopia eletrônica de varredura mostra em detalhes, a morfologia do aparelho inoculador de veneno como também a presença de sensilas na porção final do abdômen. Pode-se notar que existe uma diferença na quantidade de sensilas presentes entre as duas espécies sendo que a S. asiaticum apresenta uma quantidade menor de sensilas em relação a M. ferrugínea.
Resultados de obtenção de RNA total da glândula de veneno e posterior síntese de cDNA: os resultados não puderam ser obtidos devido a escassez de indivíduos das espécies já supracitadas. O numero de glândulas isoladas não foi suficiente para se obter uma quantidade mínima de RNA total, implicando na impossibilidade de se sintetizar cDNA a partir do mesmo. Foram coletados cem abdomens de M. ferruginea os quais foram enviados para o laboratório de virologia e microscopia eletrônica da UnB e que já estão em processo de extração de RNA total e posterior síntese de cDNA. Esses dados estão sendo aguardados para darmos continuidade ao projeto visto que existem muitas dificuldades de se fazer ensaios de biologia molecular por falta de estrutura física, equipamentos e recursos financeiros. No caso da espécie S. asiaticum, houve uma grande diminuição na sua população o que impediu a coleta de uma quantidade suficiente para que se pudesse proceder a extração de RNA total.
LITERATURA CITADA
CARDOSO, J. L. C. et al. Animais peçonhentos no Brasil: biologia, clínica e terapêutica dos acidentes. 2. ed. São Paulo: SARVIER, 2009.
VEIGA, A.B.G.; PASQUALI, G.; GUIMARÃES, J.A.. Expressed sequence tags from a cDNA library of Lonomia obliqua. In: XVIII Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental - FESBE, 2003, Curitiba. 2003.
VIEIRA, A.G.L.. Clonagem molecular e análise de genes codificantes para proteínas imunogênicas da aranha Lasiodora sp. (caranguejeira). Monografia para conclusão de curso – Instituto de Ciências Exatas e Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, 2003. MORTARI, M. R.; FERREIRA, L. B.. Neurotoxinas: perspectivas para a descoberta de novos analgésicos. Universitas Ciências da Saúde, Brasilia, v. 5, n. 1/2, p. 155-167, 2007. CATAE, A. L. et al,. Análise morfológica comparativa das glândulas de veneno de Apis
melífera (Hymenopetra, Apidae) e de Polybia paulista (Hymenopetra, Vespidae).
BARBALHO, S. M.; DIAS, A. M. P.. Análise Morfológica do Aparelho de Veneno nos Braconidae Cyclostome (Hymenoptera). Revista Brasileira de Zoologia,1997.
AGRADECIMENTOS
