1- UTILIZAÇÃO PREVISTA

(1)

1

PLATELIA™ ASPERGILLUS Ag

1 placa – 96

62794

O Platelia™ Aspergillus Ag é um ensaio imunoenzimático de microplaca, tipo sanduíche,

para a detecção do antigénio galactomanano de Aspergillus em amostras de soro de

adultos e pediátricas, bem como em amostras de lavado broncoalveolar

(LBA).

881115 – 2013/10

1- UTILIZAÇÃO PREVISTA

O Platelia™ Aspergillus Ag é um ensaio imunoenzimático de microplaca, tipo sanduíche, para a detecção do antigénio galactomanano de Aspergillus em amostras de soro de adultos e pediátricas, bem como em amostras de lavado broncoalveolar (LBA).

O Platelia™ Aspergillus Ag é um teste que, quando utilizado em conjunto com outros procedimentos de diagnóstico, tais como culturas microbiológicas, exames histológicos de amostras de biopsia e evidências radiológicas, pode ser utilizado como auxiliar no diagnóstico de Aspergilose Invasiva.

2- INDICAÇÕES DE UTILIZAÇÃO

O Platelia™ Aspergillus Ag é um ensaio imunoenzimático de microplaca, tipo sanduíche, para a detecção do antigénio galactomanano de Aspergillus em amostras de soro de adultos e pediátricas, bem como em amostras de lavado broncoalveolar (LBA).

O Platelia™ Aspergillus Ag é um teste que, quando utilizado em conjunto com outros procedimentos de diagnóstico, tais como culturas microbiológicas, exames histológicos de amostras de biopsia e evidências radiológicas, pode ser utilizado como auxiliar no diagnóstico de Aspergilose Invasiva.

3- RESUMO E EXPLICAÇÃO

Em geral, as infecções por Aspergillus têm início nos pulmões, sendo estes a porta de entrada, após a inalação de esporos de Aspergillus presentes no meio ambiente. As formas invasivas, que têm vindo a aumentar ao longo dos últimos 10 anos, constituem a maioria das infecções graves. Ocorrem principalmente em doentes neutropénicos (no seguimento de tratamentos contra o cancro) e em doentes tratados com supressores de imunidade (transplantes de órgãos, particularmente no transplante de medula óssea) e corticosteróides 10_.

O Aspergillus raramente é isolado a partir de culturas de sangue. Frequentemente, o diagnóstico baseia-se em evidências diagnósticas ou radiológicas não específicas (sintomas clínicos, exame de TC, raio X torácico, etc).

O teste do antigénio galactomanano solúvel no soro aparenta ser um método serológico capaz de auxiliar no diagnóstico da Aspergilose Invasiva9, 12, 23, 54, 62_.

Além disso, no caso dos receptores de transplantes de órgãos sólidos, a detecção do antigénio galactomanano no lavado broncoalveolar (LBA) demonstrou ser vantajosa para o diagnóstico de Aspergilose Invasiva nesta população8,17,18_.

4- PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO 45

O Platelia™ Aspergillus Ag é um ensaio imunoenzimático de microplaca, tipo sanduíche, que detecta a presença de galactomanano no soro humano e no LBA. O ensaio utiliza anticorpos monoclonais EBA-2 de rato, que são dirigidos contra o galactomanano de Aspergillus, tendo sido caracterizado em estudos anteriores25, 46_{. Os anticorpos monoclonais são utilizados}

(1) para revestir os poços da microplaca e ligar o antigénio e (2) para detectar o antigénio ligado à microplaca tornada sensível ao mesmo (reagente conjugado: anticorpos monoclonais ligados à peroxidase). As amostras de soro e de LBA recebem tratamento térmico na presença de EDTA, de modo a dissociar os complexos imunes e a precipitar proteínas que poderiam eventualmente interferir com o teste24_{. As amostras tratadas e o conjugado são adicionados aos poços revestidos com}

(2)

2 5- REAGENTES

Platelia™ Aspergillus Ag: produto refª 62794 (96 testes)

Conserve o kit a 2-8 °C. Deixe todos os reagentes atingir a temperatura ambiente (18-25 °C) antes de os utilizar. Volte a colocar todos os reagentes a 2-8 °C imediatamente após a utilização. Volte a colocar as tiras/placas na bolsa e feche-a novamente.

Não remova o dessecante. Após diluição, a solução de lavagem de trabalho pode ser conservada durante 14 dias a 2-30 °C. Todos os reagentes devem ser utilizados num prazo de 8 semanas após a abertura. Os reagentes são fornecidos em quantidades suficientes para a realização de 96 testes, num número máximo de 9 lotes.

Componente Conteúdo Quantidade

R1 Microwell Strip Plate

Microplaca:

- 96 poços (12 tiras de 8 poços cada), revestidos com anticorpos monoclonais anti-galactomanano - Etiquetas de tira com a indicação “85”

1 Placa / 12 x 8 Poços

R2 _{Washing Solution}Concentrated

Solução de lavagem concentrada (20X):

- Tampão Tris NaCl (pH 7,4) - Tween®_{20 a 2%}

- Conservante: ProClinTM_{300 a 0,04%}

1 x 70 ml

R3 Negative Control Serum

Soro de controlo negativo:

- Soro humano negativo

- Negativo para anticorpos VIH-1, VIH-2, anti-VHC e HBs Ag

2 x 1,7 ml

R4 Cut-off Control Serum

Soro de controlo de corte (cut-off):

- Soro humano contendo galactomanano

2 x 1,7 ml

R5 Positive Control Serum

Soro de controlo positivo:

- Soro humano contendo galactomanano

2 x 1,7 ml

R6 Conjugate

Conjugado (pronto a utilizar):

- Anticorpos monoclonais anti-galactomanano / marcados com peroxidase

1 x 8 ml

R7 Sample Treatment Solution

Solução de tratamento de amostras (pronta a utilizar):

- Solução ácida de EDTA

1 x 13 ml

R9 Chromogen:TMB Solution Solução cromogénica de TMB (pronta a utilizar): - 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina§_{(< 0,1%)}

- H2O2 (< 1,0 %)

1 x 28 ml

R10 Stopping Solution Solução de paragem (pronta a utilizar): _{- Solução de ácido sulfúrico 1N (H}

2SO4) 1 x 28 ml

§_Nota_{: a TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina) é um cromogénio não carcinogénico e não mutagénico para a peroxidase.}

6- ADVERTÊNCIAS AOS UTILIZADORES 1. Apenas para utilização em diagnóstico in vitro. 2. Apenas para utilização profissional.

3. A utilização deste kit de teste com outras amostras que não de soro humano e de LBA não é recomendada.

4. O controlo positivo, controlo de cut-off e o controlo negativo são fabricados a partir de soro humano que foi testado e demonstrou não ser reactivo para HBsAg e anticorpos do VIH-1, VIH-2 e VHC, através de testes possuidores da marcação CE. Contudo, todos os reagentes devem ser manipulados como sendo capazes de transmitir infecções. Todos os testes devem ser efectuados em conformidade com a norma OSHA relativa a agentes patogénicos transmitidos pelo sangue, nível 2 de segurança biológica, ou outras práticas adequadas de segurança biológica.

5. Utilize vestuário de protecção, incluindo bata de laboratório, protecção ocular/facial e luvas descartáveis (recomendam-se luvas sintéticas que não contenham látex) e manipule os reagentes do kit e as amostras dos doentes de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais. Lave bem as mãos após a realização dos testes.

6. Não pipete os reagentes com a boca.

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3 9. Os derrames biológicos que não contenham ácido devem ser completamente limpos com um desinfectante eficaz. Os desinfectantes que podem ser utilizados incluem (entre outros), uma solução de lixívia a 10% (solução de hipoclorito de sódio a 0,5%), etanol a 70% ou Wescodyne Plus™ a 0,5%. Os materiais utilizados para limpar os derrames devem ser eliminados junto dos resíduos biológicos perigosos.

CUIDADO: não coloque na autoclave soluções que contenham lixívia.

10. Os derrames que contenham ácido devem ser adequadamente absorvidos (com um pano) ou neutralizados com bicarbonato de sódio, e a área afectada deve ser enxaguada e seca com um pano; se contiver materiais perigosos, limpe a área com um dos desinfectantes químicos.

11. Elimine todas as amostras e materiais utilizados para efectuar o teste partindo do princípio de que contêm um agente infeccioso. Os produtos químicos de laboratório e os resíduos biológicos perigosos devem ser manipulados e eliminados em conformidade com todos os regulamentos locais e nacionais.

12. Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns componentes químicos neste kit de teste, consulte as ilustrações indicadas nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em www.bio-rad.com.

13. A Ficha de Dados de Segurança (FDS) do material está disponível mediante solicitação. 7- PRECAUÇÕES PARA OS UTILIZADORES

1. AS AMOSTRAS CONGELADAS DE SORO OU DE LBA CONSERVADAS EM CONDIÇÕES DESCONHECIDAS PODEM DAR ORIGEM A RESULTADOS DE FALSOS POSITIVOS, DEVIDO A CONTAMINAÇÃO POR FUNGOS E/OU BACTÉRIAS.

2. Não utilize o kit nem nenhum dos seus reagentes após o prazo de validade indicado.

3. Não misture reagentes pertencentes a outros kits que apresentem diferentes números de lote, com excepção da solução de lavagem (R2, identificação*: 20x de cor verde), do cromogénio (R9, identificação*: TMB de cor turquesa) e da solução de paragem (R10, identificação*:1N de cor vermelha), desde que estes reagentes sejam estritamente equivalentes e que seja utilizado o mesmo número de lote para cada ensaio.

*no rótulo do frasco

NOTA: a solução de lavagem (R2, identificada* a verde como 20x) não pode ser misturada com a solução de lavagem (R2 identificada* a azul como 10X) fornecida nos kits de reagentes Bio-Rad.

*no rótulo do frasco

4. Deixe todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente, durante, pelo menos, 30 minutos, antes de os utilizar. 5. Agite bem cada um dos reagentes antes de os utilizar.

6. Agite bem a solução de lavagem concentrada (R2) antes de preparar a solução de lavagem de trabalho, tendo o cuidado de evitar a contaminação microbiana.

7. Não efectue o teste na presença de vapores reactivos (ácidos, alcalis, aldeídos) ou poeiras, os quais podem afectar a actividade enzimática do conjugado.

8. Para pipetagem manual dos controlos e amostras, utilize pontas de pipeta individuais, de modo a evitar a transição de amostras.

9. Para garantir a lavagem adequada dos poços, execute o número recomendado de ciclos de lavagem e certifique-se de que todos os poços estão completamente cheios e, em seguida, completamente vazios. A lavagem não deve ser executada manualmente.

10. Não deixe a microplaca secar entre o final do ciclo de lavagem e a adição dos reagentes. 11. Não utilize o mesmo recipiente para as soluções de conjugado e de substrato.

12. Não deixe que as soluções do conjugado ou da TMB cromogénica entrem em contacto com metais ou iões metálicos. 13. Evite expor a solução cromogénica de TMB a uma forte intensidade luminosa durante o armazenamento ou a incubação.

Não deixe as soluções cromogénicas entrarem em contacto com um agente oxidante.

14. Evite o contacto da solução de paragem com todo e qualquer agente oxidante. Não deixe que a solução de paragem entre em contacto com metais ou iões metálicos.

15. Utilize materiais limpos (tubos, pontas, recipientes, etc.), isentos de poeiras, de modo a minimizar a possibilidade de contaminação com esporos de Aspergillus presentes no ambiente. Dado que o galactomanano permanece estável face ao calor, a esterilização dos materiais utilizados não garante a ausência do antigénio contaminante. Os materiais apirogénicos são os ideais, mas podem ser utilizados materiais normais desde que sejam adoptadas as precauções adequadas.

16. Limite a exposição das soluções (soro, LBA, solução de tratamento de amostras, conjugado) ou dos recipientes abertos (placas, tubos, pipetas) ao ar.

17. Não volte a despejar conjugado não utilizado no recipiente de origem.

(4)

4 8- PREPARAÇÃO E CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES

Placa de tiras de micropoços (R1)

Cada estrutura contendo 12 tiras vem embalada numa bolsa. Utilizando uma tesoura, corte a bolsa imediatamente abaixo da junção. Abra a bolsa e retire a estrutura. Volte a colocar a estrutura contendo as tiras não utilizadas na bolsa de origem. Volte

a selar cuidadosamente a bolsa e conserve-a a +2-8 °C.

Após a abertura da bolsa embalada a vácuo, as tiras permanecem estáveis durante 8 semanas, desde que conservadas a +2-8°C na bolsa de origem e estando esta devidamente selada. Verifique se o dessecante ainda está presente.

Solução de lavagem (R2)

Prepare a solução de lavagem de trabalho consoante o necessário, adicionando uma parte de solução de lavagem concentrada (R2) a 19 partes de água desionizada ou destilada. A solução de lavagem de trabalho pode ser conservada durante 14 dias a 2-30 °C. Prepare uma quantidade de solução de lavagem de trabalho suficiente para efectuar o ensaio (80 ml para uma tira: 4 ml de R2 + 76 ml de água destilada).

Após a abertura, a solução de lavagem concentrada conservada a +2-30 o_{C, na ausência de contaminação, permanece estável}

até ao final do prazo de validade indicado no rótulo.

Soro de controlo negativo (R3), soro de controlo de cut-off (R4) e soro de controlo positivo (R5)

Os controlos têm de receber tratamento térmico com a solução ácida de EDTA (R7), como as amostras dos doentes, de modo a constituírem também monitores do tratamento.

Após a abertura, estes reagentes permanecem estáveis durante 8 semanas, desde que conservados a +2-8 °C e na ausência de contaminação.

Conjugado (R6), solução de tratamento de amostras (R7), cromogénio: solução de TMB solution (R9)

Estes reagentes são fornecidos prontos a utilizar.

Após a abertura, estes reagentes permanecem estáveis durante 8 semanas, desde que conservados a +2-8 °C e na ausência de contaminação.

Reacção de paragem (R10)

Este reagente é fornecido pronto a utilizar.

Após a abertura, este reagente permanece estável até ao final do prazo de validade indicado no rótulo, desde que seja conservado a +2-8 °C e que não ocorra contaminação.

9- RECOLHA DE AMOSTRAS Este teste é efectuado com soro ou LBA.

I. SORO

Recolha as amostras de sangue de acordo com os procedimentos laboratoriais padrão. As amostras de soro não podem estar contaminadas por esporos de fungos e/ou bactérias. Transporte e conserve as amostras em tubos selados, de modo a que as amostras não fiquem expostas ao ar. As amostras por abrir podem ser conservadas a 2-8 °C por um período de até 5 dias antes do teste. Após a abertura inicial, as amostras podem ser conservadas a 2-8 °C durante 48 horas antes do teste. Para períodos de conservação mais prolongados, conserve o soro a -70 °C.

As amostras de soro podem ser submetidas a um máximo de 4 ciclos de congelação/descongelação. As amostras previamente congeladas devem ser bem agitadas após a descongelação, antes de serem testadas.

Os resultados não são afectados por amostras contendo 20 mg/l de bilirrubina, amostras lipémicas contendo o equivalente a 2 g/l de trioleína (triglicérido) ou amostras hemolisadas contendo 165 mg/l de hemoglobina. As interferências relacionadas com o excesso de albumina não foram testadas.

Não descomplemente os soros.

II. LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)

Recolha as amostras de LBA de acordo com os procedimentos laboratoriais padrão. As amostras de LBA têm de ser recolhidas em soro fisiológico estéril, podendo ser testadas em amostras puras (tal como estão) ou em sobrenadantes de amostras centrifugadas (10.000 rpm durante 10 min.), antes de se proceder ao tratamento da amostra, conforme descrito na secção 10. As amostras de LBA não podem estar contaminadas por esporos de fungos e/ou bactérias. Transporte e conserve as amostras em tubos selados, de modo a que as amostras não fiquem expostas ao ar. Após a abertura inicial, as amostras podem ser conservadas a 2-8 o_{C por um período máximo de 24 horas. Para períodos de conservação mais prolongados, pode conservar}

as amostras de LBA congeladas (a -20 °C ou menos) por um período máximo de 5 meses.

As amostras de LBA podem ser submetidas a um número máximo de 4 ciclos de congelação/descongelação. As amostras previamente congeladas devem ser bem agitadas após a descongelação, antes de serem testadas.

10- PROCEDIMENTO

Materiais fornecidos

(5)

5 Materiais necessários mas não fornecidos

1. Água destilada ou desionizada, para diluição da solução de lavagem concentrada. 2. Papel absorvente.

3. Luvas descartáveis. 4. Óculos de protecção.

5. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio.

6. Pipetas ou pipetas multicanal, ajustáveis ou fixas, para medir e distribuir 50 µl, 100 µl, 300 µl e 1000 µl.

7. Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, em polipropileno, com tampas impermeáveis ao ar, capazes de suportar temperaturas até 120 °C (bloco de aquecimento) ou 100 °C (banho de água a ferver):

- Tampas roscadas e tubos: tubos cónicos de 1,5 ml,

OU

- Tubos com tampa de encaixe: tubos de teste EZ Micro de 1,5 ml,

- Fechos para tampas de microtubos. Estes fechos permitem vedar com segurança os tubos com tampa de encaixe, impedindo que as tampas abram devido a alterações de temperatura e pressão, permitindo também que os tubos possam ser facilmente retirados do bloco de aquecimento ou do banho de água a ferver.

8. Centrífuga de bancada laboratorial para tubos de polipropileno de 1,5 ml, capaz de atingir 10.000 g (refª 22-36-280-1 do catálogo da Brinkman, refª 20901-051 do catálogo da VWR Scientific ou equivalente).

9. Se for utilizado um bloco de aquecimento para o tratamento do soro/LBA:

- Bloco de aquecimento. Recomendam-se os seguintes modelos de blocos de aquecimento:

- Modelo de bloco único: refª QBD-1L do catálogo da Grant - fora dos EUA: refª QBD1 do catálogo da Grant, distribuído pela VWR com a refª # 460-0074)

- Modelo de dois blocos: refª QBD-2L do catálogo da Grant – fora dos EUA: refª QBD2 do catálogo da Grant, distribuído pela VWR com a refª # 460-0076)

- Bloco para blocos de aquecimento: ambos os blocos de aquecimento (QBD-1L, QBD1 e QBD-2L, QBD2) têm de ser utilizados com o bloco de aquecimento da Grant, refª QB-E1, distribuído fora dos EUA pela VWR com a refª # 460-8517

Se for utilizado um banho de água para o tratamento do soro/LBA:

- Suporte redondo flutuante para microcentrífuga, para uma proveta de 1 litro (nos EUA: refª 60986-100 do catálogo da VWR Scientific, refª 5974-1015 do catálogo da Nalgene ou equivalente).

- Banho de água a ferver a 100 °C. 10. Agitador de vórtice.

11. Incubador para microplacas a 37 ± 1 °C.

12. Aparelho semi-automático ou automático de lavagem de microplacas. 13. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm e 620/630 nm.

Comentários sobre procedimentos

Os controlos negativo, positivo e de cut-off têm de ser testados em cada ensaio, de modo a validar os resultados do teste.

Tratamento do soro/LBA

Todos os soros de controlo: negativo (R3), de cut-off (R4) e positivo (R5), têm de ser processados ao mesmo tempo como amostras de soro/LBA:

1. Pipete 300 µl de cada soro/LBA de teste e controlo para um tubo individual de polipropileno de 1,5 ml. 2. Adicione 100 µl de solução de tratamento de amostras (R7) a cada tubo.

3. Agite bem os tubos, agitando-os vigorosamente ou colocando-os num agitador de vórtice, de modo a que o conteúdo fique bem misturado. Feche bem os tubos para evitar que a tampa abra durante o aquecimento.

4. Opção do bloco de aquecimento

Aqueça os tubos durante 6 minutos num bloco de aquecimento, a 120 °C. Os tubos têm de ser colocados no bloco apenas quando a temperatura prescrita é atingida (*).

OU

Opção do banho de água

Se utilizar um banho de água a ferver: aqueça os tubos durante 3 minutos a 100 °C (*). Os tubos têm de ser colocados no banho de água apenas quando a temperatura prescrita é atingida.

5. Retire com cuidado os tubos quentes do bloco de aquecimento ou do banho de água a ferver e coloque-os na centrífuga. Centrifugue os tubos a 10.000 g durante 10 minutos. O sobrenadante é utilizado para a detecção do antigénio galactomanano.

6. Teste os sobrenadantes utilizando o procedimento seguinte. Após a preparação, o sobrenadante pode ser removido e

armazenado a

2-8 °C por um período máximo de 48 horas antes de ser testado. Se a análise dos resultados indicar a necessidade de um novo teste, tem de ser tratada outra alíquota da amostra para ser posteriormente testada.

(*) O cumprimento rigoroso das indicações relativas à temperatura e à duração dos ciclos, bem como a utilização dos materiais recomendados, são essenciais para o sucesso do teste.

(6)

6 Procedimento do imunoensaio enzimático

Observe rigorosamente o protocolo proposto.

Proceda em conformidade com as Boas Práticas Laboratoriais.

1. Deixe todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente (+18-25 °C) durante, pelo menos, 30 minutos, antes de

os utilizar.

2. Prepare a solução de lavagem de trabalho.

3. Prepare uma tabela para identificação das amostras de soros/LBA de teste e dos controlos na microplaca. Utilize um poço para o soro de controlo negativo (R3), dois poços para o soro de controlo de cut-off(R4) e um poço para o soro de controlo positivo (R5). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R5 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R3 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12

4. Retire o suporte da placa e as tiras de micropoços (R1) da bolsa da placa. Volte a colocar todas as tiras que não serão utilizados na bolsa, com o dessecante, e sele novamente a bolsa.

5. Agite o conteúdo do frasco do conjugado (R6) por inversão, antes da utilização. Adicione 50 µl de conjugado (R6) a cada poço. Em seguida, adicione 50 µl de sobrenadante de soro/LBA a cada poço, pela ordem acima indicada. Não adicione as amostras de soro/LBA aos poços antes do conjugado.

6. Cubra a placa com o respectivo vedante ou por outros meios, de modo a evitar a evaporação, certificando-se de que toda a superfície está coberta e estanque.

7. Incube a microplaca num incubador de microplacas a seco durante 90 ± 5 minutos a 37 °C (± 1 °C).

8. Retire o vedante da placa. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos (contendo hipoclorito de sódio). Lave a placa 5 vezes com um aparelho de lavagem de microplacas (utilizando 800 µl de solução de lavagem de trabalho). Após a última lavagem, inverta a microplaca em cima de papel absorvente e bata suavemente com os dedos na mesma, de modo a remover o restante líquido.

9. Adicione rapidamente 200 µl da solução cromogénica de TMB (R9) a cada poço, evitando a exposição a uma luz intensa. 10. Incube a microplaca no escuro à temperatura ambiente (+18-25 °C), durante 30 ± 5 minutos. Não utilize película adesiva

durante esta etapa de incubação.

11. Adicione 100 µl de solução de paragem (R10) a cada poço, pela mesma ordem com que adicionou a solução cromogénica de TMB. Misture bem.

12. Limpe completamente o fundo de cada placa.

13. Leia a densidade óptica de cada poço a 450 nm (filtro de referência de 620/630 nm). As microplacas têm de ser lidas no prazo de 30 minutos após a adição da solução de paragem.

11- CONTROLO DE QUALIDADE (CRITÉRIOS DE VALIDAÇÃO)

Controlo de cut-off: a densidade óptica (DO) de cada soro de controlo de cut-off tem de ser



0,300 e



0,800.

Controlo positivo: o índice do soro de controlo positivo tem de ser superior a 1,50.

I = DO do controlo positivo (R5) > 1.50 DO média do controlo de cut-off

Controlo negativo: o índice do soro de controlo negativo tem de ser inferior a 0,40.

I = DO do controlo negativo (R3) < 0.40 DO média do controlo de cut-off

No caso de algum dos controlos não cumprir os critérios de validação acima descritos, o ensaio é inválido, e os resultados da amostra do doente não devem ser reportados. O operador pode decidir repetir o ensaio, após rever o procedimento, ou pode contactar o fabricante para solicitar assistência. Se for executada uma repetição do ensaio, deve ser utilizada uma nova alíquota da mesma amostra no ensaio de repetição.

Exemplo de cálculo:

Amostra Absorvância (DO)

DO do controlo negativo (R3) 0.116

DO do controlo de cut-off (R4) 0.513

0.533

(7)

7 Cálculos

Valor médio do controlo de cut-off

Para calcular a DO média do controlo de cut-off (R4), adicione os valores de DO de todas as réplicas do controlo de cut-off e divida o resultado por 2:

(0.513 + 0.533) ÷ 2 = 0.523 Índice do controlo negativo

Para calcular o índice do controlo negativo, divida a DO do controlo negativo pela DO média do controlo de cut-off: I = 0.116 = 0.22

0.523

Índice do controlo positivo

Para calcular o índice do controlo positivo, divida a DO do controlo positivo pela DO média do controlo de cut-off: I = 1.834 = 3.51

0.523

Validação

No exemplo apresentado acima:

 A DO de cada controlo de cut-off é



0,300 e



0,800, indicando que o controlo de cut-off é válido.  O índice do controlo negativo é < 0,40, indicando que o controlo negativo é válido.

 O índice do controlo positivo é > 1,50, indicando que o controlo positivo é válido.

O ensaio de teste referido neste exemplo é considerado válido, dado que os resultados cumprem os critérios de validação de cada controlo.

12- INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS

A presença ou ausência de antigénio galactomanano na amostra de teste é determinada pelo cálculo de um índice para cada amostra do doente. O índice (I) corresponde ao valor da DO da amostra dividido pela densidade óptica média dos poços contendo soro de controlo de cut-off.

Cálculo da densidade óptica média do controlo de cut-off:

Adicione as densidades ópticas dos dois poços que contêm soro de controlo de cut-off (R4) e divida o total por 2.

Cálculo de um índice (I) para cada amostra de teste:

Calcule o rácio seguinte para cada amostra de teste:

I = DO da amostra

DO média do controlo de cut-off

Interpretação de soros/LBA com um índice < 0,50:

Os soros/lavados broncoalveolares com um índice < 0,50 são considerados negativos para o antigénio galactomanano.

Nota : um resultado negativo pode indicar que o resultado do doente se situa abaixo do nível de detecção do ensaio. Os

resultados negativos não excluem o diagnóstico de Aspergilose Invasiva. Recomenda-se a repetição do teste se o resultado for negativo mas houver suspeita da presença da doença.

Interpretação de soros/lavados broncoalveolares com um índice



0,50

Os soros/lavados broncoalveolares com um índice



0,50 são considerados positivos para o antigénio galactomanano.

Para todos os doentes com resultados positivos, recomenda-se a repetição do teste numa nova alíquota da mesma amostra (soro/LBA).

Nota : um valor de absorvância inferior a 0,000 pode indicar um erro dos procedimentos ou dos instrumentos, o qual deve ser

avaliado. Tal resultado é inválido e a amostra tem de ser submetida a novo teste.

Recomenda-se o rastreio regular (duas vezes por semana) de amostras de soro de doentes de alto risco, de modo a aumentar a sensibilidade e positividade precoce do teste.

Nota : o Platelia™ Aspergillus Ag destina-se a ser utilizado como um auxiliar ao diagnóstico da Aspergilose Invasiva. Os

resultados positivos obtidos com o Platelia™ Aspergillus Ag devem ser considerados em conjunto com outros procedimentos de diagnóstico, tais como culturas microbiológicas, exame histológico de amostras para biopsia e evidências radiológicas.

Exemplo de cálculo:

Amostra Absorvância (DO)

(8)

8 Cálculos

Consulte, na secção CONTROLO DE QUALIDADE (CRITÉRIOS DE VALIDAÇÃO), o exemplo dos cálculos necessários para determinar a validade dos controlos do ensaio.

Valor médio do controlo de cut-off

Para calcular a DO média do controlo de cut-off (R4), adicione os valores de DO de todas as réplicas do controlo de cut-off e divida o resultado por 2:

(0.513 + 0.533) ÷ 2 = 0.523 Amostra n.º 1 do doente

Para calcular o índice da amostra n.º 1 do doente, divida a DO da amostra n.º 1 do doente pela DO média do controlo de cut-off:

I = 0.134 _0.523 = 0.26

Neste exemplo, a amostra n.º 1 do doente é negativa, dado que o índice de 0,26 é < 0,50. Amostra n.º 2 do doente

I = 0.436 = 0.83 0.523

Neste exemplo, a amostra n.º 2 do doente é positiva, dado que o índice de 0,83 é



0,50. Amostra n.º 3 do doente

I = 1.196 _0.523 = 2.29

Neste exemplo, a amostra n.º 3 do doente é positiva, dado que o índice de 2,29 é



0,50. Queira consultar "Interpretação de resultados positivos" na secção 12.

13- LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO

1. Um resultado negativo do teste de amostras de soro e/ou LBA não exclui o diagnóstico de Aspergilose Invasiva. Devem ser testadas duas vezes por semana amostras de doentes em risco de sofrerem de Aspergilose Invasiva.

2. As indicações das secções "Procedimento" e "Interpretação de resultados" do Platelia™ Aspergillus Ag devem ser seguidas quando se procede ao teste de amostras para determinação da presença do antigénio galactomanano. O utilizador do kit deve ler o folheto informativo atentamente antes de proceder à realização do teste. Em particular, o procedimento de teste tem de ser cuidadosamente respeitado no que se refere à pipetagem de amostras e reagentes, lavagem da placa e tempos das etapas de incubação.

3. A não observância das indicações relativas à adição de amostras ou reagentes contidas no procedimento pode resultar num teste falso negativo. Deve considerar-se a repetição do teste em amostras adicionais sempre que existir

suspeita clínica da presença de Aspergilose Invasiva ou da ocorrência de erros no procedimento.

4. Pode ocorrer a contaminação de poços contendo amostras negativas de doentes por parte de poços contendo amostras positivas de doentes ou controlo positivo, caso o conteúdo de um dos poços salpique para o outro poço devido à manipulação pouco cuidadosa da microplaca ou a uma técnica de pipetagem incorrecta durante a adição dos reagentes. 5. O desempenho do Platelia™ Aspergillus Ag não foi avaliado em amostras neonatais. A literatura europeia reporta uma

incidência mais elevada do número de resultados falsos positivos de galactomanano entre a população neonatal13, 15, 33, 44

_.

6. O Platelia™ Aspergillus Ag pode apresentar uma capacidade reduzida de detecção em doentes com doença granulomatosa crónica (DGC) e síndrome de Job56, 58_.

7. A utilização concomitante de terapêutica antifúngica contra bolores activos em doentes com Aspergilose Invasiva pode resultar na diminuição da sensibilidade do Platelia™ Aspergillus Ag 30,31_.

8. A utilização do Platelia™ Aspergillus Ag com plasma ou amostras de outros tipos, como urina ou líquido cefalorraquidiano (LCR), não foi avaliada.

9. O desempenho do Platelia™ Aspergillus Ag não foi estabelecido para a leitura manual e/ou determinação visual do resultado.

10. Outros géneros de fungos, tais como os Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum e Histoplasmademonstraram reactividade com os anticorpos monoclonais EBA-2 de rato utilizados no ensaio de detecção do galactomanano de Aspergillus. A histoplasmose deve ser tida em consideração em áreas endémicas, incluindo determinadas regiões dos EUA36, 50, 59_.

11. Não foi avaliada a reactividade cruzada entre amostras de LBA com Mycoplasma pneumoniae ou fármacos anestésicos/lubrificantes utilizados para entorpecer a área do pescoço/garganta durante o processo de aspiração.

12. Reacções positivas sem sinais clínicos:

(9)

9 No entanto, em alguns casos particulares, devem ser tidos em consideração factores específicos quando se interpreta o teste:

a. Foram reportados casos de resultados positivos sem sinais clínicos, especialmente em crianças pequenas44_{. Embora}

alguns destes casos possam relacionar-se com a circulação real de antigénios de Aspergillus , a maioria dos mesmos pode ser considerada como falsos positivos7_.

b. A presença de galactofuranose foi demonstrada em vários alimentos, particularmente em cereais, produtos à base de cereais e sobremesas com natas1, 27_{. Ao contrário do leite humano, os leites artificiais para consumo humano contêm}

frequentemente concentrações elevadas de galactomanano13_{. Por conseguinte, têm de ser tidos em consideração}

factores relacionados com a alimentação na interpretação do curso da antigenemia em crianças pequenas e, regra geral, em todos os doentes que apresentem uma barreira intestinal alterada6, 13_{. Nesta população de doentes, todos}

os casos de antigenemia positiva não acompanhados por sinais clínicos devem ser interpretados ainda com mais prudência.

c. Foram reportados resultados de testes de galactomanano positivos em doentes submetidos a tratamento com piperacilina/tazobactam. Também se verificou que certos lotes de piperacilina/tazobactam revelavam resultados positivos para o antigénio galactomanano. Por conseguinte, os resultados de testes positivos em doentes submetidos a tratamento com piperacilina/tazobactam devem ser interpretados com prudência e confirmados por outros métodos de diagnóstico. Também foi reportada a detecção de galactomanano em alguns lotes de amoxicilina associada a preparações parentéricas de ácido clavulânico. Por conseguinte, os tratamentos com beta-lactâmicos semi-sintéticos devem ser tidos em consideração ao interpretar o teste1, 3, 32_.

No entanto, dado que o Platelia™ Aspergillus Ag consegue detectar o antigénio galactomanano muito antes do surgimento de sinais clínicos ou radiológicos, a ocorrência de Aspergilose Invasiva não pode ser excluída. Como tal, os doentes tratados com piperacilina/tazobactam que apresentem resultados de teste positivos devem ser acompanhados de perto.

d. Podem ser observadas reacções positivas na ausência de sinais clínicos em doentes que a receber produtos contendo galactomanano, quer por via parentérica quer por via oral (na presença de uma alteração da barreira intestinal). A presença de galactomanano nestes produtos pode dever-se muitas vezes à utilização de processos de fermentação à base de microrganismos fúngicos. Contudo, o doente não apresentará um resultado positivo, a menos que a concentração sérica de galactomanano exógeno atinja ou ultrapasse o limite de detecção do teste.

Assim, no caso de ocorrer um resultado positivo suspeito na ausência de outros sinais clínicos, recomenda-se que se investigue os produtos que o doente está a tomar e, nomeadamente, os processos de fabrico dos mesmos e a origem das matérias-primas utilizadas14, 41, 49_.

13. Em vários estudos, foram reportadas reacções positivas para o galactomanano no soro e LBA, associadas à administração de PLASMA-LYTE™14, 41_{. Por conseguinte, a eventual administração de PLASMA-LYTE™ deve ser tida em consideração}

quando se interpretam os resultados deste teste.

14. Os resultados do Platelia™ Aspergillus Ag em amostras de lavado broncoalveolar (LBA) de doentes não imunocomprometidos devem ser interpretados com cuidado37

15. Os resultados próximos do valor do índice de cut-off (0,5) devem ser interpretados com prudência e devem ser apoiados por outras evidências clínicas, radiológicas ou laboratoriais de Aspergilose Invasiva, dado que não está incluída nenhuma zona indeterminada na interpretação dos resultados do ensaio.

16. Além disso, os resultados do ensaio imunoenzimático Platelia™ Aspergillus Ag em amostras de LBA com valores de índice situados entre 0,5 e 1,0 apresentam um valor positivo previsto inferior aos resultados de amostras de LBA que revelam valores de índice > 1,0, pelo que os resultados com valores de índice situados entre 0,5 e 1,0 devem ser reavaliados e apoiados por outras evidências clínicas, radiológicas ou laboratoriais de Aspergilose Invasiva8,17.

14- VALORES ESPERADOS

I. SORO

A prevalência esperada de Aspergilose Invasiva varia com a população de doentes; foram reportadas taxas de 5 a 20%10, 16_.

Os resultados seguintes foram obtidos em estudos clínicos realizados com doentes pediátricos (idade ≤ 21 anos) nos EUA e com doentes adultos na América do Norte.

A- Doentes pediátricos

Foi realizado um estudo clínico envolvendo um total de 1954 amostras de soro de 129 doentes pediátricos (idade ≤ 21 anos) imunocomprometidos, em risco de sofrerem de Aspergilose Invasiva (AI) e doentes diagnosticados com Aspergilose Invasiva Comprovada ou Provável, em três centros de ensaio nos EUA, para determinar as características de desempenho do Platelia™ Aspergillus Ag. A distribuição de valores de índice destas populações é apresentada nas tabelas seguintes:

Doentes pediátricos sem diagnóstico de Aspergilose Invasiva (população de controlo)

(10)

10 Figura 1 8 0 1 1 0 2 1 2 2 2 6 16 50 145 584 805 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0-0. 1 0. 1-0.2 0. 2-0.3 0. 3-0.4 0. 4-0.5 0. 5-0.6 0. 6-0.7 0.7-0 .8 0.8 -0.9 0. 9-1.0 1. 0-1.1 1. 1-1.2 1. 2-1.3 1. 3-1.4 1. 4-1.5_>1.5 Index Num b e r o f S e ra

Distribution of the Serum Index Value from the Pediatric Control Population (N=1625)

*Nota: foram excluídas 80 amostras, obtidas a partir de 4 doentes de controlo com resultados positivos para o antigénio galactomanano coincidentes com terapêutica com piperacilina/tazobactam (Zosyn®).

Doentes pediátricos com diagnóstico de Aspergilose Invasiva

O gráfico de dispersão representa os resultados do ensaio de galactomanano das 249 amostras de soro de 17 doentes do estudo, diagnosticados com Aspergilose Invasiva Comprovada ou Provável, conforme estabelecido pelas definições EORTC/NIAID. Não é de esperar que todas as amostras de soro de cada doente sejam positivas. A prevalência esperada de Aspergilose Invasiva varia com a população de doentes; foram reportadas taxas de 5 a 20%10, 24_{. A taxa de prevalência deste}

estudo foi de 13,6%. Figura 2 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Patient Number In d e x

Pediatric Proven/ Probable Aspergillosis: Distribution of Index/ Pediatric Patient (N=17)

>

Doentes pediátricos com Aspergilose Comprovada/Provável Distribuição do índice Doentes pediátricos (N = 17)

N

úmero de soros

Índice

Distribuição de valores de índice do soro da população pediátrica de controlo (N = 1625)

Índice

(11)

11 B. Adultos

Foi realizado um estudo clínico envolvendo 1724 amostras de soro obtidas de 172 doentes submetidos a transplante da medula óssea (TMO) e com leucemia, com e sem diagnóstico de Aspergilose Invasiva, em três centros de ensaio na América do Norte, para determinar as características de desempenho do Platelia™ Aspergillus Ag. A distribuição de valores de índice destas populações é apresentada nas tabelas seguintes.

Doentes adultos sem diagnóstico de Aspergilose Invasiva (população de controlo)

Um total de 1262 amostras de soro, obtidas a partir de 143 doentes submetidos a transplante da medula óssea (TMO) e com leucemia, em três centros de ensaio na América do Norte, foram testadas com o Platelia™ Aspergillus Ag. A distribuição dos valores de índice é apresentada na tabela seguinte.

Figura 3

Distribution of the Serum Index Value from the Adult Control Population (N=1262)

40 4 0 0 1 0 0 1 0 4 4 5 14 107 420 662 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0-0. 1 0.1-0 .2 0. 2-0.3 0.3-0 .4 0. 4-0.5 0. 5-0.6 0. 6-0.7 0. 7-0.8 0.8 -0.9 0.9-1 .0 1. 0-1.1 1.1-1 .2 1. 2-1.3 1. 3-1.4 1. 4-1.5 _>1.5 Index Nu m b e r o f Se ra

Doentes adultos com diagnóstico de Aspergilose Invasiva

O gráfico de dispersão representa os resultados do ensaio de galactomanano das 462 amostras de soro de 29 doentes do estudo, diagnosticados com Aspergilose Invasiva Comprovada ou Provável, conforme estabelecido pelas definições EORTC/NIAID. Não é de esperar que todas as amostras de soro de cada doente sejam positivas. A prevalência esperada de Aspergilose Invasiva varia com a população de doentes; foram reportadas taxas de 5 a 20%10, 24_{. A taxa de prevalência deste}

estudo foi de 16,9%. Figura 4

Adult Proven/ Probable Aspergillosis: Distribution of Index/ Adult Patient (N=29)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ₁₀ ₁₁ ₁₂ ₁₃ ₁₄ ₁₅ ₁₆ ₁₇ ₁₈ ₁₉ ₂₀ ₂₁ ₂₂ ₂₃ ₂₄ ₂₅ ₂₆ ₂₇ ₂₈ ₂₉ ₃₀ Patient Number Index >

Doentes adultos com Aspergilose Comprovada/Provável Distribuição do índice Doentes adultos (N = 29)

N

úmero de soros

Índice

Distribuição de valores de índice do soro da população adulta de controlo (N = 1262)

Índice

(12)

12 Os gráficos seguintes representam os exemplos de um doente sem sinais clínicos ou sintomas de Aspergilose Invasiva (negativo para Aspergillus) e de um doente com Aspergilose Invasiva Comprovada ou Provável (positivo para Aspergillus), respectivamente. Figura 5 Doente negativo CONTROL PATIENT 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 10 20 30 40 50 60 Days Inde x Figura 6 Doente positivo

PROVEN INVASIVE ASPERGILLOSIS PATIENT

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 10 20 30 40 50 60 Days Inde x

II. LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)

Foram realizados dois estudos envolvendo um total de 449 amostras de LBA, obtidas a partir de 178 receptores de transplantes de órgãos sólidos e de transplantes pulmonares, com e sem Aspergilose Invasiva nos EUA, para determinar as características de desempenho do kit Platelia™ Aspergillus Ag com amostras de lavado broncoalveolar (LBA).

Destas, 403 amostras de LBA de 167 receptores de órgãos sólidos e pulmonares revelaram-se negativas para a Aspergilose Invasiva.

Além disso, uma análise retrospectiva foi realizada em amostras de LBA de 99 pacientes de alto risco avaliados num estudo de hematologia fora dos Estados Unidos, que incluiu 58 pacientes com comprovada ou provável Aspergilose Invasiva.

Os valores esperados das amostras de LBA obtidas a partir da população combinada de receptores de transplantes de órgãos sólidos e de transplantes pulmonares sem Aspergilose Invasiva, são apresentados na tabela seguinte. Os resultados são apresentados por amostras de receptores de transplantes com e sem colonização por fungos.

Tabela 1

Valores esperados por amostra

População combinada de receptores de transplantes de órgãos sólidos e de transplantes pulmonares sem Aspergilose Invasiva N = 403 amostras de LBA

Os valores esperados das amostras de LBA obtidas a partir da população combinada de receptores de transplantes de órgãos sólidos e de transplantes pulmonares sem Aspergilose Invasiva, são apresentados por tipo de transplante na tabela seguinte.

Diagnóstico N Positivo (%) Negativo (%)

Controlos sem colonização 341 11/341 (3.2%) 330/341 (96.8%)

Controlos com colonização 62 12/62 (19.4%) 50/62 (80.6%)

Total dos controlos 403 23/403 (5.7%) 380/403 (94.3%)

Doente com Aspergilose Invasiva Comprovada

Índice

Dias Doente de controlo

Índice

(13)

13 Tabela 2

População combinada de receptores de transplantes de órgãos sólidos e de transplantes pulmonares sem Aspergilose Invasiva, por tipo de transplante

N = 403 amostras de LBA

Tipo de transplante N Positivo (%) Negativo (%)

Coração 28 3/28 (10.7%) 25/28 (89.3%)

Rim 25 3/25 (12.0%) 22/25 (88.0%)

Fígado 23 1/23 (4.3%) 22/23 (95.7%)

Pulmão 327 16/327 (4.9%) 311/327 (95.1%)

Total dos controlos 403 23/403 (5.7%) 380/403 (94.3%)

Valores esperados também foram avaliados, num total de 41 amostras de LBA de 41 pacientes com doença hematológica sem Aspergilose Invasiva e são apresentados na tabela abaixo:

Tabela 3

Doentes com doença hematológica sem Aspergilose Invasiva N = 41 amostras de LBA

Diagnóstico N Positivo (%) Negativo (%)

Controlos 41 8/41 (19.5%) 33/41 (80.5%)

15- CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE DESEMPENHO

A- REPRODUTIBILIDADE

a) Estudos de reprodutibilidade com soro

(14)

14 Tabela 4 Local 1 Membro do Painel Negativa Fracamente

positiva Positiva n.º 1 Positiva n.º 2 positiva n.º1 Altamente positiva n.º 2 Altamente Controlo Neg. Controlo CO Controlo Pos. DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice N 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 6 6 3 3 Média 0.052 0.09 0.445 0.74 0.702 1.17 0.931 1.563 1.227 2.06 2.887 4.83 0.046 0.08 0.606 1.00 2.216 3.67 Em cada ensaio (intra-ensaio)1 DP

0.002 0.00 0.022 0.03 0.059 0.09 0.044 0.08 0.051 0.09 0.089 0.17 N/A N/A 0.02 0.03 N/A N/A

% CV N/A N/A 4.8% 4.4% 8.4% 7.6% 4.7% 5.1% 4.2% 4.4% 3.1% 3.6% N/A N/A 3.7% 3.4% N/A N/A

Total (inter-ensaio)2

DP

0.036 0.04 0.051 0.08 0.070 0.14 0.044 0.25 0.058 0.29 0.169 0.58 N/A N/A 0.102 0.03 0.317 0.12

% CV N/A N/A 11.5% 10.4% 10.0% 11.6% 4.7% 15.7% 4.7% 14.3% 5.9% 11.9% N/A N/A 16.9% 2.8% 14.3% 3.3%

Local 2

Membro do Painel

Neg Pos. Baixo Pos. n.º 1 Pos. n.º 2 Pos. n.º1 Alto Pos. n.º 2 Alto Controlo Neg. Controlo CO Controlo Pos.

DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice N 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 6 6 3 3 Média 0.040 0.10 0.280 0.70 0.364 0.89 0.602 1.49 0.801 2.01 1.361 3.43 0.074 0.18 0.415 1.00 1.197 2.97 Em cada ensaio (Intra-ensaio)1 DP

0.006 0.01 0.041 0.09 0.023 0.07 0.045 0.11 0.046 0.10 0.047 0.11 N/A N/A 0.00 0.01 N/A N/A

% CV N/A N/A 14.5% 13.0% 6.4% 7.6% 7.5% 7.1% 5.7% 4.8% 3.5% 3.2% N/A N/A 1.1% 1.1% N/A N/A Total

(inter-ensaio)2

DP

0.006 0.03 0.058 0.19 0.083 0.18 0.057 0.28 0.042 0.53 0.079 1.00 N/A N/A 0.094 0.01 0.068 0.54

% CV N/A N/A 20.8% 27.0% 22.7% 19.8% 9.5% 18.7% 5.3% 26.5% 5.8% 29.2% N/A N/A 22.7% 0.9% 5.7% 18.2%

Local 3

Membro do

Painel Neg Pos. Baixo Pos. n.º 1 Pos. n.º 2 Pos. n.º1 Alto Pos. n.º 2 Alto Controlo Neg. Controlo CO Controlo Pos. DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice N 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 3 3 6 6 3 3 Média 0.049 0.10 0.388 0.81 0.652 1.36 0.830 1.73 1.158 2.41 2.378 4.96 0.059 0.12 0.480 1.00 1.652 3.45 Em cada ensaio (Intra-ensaio)1 DP

0.003 0.01 0.009 0.02 0.082 0.17 0.068 0.14 0.094 0.20 0.126 0.25 N/A N/A 0.028 0.06 N/A N/A

% CV N/A N/A 2.4% 2.4% 12.5% 12.2% 8.2% 8.2% 8.1% 8.2% 5.3% 5.1% N/A N/A 5.8% 5.8% N/A N/A Total

(inter-ensaio)2

DP

0.012 0.03 0.078 0.13 0.068 0.15 0.104 0.25 0.082 0.15 0.111 0.34 N/A N/A 0.028 0.04 0.056 0.23

% CV N/A N/A 20.0% 15.8% 10.5% 11.1% 12.5% 14.3% 7.1% 6.2% 4.7% 6.8% N/A N/A 5.8% 4.1% 3.4% 6.6%

N/A = não aplicável 1

NCCLS EP5-A, Vol. 19, N.º 2, Página 24, Equação (C2) 2

NCCLS EP5-A, Vol. 19, N.º 2, Página 25, Equação (C3) e Equação (C4) b) Reprodutibilidade com LBA

(15)

15 Tabela 5

Resumo combinado dos centros Resumo Negativo Altamente negativa Fracamente Positiva Medianamente positiva Controlo positivo Controlo negativo N = 60 N = 60 N = 60 N = 60 N = 60 N = 60

DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice DO Índice

Média 0.121 0.29 0.214 0.50 0.375 0.88 0.575 1.35 1.580 3.72 0.047 0.11 Em cada ensaio (Intra-ensaio)

DP N/A N/A 0.037 0.103 0.035 0.078 0.029 0.067 0.111 0.265 N/A N/A

%

CV N/A N/A 7.4% 20.5% 9.3% 8.9% 5.0% 5.0% 7.0% 7.1% N/A N/A

Total (Inter-ensaio)

DP N/A N/A 0.042 0.095 0.061 0.122 0.070 0.138 0.190 0.438 N/A N/A

%

CV N/A N/A 19.6% 18.9% 16.2% 13.9% 12.2% 10.2% 12.0% 11.8% N/A N/A

B. REACTIVIDADE CRUZADA

Um estudo destinado a avaliar o efeito de condições médicas potencialmente interferentes não relacionadas com a Aspergilose Invasiva, foi realizado com um lote do kit Platelia™ Aspergillus Ag. As amostras de soro seguintes foram testadas, em termos de reactividade cruzada, com o Platelia™ Aspergillus Ag. Foram testados um total de 151 soros.

Tabela 6

Patologia N.º de amostras testadas N.º de amostras positivas

Factor reumatóide 10 0

Antigénio antinuclear positivo 10 0

Hipergamaglobulinemia IgG 10 0

Hipergamaglobulinemia IgM 10 0

Cancro* 11 0

Cirrose não viral (biliar primária;induzida pelo álcool;

induzida por fármacos) _{10 0}

Transfusões múltiplas 10 0 Mulheres multíparas 10 0 VHA 10 0 VHC 10 0 Rubéola 10 0 CMV 10 0 Sífilis (RPR+) 10 0 Toxoplasmose 10 0 Micoplasma 10 0

* Uma amostra de cada um dos seguintes tipos de cancro: bexiga, mama (2), cólon, endometrial, pulmão, próstata, renal e de células escamosas (3).

C. Ensaio clínico

ESTUDOS CLÍNICOS NA AMÉRICA DO NORTE I. AMOSTRAS DE SORO

Conduziram-se ensaios clínicos destinados a avaliar a sensibilidade, especificidade e valor de previsão do Platelia™ Aspergillus Ag em doentes pediátricos (idade ≤ 21 anos), em três centros localizados nos EUA, e em doentes adultos, em três centros localizados na América do Norte. Os estudos foram conduzidos utilizando um total de 1954 amostras de soro obtidas a partir de 129 doentes pediátricos, e um total de 1724 amostras de soro recolhidas de 172 doentes adultos, pertencentes às seguintes populações*:

 Doentes sem sinais de Aspergilose Invasiva (doentes de controlo)  Doentes com Aspergilose Invasiva Provável

 Doentes com Aspergilose Invasiva Comprovada

(16)

16 SENSIBILIDADE

A. Doentes pediátricos

Os resultados deste estudo foram analisados em termos de sensibilidade do doente. O teste da sensibilidade foi conduzido utilizando o Platelia™ Aspergillus Ag em três centros, num total combinado de 17 doentes pediátricos imunocomprometidos, diagnosticados com Aspergilose Invasiva Provável ou Comprovada.

Tabela 7

Diagnóstico Número de doentes Sensibilidade Intervalo de confiança a 95%

Aspergilose Comprovada 9 44.4% (4/9) 18.9-73.3%

Aspergilose Provável 8 62.5% (5/8) 30.6-86.3%

Aspergilose Comprovada e Provável

combinadas 17* 52.9% (9/17) 31.0-73.8%

*Nota: 8 dos 17 doentes apresentaram resultados negativos para o antigénio galactomanano do Aspergillus . Todos os 8 doentes com resultados negativos para o antigénio galactomanano do Aspergillus tinham recebido terapêutica com vários agentes antifúngicos. A utilização concomitante de

terapêutica antifúngica contra bolores activos em alguns doentes com Aspergilose Invasiva pode resultar na diminuição da sensibilidade31.

B. Adultos

O teste de sensibilidade foi conduzido utilizando o Platelia™ Aspergillus Ag em três centros, num total combinado de 29 doentes adultos submetidos a transplante da medula óssea (TMO) e com leucemia, diagnosticados com Aspergilose Invasiva Comprovada ou Provável.

Tabela 8

ESPECIFICIDADE A. Doentes pediátricos

Especificidade por doentes pediátricos

O teste da especificidade foi conduzido utilizando o Platelia™ Aspergillus Ag em três centros, num total combinado de 108* doentes pediátricos imunocomprometidos, sem sinais de Aspergilose Invasiva (doentes de controlo).

Tabela 9

*Nota: foram excluídos 4 doentes com resultados positivos para o antigénio galactomanano coincidentes com terapêutica com piperacilina/tazobactam.

Especificidade por amostras pediátricas

O teste da especificidade foi conduzido utilizando o Platelia™ Aspergillus Ag em três centros, num total combinado de 1625* amostras obtidas a partir de 108 doentes pediátricos imunocomprometidos, sem sinais de Aspergilose Invasiva (doentes de controlo).

Diagnóstico Número de doentes Sensibilidade Intervalo de confiança a _95%

Aspergilose Comprovada 11 81.8% (9/11) 52.3-94.9%

Aspergilose Provável 18 77.8% (14/18) 54.8-91.0%

Aspergilose Comprovada e

Provável combinadas 29 79.3% (23/29) 61.6-90.2%

Centro Número de doentes Especificidade Intervalo de confiança a 95%

1 44 86.4 % (38/44) 73.3-93.6%

2 59 86.4 % (51/59) 75.5-93.0%

3 5 100% (5/5) 56.6-100%

(17)

17 Tabela 10

Centro Número de amostras Especificidade Intervalo de confiança a 95%

1 794 98.9% (785/794) 97.9-99.4%

2 731 97.8% (715/731) 96.5-98.6%

3 100 100% (100/100) 96.3-100%

Centros combinados 1625 98.5% (1600/1625) 97.7-99.0%

*Nota: foram excluídas 80 amostras de 4 doentes com resultados positivos para o antigénio galactomanano coincidentes com terapêutica com piperacilina/tazobactam.

B. Adultos

Especificidade por doentes adultos

O teste de especificidade foi conduzido utilizando o Platelia™ Aspergillus Ag em três centros, num total combinado de 143 doentes adultos submetidos a transplante da medula óssea (TMO) e com leucemia, sem sinais de Aspergilose Invasiva (doentes de controlo).

Tabela 11

Especificidade por amostras de adultos

O teste de especificidade foi conduzido utilizando o Platelia™ Aspergillus Ag em três centros, num total combinado de 1262 amostras obtidas de 143 doentes adultos submetidos a transplante da medula óssea (TMO) e com leucemia, sem sinais de Aspergilose Invasiva (doentes de controlo).

Tabela 12

VALORES INDICATIVOS

Analisaram-se os valores indicativos, positivos e negativos, para a população de doentes abrangida neste estudo. Com base na média real de 13,6% da taxa de prevalência nos doentes pediátricos e de 16,9% da taxa de prevalência nos adultos, observadas neste estudo, os valores indicativos, positivos e negativos, foram calculados da seguinte forma:

A. Doentes pediátricos

13,6% de prevalência no estudo

Valor indicativo positivo: 39.1% Intervalo de confiança a 95%: 22.2-59.2% Valor indicativo negativo: 92.2% Intervalo de confiança a 95%: 85.3-96.0%

B. Adultos

16,9% de prevalência no estudo

A prevalência esperada de Aspergilose Invasiva varia com a população de doentes; foram reportadas taxas de 5 a 20%10, 24_.

Para as populações de doentes situadas na extremidade inferior da prevalência publicada, as prevalências positiva e negativa foram recalculadas utilizando uma taxa de prevalência de 5%.

Centro Número de doentes Especificidade Intervalo de confiança a _95%

1 28 78.6% (22/28) 60.5-89.8%

2 77 93.4% (71/77) 84.0-96.4%

3 38 89.5% (34/38) 75.9-95.8%

Centros combinados 143 88.8% (127/143) 82.6-93.0%

Centro Número de amostras Especificidade Intervalo de confiança a 95%

1 349 98.0% (342/349) 95.9-99.0%

2 560 98.6% (552/560) 97.2-99.3%

3 353 98.9% (349/353) 97.1-99.6%

(18)

18 A. Doentes pediátricos

Prevalência calculada de 5%

B. Adultos

Prevalência calculada de 5%

II. AMOSTRAS DE LBA - CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO

A sensibilidade e especificidade do Platelia™ Aspergillus Ag com amostras de LBA foram avaliadas em dois estudos realizados nos EUA, envolvendo 116 amostras de 62 receptores de transplantes de órgãos sólidos e 333 amostras de 116 receptores de transplantes pulmonares e um estudo fora dos Estados Unidos em 99 amostras de 99 pacientes de alto risco de hematologia com e sem Aspergilose Invasiva.

A. SENSIBILIDADE

A sensibilidade foi avaliada em receptores de transplantes de órgãos sólidos e em receptores de transplantes pulmonares, diagnosticados com Aspergilose Invasiva de acordo com os critérios EORTC/MSG.

I. Receptores de transplantes de órgãos sólidos com Aspergilose Invasiva

De um total de 116 amostras de 62 receptores de transplantes de órgãos sólidos envolvidos num estudo, a sensibilidade foi avaliada em 5 receptores diagnosticados com Aspergilose Invasiva, conforme indicado na tabela seguinte.

Tabela 13

Sensibilidade com Platelia™ Aspergillus Ag

Aspergilose Invasiva Comprovada ou Provável em receptores de transplantes de órgãos sólidos, por doente

Diagnóstico N Índice ≥ 0,5 Sensibilidade Intervalo de confiança a 95% Aspergilose Comprovada 2 2 2/2 (100%) 34.2 - 100% Aspergilose Provável 3 3 3/3 (100%) 43.8 - 100% Aspergilose Comprovada e Provável combinadas 5 5 5/5 (100%) 56.5 - 100% Tabela 14

Aspergilose Invasiva Comprovada ou Provável em receptores de transplantes de órgãos sólidos, por tipo de transplante

II. Receptores de transplantes pulmonares com Aspergilose Invasiva

De um total de 333 amostras de 116 receptores de transplantes pulmonares envolvidos num outro estudo, a sensibilidade foi avaliada em 6 receptores diagnosticados com Aspergilose Invasiva, conforme indicado na tabela seguinte.

Tabela 15

Aspergilose Invasiva Comprovada ou Provável em receptores de transplantes pulmonares, por doente

III. Pacientes com doenças hematológicas com Aspergilose Invasiva

A sensibilidade também foi avaliada num terceiro estudo em 58 amostras de 58 pacientes com doença hematológica diagnosticados com Aspergilose Invasiva, como mostra a tabela abaixo. No estudo uma análise retrospectiva foi realizada em amostras de LBA de pacientes com alto risco de doença hematológica usando o Platelia ™ Aspergillus Ag. Os resultados deste estudo foram publicados conforme abaixo e foram avaliados para estabelecer as características de desempenho do Platelia ™ Aspergillus Ag em 29 amostras de LBA29.

Tipo de transplante N Índice ≥ 0,5 Sensibilidade Intervalo de confiança a 95%

Coração 1 1 1/1 (100%) 20.6 - 100%

Rim 3 3 3/3 (100%) 43.8 - 100%

Fígado 1 1 1/1 (100%) 20.6 - 100%

Total 5 5 5/5 (100%) 56.5 - 100%

Diagnóstico N Índice ≥ 0,5 Sensibilidade Intervalo de confiança a 95%

Aspergilose Comprovada 2 1 1/2 (50.0%) 9.4 - 90.6%

Aspergilose Provável 4 3 3/4 (75.0%) 30.0 - 96.4%

(19)

19 Tabela 16

Comprovada ou provável Aspergilose Invasiva em pacientes com doença hematológica

B. ESPECIFICIDADE

A especificidade foi avaliada num total de 98 amostras de LBA, obtidas de 57 receptores de transplantes de órgãos sólidos e 305 amostras de LBA de 110 receptores de transplantes pulmonares, sem Aspergilose Invasiva, sendo indicada na tabela seguinte. Os resultados são apresentados por amostras de receptores de transplantes com e sem colonização por fungos. Tabela 17

Especificidade por amostra

População combinada de receptores de transplantes de órgãos sólidos e de transplantes pulmonares sem Aspergilose Invasiva N = 403 amostras de LBA

A especificidade nas amostras de LBA dos receptores combinados de transplantes de órgãos sólidos e pulmonares, sem Aspergilose Invasiva, é apresentada por tipo de transplante na tabela 18 abaixo.

Tabela 18

População combinada de receptores de transplantes de órgãos sólidos e de transplantes pulmonares sem Aspergilose Invasiva, por tipo de transplante

N = 403 amostras de LBA

A especificidade também foi avaliada num total de 41 amostras de LBA de 41 pacientes com doença hematológica sem Aspergilose Invasiva e é mostrada na tabela abaixo.

Tabela 19

Doentes com doença hematológica sem Aspergilose Invasiva N = 41

Diagnóstico N Índice ≥ 0.5 Sensibilidade Intervalo de confiança a _95%

Aspergilose Comprovada 31 31 31/31 (100%) 89.0 - 100%

Aspergilose Provável 27 26 26/27 (96.3%) 81.7 - 99.3%

combinadas 58 57 57/58 (98.3%) 90.8 - 99.7%

Diagnóstico N Índice _{< 0.5} Negativo (%) _{confiança a 95%}Intervalo de

Controlos sem colonização 341 330 330/341 (96.8%) 94.3 - 98.2%

Controlos com colonização 62 50 50/62 (80.6%) 69.1 - 88.6%

Total dos controlos 403 380 380/403 (94.3%) 91.6 - 96.2%

Tipo de transplante N Índice _{< 0.5} Negativo (%) Intervalo de confiança a 95%

Coração 28 25 25/28 (89.3%) 72.8 - 96.3%

Rim 25 22 22/25 (88.0%) 70.0 - 95.8%

Fígado 23 22 22/23 (95.7%) 79.0 - 99.2%

Pulmão 327 311 311/327 (95.1%) 92.2 - 97.0%

Total dos controlos 403 380 380/403 (94.3%) 91.6 - 96.2%

Diagnóstico N Índice _{< 0.5} Negativo (%) _{confiança a 95%}Intervalo de