Extração e Isolamento do DNA

Extração e Isolamento do DNA

Ana Monteiro, Carolina Costa e Joana Sabino

Introdução:

O DNA (ácido desoxirribonucleico) é um composto orgânico constituído por monómeros denominados nucleótidos, sendo cada um deles formado por um grupo fosfato, uma base azotada e um monossacarídeo (desoxirribose).

Enquanto que nas células procarióticas o DNA se encontra disperso no citoplasma, constituindo o nucleóide, nas células eucarióticas este localiza-se no interior do núcleo.

Na sua estrutura a molécula de DNA é constituída por duas cadeias nucleotídicas antiparalelas unidas por ligações de hidrogénio nas bases azotadas. Como estas ligações possuem o mesmo comprimento a molécula forma uma dupla hélice.

Sendo o DNA a molécula responsável pela manutenção da vida, visto que intervém na síntese proteica e é responsável pelo armazenamento e transmissão da informação genética, o conhecimento da sua composição química e da sua estrutura permitiu grandes avanços a nível da Biologia molecular e da Genética.

A extração e isolamento do DNA permite a identificação visual da estrutura da molécula pela sua observação in vitro e a comprovação da localização desta na célula, devido aos procedimentos aplicados

.

Método:

B

anana

Cortar e Macerar no almofariz com o pilão Adicionar 100 ml de H₂O, 2 colheres de chá de detergente e 3 g de NaCl Macerar até homogeneizar Transferir através do coador para os funis dos

dispositivos de filtração Dispositivo de filtração 1 Dispositivo de filtração 2 Filtrar até obter 5mL Filtrar até obter 20mL Transferir para tubo de centrífuga Adicionar álcool a 5ºC até 1 cm da extremidade

Cobrir o tubo com parafilme e inverter 2 a 3 vezes Centrifugar a 5000 rpm durante 5 min. Adicionar 20 mL de álcool frio Deixar repousar até se observar a “medusa” de DNA Adicionar 2 a 5 gotas de fucsina básica Registar o resultado Registar o resultado

Observar durante 1 min. e registar.

Observar e registar.

Resultados:

Após se adicionarem 20 ml de álcool etílico frio ao conteúdo da proveta, observou-se a precipitação e sucessiva ascensão das moléculas de DNA, sob a forma de uma camada gelatinosa de forma irregular. Este foi depois corado com fucsina básica (2-5 gotas), adquirindo um tom rosa avermelhado, tornando-se assim mais fácil examinar a sua posição na proveta (entre os de 25 ml e 35 ml) encontrando-se na zona superior do álcool etílico.

• Proveta de 50 mL:

5 gotas de fucsina 2 gotas de fucsina

• Proveta de 10 mL:

Ao examinar o filtrado contido no tubo após a centrifugação do mesmo a 5000 rpm durante 5 minutos, foi possível notar um aglomerado de DNA (com uma forma alongada e cerca de 5 centímetros) disperso pela parede do tubo (fig.2).

Após o tubo de centrífuga ter sido tapado com parafilme e invertido 2 a 3 vezes (fig.1), observou-se a precipitação das moléculas de DNA ao longo de todo o tubo, não existindo nenhum aglomerado em particular.

No início do procedimento, tivemos que recorrer à maceração da banana, de forma a isolar as células, destruindo os tecidos. Durante este processo foi adicionado detergente da loiça para reduzir a tensão superficial, levando à dispersão dos fosfolípidos que constituem a membrana celular e a membrana nuclear, que delimita o núcleo, no interior do qual se encontra o DNA. Foi ainda adicionado cloreto de sódio, que permitiu neutralizar o DNA, para que não houvesse repulsão entre as suas moléculas, uma vez que estas possuem na parte externa da hélice o grupo fosfato dos nucleótidos que lhes confere uma carga elétrica negativa.

De seguida, realizamos a filtração em dois dispositivos, de modo a separar as moléculas de DNA (de menor dimensão), dissolvidas no citosol, do restante conteúdo celular.

No dispositivo da proveta de 50 mL foi adicionado álcool frio ao filtrado, e devido à sua baixa temperatura, o DNA perdeu a solubilidade, precipitando. Como o álcool é mais denso do que as moléculas de DNA e devido à adição inicial de sal, observou-se a ascensão de um aglomerado de DNA.

Posteriormente, foi adicionada fucsina básica, ocorrendo reacções acido-base, dado que o DNA é ácido. Assim, foi possível diferenciar o DNA.

Já o filtrado do dispositivo da proveta de 10 mL, após ter sido adicionado álcool etílico a 5ºC, o tubo foi invertido e verificou-se a precipitação das moléculas de DNA por todo o tubo, não ocorrendo a sua ascensão, visto que a sua filtração ocorreu a frio (a proveta encontrava-se numa cuba de gelo), não havendo variação da temperatura no seu conteúdo. Depois recorreu-se à centrifugação, para isolar o DNA da restante solução, pela sua densidade.

A partir da observação in vitro da molécula de DNA, comprovou-se que esta é constituída por duas cadeias polinucleotídicas dispostas em hélice e que a molécula de DNA se encontra no interior do núcleo nas células eucarióticas vegetais.

Conclusão:

Dispositivo de filtração 1 Dispositivo de filtração 2 Funil revestido por papel de filtro sobre proveta de 10 mL numa cuba de gelo

Funil revestido por papel de filtro sobre proveta de 50 mL

Bibliografia:

Silva, J.; Ribeira, E.; Oliveira, O.; (2014), Desafios, Biologia e Geologia 11ºano;

Fig.1