Faculdade de Engenharia de Alimentos
MIGUEL MEIRELLES DE OLIVIERA
EFEITO DA ALTA PRESSÃO ISOSTÁTICA, HOMOGENEIZAÇÃO POR
ALTA PRESSÃO E ENZIMA TRANSGLUTAMINASE NA PRODUÇÃO
DE IOGURTE E BEBIDA LÁCTEA
“EFFECTS OF HIGH ISOSTATIC PRESSURE, HIGH PRESSURE
HOMOGENIZATION AND TRANSGLUTAMINASE ENZYME IN THE
PRODUCTION OF YOGHURT AND DAIRY BEVERAGE”
CAMPINAS – S.P. 2017
EFEITO DA ALTA PRESSÃO ISOSTÁTICA, HOMOGENEIZAÇÃO POR
ALTA PRESSÃO E ENZIMA TRANSGLUTAMINASE NA PRODUÇÃO
DE IOGURTE E BEBIDA LÁCTEA
“EFFECTS OF HIGH ISOSTATIC PRESSURE, HIGH
PRESSURE HOMOGENIZATION AND TRANSGLUTAMINASE
ENZYME IN THE PRODUCTION OF YOGHURT AND DAIRY
BEVERAGE”
Tese apresentada ao Programa à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Tecnologia de Alimentos.
Thesis presented to the School of Food Enginnering of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Food Technology. Orientador: Prof. Dr. Marcelo Cristianini
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO MIGUEL MEIRELLES DE OLIVEIRA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCELO CRISTIANINI.
CAMPINAS – S.P. 2017
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Oliveira, Miguel Meirelles de, 1989-
OL4e Efeito da alta pressão isostática, homogeneização por alta pressão e enzima transglutaminase na produção de iogurte e bebida láctea / Miguel Meirelles de Oliveira. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
Orientador: Marcelo Cristianini.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
1. Alta pressão dinâmica. 2. Alta pressão hidrostática. 3. Processos não térmicos. 4. Textura. I. Cristianini, Marcelo. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Effects of high isostatic pressure, high pressure homogenization and transglutaminase enzyme in the production of yoghurt and dairy beverage
Palavras-chave em inglês: Dynamic high pressure High hydrostatic pressure Non-thermal process Texture
Área de concentração: Tecnologia de Alimentos Titulação: Doutor em Tecnologia de Alimentos Banca examinadora:
Marcelo Cristianini [Orientador] Adriane Elisabete Antunes de Moraes Ariene Gimenes Fernandes Van Dender Hélia Harumi Sato
Leila Maria Spadoti
Data de defesa: 07-12-2017
________________________________ Prof. Dr. Marcelo Cristianini
Orientador
Universidade Estadual de Campinas – FEA
________________________________ Profa. Dra. Adriane Elisabete Antunes de
Moraes Membro Titular
Universidade Estadual de Campinas – FCA
________________________________ Dra. Ariene Gimenes Fernandes Van
Dender Membro Titular
Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL
________________________________ Profa. Dra. Hélia Harumi Sato
Membro Titular
Universidade Estadual de Campinas – FEA
________________________________ Dra. Leila Maria Spadoti
Membro Titular
Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Aos meus pais, Dedico.
contribuíram direta ou indiretamente, na vida profissional e pessoal. Com carinho, agradeço a todos.
Ao professor Dr. Marcelo Cristianini pela orientação, dedicação, companheirismo, amizade, confiança em meu trabalho e pelo apoio nas decisões profissionais e
pessoais.
A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas contribuições. Ao Departamento de Tecnologia de Alimentos pela oportunidade de realização do
projeto e ao CNPq pela bolsa concedida.
Ao secretário da SPG/FEA, Cosme Perota, pela disponibilidade e auxílios diversos. Aos amigos do laboratório de Tecnologias Emergentes (“os high pressure”; Alline, Ana Laura, Bruno, Bruna, Leandro, Luma e Thiago) pelos cafezinhos após o almoço,
auxílios profissionais e momentos de descontração.
Aos técnicos de laboratório, Juliana, Zé Roberto, Ana Koon e Ana Maria, pelos auxílios nas realizações das análises, e excelente assessoria administrativa. À Leila
e Sandra pela disponibilidade e atenção, e aos demais assistentes de laboratório. Aos amigos de república e também high pressure, Leandro e Bruno pelo apoio,
incentivo e cooperação.
À Diana pelo carinho, conselhos e principalmente por deixar meus dias mais leves e felizes.
À Kazumi, Mária, Ludmilla, Karina e Sebastian, pela amizade e companheirismo diário nas atividades profissionais e na vida.
Ao IF-Rio Pomba e à UNICAMP, bem como aos seus professores e funcionários, pelo conhecimento sólido e base segura para minha formação acadêmica,
profissional e pessoal.
Ao CEFET e seus funcionários pelo apoio e incentivo para realizar o doutorado. A Deus, por permitir que tudo isso fosse possível.
Processo térmico (PT) é convencionalmente utilizado no processamento do leite para aumentar a consistência do iogurte e da bebida láctea. Contudo, algumas tecnologias emergentes podem ser utilizadas em substituição ao processo convencional. Dentre elas a Alta Pressão Isostática (API), Homogeneização por Alta Pressão (HAP) e, ainda o uso de enzimas como a Transglutaminase (TGase). Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito destas tecnologias no comportamento reológico de iogurte e bebida láctea. No Capítulo 2, avaliou-se a produção de iogurte feito com leite contendo diferentes concentrações de gordura (0,5%, 1,5% e 3,0%) e submetido ao PT (90°C por 5 min), API (200 MPa, 400 MPa, 600 MPa por 15 minutos e 600 MPa por 30 min) e HAP (50 MPa, 100 MPa, 150 MPa e 150 MPa com duas passagens). Para o comportamento de viscoelasticidade o processo de API (600 MPa por 15 min) foi capaz de igualar a consistência do iogurte ao PT. Para o comportamento ao fluxo as amostras submetidas à HAP (150 MPa; 1,5% e 3,0% de gordura) foram capazes de superar a viscosidade aparente do iogurte produzido por PT. Este capítulo apresenta um esquema ilustrativo (Figura 2.6) que explica os principais fenômenos envolvidos no comportamento reológico de iogurte processado por API e HAP. Para o capítulo 3, selecionaram-se as melhores condições de processo de API (600 MPa por 15 min), HAP (150 MPa) e PT (90°C por 5 min) para avaliar o efeito de cada tecnologia na atuação de TGase para a produção de iogurte elaborado com diferentes concentrações de gordura (0,5%, 1,5% e 3,0%). Os resultados mostraram que as alterações causadas na caseína pelo processo de API favoreceram a atuação da TGase, por outro lado o processo de HAP prejudicou a atuação da TGase, devido à fragmentação dos glóbulos de gordura que podem ser adsorvidos na superfície das proteínas dificultando o acesso de TGase aos resíduos de lisina e glutamina das proteínas. Desta forma, concluiu-se que para o comportamento viscoelástico o processo de API com TGase conferiu maior consistência ao iogurte, seguido do PT com TGase. Já para o comportamento ao fluxo o PT com TGase apresentou maior viscosidade aparente, com incremento de 103% quando comparado ao PT sem TGase, em seguida o iogurte com maior viscosidade aparente foi a amostra processada por API com TGase. Para avaliação da bebida láctea (Capítulo 4) realizou-se a adição de 15% e 30% de soro ao leite e
comportamento ao fluxo mostraram que a bebida láctea com 30% de soro apresentou a mesma viscosidade aparente que o iogurte fabricado com leite processado por PT, e os consumidores também não conseguiram perceber diferença sensorial em relação à textura entre esses produtos. O capítulo 5 apresenta a caracterização sensorial dos iogurtes produzidos com leite processado por alta pressão (API ou HAP) ou PT. Os resultados mostraram que os consumidores conseguiram perceber as diferenças sensoriais entre os iogurtes processados por PT e por tecnologias de alta pressão, sendo os atributos que favorecem a aceitação: homogeneidade, aroma de iogurte, sabor de iogurte e doce. Os atributos que desagradam foram grumosidade, amargor, adstringência, pegajosidade e gorduroso.
Palavras-chave: Alta pressão dinâmica, Alta pressão hidrostática, processo não térmico, textura.
yoghurt and dairy beverage. However, some emerging technologies can be used instead of the conventional process. Among them, High Isostatic Pressure (HIP), High Pressure Homogenization (HPH) and transglutaminase enzyme (TGase). In this context, the objective of the present study was to evaluate the effect of these technologies on the rheological behavior of yoghurt and dairy beverage. In Chapter 2, the evaluation of yoghurt was performed using milk with different fat concentrations (0.5%, 1.5% and 3.0%) and submitted to TP (90°C for 5 min), HIP (200 MPa, 400 MPa, 600 MPa for 15 min and 600 MPa for 30 min) and HPH (50 MPa, 100 MPa, 150 MPa and 150 MPa two pass). For the viscoelasticity behavior the HIP process (600 MPa for 15 min) was able to equal the consistency of the yoghurt processed by TP. On the other hand, for the flow behavior the HPH process (150 MPa) was also able to overcome the apparent viscosity of the yoghurt (1.5% and 3.0% fat) in relation to the TP. This chapter presents an illustrative schema (Figure 2.6) that explains the main phenomena involved in the rheological behavior of yoghurt processed by HIP and HPH. For Chapter 3, the best HIP process conditions (600 MPa for 15 min), HPH (150 MPa) and TP (90 ° C for 5 min) were selected to evaluate the effect of each technology in conjunction with TGase to produce yoghurt with different fat concentrations (0.5%, 1.5% and 3.0%). The results showed that the alterations caused in the casein by the HIP process favored the TGase activity. On the other hand, the HPH process impaired the performance of TGase, due to the fragmentation of the fat globules that can be adsorbed on the surface of the proteins making it difficult to access TGase to the lysine and glutamine residues of the proteins. Thus, it was concluded that for the viscoelastic behavior of the yoghurt produced with milk subjected to HIP process with TGase has increased the consistency of the yoghurt, followed by sample produced with milk processed with TP and TGase. For the flow behavior the yoghurt produced with milk subjected to TP with TGase had a higher apparent viscosity, with an increase of 103% when compared to TP without TGase, then the yoghurt with higher apparent viscosity was the HIP with TGase. The Chapter 4 evaluated the rheological behavior of dairy beverage (15% and 30% of serum) and
compared with yoghurt. All formulations were submitted to the HIP process (600 MPa / 15 min), HPH (150 MPa) and TP (90 ° C for 5 min). The flow behavior results showed that the dairy beverage with 30% of whey had the same apparent viscosity that yoghurt made with milk processed by TP, and consumers also failed to point sensory differences between the textures of these products. Chapter 5 presents the sensorial characterization of yoghurts produced with milk subjected to API, HAP or TP and showed that consumers can perceive the sensorial differences among the sample produced with TP and high pressure technologies, being the attributes that favor acceptance: homogeneity, yoghurt aroma, yoghurt flavor and sweet. The attributes that displeased were lumpiness, bitterness, astringency, stickiness and fatty.
Palavras-chave: High dynamic pressure, high hidrostatic pressure, non-thermal process, texture.
Figura 1.1: Estrutura da proteína e gordura em iogurte feito com leite pasteurizado (72° C / 15 s) e leite processado termicamente (95° C / 5 min).. ... 27 Figura 1.2: Número de equipamentos de API instalados no mundo e principais produtos produzidos. ... 30 Figura 1.3: Esquema de operação do equipamento de alta pressão isostática. .. 31 Figura 1.4. Esquema de operação do equipamento de homogeneização por alta pressão. ... 36 Figura 1.5: Atuação da transglutaminase na formação de ligação covalente entre glutamina e lisina. ... 40 Figure 2.1. Elastic (k′; black bars) and viscous (k″; gray bars) components of the thermal process and samples submitted to the high isostatic pressure or high pressure homogenization.. ... 74 Figure 2.2. Shear stress at 100s-1 of the thermal process and sample submitted to
the high isostatic pressure or high pressure homogenization.. ... 79 Figure 2.3. Percentage of water-holding capacity of the thermal process and sample submitted to the high isostatic pressure or high pressure homogenization..80 Figure 2.4. Percentage of denatured whey protein after thermal, high isostatic pressure or high pressure homogenization.. ... 82 Figure 2.5 Confocal micrographs of yoghurt (milk with 0.5% fat) processed by thermal, high isostatic pressure or high pressure homogenization.. ... 83 Figure 2.6. Protein and fat structure of yoghurt made with pasteurized milk, thermal processed, high isostatic pressure or high pressure homogenization.. .... 86 Figura 3.1. Componente elástico (k’; a) e viscoso (k’’; b) de iogurte feito com leite processado por processo térmico, alta pressão isostática ou homogeneização por alta pressão.. ... 106
Figura 3.2. Viscosidade aparente a 100 s-1 de iogurte feito com leite processado
termicamente, alta pressão isostática ou homogeneização por alta pressão.. ... 109 Figura 3.3. Capacidade de retenção de água (CRA) de iogurte feito com leite processado termicamente, alta pressão isostática ou homogeneização por alta pressão... 111 Figura 3.4: Microscopia confocal de iogurte (leite com 0,5% de gordura) feito com leite processado termicamente, alta pressão isostática ou homogeneização por alta pressão.. ... 112 Figura 4.1. Componente elástico (k’; a) e viscoso (k’’; b) de iogurte e bebida láctea processados termicamente, alta pressão isostática ou homogeneização por alta pressão, com transglutaminase.. ... 135 Figura 4.3. Capacidade de retenção de água de iogurte e bebida láctea processados termicamente, alta pressão isostática ou homogeneização por alta pressão, com transglutaminase.. ... 139 Figure 5.1: Frequency of citations of the descriptors for yoghurt sensory methodology using Projective Mapping (a) and Rate-all-that-apply (b).. ... 160 Figure 5.2. MFA map of Projective Mapping data representing the descriptors used to describe the sample (a) and the distribution of yoghurt samples (b)... 162 Figure 5.3. Dendrogram obtained from Hierarchical Cluster Analysis (HCA) of Projective Mapping (a) and Rate-all-that-apply (b).. ... 163 Figure 5.4. MFA map of Rate-all-that-apply data representing the descriptors used to describe the sample and (a) and the distribution of yoghurt samples (b). In this map we used only the terms descriptors that presented statistical difference and better contribute to differentiate the samples (Tukey test; P <0.05).. ... 165 Figure 5.5: Partial least squares standardized coefficients of yoghurt using acceptance data and descriptors raised from the Rate-all-that-apply methodology.168 Figure 5.6. Comparative MFA map on individual configurations of Projective Mapping and Rate-all-that-apply of yoghurt samples (a) and the descriptors (b)..170
do leite por bactérias L. bulgaricus e S. thermophilus (Adaptado de LEE; LUCEY, (2010) ... 28 Tabela 1.2: Comparação entre alta pressão isostática (API) e homogeneização por alta pressão (HAP). ... 29 Table 2.1: Thermal, high isostatic pressure or high pressure homogenization process applied in milk before to yoghurt manufacture. ... 68 Table 2.2: Mean values of the Power Law model (SAOR test) and Cason model parameters (SSSR test). ... 77 Table 2.2: Mean values of the Power Law model (SAOR test) and Cason model parameters (SSSR test). ... 78 Table 2.3: Mean values of number of pores and average pore area of yoghurt (Milk with 0.5% of fat) processed by thermal, high isostatic pressure or high pressure homogenization. ... 84 Tabela 3.1. Valor médio dos parâmetros de Lei da Potência (teste EOBA) e Casson (teste EREE) para iogurte feito com leite processsado termicamente, API e HAP. ... 107 Tabela 3.2: Valores médios do número de poros e área média do poro do iogurte (leite com 0,5% de gordura) processado termicamente, alta pressão isostática e homogeneização por alta pressão. ... 113 Tabela 4.1: Valores médios dos parâmetros do modelo de Lei da Potência obtido por EOBA e modelo de Casson obtidos por EREE para iogurte e bebida látea processados termicamente, alta pressão isostática ou homogeneização por alta pressão. ... 136 Tabela 4.2: Média das notas do teste de diferença do controle em relação à textura das amostras de iogurte e bebida láctea (30% de soro). ... 140 Tabela 4.3: Tabela de contingência mostrando os termos descritores citados pelos consumidores divididos entre Gostei (G) e Desgostei (D). ... 141
Table 5.1. Average score for the terms descriptors cited in yoghurt by the methodology Rate-All-That-Apply. ... 166 Table 5.2. Mean scores to acceptance test of yoghurt. ... 168
Introdução Geral ... 20
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica e Objetivos ... 23
1.1 Mercado de lácteos fermentados ... 24
1.2 Formação da microestrutura do iogurte e da bebida láctea ... 25
1.3 Processos de alta pressão e utilização industrial ... 26
1.3.1 Alta pressão isostática ... 28
1.3.2 Homogeneização por Alta Pressão ... 34
1.4 Efeito da transglutaminase na fabricação de iogurte e bebida láctea.. 39
1.5 Novas metodologias em análise sensorial ... 42
1.6 Objetivos ... 46
1.7 Referências ... 47
Capítulo 2. Effect of high isostatic pressure and high pressure homogenization on rheological behavior of yoghurt ... 63
2.1 Introduction ... 65
2.2 Material and methods ... 66
2.2.1 Inoculum preparation ... 66
2.2.2 Milk processing and yoghurt manufacture ... 67
2.2.3 Milk fermentation ... 69 2.2.4 Rheological analysis ... 69 2.2.5 Water-holding capacity (WHC) ... 71 2.2.6 Complementary analysis... 71 2.2.7 Statistical analysis ... 72 2.3 Results ... 72
2.3.1 Small amplitude oscillatory rheological test (SAOR) ... 72
2.3.2 Steady-state shear rheological tests (SSSR) ... 75
2.3.3 Water-holding capacity ... 79
2.3.4 Complementary analysis... 81
2.4 Discussion ... 84
2.4.2 High pressure homogenization processing ... 87
2.5 Conclusion ... 90
2.6 Acknowledgments ... 90
2.7 References ... 91
Capítulo 3. Efeito do processamento do leite por alta Pressão isostática e homogeneização por alta pressão associada à adição de transglutaminase no comportamento reológico de iogurte ... 96
3.1 Introdução ... 98
3.2 Material e métodos ... 99
3.2.1 Micro-organimos e enzimas ... 99
3.2.2 Processamento do leite e fabricação do iogurte ... 100
3.2.3 Fermentação do leite ... 101
3.2.4 Análise reológica ... 101
3.2.5 Capacidade de retenção de água (CRA) ... 103
3.2.6 Microestrutura do iogurte ... 104
3.2.7 Análise estatística ... 104
3.3 Resultados ... 105
3.3.1 Ensaio oscilatório de baixa amplitude (EOBA) ... 105
3.3.2 Ensaio reológico em estado estacionário (EREE) ... 108
3.3.3 Capacidade de retenção de água (CRA) ... 110
3.3.4 Microestrutura do iogurte ... 111
3.4 Discussão ... 113
3.4.1 Processo térmico ... 114
3.4.2 Alta Pressão Isostática (API) ... 115
3.4.3 Homogeneização por Alta Pressão (HAP) ... 117
3.5 Conclusão ... 118
3.6 Referências ... 118
Capítulo 4. Efeito do processamento de leite por alta pressão isostática e homogeneização por alta pressão associada à adição de transglutaminase no comportamento reológico de iogurte e bebida láctea ... 124
4.1 Introdução ... 126
4.2.3 Processo de fermentação ... 129
4.2.4 Análise reológica ... 130
4.2.5 Capacidade de retenção de água (CRA) ... 131
4.2.6 Análise sensorial ... 132
4.2.7 Análise estatística ... 133
4.3 Resultados ... 133
4.3.1 Ensaio oscilatório de baixa amplitude (EOBA) ... 133
4.3.2 Ensaio reológico em estado estacionário (EREE) ... 137
4.3.3 Capacidade de retenção de água (CRA) ... 138
4.3.4 Análise sensorial ... 139
4.4 Discussão ... 141
4.5 Conclusão ... 145
4.6 Referências ... 146
Capítulo 5. Sensory evaluation of yoghurt made from milk processed by high isostatic pressure and high pressure homogenization by map projective and rate-all-that-apply ... 151
5.1 Introduction ... 153
5.2 Materials and methods ... 155
5.2.1 Stirred yoghurt manufacture ... 155
5.2.2 Consumer test ... 156 5.2.3 Statistical analysis ... 157 5.3 Results ... 159 5.3.1 Projective mapping ... 159 5.3.2 Rate-all-that-apply (RATA) ... 164 5.3.3 Acceptance testing ... 167
5.3.4 Correlation between Projective Mapping and RATA ... 169
5.4 Discussion ... 169
5.4.1 Comparison between Projective Map and RATA ... 169
5.4.2 Characteristics of yoghurt processed by high pressure homogenization and high isostatic pressure ... 172
5.5 Conclusion ... 175
5.6 Acknowledgments ... 175
5.7 References ... 175
Discussão Geral ... 182
Processo térmico ... 183
Processo de Alta Pressão Isostática ... 185
Processo de Homogeneização por Alta Pressão ... 187
Avaliação sensorial ... 189
Conclusão Geral ... 191
Referências Gerais ... 194
Iogurte e bebida láctea fermentada são produtos tradicionalmente fabricados utilizando processos térmicos (85-95°C por 5-10 min), seguido de resfriamento a 43-45°C e adição das culturas láticas para fermentação. O processo térmico é utilizado objetivando a desnaturação das proteínas do soro, principalmente a β-lactoglobulina (β-lg), que agregam-se as micelas de caseína (κ-caseína) por pontes dissulfeto. No momento da formação do gel durante a fermentação (pH< 5,2), o complexo κ-casein-β-lg é responsável por limitar a aproximação das micelas de caseína por impedimento estérico, e assim aumentar a consistência do produto, reduzir a sinérese e reduzir tempo de formação do gel (ANEMA et al., 2004; LUCEY et al., 1997, 1998; LUCEY; MUNRO; SINGH, 1998).
Neste contexto, as tecnologias emergentes podem ser utilizadas para substituir ou conciliar com o processo térmico para aumentar a consistência e reduzir a sinérese de fermentados lácteos. Dentre as mais exploradas estão a Alta Pressão Isostática (API; também conhecido como alta pressão hidrostática) e Homogeneização por Alta Pressão (HAP; também conhecida como alta pressão dinâmica) (CIRON et al., 2010, 2011; HARTE et al., 2002; HERNÁNDEZ; HARTE, 2008; OLIVEIRA et al., 2014; SERRA et al., 2007, 2009). Além disso, há a possibilidade de utilizar a enzima transglutaminase para potencializar as características reológicas dos produtos lácteos fermentados (BÖNISCH et al., 2007a; SANLI et al., 2011).
No processamento por API, o leite é submetido à pressurização em um vaso seguindo o princípio isostático que garante que a pressão seja distribuída de forma uniforme e instantaneamente por todo o produto. As variáveis envolvidas neste processo são pressão (0-1000 MPa), temperatura e tempo (CONSIDINE et al., 2007; HUPPERTZ et al., 2006; LÓPEZ-FANDIÑO, 2006; TRUJILLO et al., 2002). O processo de HAP é semelhante à homogeneização utilizada na indústria láctea, porém opera sob altas pressões (até 400 MPa). O processo é baseado em bombear o leite sob alta pressão e forçar sua passagem por um estreito orifício, após a passagem ocorrerá imediata redução de pressão para a pressão atmosférica (0,1 MPa). Durante o processo de HAP ocorre aumento drástico na velocidade do fluido, gerando altas tensões de cisalhamento, turbulência e cavitação. As variáveis controladas na HAP são a
pressão (0-400 MPa) e temperatura (HAYES; KELLY, 2003a; THIEBAUD et al., 2003).
As tecnologias de API e HAP possuem a capacidade de promover as características de iogurte e bebida láctea devido às alterações nos constituintes do leite, em especial a fragmentação das caseínas, que favorecem a interação proteína-proteína (HARTE et al., 2002; HUPPERTZ et al., 2002; NEEDS et al., 2000a). Além disso, a API atua na desnaturação das proteínas do soro, contribuindo para a formação do complexo κ-casein-β-lg (HARTE et al., 2002; HUPPERTZ et al., 2002), e a HAP atua fragmentando os glóbulos de gordura aumentando a interação proteína-gordura no produto (CIRON et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2014).
Outra forma de aumentar a consistência do iogurte é a utilização da enzima transglutaminase (BÖNISCH et al., 2007a; SANLI et al., 2011). Isto ocorre porque a enzima atua na formação de ligações covalentes entre resíduos de lisina e glutamina (LOVEDAY; SARKAR; SINGH, 2013; O’SULLIVAN; KELLY; FOX, 2002), fortalecendo a rede proteica estrutural do iogurte por ligações proteína-proteína.
Apesar de existirem diversos estudos que comprovam que a API, HAP e transglutaminase aumentam a consistência e viscosidade aparente do iogurte e da bebida láctea são necessários ainda estudos comparativos entre as tecnologias para determinar qual é mais eficaz para melhorar as características reológicas.
1.1 Mercado de lácteos fermentados
O consumo de iogurte no mundo está crescendo continuamente. No período de 2012 a 2015 o consumo de iogurte aumentou 61 % no Brasil, 67 % na China, 60 % na Turquia, 48 % nos EUA e 29 % na França, sendo as principais demandas por iogurte com probiótico, natural e estilo Grego (produto de elevada consistência). Porém, para conseguir produtos com características ideais 31% dos consumidores não aceitam que sejam adicionados aditivos tecnológicos. Na Turquia e na China, 85 % dos consumidores acreditam que o consumo de iogurte está relacionado ao estímulo de vida saudável, sendo consumido em alguns países como sobremesa (87 % da população da França) e/ou consumido junto com frutas e cereais (33 % da população de vários países) (DSM, 2015).
O mercado mundial de iogurte atingiu em 2013 o faturamento de 62,3 bilhões de euros e em 2014 saltou para 65,1 bilhões de euros e há projeções para 2018 de 77,6 bilhões de euros. No Brasil, a produção de iogurte também vem crescendo, em média 400 mil toneladas por ano. Para 2020 estima-se um faturamento de 17,9 bilhões de reais (EUROMONITOR, 2015).
Segundo dados do Euromonitor (2015), o consumo de iogurte per capita anual no Brasil é de 6,5 kg, sendo considerado muito baixo quando comparado com a Holanda (42 kg), França (20,7 kg) e a Argentina (9 kg). Estes dados destacam a oportunidade e desafio para aumentar o consumo de iogurte no país. Nos últimos anos o mercado Brasileiro aderiu ao novo produto, iogurte Grego, que aumentou as vendas em 19%, correspondentes a 5,2 bilhões de reais. Em relação ao consumo de bebida láctea no Brasil, este produto está na 4° posição entre as bebidas consumidas no café da manhã e atingiu uma produção de 63 mil toneladas em 2010 e 76 mil toneladas em 2015 (DATAMARK, 2015).
Esta demanda mercadológica por produtos mais consistentes (iogurte Grego) sem aditivos e saudáveis, abre oportunidade para as tecnologias emergentes, que podem melhorar as características sensoriais dos iogurtes e bebida láctea, em especial aumentar a consistência e reduzir sinérese.
1.2 Formação da microestrutura do iogurte e da bebida láctea
Segundo o Regulamento Técnico de Identidade Qualidade de Leite Fermentado (BRASIL, 2007), iogurte é produzido pela fermentação de leite por Streptococcus salivarius sp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus devendo estes permanecer viáveis durante todo o período de comercialização (107 UFC.mL-1). Já para a bebida láctea é permitido à mistura de
leite, leite reconstituído e/ou soro de queijos (BRASIL, 2017). Este produto pode ser fermentado por bactérias lácteas até pH 4,6, conferindo características semelhantes às do iogurte (CASTRO et al., 2013a)
Para a fabricação destes produtos é essencial, após a padronização de gordura, a etapa de processo térmico (85°C a 95°C por 3 a 10 min) que tem a função de modificar as interações dos constituintes do leite para favorecer a formação do gel. Temperaturas superiores a 70° C por alguns minutos aumentam a concentração de fosfato de cálcio coloidal nas caseínas e desnaturam as proteínas do soro, em especial a β-lactoglobulina (LEE; LUCEY, 2010a; LUCEY, 2002; TAMIME; ROBINSON, 2007). A β-lactoglobulina (β-lg) desnaturada interage com a micela de caseína por pontes dissulfeto, formando o complexo κ-caseína-β-lactoglobulina (κ-caseína-β-lg). Na etapa de fermentação a produção de ácido lático neutraliza a carga negativa das caseínas gerando aproximação das mesmas (ponto isoelétrico pH 4,6). Desta forma, o complexo formado entre κ-caseína-β-lg limita a aproximação excessiva das micelas de caseína por impedimento estérico (Figura 1.1), sendo responsável por aumentar a capacidade de retenção de água, aumentar a consistência e antecipar a formação do gel (ANEMA et al., 2004; LEE; LUCEY, 2010a; LUCEY et al., 1997; TAMIME; ROBINSON, 2007). Controlar a etapa de fermentação é extremamente importante para aumentar a consistência de lácteos fermentados.
A Tabela 1.1 apresenta as principais etapas de formação do gel durante a fermentação. Destaca-se que o processo de acidificação é responsável por neutralizar as cargas negativas da caseína até o ponto isoelétrico (pH 6,7 até 4,6). Com base na aproximação lenta das micelas de caseína, é extremamente importante que o produto não seja movimentado durante toda a fermentação, principalmente quando atinge pH inferior a 5,2 (início da formação do gel), caso
contrário qualquer vibração poderá prejudicar a consistência (LEE; LUCEY, 2010a). Além disso, a temperatura de fermentação também influencia na consistência, em geral géis formados em temperaturas mais baixas (38 °C) geralmente apresentam consistência maior do que gel formado em temperaturas muito altas (44 °C), porém o tempo de coagulação será muito mais longo. Geralmente a fermentação de iogurte é feita entre 40 e 45 °C (LUCEY; SINGH, 1998). Outras causas que reduzem a consistência e aumentam a sinérese são: aquecimento excessivo do leite, rápida taxa de acidificação, concentração de sólidos (proteína ou gordura), baixa produção de ácido (pH elevado), uso de enzimas coagulantes (aumenta particularmente a sinérese) (LUCEY; SINGH, 1998)
Após a fermentação, o iogurte pode ser comercializado na forma firme (gel) ou na forma batido, já a bebida láctea fermentada é comercializada apenas na forma batida. No iogurte firme há uma distância maior entre as proteínas (impedimento estérico) o que lhe confere maior resistência ao escoamento e maior consistência (LEE; LUCEY, 2010a), já no iogurte batido o processo de quebra do gel permite uma reorganização das proteínas e maior aproximação entre as estruturas e, conseqüentemente, redução da consistência e aumento da sinérese (LEE; LUCEY, 2010a; LOVEDAY; SARKAR; SINGH, 2013; TAMIME; ROBINSON, 2007). Desta forma, o iogurte batido sempre terá menor consistência e maior tendência à sinérese do que o iogurte firme.
1.3 Processos de alta pressão e utilização industrial
Nos últimos anos, vários processos não térmicos têm sido estudados e aplicados na produção de uma larga variedade de alimentos, contribuindo para sua qualidade e segurança. Contudo, é importante destacar que o processo de alta pressão estabelece duas classes de tecnologia totalmente diferentes (HUPPERTZ et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2014), denominados alta pressão isostática (API) e homogeneização por alta pressão (HAP). A diferença entre as duas tecnologias não é amplamente conhecida pela comunidade científica e por isso a importância em divulgá-las. De forma geral, a Tabela 1.2 apresenta as principais diferenças no processamento entre as tecnologias de alta pressão.
Leite não processado Glóbulo gordura Caseína β-lactoglobulina desnaturada Características pós-processo Iogurte Pouca desnaturação de proteínas do soro1,2,3;
Pouca alteração nas micelas de caseína1,2.
Proximidade excessiva das caseínas em pH4.6. Baixa consistência e alta sinérese2. Desnaturação de proteínas, formação do complexo β-lg-κ-casein2,3,4,5. Pouca alteração no tamanho da micela2; Pouca alteração na gordura1,2. Impedimento estérico do complexo β-lg-κ-casein2,3,4,5. Alta consistência.
Figura 1.1: Estrutura da proteína e gordura em iogurte feito com leite pasteurizado (72° C / 15 s) e leite processado termicamente (95° C / 5 min). (1)Harte et al., (2002); (2)Tamime &
Robinson (1999); (3)Loveday, Sarkar & Singh (2013); (4)Lucey, Munro & Singh, (1998); (5)Lucey et al., (1997).
Em relação ao mercado o processo de API é a tecnologia não térmica emergente, com maior utilização industrial e mais de 350 equipamentos instalados no mundo, dos quais 54% na América do Norte, 25% na Europa e 12 % na Ásia. Este mercado em ascensão atingiu em 2015 o faturamento de 9,8
90° C / 5 min Pasteurização (72° C/15s)
bilhões de dólares, com a venda de produtos cárneos, frutas, lácteos e diversas bebidas. Estimativas das indústrias apostam em um faturamento de 54,77 bilhões de dólares em 2025 (Figura 1.2; HUANG et al., 2017; VISIONGAIN, 2015).
Tabela 1.1: Principais fenômenos bioquímicos durante o processo de acidificação do leite por bactérias L. bulgaricus e S. thermophilus (Adaptado de LEE; LUCEY, (2010)
pH Fenômenos bioquímicos Interações
6,7 até 6,0
Início da dissolução de fosfato de cálcio coloidal (FFC) da micela de caseína,
alteração estrutural da micela.
Repulsão eletrostática
6,0 até 5,0
FCC completamente dissolvido (pH 5,0) contribui para desestabilização da micela,
aproximação das micelas de caseína e início da formação do gel (pH ~5,2).
Repulsão eletrostática
< 5,0
Carga negativa reduzida, aumento das interações caseína-caseína até alcançar o
ponto isoelétrico (pH 4,6).
Repulsão eletrostática; Interações hidrofóbicas; Forças Van der Waal’s Por outro lado, o processo de HAP não possui ampla utilização pela indústria de alimentos, sua aplicação está mais restrita à indústria farmacêutica. No entanto, devido ao grande interesse industrial tem ocorrido o desenvolvimento de novos equipamentos com maiores capacidades de produção a pressões elevadas (>150 MPa), aumentando substancialmente a chance de aplicação industrial desta tecnologia. Aspectos tecnológicos foram revisados por Paquin, (1999) e Hayes et al., (2005).
1.3.1 Alta pressão isostática
A alta pressão isostática (API) é conhecida também como alta pressão hidrostática ou apenas processo de alta pressão. Este processo consiste em submeter o produto à alta pressão dentro de um vaso pressurizado (100 MPa a 1000 MPa) utilizando um meio que transfere a pressão ao produto (geralmente água potável). Este processo permite ainda controlar o tempo (segundos até
horas) e temperatura de processo (congelamento até elevadas temperaturas) (RENDUELES et al., 2011).
Tabela 1.2: Comparação entre alta pressão isostática (API) e homogeneização por alta pressão (HAP).
Parâmetro API HAP
Tipo de alimento Líquido/Semi-sólido/Sólido Líquido Fluxo de operação Batelada / Semi-contínuo Contínuo
Máxima pressão Até 1000 MPa Até 400 MPa
Tempo de residência
sob pressão Ilimitado (controlado pelo operador em função do objetivo do processo) Muito rápido <2 segundos (variável não controlada)
Temperatura de
processo Congelamento ou alta temperatura
Baixa temperatura (não congelado) ou alta
temperatura
Aquecimento durante
a pressurização (aquecimento adiabático) 3-8 °C a cada 100 MPa
15-25 °C a cada 100 MPa (aquecimento por
cisalhamento) Capacidade Câmaras de até 525 L; Produção de até 3.000Kg/hora Até 60.000 L/hora a 150 MPa
Envase
Produto embalado em embalagens flexíveis antes do processamento (mais
comum) ou produto sem embalagem (menos comum)
Produto embalado após o processamento
Forças físicas Compressão e descompressão Cisalhamento, cavitação, turbulência e impacto. Informações obtidas da GEA Process Engineering Ltd. (2017) e Hiperbaric (2017).
Figura 1.2: Número de equipamentos de API instalados no mundo e principais produtos produzidos (adaptado de Visiongain, 2015 citado por Huang et al., 2017).
A Figura 1.3 apresenta um esquema básico de operação do equipamento de API. Neste tipo de equipamento, o alimento já embalado é colocado na câmara de pressurização, o mesmo é fechado e abastecido com água (ou qualquer outro líquido de baixa compressibilidade) e a pressurização ocorre mediante um sistema de bombas intensificadoras de pressão. Existem outros equipamentos em que alimentos líquidos podem ser utilizados como o próprio liquido de compressão. Os processos de API são sempre em batelada, podendo ser utilizado um processo semicontínuo se forem sincronizados sistemas de vasos de pressurização em série (VOIGT; KELLY; HUPPERTZ, 2015).
Durante a pressurização não há gradiente de pressão, sendo assim todo alimento recebe a mesma intensidade de pressão, independente da geometria e tamanho do alimento, ou seja, não há risco de subprocessamento em nenhuma parte do alimento, como pode ocorrer em processos térmicos. Além disso, a
Figura 1.3: Esquema de operação do equipamento de alta pressão isostática.
pressurização é acompanhada pelo aquecimento adiabático promovido pela compressão. A taxa de aquecimento adiabático é específica para cada composto químico (por exemplo, alimentos com elevado conteúdo de água aumentam de 3-5 °C a cada 100 MPa; enquanto alimentos com elevado teor de gordura ou óleo
aumentam de 6-10 °C a cada 100 MPa), sendo dependente da pressão e da temperatura (PATAZCA; KOUTCHMA; BALASUBRAMANIAM, 2007). Durante a despressurização o ganho de temperatura adiabática é revertido completamente.
O processo de API foi inicialmente estudado para a inativação de micro-osganismos, sem a necessidade de utilizar temperaturas elevadas, e assim, manter a estabilidade dos constituintes termossensíveis (RENDUELES et al., 2011). Além disso, o produto pode ser pressurizado embalado, minimizando a ocorrência de contaminação pós-processo. Os efeitos de inativação microbiana ocorrem devido a uma série de alterações na membrana celular e nos mecanismos enzimáticos (RENDUELES et al., 2011). Contudo, durante as pesquisas com micro-organismos foi observado que ocorriam simultaneamente alterações nos constituintes dos alimentos, e diversas pesquisas foram iniciadas para melhorar a funcionalidade tecnológica dos constituintes dos alimentos, dentre eles os constituintes do leite.
1.3.1.1 Efeito da alta pressão isostática na fabricação de iogurte e bebida láctea
A API no leite para a fabricação de iogurte vem despertando atenção devido ao aumento da consistência, redução da sinérese, extensão da vida de prateleira pela inativação de micro-organismos deteriorantes e manutenção de bactérias starter vivas (SHAH et al., 2008; HARTE et al., 2002, 2003; UDABAGE et al., 2010). Essas características são potencializadas com o aumento da pressão e/ou tempo de processo (VOIGT; KELLY; HUPPERTZ, 2015).
O aumento da consistência e redução da sinérese de iogurte é obtido devido às alterações nas proteínas do leite, principalmente (i) fragmentação das micelas de caseína, que aumentam a área superficial favorecendo a interação entre as micelas (BRAVO et al., 2015; HARTE et al., 2002; LÓPEZ-FANDIÑO, 2006; NEEDS et al., 2000b; PENNA; SUBBARAO-GURRAM; BARBOSA-CÁNOVAS, 2007; UDABAGE et al., 2010), (ii) solubilização parcial de fosfato de cálcio coloidal (FCC), que favorece a desestabilização das micelas de caseína (HARTE et al., 2002; LÓPEZ-FANDIÑO, 2006; ORLIEN; BOSERUP; OLSEN, 2010) e (iii) desnaturação de β-lg causada por pressões elevadas e tempos longos formando o complexo β-lactoglobulina-κ-caseína, semelhante ao
observado em processos térmicos (BRAVO et al., 2015; HARTE et al., 2002; HERNÁNDEZ; HARTE, 2008; LÓPEZ-FANDIÑO, 2006). Essas alterações nas proteínas favorecem a dispersão da caseína e aumentam a probabilidade de interações caseína-caseína por interações eletrostáticas e hidrofóbicas (HARTE et al., 2002; LÓPEZ-FANDIÑO, 2006). Segundo Penna, Subbarao-Gurram, Barbosa-Cánovas, (2007), os iogurtes feitos com API apresentam melhor uniformidade da estrutura do produto e menos agregados de caseína que prejudicam a consistência. Esse aumento da consistência é percebido sensorialmente pelos consumidores, que atribuíram pontuações elevadas para textura e cremosidade em iogurte feito com leite processado por API (ANCOS; PILAR CANO; GÓMEZ, 2000; TRUJILLO et al., 2002).
Alguns autores publicaram estudos sobre a consistência de iogurte feito utilizando API. Em estudo realizado por Needs et al., (2000b) os autores observaram que no leite desnatado houve desnaturação de β-lactoglobulina superior a 90%, tanto no processo térmico (85°C por 20 min) quanto no processo de API (600 MPa por 5 min). Além disso, os resultados reológicos mostraram que em ensaios oscilatórios de baixa deformação o processo API apresentou consistência maior do que o processo térmico, porém sobre altas deformações o iogurte feito com API apresentou menor consistência do que o processo térmico. Outro estudo com leite desnatado (0,4% de gordura) processado por API (300 a 676 MPa por 5 min) mostrou que em testes de alta deformação, o processo de alta pressão também conferiu baixa consistência ao iogurte quando comparado ao processo térmico (85°C por 30 min). Complementar a estes estudos, Knudsen et al. (2006) verificaram que em iogurte batido o processo por API (600 MPa por 20 min) apresenta consistência inferior ao processo térmico (90° C por 30 min).
Contudo, os efeitos combinados do processo térmico e API conferiram maior consistência nas amostras de iogurte em relação aos processos executados isoladamente (HARTE et al., 2003). Esse resultado foi semelhante ao encontrado por Penna, Subbarao-Gurram, Barbosa-Cánovas, (2007), utilizando processos de API a 676 MPa por 5 min e processo térmico de 85°C por 40 min. Em estudo feito por Knudsen et al., (2006) em leite desnatado (<0,3 % de gordura), os autores verificaram consistência semelhante no iogurte batido feito utilizando os efeitos
isolados dos processos de API (400 ou 600 MPa por 20 min) ou térmico (90°C por 30 min).
Em leite com 3,6% de gordura foi relatado que processos com longos tempos (676 MPa por 30 min) foram capazes de igualar a consistência obtida com o processo térmico (85°C por 35 min), e melhorar a capacidade de retenção de água do gel. Pressões e tempos menores (193 MPa por 30 min e 676 MPa por 5 min) produziram géis de iogurte com baixa consistência (HARTE et al., 2002). Estudo feito por Anema et al., (2005) mostrou também que melhores resultados de consistência foram conferidos por processos mais longos (400 MPa por 60 ou 120 min).
Com base nos trabalhos publicados nota-se que os estudos abordam condições experimentais muito distintas entre eles (condições de processo de API: pressão, tempo e temperatura; composição do leite: teor de gordura e proteína; fortificação do leite com adição de leite em pó ou proteínas em pó; tipo do iogurte: firme ou batido; processos térmicos para a amostra controle; dentre outras), o que torna difícil determinar o efeito da API nas características reológicas do iogurte. Desta forma, estudos avaliando o tempo de processo, quantidade de gordura no leite, bem como o tipo de iogurte (firme e batido) ainda são necessários.
Além das modificações das características físicas, a API pode ser utilizada para a inativação de culturas fermentadoras de iogurte (Lactobacillus delbruecki sp. bulgaricus e Streptococcus salivarius sp. thermophilus) após a fermentação, leveduras e fungos, estendendo o prazo de comercialização em até 130 dias a 4°C (CARROLL et al., 2006). No entanto, pressões superiores a 300 MPa podem prejudicar a textura do produto (JANKOWSKA et al., 2012). Além disso, pode ser usada na seleção de bactérias probióticas baroresistentes e favorecer sua viabilidade durante a estocagem (CARROLL et al., 2004). Contudo, no Brasil não é permitido inativar a cultura lática do iogurte, devendo permanecer viável (107 UFC.mL-1) durante o prazo de comercialização (BRASIL, 2007).
1.3.2 Homogeneização por Alta Pressão
O processo de homogeneização por alta pressão (HAP), também citado na literatura como alta pressão dinâmica, baseia-se no mesmo princípio
dos homogeneizadores tradicionais, mas operam em níveis de pressão da ordem de 10 a 15 vezes superiores (400 MPa). A Figura 1.4 apresenta o sistema de HAP no qual o fluido é pressurizado por poucos segundos e forçado a passar por um orifício estreito regulado por uma válvula, o que resulta em alto gradiente de pressão em um curto período de tempo (10-4 segundos), gerando desta forma
aumento de velocidade (150 a 300 m.s-1) e aumento de temperatura (12 °C a 19
°C a cada 100 MPa, dependendo do equipamento) (BOUAOUINA et al., 2006; PEREDA et al., 2009). Após a passagem do líquido pela válvula ocorre imediata descompressão e rápida formação de bolhas (ou cavidades), que crescem no corpo do líquido, e o colapso de tais cavidades pode transmitir várias forças localizadas para as superfícies das partículas causando danos à sua estrutura (LANCIOTTI et al., 2004). Além disso, outros fenômenos físicos como turbulência, forças de impacto e cisalhamento contribuem para este efeito (BOUAOUINA et al., 2006).
Diversos estudos apontam a utilização de HAP na destruição microbiana, sendo capazes de inativar bactérias vegetativas, leveduras e fungos (CAMPOS; CRISTIANINI, 2007; PEDRAS et al., 2012; PINHO et al., 2015; TRIBST; FRANCHI; CRISTIANINI, 2008). Além desta utilização, a HAP vem sendo investigada na alteração de macromoléculas, sendo capaz de alterar sua funcionalidade. A ação sobre proteínas pode alterar sua conformação, propiciando maior susceptibilidade à proteólise (GARCÍA-RISCO et al., 2000), aumento do número de interações hidrofóbicas (GRÁCIA-JULIÁ et al., 2008; SANDRA; DALGLEISH, 2005), aumento do teor de fragmentos protéicos. (SANDRA; DALGLEISH, 2005; SERRA et al., 2008). Além disso, tem a capacidade de reduzir o tamanho de gotículas de emulsões, incluindo gordura do leite (CIRON et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2014; ZAMORA et al., 2012a). Contudo, estes efeitos geram um novo campo de estudo, uma vez que as alterações moleculares causadas por HAP podem alterar estruturalmente os alimentos (AUGUSTO; IBARZ; CRISTIANINI, 2012; ESCOBAR et al., 2011; SERRA et al., 2007). Entretanto estes efeitos possuem intensidades diferenciadas em detrimento à pressão utilizada, sendo que, quanto maior a pressão e/ou a temperatura do produto durante a homogeneização, maior o efeito (GRÁCIA-JULIÁ et al., 2008; PEREDA et al., 2009).
Figura 1.4. Esquema de operação do equipamento de homogeneização por alta pressão.
1.3.2.1 Efeito da homogeneização por alta pressão na fabricação de iogurte e bebida láctea
A HAP tem sido amplamente estudada na modificação da textura de iogurte e lácteos fermentados, extensão do shelf-life e melhoria de diversas outras características, tais como, retenção de água, textura, viscosidade, densidade do gel e redução de pós-acidificação (GRÁCIA-JULIÁ et al., 2008; HAYES; FOX; KELLY, 2005; PATRIGNANI et al., 2007; SERRA et al., 2009). Esses fatores contribuem para o interesse das indústrias em eliminar o uso de amido, pectina, gelatina e /ou misturas desses estabilizadores (MASSON et al., 2011; TAMIME; ROBINSON, 2007), seguindo a tendência para a elaboração de alimentos funcionais de alta qualidade e redução de custos.
O aumento na consistência do iogurte feito com leite processado por HAP pode ser conferido por duas alterações principais que ocorrem na proteína (i) fragmentação parcial da micela (CIRON et al., 2010; ROACH; HARTE, 2008; SANDRA; DALGLEISH, 2005) e (ii) solubilização de FCC (ROACH; HARTE, 2008; SANDRA; DALGLEISH, 2005). Essas alterações aumentam a superfície total das micelas de caseína e favorecem as interações entre caseína-caseína durante a formação do gel por interações hidrofóbicas e eletrostáticas (CIRON et al., 2010; SERRA et al., 2007, 2009). Porém é importante destacar que na HAP há pouca desnaturação das proteínas do soro, em especial a β-lactoglobulina (DUMAY et al., 2013; GRÁCIA-JULIÁ et al., 2008; SERRA et al., 2008, 2009), com desnaturação inferior a 10 % a 150 MPa (Capítulo 2).
Além das alterações causadas na proteína, a gordura do leite quando submetida ao processo por HAP também desempenha função importante na formação da estrutura do iogurte. Os glóbulos de gordura quando processados por HAP sofrem intensa fragmentação e são adsorvidas na superfície hidrofóbica das proteínas do leite, incorporando de forma mais efetiva a gordura na estrutura proteica do iogurte (CIRON et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2014; ZAMORA et al., 2012b).
Alguns estudos na literatura indicam o aumento da consistência do iogurte firme ou batido feito com leite processado por HAP. Serra et al., (2007) processaram leite (3,5% de gordura) a 100 MPa, 200 MPa e 300 MPa (30 e 40 °C) e relataram que a taxa de agregação do gel não diferiu entre as amostras, porém a firmeza do iogurte firme feito com leite processado a 200 MPa e 300 MPa apresentou resultados superiores quando comparado com iogurte feito pelo método convencional (90 °C por 90 segundos), além de redução na sinérese. Em continuação ao trabalho anterior, Serra et al. (2008) avaliaram a consistência de iogurte desnatado (<0.1% de gordura) feito com leite processado a 100 MPa, 200 MPa e 300 MPa (30 °C) e concluíram que a firmeza do gel foi inferior à do gel obtido com leite submetido ao processo térmico (90° C por 90 s). A diferença entre os dois estudos foi basicamente a quantidade de gordura no leite (3,0 e 0,5%), evidenciando a participação da gordura na estrutura do iogurte (interação proteína-gordura e proteína-proteína). Além disso, mostra que a baixa
desnaturação de β-lactoglobulina prejudicou a firmeza do gel sem gordura (13% a 100 MPa, 20% a 200 MPa, e 25% a 300 MPa; Serra et al., 2008).
Estes efeitos causados pela HAP são reforçados por Ciron et al., (2010) que avaliou iogurte batido elaborado com leite contendo 0 % e 1,5 % de gordura e submetidos a 150 MPa (60° C). Os autores verificaram que o iogurte com 1,5% de gordura apresentou consistência igual ao do obtido por processo térmico (95° C por 2 min) enquanto o iogurte desnatado apresentou uma consistência inferior.
Outro resultado importante, publicado por Serra et al. (2008), foi a taxa de agregação do gel em leite desnatado, que foi 54% mais rápida na amostra processada a 300 MPa do que no processo térmico (90° C por 90s). Os autores justificaram este resultado devido à parcial fragmentação da micela de caseína e solubilização de fosfato de cálcio coloidal, que aumenta a superfície total das micelas e aumenta a susceptibilidade das interações entre as proteínas. Outros estudos também reportaram a redução da micela de caseína e solubilização de fosfato de cálcio coloidal após processo por HAP superior a 100 MPa (CIRON et al., 2010; ROACH; HARTE, 2008; SANDRA; DALGLEISH, 2005). Contudo, alguns trabalhos relatam que essa maior susceptibilidade à agregação proteica favorece a presença de grumos quando são utilizadas pressões superiores a 200 MPa e temperaturas elevadas (>60° C), especialmente em leite com baixo teor de gordura (CIRON et al., 2010; SERRA et al., 2009). Desta forma, para leite desnatado são recomendados processos com pressões inferiores a 200 MPa (MASSON et al., 2011; SERRA et al., 2009).
Para aumentar a consistência de iogurte feito com leite desnatado Hernández e Harte (2008) sugerem a aplicação simultânea do processo térmico seguida de HAP (200 MPa a 350 MPa). Neste trabalho os autores avaliaram a consistência do gel ácido feito com leite desnatado coagulado com glucono-δ-lactona e concluíram que o processo térmico em sinergia com o processo por HAP (processo térmico seguido de HAP; ou HAP seguido de processo térmico) apresentaram consistência superior ao controle (térmico 90° C por 5 min).
Na avaliação comparativa entre iogurte firme e batido com 3,5% de gordura realizada por Serra et al., (2009) os autores mostraram que a HAP (200
MPa e 300 MPa) é eficiente apenas para o iogurte batido. No iogurte firme a consistência apresentada foi inferior ao processo térmico (90° C por 90s).
Contudo, para esta tecnologia também há divergência nas condições dos experimentos descritos na literatura (condições de processo de HAP: pressão e temperatura; composição do leite: teor de gordura e proteína; fortificação do leite com adição de leite em pó; tipo do iogurte: firme ou batido; dentre outras), tornando necessário realizar experimentos controlando essas variações para compreender melhor o efeito da HAP em comparação a outros processos, entre eles a API.
1.4 Efeito da transglutaminase na fabricação de iogurte e bebida láctea A enzima transglutaminase (TGase) catalisa a formação de ligações covalentes entre aminas primárias, tais como lisina e grupo carboxiamida do resíduo de glutamina de proteínas (Figura 1.5). Desta forma, esta enzima pode atuar formando ligações intermoleculares entre proteínas e estabilizar a estrutura do iogurte e da bebida láctea (GERRARD et al., 2012).
O uso da TGase para melhorar a consistência dos alimentos iniciou em 1980. Possui sua utilização liberada pela União Européia (EU regulation 1332/2008) e considerada como GRAS (generally recognised as safe) pelos Estados Unidos da América. No Brasil, é comum o uso desta enzima em produtos cárneos, auxiliando na reestruturação de produtos, aumento da capacidade de reter água e melhora do fatiamento. O principal fornecedor da enzima é a Ajinomoto® e detentora de diversas patentes sobre a produção e utilização
(MOTOKI et al., 1989).
Contudo, diversas pesquisas comprovam benefícios da utilização de TGase em derivados lácteos (JAROS et al., 2006) como queijos (BÖNISCH; HEIDEBACH; KULOZIK, 2008; DE SÁ; BORDIGNON-LUIZ, 2010), iogurte (BÖNISCH et al., 2007a; ERCILI-CURA et al., 2013; GUYOT; KULOZIK, 2011; SANLI et al., 2011; TSEVDOU; ELEFTHERIOU; TAOUKIS, 2013) e bebida láctea (GAUCHE et al., 2009). Os derivados lácteos são estruturados basicamente por interações entre caseínas, e a TGase possui excelente atuação sobre estas
proteínas. Esta elevada atuação na caseína é atribuída pela sua estrutura mais aberta, flexível e com resíduos de lisina e glutamina facilmente acessíveis (JAROS; ROHM, 2011). Porém a susceptibilidade de atuação da TGase pode ser alterada dependendo da temperatura, pH e concentração de cálcio, sendo que o aumento da temperatura ou cálcio melhora a atuação da TGase e a redução do pH prejudica a atuação (HINZ; HUPPERTZ; KELLY, 2012).
Figura 1.5: Atuação da transglutaminase na formação de ligação covalente entre glutamina e lisina (Adaptado de BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2012).
A TGase é estudada no aumento da consistência e redução da sinérese em iogurte e bebida láctea e pode ser utilizada de duas formas. A primeira forma é incubar a enzima (40 °C a 43 °C por 120 a 180 min) antes do processo térmico para fabricação do iogurte (85°C a 95°C por 3 a 10 min), no qual a enzima será posteriormente inativada e não terá atividade durante a fermentação das bactérias do ácido láctico (BÖNISCH et al., 2007a; LAUBER; HENLE; KLOSTERMEYER, 2000; LORENZEN et al., 2002; OZER et al., 2007). Contudo, neste procedimento cuidados devem ser tomados para evitar o desenvolvimento de micro-organismos indesejáveis durante o período de
incubação da enzima TGase. Outra forma de utilizar a TGase é adicioná-la juntamente com a cultura de bactérias do ácido láctico, neste caso a atividade da TGase será reduzida gradativamente durante a acidificação, sendo que a enzima não altera a cinética de fermentação das culturas de iogurte (BÖNISCH et al., 2007a, 2007b; ERCILI-CURA et al., 2013; LORENZEN et al., 2002). Considerando que na fermentação de iogurte o pH 5 é alcançado acima de 180 min de fermentação há tempo hábil para a atuação da TGase, e em pH inferior a 5 há perda considerável da atividade enzimática (BÖNISCH et al., 2007b).
A atividade residual da TGase foi avaliada por Bönisch et al., (2007b) após manutenção da enzima por 120 min a 40°C em pH 5 obteve atividade residual inferior a 8%, sendo que em pH < 4 a enzima sofreu perda irreversível de atividade. Considerando as características de fermentação do iogurte com temperatura entre 40 a 43° C e taxa de redução do pH entre 5 e 4,6 em aproximadamente 120 minutos, estima-se que há perda considerável de atividade da TGase durante o final da etapa de fermentação. Além disso, a temperatura ótima de atividade da TGase é 40°C e o iogurte é armazenado a 5° C, ratificando a redução ainda maior da atividade da enzima. Contudo é consensual que a adição da TGase em conjunto com a cultura starter melhora a capacidade de retenção de água e a consistência do gel (BÖNISCH et al., 2007b; SANLI et al., 2011). Porém, a adição de TGase, tanto antes da fermentação quanto em conjunto com a cultura de iogurte, contribui para o surgimento de característica grumosa do produto, provavelmente conferida pelas ligações covalentes entre proteína-proteína (LORENZEN et al., 2002).
Em estudo realizado por Sanli et al., (2011) na avaliação de iogurte firme com 3,0% de gordura, houve aumento da viscosidade em 72% quando a TGase foi utilizada em conjunto com a cultura de iogurte. Quando a enzima foi adicionada antes da fermentação (incubação por 1 hora a 50°C) houve aumento da viscosidade de 76%, não havendo, praticamente, diferença entre as duas formas de utilização da TGase. Já o teor de gordura influencia atividade da enzima, conforme demonstrado por Lorenzen et al., (2002), no qual o uso da TGase em iogurte com 1,5% de gordura aumentou a força do gel em 68% e reduziu a sinérese em 33%, em iogurte com 3,0% de gordura o aumento da consistência foi de 28% e a redução da sinérese de 15%. Com relação à
quantidade de proteína, não há acréscimo significativo na consistência do iogurte com adição de proteína de 3,0% até 3,75%, não justificando a fortificação do leite (TSEVDOU; ELEFTHERIOU; TAOUKIS, 2013).
Estudos utilizando API mostraram que amostras pressurizadas favorecem a atuação da TGase, aumentando a consistência e reduzindo a sinérese de iogurte firme, quando comparada a amostra processada termicamente adicionada de TGase (ANEMA et al., 2005; TSEVDOU; ELEFTHERIOU; TAOUKIS, 2013). Comparando as amostras de iogurte processadas termicamente com TGase e amostras processadas por API com TGase, Anema et al. (2005) verificaram aumento de 90% na consistência quando foi utilizado API (400 MPa/ 120min a 40°C) e Tsevdou et al. (2013), verificaram aumento de 62% na consistência do iogurte quando foi utilizado API (600MPa/10min a 55 °C). Este resultado é explicado pelas alterações causadas na caseína, como fragmentação parcial e solubilização de FCC (seção 1.3.1.1 desta tese). Contudo, não são relatados na literatura a utilização de TGase em leite processado por HAP na fabricação de iogurte.
De forma geral, diversos estudos comprovam o efeito sinergético do processo térmico (desnaturação de β-lactoglobulina) e adição de TGase (ligação covalente entre proteína-proteína) para aumentar a consistência de iogurte e reduzir a sinérese (ANEMA et al., 2005; BÖNISCH et al., 2007a, 2007b; ERCILI-CURA et al., 2013; LAUBER; HENLE; KLOSTERMEYER, 2000; LORENZEN et al., 2002; SANLI et al., 2011). Esses resultados são obtidos pelo arranjo estrutural estável promovido pela enzima que contribui para uma microestrutura mais homogênea e com poros reduzidos, minimizando a reorganização estrutural durante a estocagem (ERCILI-CURA et al., 2013).
1.5 Novas metodologias em análise sensorial
Para o desenvolvimento de novos produtos ou inserção de novas tecnologias no processamento de alimentos é extremamente necessário conhecer as características sensoriais (CHOLLET et al., 2011). Por isso, é importante conhecer os termos descritores dos produtos e correlacioná-los com dados de
aceitação. Para isto, geralmente é aplicado um teste descritivo e um teste afetivo (GOMES et al., 2014).
Os testes afetivos são realizados com consumidores não treinados e habituados ao consumo do produto, obtendo respostas do quanto gostou ou desgostou da aparência, aroma, textura, sabor, dentre outros (Stone & Sidel, 2004). Paralelamente, realiza-se um teste descritivo utilizando técnicas de perfil sensorial para determinar quantitativamente os termos descritores do produto, geralmente utiliza-se o método Análise Descritiva Quantitativa (ADQ) (ALLGEYER; MILLER; LEE, 2010; CADENA et al., 2012; GONZALEZ; ADHIKARI; SANCHO-MADRIZ, 2011). O método ADQ utiliza assessores treinados e por isso apresenta alta precisão na quantificação dos termos descritores. Porém, a etapa de seleção e treinamento dos assessores torna essa metodologia demorada e cansativa, o que dificulta sua utilização pela indústria, principalmente de pequeno porte. Além disso, é comum a equipe treinada avaliar termos descritores que o consumidor não consegue detectar, e por isso podem não influenciar a aceitação do produto (BRUZZONE, ARES, & GIMÉNEZ, 2012).
Para facilitar a etapa de caracterização dos termos descritores existem metodologias mais rápidas que utilizam consumidores habituados ao consumo do produto para efetuar o levantamento de termos descritores (CADENA et al., 2014). Segundo Dooley, Lee e Meullenet (2010), usando a metodologia Check-all-that-apply (CATA) com consumidores foi possível obter resultados mais simplificados (13 termos descritores) do que com assessores treinado por ADQ (23 termos descritores). Albert et al., (2011) também obtiveram boa correlação entre o ADQ e Mapa Projetivo sugerindo a possibilidade de substituir o método tradicional.
Diversas metodologias foram estudadas e tiveram sua eficácia atestada, como: CATA (CADENA et al., 2014; CRUZ et al., 2013; DOOLEY; LEE; MEULLENET, 2010; PARENTE; MANZONI; ARES, 2011), Sorting task (CHOLLET et al., 2011; CRUZ et al., 2013); Mapa Projetivo ou Napping (ARES et al., 2011a; CADENA et al., 2014; CHOLLET et al., 2011; DEHLHOLM et al., 2012), Flash profile (CHOLLET et al., 2011; DEHLHOLM et al., 2012), Free choice profile (CHOLLET et al., 2011), Polarized sensory positioning (CADENA et al., 2014), Taxonomic free sorting (WITHERS et al., 2014). As principais metodologias
foram revisadas por Varela e Ares, (2012) e no livro publicado por Varela e Ares, (2014).
Dentre essas metodologias sensoriais foram escolhidas para esta tese o Mapa Projetivo (MP) e Rate-all-that-apply (RATA) por apresentarem princípios diferentes e por isso podem ser aplicadas em conjunto de forma complementar (ARES et al., 2014b; CADENA et al., 2014). Diversos autores avaliam metodologias rápidas em uma mesma amostra para atestar a eficácia dos métodos, e obtiveram resultados semelhantes utilizando diferentes métodos sensoriais (ALBERT et al., 2011; CHOLLET et al., 2011; CRUZ et al., 2013; DEHLHOLM et al., 2012; NESTRUD; LAWLESS, 2010; REINBACH et al., 2014)
No método MP também relatado como Napping®, as amostras são
apresentadas ao mesmo tempo e os consumidores são orientados a marcar em uma folha A4 (em branco) a localização das amostras de acordo com suas similaridades e diferenças, como se fosse um mapa. Desta forma, amostras semelhantes devem ficar próximas e amostras diferentes devem ficar afastadas. Paralelamente, os consumidores devem descrever os termos que caracterizam as amostras usando critérios próprios (CRUZ et al., 2013; VARELA; ARES, 2012). Nesta metodologia quando os consumidores não forem treinados é necessária a participação de 15 a 50 pessoas (ALBERT et al., 2011; NESTRUD; LAWLESS, 2008) e quando houver treinamento o teste pode ser realizado com 9 a 15 pessoas (PERRIN; PAGÈS, 2009; RISVIK et al., 1994)
O MP já foi utilizado para caracterizar chocolate (RISVIK et al., 1994), sopa em pó comercial (RISVIK; MCEWAN; RØDBOTTEN, 1997), queijos de leite de ovelha (BARCENAS; ELORTONDO; ALBISU, 2004), sucos (NESTRUD; LAWLESS, 2008), vinhos (PERRIN; PAGÈS, 2009), bebidas (MOUSSAOUI; VARELA, 2010), sobremesas lácteas (ARES et al., 2010a), nuggets (ALBERT et al., 2011) e bebidas em pó (ARES et al., 2011a).
A metodologia de RATA é derivada do método CATA. No método CATA os consumidores recebem uma lista com termos descritores previamente determinados por ADQ ou por outros estudos publicados, e os consumidores devem marcar quais os termos se aplicam ao produto avaliado. Para o RATA além de indicar os termos, os consumidores devem determinar a intensidade de cada termo descritor (REINBACH et al., 2014). Na comparação das 2
metodologias (CATA e RATA) evidencia-se a mesma eficácia (REINBACH et al., 2014). Contudo, no RATA o consumidor terá que indicar a intensidade e por isso necessita refletir melhor sobre cada termo descritor. Devido a isso, no método RATA pode haver maior discriminação entre as amostras (ARES et al., 2014b). Esta metodologia necessita da participação de 50 a 100 consumidores (DOOLEY; LEE; MEULLENET, 2010).
Muitos estudos já foram realizados com método CATA utilizando diversos produtos: morangos, maçã (ARES; JAEGER, 2013), sorvete (DOOLEY; LEE; MEULLENET, 2010), sobremesa láctea, chocolate (ARES et al., 2010b), suco de laranja em pó (ARES et al., 2011a, 2011b), e refrigerante (PLAEHN, 2012). Utilizando RATA foram avaliados pão, sobremesa láctea, balas (ARES et al., 2014b), amendoim, biscoito, ervilhas, maçã (JAEGER; ARES, 2015; MEYNERS; JAEGER; ARES, 2016) e chocolate (GIACALONE; HEDELUND, 2016).
Desta forma, o método MP é interessante para selecionar os termos descritores que os consumidores julgam importantes, porém podem deixar de comentar algum descritor que o pesquisador está interessado em obter informações. Para isso, a metodologia RATA permite que o pesquisador insira na lista termos descritores de interesse, e cabe aos consumidores julgarem se o termo caracteriza a amostra apresentada.
1.6 Objetivos
O objetivo geral do presente trabalho foi avaliar as características de iogurte e bebida láctea fermentada fabricados com leite processado por alta pressão isostática (API), homogeneização por alta pressão (HAP) e transglutaminase (TGase).
Objetivos específicos:
1- Estabelecer a tecnologia emergente (API ou HAP) que confere maior consistência (comportamento viscoelástico) e viscosidade aparente (comportamento ao fluxo) ao iogurte (Capítulo 2).
2- Avaliar o efeito da utilização de TGase no comportamento reológico de iogurte feito com leite processado por API ou HAP (Capítulo 3).
3- Avaliar o comportamento reológico de iogurte e bebida láctea (15 e 30% de soro) feito com leite processado por API, HAP ou TGase (Capítulo 4).
4- Caracterizar o perfil sensorial de iogurte elaborado com leite processado por API ou HAP (Capítulo 5).
