Filipe da Silveira Martins
Licenciado em Química Aplicada
Desenvolvimento de um novo método de
produção de sumo de maçã visando
incrementar o teor em polifenóis e diminuir
o escurecimento
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em
Tecnologia e Segurança Alimentar
Orientador: Professora Doutora Maria Paula Amaro de Castilho Duarte,
Professora Auxiliar, FCT/UNL
Júri:
Presidente: Prof. Doutora Benilde Simões Mendes, FCT/UNL Arguente: Prof. Doutor Marco Diogo Richter Gomes da Silva, FCT/UNL
Setembro 2012
Filipe da Silveira Martins
Licenciado em Química Aplicada
Desenvolvimento de um novo método de
produção de sumo de maçã visando
incrementar o teor em polifenóis e diminuir
o escurecimento
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em
Tecnologia e Segurança Alimentar
Orientador: Professora Doutora Maria Paula Amaro de Castilho Duarte,
Professora Auxiliar, FCT/UNL
Júri:
Presidente: Prof. Doutora Benilde Simões Mendes, FCT/UNL Arguente: Prof. Doutor Marco Diogo Richter Gomes da Silva, FCT/UNL
COPYRIGHT
Desenvolvimento de um novo método de produção de sumo de maçã visando incrementar o teor em polifenóis e diminuir o escurecimento Copyright © em nome de Filipe da Silveira Martins, aluno da FCT/UNL.
AGRADECIMENTOS
Os agradecimentos que apresento de seguida, dirigem-se a pessoas que de algum modo contribuíram para que fosse possível alcançar os objectivos que me propus com esta dissertação. Algumas destas pessoas colaboraram diretamente neste trabalho, através de reuniões realizadas na FCT e no IICTenquanto outras contribuíram simplesmente com a sua boa vontade, amizade e afecto. Assim sendo, os meus agradecimentos são para:
A Professora Maria Paula Amaro de Castilho Duarte do Departamento de Ciências e Tecnologia da Biomassa da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, que como orientadora desta dissertação, além de me transmitir os conhecimentos necessários para efetuar este trabalho de investigação, me orientou em relação à recolha e gestão de toda a informação disponível sobre o objeto da pesquisa. Quero também agradecer a sua pronta disponibilidade, amizade e incentivo que sempre me deu desde que a conheci como professora da disciplina de Ecotoxicologia do Mestrado de Tecnologia e Segurança Alimentar e em especial ao longo destes últimos meses;
Ao Doutor António Eduardo Leitão, do Instituto de Investigação Científica Tropical, quero agradecer toda a disponibilidade na colaboração com as análises cromatográficas essenciais para esta dissertação.
À Professora Doutora Benilde Mendes, coordenadora deste Mestrado, por ter proporcionado as condições necessárias para a realização deste trabalho.
À Doutora Cármen Pinheiro pelas sugestões dadas na estruturação deste trabalho.
Para toda a minha família que sempre me apoiou durante a realização do Mestrado, em especial à minha mãe Olga Maria da Silveira Martins.
RESUMO
A crescente procura por sumos com menor grau de processamento e elevado valor nutricional, ricos em compostos bioativos e com propriedades sensoriais próximas da fruta fresca, tem motivado a procura de novos métodos de produção que permitam obter sumos com estas características e com longo período de vida útil. Neste trabalho testaram-se diferentes métodos de produção de sumo de Maçã Golden Delicious tendo em vista o incremento do teor em polifenóis e a redução do escurecimento. Os resultados foram comparados com um sumo obtido através de um processo convencional. Dos métodos testados aquele em que realizou um escaldamento prévio da fruta e trituração com ácido ascórbico foi o que obteve resultados mais satisfatórios.
O novo método garantiu a inactivação enzimática completa e um teor em polifenóis significativamente superior ao do sumo convencional. Este sumo apresentou-se microbiologicamente estável durante um período de conservação de dois meses, mesmo quando pasteurizado a uma temperatura inferior à do método convencional (65ºC contra 90ºC). O escurecimento não enzimático a quando da produção foi reduzido em cerca de 56% embora tenha continuado a desenvolver-se durante o armazenamento a 4 ou a 25 ºC.
Concluiu-se que o novo método permite obter um sumo de maçã com valor nutricional significativamente melhor que o sumo produzido pelo método convencional com menos passos de produção e temperaturas mais baixas de tratamento.
Abstract
The growing demand for unprocessed fruit juices with higher nutritional values, bioactive compounds and with sensory properties closer to those of the fresh fruit, has trigged the search of new methods of juices production that result in juices with these characteristics and with long shelf lives. In this study we have tested different juice production methods using Golden Delicious apples, focusing on the increment of the phenolic compounds content and reduced browning. These results were compared with the juice produced under the conventional method. The juice that was extracted with the blanching of the whole apples and grinding with the ascorbic acid solution showed the best results.
The new method ensured a complete enzymatic inactivation and phenolic content significantly higher than the juice produced under the conventional method. This juice was microbiologicly stable during the two month study even for the juice preserved at room temperature after pasteurization at 65 ºC. The non enzymatic browning was 56 % lower than the juice produced under the conventional method, although, during the preservation all the juices darkened both at 4 and 25 ºC.
In conclusion the new method results in an apple juice with higher nutritional value, better sensory properties and less processing steps than that produced under the conventional methods.
ÍNDICE
Introdução ... 1
1. Sumos de Maçã: Aspectos Funcionais, Nutricionais e Tecnológicos... 3
1.1 Maçã e os seus benefícios para a saúde ... 3
1.2 Polifenóis ... 4
1.3 Polifenóis na maçã ... 13
1.4 Produção e qualidade do sumo de maçã ... 18
1.5 Métodos alternativos de produção de sumo de maçã ... 26
2. Material e Métodos ... 29
2.1 Amostra ... 29
2.2 Reagentes e meios de cultura ... 29
2.3 Preparação do sumo de maçã ... 29
2.4. Otimização da temperatura de pasteurização ... 32
2.5. Rendimento da extração ... 33
2.6. Determinação da atividade da polifenol oxidase (PPO) ... 33
2.7. Determinação dos polifenóis totais ... 33
2.8. Determinação do perfil fenólico ... 34
2.9. Determinação do escurecimento não enzimático - determinação de HMF ... 35
2.10. Análise microbiológica ... 35
2.11. Análise Estatística ... 36
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 37
3.1. Escolha do melhor método de preparação do sumo ... 37
3.2. Otimização da temperatura de pasteurização ... 41
CONCLUSÃO ... 50
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1: Estrutura base dos flavonóides composta por dois anéis benzénicos (A e B) ligados através
de um anel pirano (C) ………... 5
Figura 1.2: Estruturas básicas dos principais grupos fenólicos nas frutas e vegetais ……... 5
Figura 1.3: Metabolismo fenólico, PEP (fosfoenol piruvato); E4P (eritrose 4-fosfato); DAHP (3Deoxi-D-arabino-heptulosonato 7–fosfato); PAL (Fenilalanina amónia liase) . O stress ativa transcripcionalmente as enzimas chave do metabolismo fenólico (PAL e DAHP sintetase) ... 7
Figura 1.4: Inter-relações entre classes de flavonóides. As setas indicam o principal caminho biossintético)………... 8
Figura 1.5: Mecanismos de lesão celular associados ao stress oxidativo ………... 12
Figura 1.6: Estrutura química dos flavonóis quercetina e caempferol …... 14
Figura 1.7: Estrutura química dos derivados glicosilados da quercetina e caempferol encontrados nas maçãs ………... 14
Figura 1.8: Estrutura química das procianidinas e dos seus precursores encontrados nas maçãs ... 15
Figura 1.9: Estrutura química de um derivado do ácido hidroxicinâmico encontrado nas maçãs ... 15
Figura 1.10: Estruturas químicas das dihidrocalconas encontradas nas maçãs ... 16
Figura 1.11: Estrutura química de um pigmento de antocianidina ……... 16
Figura 1.12: Diagrama de produção de concentrado de maçã ... 19
Figura 1.13: Reações catalisadas pelas polifenoloxidases cresolase (E.C.1.14.18.1), catecoloxidase (E.C.1.10.3.1) e lacase (E.C.1.10.3.2) ………... 22
Figura 1.14: Formação de pigmentos escuros por oxidação dos polifenóis ... 22
Figura 1.15: Formação de pigmentos escuros por oxidação dos polifenóis ……... 23
Figura 1.16: Esquema da reacção de Maillard ………... 25
Figura 2.1: Fluxograma de extração e análise do sumo de maçã ...…………... 30
Figura 3.1: Curvas de variação da absorvância a 420 nm com o tempo obtidas no ensaio da actividade da PPO no sumo controlo (sem nenhum tipo de tratamento) e nos sumos obtidos pelos quatro métodos experimentais utilizados……….. 38
Figura 3.2: Actividade da enzima polifenol oxidase (U/mL) no sumo controlo (sem nenhum tipo de tratamento) e nos sumos obtidos pelos quatro métodos experimentais utilizados………. 38
Figura 3.3: Concentração dos compostos fenólicos totais no sumo controlo (sem nenhum tipo de tratamento) e nos sumos obtidos pelos quatro métodos experimentais utilizados………. 39
Figura 3.4: Teor em polifenóis dos sumos imediatamente após pasteurização às diferentes temperaturas (semana 0) e ao fim de dois meses de conservação a 4ºC (semana 8 a 4ºC) e a 25 º C (semana 8 a 25 ºC)………. 42
Figura 3.5: Variação percentual em relação ao valor imediatamente após a pasteurização do teor em polifenóis dos sumos imediatamente ao fim de dois meses de conservação a 4ºC (semana 8 a 4ºC) e a 25 º C (semana 8 a 25 ºC)……… 43
25ºC) ……… 44
Figura 3.7: Teor em epicatequina (mg/L) nos sumos antes e imediatamente após a pasteurização (semana 0) e ao fim de dois meses de conservação a 4ºC (semana 8 a 4ºC) e a 25 º C (semana 8 a 25
ºC) ……… 45
Figura 3.8: Teor em quercetina 3- -D-glucosido (mg/L) nos sumos antes e imediatamente após a pasteurização (semana 0) e ao fim de dois meses de conservação a 4ºC (semana 8 a 4ºC) e a 25 º C
(semana 8 a 25 ºC)……….. 46
Figura 3.9: Aspecto dos sumos imediatamente após a sua pasteurização. M1(90ºC): Sumo preparado pelo método 1 e pasteurizado a 90ºC; M4(65ºC): Sumo preparado pelo método 4 e pasteurizado a 65ºC; M4(75ºC): Sumo preparado pelo método 4 e pasteurizado a 75ºC; M4(90ºC): Sumo preparado pelo
método 4 e pasteurizado a 90ºC………. 46
Figura 3.10: Aspecto dos sumos após dois meses de armazenamento a 4ºC e a 25ºC. M1(90ºC): Sumo preparado pelo método 1 e pasteurizado a 90ºC; M4(65ºC): Sumo preparado pelo método 4 e
pasteurizado a 65ºC; M4(75ºC): Sumo preparado pelo método 4 e pasteurizado a 75ºC; M4(90ºC):
Sumo preparado pelo método 4 e pasteurizado a 90ºC……….. 47
Figura 3.11: Teor em HMF (mg/L) nos sumos imediatamente após a pasteurização (semana 0) e ao
fim de dois meses de conservação a 4ºC (semana 8 a 4ºC) e a 25 º C (semana 8 a 25 ºC)………. 47
Simbologia e Notações
DAHP - 3-deoxi-D-arabino-heptulossonato
DNA - Ácido desoxirribonucleico g– Aceleração gravítica
HAT – “Hydrogen atom transfer” (transferência de um átomo de hidrogénio)
HMF - Hidroximetilfurfural
HPLC - Cromatografia líquida de elevada eficiência
LDL - Lipoproteínas de baixa densidade
MDA - Malonildialdeído
PAL - Fenilalanina amonia-liase
PPO - Polifenol oxidase
ROS - Espécies Reactivas de Oxigénio
SET – “Single electron transfer” (transferência de um electrão)
Introdução
Existe, atualmente, uma procura crescente por sumos de fruta que tenham o mínimo grau de processamento e que conservem as propriedades sensoriais da fruta que os originou. No entanto, por questões de rentabilidade, e devido a sazonalidade da fruta, esta deve passar por um processamento que permita longos períodos de vida útil dos sumos produzidos, sendo que, esse tratamento, pode resultar em perdas nutricionais e sensoriais independentemente da tecnologia utilizada.
Um parâmetro essencial para a produção de sumos de vida útil longa é a estabilidade microbiológica e para que um sumo seja estável durante seis a doze meses ele deve passar por uma pasteurização à temperatura de 90 °C durante 30 a 60 segundos (Aguilar-Rosas et al., 2007). A estas temperaturas podem perder-se compostos voláteis, vitaminas, em especial o ácido ascórbico, e polifenóis, estão favorecidas as reacções de escurecimento não enzimático (Dorantes-Alvarez & Chiralt, 2000; Zhu et al., 2009; Patras et al., 2010) podendo, assim, ocorrer o aparecimento de sabores e aromas não-naturais (Kato et al., 2003). Além disso, durante a trituração das maçãs dá-se a ativação da enzima polifenol oxidase. Esta enzima é responsável pela degradação e perda dos polifenóis e, de forma indireta, de ácido ascórbico, podendo estar a sua actividade associada a alterações sensoriais que incluem a evolução de aromas não naturais (Komthong et al., 2006; Ye et al., 2007).
Os efeitos negativos do processamento dos sumos de fruta não terminam na sua produção, pois as perdas nutricionais de propriedades bioativas e de qualidade sensorial podem prolongar-se durante a fase de armazenamento. Durante este período podem ocorrer reações de degradação dos polifenóis, responsáveis por grandes perdas destes compostos, e, especialmente no caso dos concentrados de sumo, reações de escurecimento não enzimático muito acentuadas, que, conforme já foi referido anteriormente, levam à degradação das qualidades sensoriais do sumo bem como à evolução de aromas não naturais (Burdulu & Karadeniz, 2003).
elevados de escurecimento enzimático, devem estar sempre sob refrigeração e têm prazos de validade reduzidos (normalmente inferiores a um mês) quando comparados com os sumos pasteurizados.
Neste contexto, o desenvolvimento de novos métodos de extracção de sumo a partir de maçãs, que permitam obter sumos microbiologicamente estáveis com elevada qualidade nutricional e sensorial e elevado teor em compostos bioativos, surge como um desafio pleno de interesse, uma vez que a combinação de todas estas qualidades, apenas se encontra nos sumos que são produzidos e consumidos imediatamente a seguir a sua produção.
O presente trabalho surge, assim, no âmbito da necessidade de criar um novo método de produção de um sumo de maçã que permita manter as suas características o mais próximo possível do fruto original, de modo a obter um sumo com elevada qualidade nutricional e sensorial e elevado teor em compostos bioativos e que ao mesmo tempo preencha os requisitos de segurança alimentar. A maçã foi o fruto escolhido pelo facto de, além de ser um fruto com muitos benefícios para a saúde, também ser dos frutos mais produzidos e com maior suscetibilidade a deterioração.
Para conseguir alcançar este objetivo testaram-se três métodos diferentes de extração do sumo de maçã e, seguidamente, três temperaturas diferentes de pasteurização. O melhor método de extracção foi selecionado com base em dois critérios: Em primeiro lugar a avaliação da eficiência na inativação enzimática da polifenol oxidase, que, conforme já referido anteriormente, é uma das principais responsáveis pela degradação dos compostos bioativos do sumo de maçã; e como segundo critério a concentração em compostos fenólicos totais dos sumos. O sumo produzido pelo método de extracção selecionado foi sujeito a um processo de pasteurização a três diferentes temperaturas, tendo cada uma destas amostras, sido, posteriormente, avaliada em relação à sua estabilidade microbiológica, concentração em compostos fenólicos e extensão das reacções de escurecimento não enzimático. Esta avaliação foi efectuada no próprio dia da produção e durante um período de conservação de dois meses, tendo as amostras de sumo sido armazenadas paralelamente a 4 e 25 °C.
1. Sumos de Maçã: Aspectos Funcionais, Nutricionais e
Tecnológicos
1.1 Maçã e os seus benefícios para a saúde
A maçã é o fruto pomáceo da macieira, árvore da família Rosaceae e do género Malus. As maçãs crescem em árvores de folha caduca que florescem na Primavera e produzem fruto no Verão ou no Outono. A árvore é originária da Ásia Ocidental, onde o seu ancestral selvagem, Malus sieversii, ainda é encontrado atualmente. As maçãs cultivam-se há milhares de anos na Ásia e Europa, tendo sido levadas para a América do Norte pelos colonizadores europeus (Luby, 2003). São hoje conhecidas mais de 10 000 variedades diferentes de maçãs, embora apenas uma muito pequena percentagem destas seja produzida e comercializada à escala global (Hampson & Kemp, 2003). Em termos de produção, em Portugal destacam-se as variedades Golden delicious, Gala, Starking, Reineta, Granny Smith, Jonagold, Fuji, e Bravo de Esmolfe.
A maçã é um fruto com elevado conteúdo em água (cerca de 82,9g/100g), contendo cerca de 57 kcal/100g (média de seis variedades) fornecidas maioritariamente por açúcares cujo perfil é variável em função da variedade de maçã. A maçã possui fibra e por ter um valor negligenciável de gordura é um alimento de eleição nas dietas de emagrecimento. Este fruto contém quase todas vitaminas e minerais, destacando-se o ácido ascórbico, o α-tocoferol e o ácido pantoténico entre as vitaminas e o potássio entre os minerais. Este fruto tem ainda demonstrado possuir um elevado conteúdo em compostos fenólicos (Martins, 2007; Feliciano et al., 2010).
Diversos ensaios epidemiológicos, in vivo e in vitro, têm mostrado que o consumo de maçãs pode ter efeitos benéficos para a saúde humana a vários níveis, destacando-se:
a) Redução do colesterol
O consumo regular de maçãs leva à redução de colesterol no sangue por duas vias principais. Por um lado, a maçã é rica em fibras que inibe a absorção intestinal e favorece a excreção biliar do colesterol (Séjourné, 2009) e, por outro, é rica em polifenóis que reduzem os níveis de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) no plasma (Aprikian et al., 2001).
b) Redução da hipertensão
c) Doenças cardiovasculares e diabetes tipo-2
Estudos epidemiológicos associam o consumo da maçã a uma redução de risco de doenças cardiovasculares o que é justificado pelo seu elevado teor em polifenóis com uma elevada atividade antioxidante. Assim, estes compostos parecem ser capazes de inibir a oxidação das LDL e a consequente deposição nas artérias, evitando, assim, a aterosclerose. Como resultado, existe uma melhoria na circulação sanguínea reduzindo, consequentemente, o trabalho cardíaco e aumentando a vida útil do coração. A maçã inibe também a absorção da glucose e tem um efeito de controlo do apetite, graças ao seu teor em fibra, o que leva a que o consumo deste fruto esteja associado a uma redução de risco de diabetes tipo 2. Também o facto de contribuir para o controlo da hipertensão e da obesidade, que são factores de risco para o surgimento da diabetes tipo 2, leva a que a incidência desta doença em pessoas que consomem regularmente esta fruta, seja inferior (Boyer & Liu, 2004).
d) Obesidade
A maçã é recomendada nas dietas de emagrecimento pois o seu elevado teor em fibra e fitosteróis inibe a absorção de gorduras e colesterol e favorece uma sensação de saciedade (Oliveira, et al., 2003).
e) Cancro
A maçã é rica em polifenóis que, pela sua atividade antioxidante bem como por outras vias que serão mais à frente abordadas, pode reduzir a incidência do cancro, em particular do cancro do pulmão, como comprovam diversos estudos epidemiológicos (Boyer & Liu, 2004). In vitro, extractos preparados a partir de maçãs ou alguns dos compostos fenólicos presentes nestes frutos têm demonstrado uma potente actividade antiproliferativa em linhas celulares humanas de carcinoma do cólon (HT29), cancro gástrico humano (MKN45) e células leucémicas (HL-60) (Serra et al., 2010). A esta actividade antiproliferativa soma-se uma atividade antioxidante que pode ajudar a prevenir as lesões oxidativas no ácido desoxirribonucleico (DNA), bem como a oxidação de lípidos, da qual pode resultar a produção de compostos capazes de causar diversos danos celulares, possuindo alguns deles, como, é o caso do malonildialdeído (MDA), actividade cancerígena em ratos e mutagénica em células bacterianas e de mamíferos (Chung et al., 1996).
1.2 Polifenóis
1.1.1. Definição e classificação
constituintes hidroxilos. Esta definição não é completamente satisfatória visto que inclui compostos como a oestrona, uma hormona sexual feminina com origem terpenóide. Por esta razão a definição baseada na origem metabólica é preferível, sendo os fenóis vegetais vistos como substâncias derivadas da via de chiquimato e do metabolismo fenilpropanóide. Alguns são caracterizados como polifenóis, embora nem todos sejam derivados polihidroxilados (Robards et al., 1999).
Os polifenóis que mais se encontram na fruta e vegetais estão divididos em cinco grupos, sendo que os três primeiros se incluem no grande grupo dos flavonóides (Figuras 1.1 e 1.2) (Tomás-Barberán et al., 2000):
• Flavonóis - derivados de 2-fenilcromen-4-ona.
• Pigmentos antocianidinas – derivados do ião flavinium ou 2-fenilcromelinium.
• Flavan-3-ol ou flavanóis – derivados de 2-fenil-3,4-diidro-2H-cromen-3-ol.
• Ácidos hidroxicinâmicos – derivados hidroxilados do ácido cinâmico.
• Ácidos hidroxibenzóicos - derivados hidroxilados do ácido benzóico.
Figura 1.1: Estrutura base dos flavonóides composta por dois anéis benzénicos (A e B) ligados através de um anel pirano (C) (Tomás-Barberán et al., 2000).
Figura 1.2: Estruturas básicas dos principais grupos fenólicos nas frutas e vegetais (Tomás-Barberán et al., 2000).
Flavonóis Antocianidinas Flavanóis
Flavonóis Antocianidinas Flavanóis
Outros polifenóis menores incluem: cumarinas nos citrinos, calconas no tomate, dihidrocalconas na maçã, furocumarinas no aipo e estilbenos como o resveratrol nas uvas (Tomás-Barberán et al., 2000).
1.1.2. Biossíntese dos polifenóis
Os compostos fenólicos fazem parte de um grande grupo de metabolitos secundários que são biossintetizados a partir de glúcidos através da via do ácido chiquímico. Esta é a via biossintética para os aminoácidos aromáticos, fenilalanina, tirosina e triptofano e apenas ocorre em microrganismos e plantas (Tomás-Barberán et al., 2000). No primeiro passo, o intermediário glicolítico fosfoenol piruvato e o intermediário eritrose-4-fosfato são condensados formando 3-deoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato (DAHP), um passo catalisado pela DAHP sintetase. Esta enzima regula o fluxo de carbono na via de chiquimato. Diferentes factores bióticos, tais como infecções por microrganismos, ou abióticos, tais como, os ferimentos mecânicos, causam condições de stress na planta e induzem a expressão da enzima DAHP sintetase e, por consequência, a biossíntese dos metabolitos fenólicos.
Os intermediários da via de chiquimato são 3-desidroquinato, chiquimato e corismato. O quinato é produzido a partir do 3-desidroquinato e incorporado em ácidos clorogénicos e isoclorogénicos (ácidos cafeoilquínicos) por combinação com o ácido cafeico. O ácido gálico é produzido a partir do chiquimato. A fenilalanina é biossintetizada a partir do corismato e da fenilalanina é formado o ácido cinâmico do qual derivam todos os fenilpropanóides. A formação do ácido cinâmico a partir da fenilalanina é mediada pela ação da enzima fenilalanina amonia-liase (PAL), que faz a ligação entre metabolismo primário (via do chiquimato) e secundário (formação dos compostos fenólicos) (Tomás-Barberán et al., 2000). Vários fenilpropanóides simples (C6-C3) são produzidos a partir do ácido cinâmico através de uma série de reações de hidroxilação, metilação e desidratação; originando os ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico e sinapico e cumarinas simples (Figura 1.3). Os ácidos livres raramente se acumulam nas células vegetais, encontrando-se, geralmente, conjugados com açúcares ou com ácidos orgânicos (quínico, málico, tartárico, etc.).
1.1.3. Atividade antioxidante dos polifenóis
Um antioxidante pode ser definido como uma substância que, presente em baixas concentrações, quando comparado com a concentração do substrato oxidável, inibe ou atrasa significativamente a oxidação do substrato, protegendo os alvos biológicos (Halliwell et al., 1995). Existem, aproximadamente, 5000 polifenóis com atividade antioxidante comprovada, embora com grandes variações de eficiência entre os diferentes compostos (Robards et al., 1999; Kondo et al., 2002). A actividade antioxidante exercida pelos polifenóis pode resultar de diferentes mecanismos (Halliwell et al., 1995; Prior et al., 2005):
• Capacidade de sequestro de espécies reactivas através da transferência de um átomo de hidrogénio (mecanismo HAT de hydrogen atom transfer).
• Actividade redutora (mecanismo SET de single electron transfer).
• Capacidade de quelação de metais, em especial o Fe2+ e o Cu+, evitando, deste modo, a formação de radicais hidroxilo através das reacções de Fenton.
• Indução das enzimas antioxidantes (catalase, superóxido dismutase ou glutatião peroxidase).
• Inibição da actividade de enzimas oxidativas como a xantina oxidase ou as ciclooxigenases, de cuja actividade resultam espécies reactivas de oxigénio.
Adicionalmente, os compostos fenólicos podem proteger da oxidação outros antioxidantes fisiologicamente importantes como, por exemplo, o α-tocoferol. Esta protecção pode resultar do facto dos polifenóis poderem ser preferencialmente oxidados ou conseguirem regenerar o radical antioxidante por doação de um átomo de hidrogénio (Robards et al., 1999).
Dentro dos polifenóis, a hierarquia da atividade antioxidante é determinada pelas variações estruturais. Assim, a eficácia dos antioxidantes fenólicos, depende do número e da posição dos grupos hidroxilo ligados ao anel aromático, do tipo de substituintes e do seu local de ligação, da posição relativa dos grupos ligados e da sua habilidade para estabilizar e deslocalizar electrões desemparelhados no anel aromático. No caso concreto dos flavonóides, os arranjos estruturais que conferem maior atividade antioxidante são os seguintes (Rice-Evans et al., 1997):
• Os grupos 3’,4’-dihidroxi no anel B (p.e., catequina e quercetina).
• Os grupos 5,7-dihidroxi no anel A (p.e., caempferol).
hidroxilo e substituição de grupos hidroxilo devido a glicolisação reduzem a atividade antioxidante.
• Para a quelação de metais, os pontos e ligação coordenada na molécula do flavonóide, são os grupos o-difenólicos nas posições 3´4´-dihidroxi no anel B e os grupos 4-ceto e 5-hidroxi no anel C. No entanto, a glicolisação de qualquer um destes pontos influencia na capacidade quelante dos flavonóides.
1.1.4. Efeitos dos polifenóis sobre a saúde humana
Há cada vez mais evidências que muitas doenças, como por exemplo, as doenças cardiovasculares, o cancro, as artrites, as disfunções cerebrais, problemas renais e as cataratas, podem estar relacionadas com os danos celulares causados por espécies reactivas de oxigénio (ROS). Desta forma, os antioxidantes da nossa dieta, em particular, os polifenóis, poderão ter um papel importante na prevenção destas doenças (Diaz et al., 1997; Aruoma, 1998; Chatterjee et al., 1999). A dar mais suporte a esta hipótese existem estudos epidemiológicos que indicam a existência de uma correlação inversa entre o consumo de frutas e legumes ricos em polifenóis e o aparecimento de doenças cardiovasculares e enfartes de miocárdio (Tomás-Barberán et al., 2000), diversos tipos de cancro, cataratas, diabetes, doença de Alzheimer e mesmo a asma (Boyer & Liu, 2004).
Os organismos vivos encontram-se normalmente numa situação de equilíbrio entre o seu potencial pró-oxidante e antioxidante. Uma alteração desse equilíbrio em favor do potencial oxidante designa-se por stress oxidativo. O stress oxidativo pode resultar de uma depleção de antioxidantes, devida a uma nutrição deficiente ou a uma produção em excesso de espécies reativas de oxigénio, tanto de origem endógena como exógena. As ROS incluem espécies químicas radicalares e não radicalares, derivadas do oxigénio, tais como, o peróxido de hidrogénio (H2O2), o radical anião
superóxido (O22●-), o radical peroxilo (HOO•), o radical alcóxido (RO●) ou o radical hidroxilo (OH●).
Uma vez que estas espécies podem formar-se no decurso dos processos metabólicos normais, o Homem adquiriu defesas antioxidantes que incluem enzimas como a superóxido dismutase, a catalase e a glutationa peroxidase. No entanto, o sistema endógeno de defesa antioxidante é incompleto sem compostos exógenos redutores que desempenham um papel essencial em muitos mecanismos antioxidantes. Os principais antioxidantes de origem alimentar de frutos, vegetais e grãos são os seguintes (Bouayed & Bohn, 2010):
• Vitaminas: ácido ascórbico (vitamina C) e α-tocoferol (vitamina E);
• Elementos-traço: zinco e selénio;
• Carotenóides: β-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina;
• Ácidos fenólicos: ácido clorogénico, ácido gálico, ácido cafeico, etc.
• Flavanóis: catequinas e epicatequinas;
• Antocianidinas: cianidina, malvidina e pelargonidina;
• Isoflavonas: genisteína e daidzeína;
• Flavanonas: naringenina, erioditiol e hesperitina;
• Flavonas: luteolina e apigenina;
• Outros compostos: glutationa, ácido úrico, compostos organossulfurados, ácido lipoico, albumina, bilirrubina e coenzima Q.
Todos os componentes celulares são suscetíveis de sofrer a ação das ROS (Figura 1.5). Assim, estas podem reagir com o DNA podendo levar à sua fragmentação ou à ocorrência de mutações que podem conduzir ao aparecimento de tumores (Bishop, 1991; Aruoma, 1998). As lesões no DNA podem levar ao aumento da actividade da enzima poli(ADP)ribose sintetase, o que leva a uma depleção do seu substrato o dinucleotídeo de adenina e nicotinamina (NAD) e, consequentemente do trifosfato de adenosina (ATP), podendo conduzir a disfunções e, eventualmente, à morte celular (Chatterjee et al., 1999).
Quando reagem com as proteínas, as ROS podem causar alterações da estrutura terciária, degradação e fragmentação, o que pode traduzir-se por perda ou alteração da sua funcionalidade biológica. Desta forma, as ROS podem afectar o funcionamento de enzimas, transportadores e receptores celulares, podendo contribuir, de forma indirecta para o aparecimento de lesões noutras biomoléculas. Por exemplo, os danos nas enzimas de reparação ou de replicação do DNA podem levar a um aumento da frequência de mutações nesta molécula. As lesões nas proteínas podem levar a uma desrregulação dos níveis de cálcio, com consequentes alterações no funcionamento celular, e dos níveis de ferro facilitando, neste caso, a ocorrência de reações de Fenton de que resulta maior produção de ROS. Uma das consequências da desrregulação do cálcio parece ser a activação de endonucleases que podem levar à fragmentação do DNA (Aruoma, 1998).
este processo é caracterizado como um antioxidante capaz de quebrar reacções em cadeia (Haliwell & Chirico, 1993).
Figura 1.5: Mecanismos de lesão celular associados ao stress oxidativo (Aruoma, 1998).
proteínas do citoesqueleto e proteínas associadas com a normal permeabilidade das membranas (Aruoma, 1998).
Os polifenóis presentes na dieta têm sido associados com a promoção da saúde através de efeitos que compreendem a diminuição dos níveis de açúcar no sangue, a redução o peso corporal, actividade antimutagénica/anticarcinogénica, antiestrogénica, anti-inflamatória, anti-envelhecimento, antitrombótica, antimicrobiana e, principalmente, actividade antioxidante (Ferguson, 2001; Scalbert et al., 2005). Os polifenóis podem exercer as suas propriedades bioativas, quer pelas suas propriedades antioxidantes, quer por mecanismos adicionais como, por exemplo, através da afectação da sinalização intracelular e/ou da expressão genética, podendo modelar a actividade de receptores, enzimas e factores de transcrição (Williams et al., 2004). Em relação à actividade antimutagénica/anticarcinogénica, diversos trabalhos têm demonstrado que os polifenóis a podem exercer através de diferentes mecanismos que incluem a inibição da absorção de mutagéneos, a desactivação de espécies potencialmente mutagénicas, a modulação da expressão dos genes das enzimas de reparação do DNA e a inibição da formação endógena de mutagéneos (Ferguson, 2001).
No entanto, altas doses de antioxidantes exógenos podem criar distúrbios no equilíbrio redox e exercer efeitos pró-oxidantes. Com efeito, ensaios epidemiológicos têm demonstrado que os efeitos benéficos dos fitoquímicos são observados predominantemente quando estes são consumidos na sua forma natural dentro da matriz dos alimentos e não tanto quando estes são administrados em doses elevadas, tais como as presentes em suplementos alimentares. Isto deve-se a dois factores principais que normalmente não são tidos em conta na elaboração dos suplementos: (1) as concentrações geralmente baixas em que os fitoquímicos surgem nos alimentos; (2) os efeitos aditivos e os sinergismos que ocorrem na mistura complexa de fitoquímicos e nutrientes que compõe os alimentos (Bouayed & Bohn, 2010).
1.3 Polifenóis na maçã
Os principais grupos de polifenós encontrados nas maçãs são os seguintes (Tomás-Barberán et al., 2000; Feliciano et al., 2010):
• Flavonóis (entre os quais a quercetina e o caempferol);
• Flavanóis (entre os quais a (+)-catequina e a (-)-epicatequina);
• Ácidos hidroxicinâmicos e derivados (entre os quais o ácido clorogénico);
• Dihidrocalconas (entre as quais a floretina);
• Antocianidinas (entre as quais a cianidina).
diferenciam-se umas das outras pelo açúcar que a elas está ligado. As formas que foram descritas incluem: quercetina-glucosido, quercetina-rutinosido (rutina), quercetina-galactosido, quercetina-ramnosido, quercetina-xilosido, quercetina-arabinosido (Duda-Chodak et al., 2010), caempferol-3-glucosido (Feliciano et al., 2010) (Figura 1.7).
Quercetina Caempferol
Figura 1.6: Estrutura química dos flavonóis quercetina e caempferol (Tomás-Barberán et al., 2000).
Figura 1.7: Estrutura química dos derivados glicosilados da quercetina e caempferol encontrados nas maçãs (Duda-Chodak, 2010: Feliciano et al., 2010).
procianidinas. Tanto é assim que todos polifenóis monoméricos contam para apenas 20% da actividade antioxidante total do extrato de maçã (Lotito & Frei, 2004).
Figura 1.8: Estrutura química das procianidinas e dos seus precursores encontrados nas maçãs (Duda-Chodak et al., 2010).
Entre os derivados dos ácidos fenólicos, o ácido clorogénico (ácido 5’-cafeolquínico) (Figura 1.9) é o principal constituinte embora os ácidos 4’-cafeolquínicos e 3’-cafeolquínicos também tenham sido reportados bem como derivados dicafeolquínicos. A maçã contém o ácido cafeico, p-cumárico e ferúlico (Tomás-Barberán et al., 2000). As dihidrocalconas encontram-se na maçã na forma da floretina e do seu glucósido floridzina (Figura 1.10) (Ceyman et al., 2010). O principal pigmento antocianidínico na maçã é a cianidina 3-galactósido (Figura 1.11), embora também se tenham descrito a presença de cianidina 3-glucósido, 3-arabinóside e 3-xilósido bem como de derivados acilados (Tomás-Barberán et al., 2000).
Figura 1.10: Estruturas químicas das dihidrocalconas encontradas nas maçãs (Tomás-Barberán et al., 2000).
Figura 1.11: Estrutura química de um pigmento de antocianidina (Tomás-Barberán et al., 2000).
A distribuição dos polifenóis varia consideravelmente entre as diferentes cultivares e também dentro dos diferentes tecidos da maçã (Tsao et al., 2003; Alonso-Salces et al., 2004). As variedades de sidra, geralmente, têm maior concentração de polifenóis que as maçãs de sobremesa (Sanoner et al., 1999).
O conteúdo em compostos fenólicos das maçãs é regulado por fatores ambientais e de pós-colheita que incluem o clima, a fertilização, o estado de maturação, a exposição à luz, as condições de armazenamento e de processamento (Robards et al., 1999; Awad et al., 2000; Awad & De Jager, 2002; Kondo et al., 2002; Boyer & Liu, 2004), havendo uma tendência para a redução da atividade antioxidante e do teor em fenóis totais com o progredir do amadurecimento (Kondo et al., 2002). Adicionalmente Yuri e colaboradores (2009) verificaram uma variabilidade de fenóis totais em função da localização geográfica quer em termos de altitude quer em termos de latitude.
verificando o mesmo em relação aos teores de floridzina, catequina nem de ácido clorogénico (Awad et al., 2000). Por outro lado, a fertilização em azoto parece estar associada à redução no teor em fenóis totais, reduzindo a concentração de antocianinas e catequinas, enquanto que a fertilização em cálcio parece ter um efeito contrário aumentando o teor em antocianinas e em fenóis totais (Awad & De Jager, 2002).
A distribuição dos polifenóis pela maçã não é uniforme. Assim, verifica-se, de um modo geral, que a concentração destes compostos na casca do fruto é cerca de 3 a 8 vezes superior à respectiva concentração na polpa, sendo o de flavonóides 2 a 6 vezes mais elevado (Wolfe et al., 2003). Esta diferente distribuição dos polifenóis pode explicar o facto de, em vários genótipos de maçãs analisados, a atividade antioxidante da casca ser 3,6 a 10 vezes superior à da polpa (Wolfe et al., 2003; Khanizedeh et al., 2008). Esta maior atividade deve-se provavelmente à circunstância de haver antioxidantes poderosos, como os derivados da quercetina e as antocianinas, responsáveis pela cor vermelha da casca, que se encontram exclusivamente na casca (Escarpa e Gonzalez, 1998; Tsao et al., 2003; Tsao et al., 2005; Yuri et al., 2009), além do facto da maioria dos fenóis comuns à casca e à polpa se encontrarem, ainda assim, em maior concentração na casca (Wolfe et al., 2003; Serra et al., 2010). Excepção a esta observação é o ácido clorogénico que se encontra em maior concentração no núcleo e sementes, apresenta um valor intermediário na polpa e baixo na casca. As catequinas encontram-se predominantemente na casca embora também se encontrem na polpa. A floridzina encontra-se predominantemente nas sementes seguido de valores intermediários no núcleo e casca e valores muito baixos na polpa (Awad et al., 2000, Boyer & Liu, 2004, e Tsao et al., 2003).
Os polifenóis existentes na maçã têm sido associados com as propriedades bioactivas dos extratos deste fruto. Assim, a catequina, epicatequina e procianidina B1 parecem ser polifenóis que mais contribuem para a atividade antioxidante das maçãs, enquanto que as procianidinas B1 e B2, a floridzina e a epicatequina parecem desempenhar um papel importante contra a proliferação de células humanas de carcinoma do cólon (HT29), carcinoma gástrico (MKN45) (Serra et al., 2010) e células leucémicas (HL-60) (Yoshiawa et al., 2005). A actividade antiproliferativa verificada em linhas celulares de hepatocarcinoma humano (HepG2) foi cerca de 7 vezes mais forte com extratos preparados a partir da casca da maçã do que com extratos preparados a partir da polpa (Wolfe et al., 2003).
Edenharder (2003) estudou o efeito antimutagénico de alguns fenóis da maçã e concluiu que a catequina, epicatequina, rutina e quercetina apresentavam forte atividade antimutagénica em estirpes de Salmonella thyphimurium, além de também apresentarem forte actividade antioxidante. Pelo contrário, a floretina apresentou uma actividade antioxidante moderada e nenhum efeito antimutagénico.
de inibir a oxidação das LDL humanas, verificando-se uma correlação positiva entre esta capacidade e o teor polifenóis totais dos sumos analisados (Pearson et al., 1999). Por outro lado, foi possível verificar uma maior inibição da peroxidação de lípidos e maior capacidade antioxidante do plasma de ratos alimentados com a casca da maçã quando comparados com ratos alimentados apenas com a polpa, o que foi relacionado com a maior concentração de polifenóis existente na casca destes frutos (Leontowicz et al., 2003).
Em ensaios com ratos alimentados com maçãs verificou-se, igualmente que a presença deste fruto na alimentação levava uma redução do colesterol facto que também foi associado ao seu teor em polifenóis e em vitamina C (Aprikian et al., 2001). Em vários ensaios de actividade antioxidante in vitro, os polifenóis da maçã têm revelado uma actividade antioxidante mais intensa do que a das vitaminas C e E (Lu & Foo, 2000).
Estudos epidemiológicos indicam que o risco de ocorrência de enfartes de miocárdio é cerca de 49% mais baixo em indivíduos que consomem 110 gramas ou mais de maçã por dia do que em indivíduos que consomem menos de 18 gramas por dia (Lu & Foo, 2000). Mais uma vez, este efeito tem sido associado ao teor em polifenóis da maçã. A dar mais força a esta associação existem estudos que mostram a existência de uma correlação inversa entre o consumo de flavonóis e flavonas e o risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares e de enfartes de miocárdio (Tomás-Barberán et al., 2000).
1.4 Produção e qualidade do sumo de maçã
A produção de sumo de fruta envolve vários tratamentos como digestão enzimática, concentração, tratamento térmico, filtração, etc. O armazenamento a frio é geralmente utilizado para reduzir a respiração e metabolismo destes produtos e para aumentar o seu tempo de vida útil. Em alguns casos atmosferas controladas são usadas para inibir a degradação e manter os atributos de qualidade da fruta (Tomás-Barberán et al., 2000). As várias etapas de produção do sumo são apresentadas na figura 1.12.
Normalmente os sumos de fruta são processados a temperaturas acima dos 80ºC para eliminar microrganismos de degradação e inactivar enzimas oxidativas como a polifenol oxidase (PPO) (Dorantes-Alvarez & Chiralt, 2000).
de fruta sejam normalmente tratados a temperaturas entre os 90 e os 100 °C para aumentar o seu tempo de vida útil (Kato et al., 2003). No entanto, um estudo de Noci e colaboradores (2008) mostrou que foi possível chegar a uma estabilidade microbiológica num período de 6 meses com 6 logaritmos decimais de redução da flora microbiana com apenas 72°C de temperatura de pasteurização.
.
Figura 1.12: Diagrama de produção de concentrado de maçã (Burdurlu & Karadeniz, 2003).
A inactivação da PPO constitui um passo muito importante na produção do sumo de maçã, sendo geralmente efectuado por processamento térmico (a PPO é inactivada a temperaturas acima dos 80ºC), refrigeração, diminuição do pH, adição de agentes anti-escurecimento e/ou inibidores da enzima (Dorantes-Alvarez & Chiralt, 2000;Tomás-Barberán & Espín, 2001). Embora alguns autores tenham reportado a inactivação direta da PPO através da adição de ácido ascórbico ou derivados, o principal papel deste composto no controlo do escurecimento é de reduzir os radicais fenoxil e as formas quinonicas dos fenóis para os respectivos precursores fenólicos numa reação redox acoplada (Chow et al., 2011). No entanto, o efeito do ácido ascórbico é temporário, uma vez que este se oxida a ácido desidroascórbico, seja nas condições enzimáticas ou de oxidação química, podendo o escurecimento voltar a ocorrer depois do seu esgotamento (Serpen & Gökmen, 2007). No caso da maçã, a inactivação enzimática requer um aquecimento a 90°C por 30 segundos. Além disso, a
Concentração (50°C, 110 mbar) Lavagem e seleção
Prensagem Trituração
Inativação enzimática (90 °C)
Tratamento enzimático (50ºC)
Clarificação (50°C)
Pré-filtração
prensagem em presença de inibidores da PPO como o ácido ascórbico ou dióxido de enxofre aumentam drasticamente os rendimentos de polifenóis (Tomás-Barberán et al., 2000).
1.4.1. Consequência do processamento sobre as propriedades do sumo
Operações como o esmagamento, tratamentos enzimáticos e prensagem levam à activação da PPO e à consequente degradação dos compostos fenólicos, resultando na perda de atividade antioxidante. O maior grau de oxidação ocorre na polpa antes e durante a prensagem. A oxidação pode prolongar-se depois da extração se se demorar a proceder à inactivação da PPO. As enzimas pectolíticas usadas na clarificação podem causar hidrólise de ácidos hidroxicinâmicos na maçã. Além disso, o uso da gelatina como agente de clarificação reduz os fenóis totais, com os fenóis poliméricos a serem os mais afectados (Tomás-Barberán et al., 2000). As antocianidinas destroem-se a temperaturas superiores a 60°C e a destruição é tanto maior quanto menor o pH e maior a concentração de oxigénio (Dorantes-Alvarez & Chiralt, 2000; Patras et al., 2010).
Devido a todas estas perdas durante a extracção do sumo, verifica-se que o sumo de maçã obtido por prensagem tem apenas 10% da atividade oxidante da maçã e se previamente à prensagem se tiver realizado um tratamento enzimático esta atividade é de apenas 3%. Depois do tratamento enzimático o sumo apresenta 33% menos floridzina, 44% menos ácido clorogénico, 58% menos de catequina e 43 a 59% menos antocianinas (Boyer & Liu, 2004; Patras et al., 2010).
Também durante o armazenamento do sumo de maçã ou de concentrados de sumo se verifica a degradação de fenóis. Após armazenamento por 9 meses a 25ºC, os concentrados de sumo mostraram uma perda de 36 % de ácidos hidroxicinâmicos, 60% de glucósidos de quercetina e floretina e uma perda total de procianidinas (Tomás-Barberán et al., 2000).
1.4.2. Escurecimento enzimático
O escurecimento enzimático é um fenómeno que ocorre em frutas e vegetais e cuja principal responsável é a enzima polifenol oxidase (PPO). Esta enzima catalisa a hidroxilação de monofenóis a o-difenóis e a oxidação de o-difenóis a o-quinonas altamente reativas que polimerizam originando a formação de pigmentos heterogéneos pretos, castanhos e vermelhos (Tomás-Barberán & Espín, 2001). O processamento da maçã resulta na alteração físico-química das membranas das células do fruto, causando a descompartimentação subcelular, levando ao contacto da enzima com o oxigénio e daí à sua activação e ao aparecimento do escurecimento enzimático (Dorantes-Alvarez & Chiralt, 2000). Este escurecimento é afectado por factores como a distribuição e actividade da PPO, a concentração em fenóis totais e a concentração de oxigénio, havendo variedades de maçã em que o escurecimento enzimático está diretamente relacionado com a atividade da enzima e outras em que está diretamente relacionado com o teor em fenóis (Ye et al., 2007).
1.4.2.1. Polifenol oxidase – caracterização bioquímica
A PPO é uma enzima contendo cobre presente nas plantas superiores que causa modificações indesejadas de cor e sabor nos sumos de fruta (Tomás-Barberán & Espín, 2001). Podem encontrar-se três sub-tipos da PPO (Dorantes-Alvarez & Chiralt, 2000):
• Monofenol monooxigenase, fenolase, cresolase ou tirosinase – EC 1.14.18.1;
• o-difenol oxidoredutase, catecoloxidase ou difenoloxidase – EC 1.10.3.1;
• Lacase ou p-difenoloxidase – EC. 1.10.3.2.
A maioria das PPO’s envolvidas no escurecimento enzimático são catecoloxidases (Dorantes-Alvarez & Chiralt, 2000). A creselase catalisa a hidroxilação dos monofenóis a o-difenóis que são posteriomente convertidos em quinonas pela catecoloxidase, catalisando a lacase a passagem os p-difenóis a quinonas (Figura 1.13). As quinonas que se formam como resultado da oxidação primária dos fenóis têm diferentes cores, consoante o composto que lhes deu origem e consoante o pH. Esta primeira reacção pode ser revertida por reacção das quinonas com antioxidantes, como o ácido ascórbico ou o anidrido sulfuroso. Assim, estes compostos conseguem bloquear as reacções de escurecimento enzimático no seu passo inicial, conduzindo à regeneração do fenol original, mas apenas enquanto eles não se esgotam. Depois do seu esgotamento ocorre então a formação das o-quinonas e o escurecimento enzimático pode prosseguir (Robards et al., 1999).
originando dímeros ou regenerando o composto inicial, sendo que o dímero pode ser novamente oxidado, enzimaticamente ou via reacção com uma quinona, originando o aparecimento de olígomeros de cor escura (Figura 1.14) (Robards et al., 1999). As quinonas podem, igualmente reagir com proteínas contribuindo, deste modo, igualmente para as reacções de escurecimento (Robards et al., 1999). O papel protector do ácido ascórbico nas reações de escurecimento enzimático dos fenóis encontra-se esquematizado na figura 1.15.
Figura 1.13: Reações catalisadas pelas polifenoloxidases cresolase (E.C.1.14.18.1), catecoloxidase (E.C.1.10.3.1) e lacase (E.C.1.10.3.2) (Robards et al., 1999).
Figura 1.14: Formação de pigmentos escuros por oxidação dos polifenóis (Robards et al., 1999).
Lacase
Cresolase catecoloxidase
Lacase
Cresolase catecoloxidase
o-quinonas
Pigmentos escuross
o-quinonas
Pigmentos escuross
o-quinonas
Pigmentos escuross
o-quinonas
Figura 1.15: Formação de pigmentos escuros por oxidação dos polifenóis (Robards et al., 1999).
A contribuição de um determinado substrato para o escurecimento enzimático depende da sua concentração e da natureza dos outros substratos presentes (Rocha et al., 2000). Existe uma forte correlação entre os polifenóis totais e o grau de escurecimento enzimático, sendo maior para proantocianidinas, catequina, epicatequina e floridzina (>0,8) e baixo para o ácido clorogénico (<0,6) (Ye et al., 2007). Este resultado foi, no entanto, contrariado por outros autores que encontraram uma forte correlação entre a concentração de ácido clorogénico e o escurecimento enzimático, o que pode ter sido devido ao facto das maçãs analisadas serem de diferentes variedades e, por isso, terem variações nas concentrações das PPO’s e no pH que podem ter influenciado a atividade enzimática (Zemel et al., 1990; Ye et al., 2007). Também é de notar que, o facto de o ácido clorogénico se encontrar em grandes quantidades torna o seu papel importante no grau de escurecimento enzimático (Rocha et al., 2000). Os flavonóis como a quercetina aparentam ser menos susceptíveis à ação enzimática (Tomás-Barberán et al., 2000).
A PPO encontra-se em todas partes da maçã havendo variedades em que se encontra mais concentrada na casca e outras no córtex. A nível celular a PPO encontra-se nos cloroplastos em particular na face interna dos tilacóides, mas também se encontra nas mitocôndrias. Durante o amadurecimento ocorre uma mudança da enzima ligada para a forma solúvel, mas a atividade da enzima solúvel é sempre menor que a observada em frutos verdes (cerca de 17 % no caso da maçã) (Dorantes-Alvarez & Chiralt, 2000).
A actividade desta enzima pode ser afectada pela presença de inibidores, pelo pH ou pela temperatura. Inibidores com eficiência superior a 80% são as soluções neutras e acidificadas de cloreto de sódio, cloreto de cálcio e a combinação de cloreto de sódio e cálcio, bem como o ascorbato de cálcio usado na prevenção do escurecimento enzimático de fruta cortada (Luo et al., 2011).
O pH óptimo para a enzima PPO varia de 4,6 a 7,5 (Rocha et al., 2000; Alonso-Salces et al., 2004). Ainda assim, esta enzima é bastante tolerante a meios muito ácidos, sendo que só a um pH inferior a 2,5 existe uma quebra drástica de atividade para os 10 % (Zhou et al., 1993). Esta variabilidade da atividade da PPO em função do pH deve-se ao facto do centro ativo da PPO conter resíduos de histidina que a valores de pH inferiores a 6,0 começam a ter carga positiva na sua cadeia lateral (grupo imidazol). Assim, a pH baixos a atividade enzimática é restringida, mas num intervalo de 3,5 - 6,5 a atividade da PPO aumenta com o aumento do pH (Zemel et al., 1990).
Fenóis PPO Quinonas Polimerização Pigmentos escuros
Redução pelo ácido ascórbico
Fenóis PPO Quinonas Polimerização Pigmentos escuros
No que toca à resistência térmica, esta é também variável não só entre espécies de fruta mas também entre variedades da mesma fruta. Existem estudos de resistência térmica que são feitos com a enzima isolada e outros que são feitos com o fruto inteiro o que resulta em resultados díspares. Zhou e colaboradores (1993) estudaram a estabilidade térmica da PPO isolada da maçã Monroe e verificaram que a temperatura ideal é de 30°C para a reação com o catecol e a resistência térmica pode ir até aos 40°C, temperatura a partir da qual começa se começa a verificar um decréscimo da actividade da enzima observando-se uma inativação de 94 % aos 70 °C.
1.4.2.2. Impacto do escurecimento enzimático sobre a qualidade do sumo
O escurecimento enzimático dos tecidos danificados da fruta e vegetais é uma das principais causas de perda de qualidade da fruta e derivados (Komthong et al., 2006). Este escurecimento tem um efeito negativo não só na cor, mas também nas outras propriedades sensoriais incluindo odor e textura (Martinez & Whitaker, 1995). Além disso, o escurecimento enzimático causa perdas nutricionais e promove a deterioração dos frutos (Awad et al., 2000). A nível nutricional, a PPO está envolvida na degradação oxidativa do ácido ascórbico e dos polifenóis sendo esta tanto maior quanto maior for a susceptibilidade do polifenol à ação enzimática (Tomás-Barberán & Espín, 2001).
Os polifenóis na maçã estão muito associados ao flavor e à cor do sumo de maçã e da cidra, influenciando a amargura e a adstringência (Alonso-Salces et al., 2004), pelo que a composição em polifenóis na maçã é importante no desenvolvimento destes produtos. No caso das maçãs as procianidinas são as principais responsáveis por conferir adstringência (Tomás-Barberán & Espín 2001). Segundo Komthong e colaboradores (2006), a intensidade do odor a verde reduz-se depois de duas horas de escurecimento. Por outro lado, os odores doces aumentam drasticamente na primeira hora de escurecimento. As intensidades do aroma fresco, odor a maçã e odor frutado aumentam também intensamente depois do sumo escurecer. O aroma a amargo não apresenta alterações significativas. O aroma não natural decresce nos primeiros 15 minutos de escurecimento passando a crescer depois. Segundo os mesmos autores, estas alterações no aroma resultaram no melhoramento das qualidades sensoriais principalmente pelo facto de o odor a doce ser o mais importante na avaliação dos consumidores. Desta forma, os autores concluíram que nas primeiras duas horas de escurecimento houve melhoria no odor do sumo de maçã, tendo, no entanto, para tempos de escurecimento superiores, o odor piorou devido à formação de compostos indesejados.
1.4.3. Escurecimento não enzimático
compreendem essencialmente as reações de caramelização e as reações de Maillard. Adicionalmente, o escurecimento também pode dever-se à degradação de pigmentos (Burdulu & Karadeniz, 2003; Zhu et al., 2009).
A caramelização ocorre quando os açúcares são aquecidos a temperaturas elevadas. Nestas condições, os açúcares sofrem desidratação e condensação, ocorrendo a formação de estruturas complexas de massas moleculares diferentes. A reação Mailard ocorre entre os grupos amino dos aminoácidos e os açúcares redutores, sendo a causa mais importante de escurecimento não enzimático no sumo de maçã (Burdulu & Karadeniz, 2003). Da condensação entre o grupo amina e os açúcares redutores resulta uma glicosilamina N-substituída, que sofre vários rearranjos até originar, em condições de pH ácido, como é o caso dos sumos de maçã, o aparecimento do furfural (quando estão envolvidas pentoses) ou hidroximetilfurfural (HMF) (quando estão envolvidas hexoses). Estes compostos, por sua vez, podem sofrer reações ciclização, desidratação, isomerização, rearranjo e condensação que podem originar o aparecimento de polímeros nitrogenados castanhos, conhecidos como melanoidinas (Figura 1.16) (Martins et al., 2001).
Figura 1.16: Esquema da reacção de Maillard (Martins et al., 2001).
Durante o armazenamento de sumos e concentrados de maçã pode ocorrer o escurecimento não enzimático. Este escurecimento ocorre tanto mais depressa quanto mais elevada for a temperatura de armazenamento, uma vez que a velocidade da reação é tanto maior quanto maior for a temperatura. Mesmo quando os sumos e concentrados são armazenados em refrigeração, este
− Amino-composto + H2O
+
Aldose Amino-composto
+ Amino-composto
Melanoidinas
(polímeros nitrogenados castanhos) Aldeminas
e quetimas
Aldois e polímeros sem azoto HMF ou furfural
Base de Schiff de hidrometilfurfural (HMF) ou furfural
Produto de rearranjo Amadori (PRA) 1-amino-1-deoxi-2-quetose Glicosilamina N-substituída
Rearranjo de Amadori
PH 7
escurecimento pode ocorrer, embora num ritmo menos acelerado (Burdulu & Karadeniz, 2003). O escurecimento não enzimático pode levar a alguma perda de qualidade, por dar ao produto final uma aparência desfavorável, ou mesmo a uma redução na segurança do alimento, devido à formação de compostos potencialmente nocivos (Cohen et al., 1998). A existência de uma correlação positiva entre o escurecimento enzimático e a concentração de hidroximetilfurfural (HMF) levou a que a reação de Maillard fosse considerada a causa predominante deste processo (Burdulu & Karadeniz, 2003).
A velocidade das reações de Maillard varia em função da variedade de maçã porque, embora a reação ocorra apenas entre o grupo amina dos aminoácidos e os açúcares redutores, a matriz envolvente também tem influência. Assim, verificou-se que a maçã Golden tem uma velocidade de reação muito superior à da maçã Amasya. Esta diferença de sensibilidade em relação ao escurecimento não enzimático parece resultar da maçã Amasy apresentar uma maior proporção de cetoses (frutose) enquanto que a maçã Golden apresenta uma maior proporção de aldoses (glucose). É sabido que a reação de Maillard ocorre em maior extensão na presença de aldoses do que de cetoses, da mesma forma que ocorre em maior extensão na presença de aminoácidos básicos do que na presença de aminoácidos ácidos (Burdulu & Karadeniz, 2003).
1.5 Métodos alternativos de produção de sumo de maçã
O método convencional de produção de sumos de fruta, que passa sempre por tratamentos térmicos, tem consequências significativas sobre a qualidade sensorial e nutricional e sobre as propriedades funcionais do produto final. Com efeito, o método térmico comummente aplicado a produtos alimentares líquidos apresenta algumas desvantagens como a ocorrência de mudanças bioquímicas e nutricionais (mudanças de cor, redução de sabor e aroma e perdas de nutrientes e de vitaminas) que alteram a qualidade do produto final e tornam-no menos atrativo para o consumidor (Choi & Nielsen, 2005). A crescente procura de alimentos de alta qualidade e com menor grau de processamento tem motivado o desenvolvimento de vários métodos de processamento alternativos como, por exemplo, a utilização de radiação ionizante, luz pulsada, pulsos eléctricos, pasteurização com fluidos supercríticos, radiação ultravioleta e de pressão elevada (Ortega-Rivas et al., 1998). O interesse nestas novas tecnologias tem também como objetivo preservar compostos que possam protegem a saúde (compostos bioativos). A nível dos sumos, os tratamentos por pulsos elétricos e por altas pressões têm sido alvo de investigação intensiva, embora haja também muitas publicações sobre a combinação de diversas destas tecnologias.
polifenóis e a atividade antioxidante dos sumos tratados por estas tecnologias não apresentem melhorias significativas nas suas propriedades funcionais.
Em relação ao tratamento dos sumos por pressões elevadas, embora se tenham conseguido resultados promissores no que toca à eliminação de microrganismos, a inativação enzimática que se consegue é ainda insuficiente para evitar o escurecimento enzimático (Buckow et al., 2009). Mais ainda como os inibidores enzimáticos têm apenas uma ação temporária (Chow et al., 2011) a sua adição apenas retarda o escurecimento mas não resolve o problema, o que faz com que sumos de maçã produzidos com recurso a hiperpressões sejam particularmente escuros.
O tratamento por altas pressões tem o inconveniente de, através da disrupção da membrana celular do fruto, levar à ativação da PPO ligada à membrana, aumentando até 5 vezes a sua atividade (Tomás-Barberán & Espín, 2001). De facto, a inativação enzimática por altas pressões tem uma eficácia reduzida visto que para se reduzir a actividade da PPO em 90% é necessário aplicar pressões 800 MPa por 30 minutos (Weemaes et al., 1998). Estes valores estão no limite máximo utilizável a nível industrial (900 MP) e o tempo necessário é completamente insustentável para a produção em massa. De facto, na produção industrial de sumos por hiperpressão a pressão é mantida por menos de um minuto.
Suárez-Jacobo e colaboradores (2011) fizeram a comparação entre sumos tratados por tratamento térmico e por altas pressões e compararam com o sumo sem qualquer tipo de tratamento. Esta comparação evidenciou que a nível do perfil fenólico se obtiveram melhores resultados para o sumo pasteurizado seguido do sumo sujeito a altas pressões e por fim no sumo não tratado. Estes resultados foram explicados com base no grau de inactivação da PPO que foi total, no caso do sumo pasteurizado, parcial, no caso do sumo tratado por altas pressões e inexistente, no caso do sumo não processado. Esta observação reforça a ideia de que a PPO é uma das principais responsáveis pelas perdas de propriedades funcionais durante a produção e conservação dos sumos de fruta.
O tratamento dos sumos por pulsos eléctricos está relacionado com a instabilidade electromecânica das membranas celulares que resulta na formação irreversível de poros (electroporação). Este tipo de tratamento tem-se mostrado igualmente ineficiente na inactivação da PPO, mesmo combinando a técnica com a aplicação de radiação ultravioleta. Em termos sensoriais o sumo tratado por pulsos eléctricos não parece distanciar-se do sumo tratado por pasteurização, embora no caso do sumo tratado por pulsos eléctricos a perda de voláteis tenha sido muito inferior (Caminiti et al., 2011). Segundo Schilling e colaboradores (2007) e Noci e colaboradores (2008), o tratamento por pulsos eléctricos não parece ter uma influência significativa no perfil nutricional e de polifenóis dos sumos de maçã.
consegue alguma inactivação quando combinada com o aquecimento (Tomás-Barberán & Espín, 2001). Deste modo, nenhuma destas tecnologias resolve o problema da perda de voláteis.
Uma abordagem que tem sido tentada para melhorar o carácter funcional do sumo consiste no aproveitamento do prensado de maçã para enriquecer em compostos bioativos o sumo produzido de forma convencional. Lu & Foo (1997) quantificaram a existência de 7g de polifenóis por kg de prensado seco, dos quais mais de metade correspondiam a glicósidos de quercetina. Ao fazer-se uma extração do prensado com uma mistura equimolar de álcool e água e adicionando este extrato ao sumo conseguiu-se aumentar em cerca de cinco vezes a atividade antioxidante destes em relação ao sumo convencional, aumentando o seu teor em quercetina em mais de nove vezes (Van der Sluis et al., 2004).
2. Material e Métodos
2.1 Amostra
Para a produção do sumo de maçã foram adquiridas comercialmente maçãs da variedade Golden Delicious, produzidas em Portugal, com um calibre 50/60, tendo todas as modalidades de sumo não pasteurizado e todas as modalidades de sumo pasteurizado sido efectuadas com maçãs provenientes do mesmo lote.
2.2 Reagentes e meios de cultura
Na realização do presente trabalho foram utilizados os seguintes reagentes e meios de cultura: acetona (Panreac, 99,9%); acetonitrilo (Merck, Lichrosolv); ácido cítrico monohidratado (JMGS, 99,8%); ácido clorogénico (Sigma, 98%,HPLC); ácido fosfórico (Panreac, 85%); ácido gálico monohidratado (Merck, 99,5%); ácido L(+)ascórbico (Panreac, 99%); ácido tiobarbitúrico (TBA) (Acros, 98%); ácido tricloroacético (Riedel-de Haën, 99,5%); bacto triptona (Becton Dickinson and Company); carbonato de sódio anidro puro (JMGS); catecol (Sigma, 99%); cloreto de sódio (Panreac, 99,5%); epicatequina (Sigma, 90%,HPLC); etanol absoluto (Riedel-de Haën, 99,8%); hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (Merck, 99,5 %); 5-hidroximetilfurfural (HMF) (Aldrich); meio de cultura “plate count agar” (Becton Dickinson and Company); meio de cultura de lactose, sais biliares e verde brilhante (Biokar Diagnostics); meio de cultura de rosa de bengala e cloranfenicol (Biokar Diagnostics); quercetina 3- -D-glucosido (Sigma, 90%,HPLC); reagente de Folin-Ciocalteu (Merck). Na preparação de todas as soluções, diluições e meios de cultura, utilizou-se água ultrapura, captada a partir de um sistema de purificação Milli-Q (Millipore, Molsheim, França).
2.3 Preparação do sumo de maçã
Figura 2.1: Fluxograma de extração e análise do sumo de maçã.
