Capacidade antioxidante de bebidas aromatizadas:
águas e chás
junho, 2011
Tese de Doutoramento
Capacidade antioxidante de bebidas aromatizadas:
águas e chás
Maria de Fátima de Sá Barroso
Dissertação de candidatura ao grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas – Química Analítica,
apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto
Orientação
Professora Doutora Maria Beatriz Prior Pinto Oliveira
Porto junho, 2011
© Autorizada a reprodução parcial desta dissertação (condicionada à autorização das editoras das revistas onde os artigos foram publicados) apenas para efeitos de investigação, mediante declaração escrita do interessado, que a tal se compromete.
A realização deste trabalho foi possível graças à concessão de uma Bolsa de Doutoramento (SFRH/BD/29440/2006) pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), financiada pelo Programa Operacinal Potencial Humano (POPH) - Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN) - Tipologia 4.1 - Formação Avançada, comparticipado pelo Fundo Social Europeu (FSE) e por Fundos Nacionais do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES). Em associação à Bolsa de Doutoramento, a candidata contou ainda com subsídios para a realização de trabalho no estrangeiro, para deslocamento a congressos internacionais e para a execução gráfica desta tese.
Os estudos apresentados nesta dissertação foram realizados no Laboratório Grupo de Reacção e Análise Química (GRAQ) do Instituto Superior de Engenharia do Porto do Instituto Politécnico do Porto, no Serviço de Bromatologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, no Laboratório de Química Orgânica Física/Química Radicalar do Departamento de Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa e no Grupo de Electroanálisis da Faculdade de Química da Universidade de Oviedo.
AGRADECIMENTOS
.“…Eu não posso brincar contigo, disse a raposa. Não me cativaram ainda. Ah! desculpa, disse o principezinho. Após uma reflexão, acrescentou: - Que quer dizer "cativar"? …… - É uma coisa muito esquecida, disse a raposa. Significa "criar laços. - Criar laços?..”
Antoine de Saint-Exupéry em O Principezinho
Tal como Saint-Exupéry também a autora desta dissertação cativou, e deixou-se cativar pelas inúmeras pessoas com quem se cruzou a nível profissional e pessoal nestes 4 anos de trabalho. Sem o apoio de muitas pessoas teria sido muito difícil chegar à reta
final deste trabalho e atracar num porto seguro. Por issoficamosmeusagradecimentos à:
Fundação para a Ciência e Tecnologia pela concessão de uma bolsa de doutoramento (SFRH/BD/29440/2006), sem a qual seria impossível realizar este trabalho.
Ao diretor da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto Professor Doutor José Luís da Costa, ao ex-diretor Professor Doutor José Manuel Sousa Lobo e à Doutora Isabel Guimarães pelo apoio prestado nas questões burocáticas associadas ao processo de doutoramento.
À minha orientadora Professora Doutora Beatriz Oliveira por me ter acolhido como aluna, pela ajuda prestada no decorrer do trabalho, pelo apoio incondicional e pela amizade que foi crescendo nestes 4 anos, e também à Professora Doutora Cristina Delerue-Matos, com quem tenho o previlégio de ter criado laços à mais de 10 anos, pelo seu apoio incondicional, pelos seus conselhos e por me ajudar a crescer a nível pessoal e científico.
À Professora Teresa Teles, à Professora Sandra Ramos à Engenheira Aurora Silva e à Engenheira Elisa Soares pelo apoio prestado nas análises mineralógicas e estudos estatísticos.
Ao Professor João Paulo Noronha, pela simpatia e entusiasmo com que me recebeu no seu laboratório, pels constante preocupação e permanente disponibilidade e por todo o apoio científico prestado que permitiu valorizar este trabalho.
À Professora Rosa Fireman Dutra e ao Doutor Joilson Jesus, que me receberam no outro lado do Atlântico de braços abertos, por estarem sempres disponiveis, pelo apoio e por todo o ensinamento. Ao Professor Lauro Kubota pelo valioso contributo na análise dos resultados.
À Professora Noemí de-los-Santos Alvarez, e ao Professor Paulino Tuñón Blanco, por me terem acolhido num magnífico laboratório, por me terem oferecidas condições ótimas de trabalho, e por todo apoio científico e aprendizagem adquiridos no decorrer do trabalho.
Aos meus colegas do laboratório por me ouvirem e me apoiarem em inúmeras situações, e em especial à Doutora Marta Neves pela simpatia e ajuda aquando na estadia no estrangeiro.
À minha família, país, irmãos, sobrinhos, marido e filhos, mais do que agradecer a paciência, apoio e conselhos seguem as minhas desculpas pela ausência e pelo apoio que não foram prestados.
RESUMO
A produção contínua de radicais livres, durante os processos metabólicos, é compensada pelos mecanismos de defesa antioxidante. Estes visam eliminar ou reduzir os níveis destes radicais nas células e assim proteger o organismo dos seus efeitos pejorativos.
Os alimentos e as bebidas são uma boa fonte exógena de antioxidantes. As águas com sabores, sendo constituídas por aromas naturais, extratos de vegetais (chá) e sumos de fruta, devem apresentar alguma capacidade antioxidante. Este tipo de refrigerante (águas com sabores) foi desenvolvido recentemente e, por isso, não se encontrava caraterizado no que concerne aos fatores com efeito benéfico na saúde humana, nomeadamente a capacidade antioxidante.
O objetivo principal desta dissertação consistiu em melhorar o conhecimento acerca da composição química e antioxidante das diversas águas com sabores disponíveis no mercado português.
Numa primeira fase efetuou-se a caraterização mineralógica destas águas, tendo-se avaliado um total de 18 minerais: 4 macrominerais (Ca, Mg, K e Na), 3 microminerais (Fe, Cu e Zn) e 11 elementos vestigiais (Al, As, Cd, Cr, Co, Hg, Mn, Ni, Pb, Se e Si). Os teores determinados destes minerais estavam dentro dos limites estipulados por lei e eram variáveis de marca para marca, o que está relacionado com a sua origem.
Seguiu-se a avaliação de parâmetros relacionados com a ação antioxidante, através de métodos óticos convencionais, nomeadamente, o teor fenólico total, o teor de flavonoídes total, o poder redutor e a atividade anti-radicalar das águas e dos aromas usados na sua formulação. Para um melhor conhecimento da composição química dos aromas foi avaliado o perfil de terpenóides por HS-SPME/GC-MS.
De acordo com os resultados, as amostras de águas e aromas apresentam capacidade antioxidante e atividade anti-radicar. No entanto, não foram detetados flavonóides. A análise dos aromas indicou a presença de monoterpenos e sesquiterpenos.
Na sequência do trabalho desenvolveram-se metodologias alternativas para a quantificação da capacidade antioxidante de águas com sabores. Procedeu-se à construção de biossensores de ADN, usando bases púricas (adenina ou guanina) ou cadeias simples de ADN imobilizadas na superfície de elétrodos de carbono vítreo ou de pasta de carbono, respetivamente.
O princípio de funcionamento destes biossensores baseou-se na avaliação do dano provocado por radicais livres (hidroxilo, superóxido e sulfato) e da proteção de antioxidantes (ácido ascórbico, ácido gálico, ácido cafeico, ácido cumárico e resveratrol),
usando-se a voltametria de onda quadrada, voltametria cíclica ou voltametria de impulso diferencial, como técnicas de deteção
Verificou-se que os radicais livres hidroxilo (OH•), superóxido (O2•-) e sulfato (SO4•-)
provocam danos oxidativos na adenina e na guanina imobilizada na superfície do elétrodo de carbono vítreo. Por outro lado, os antioxidantes, ácido ascórbico, ácido gálico, ácido cafeíco, ácido cumárico e o resveratrol protegem a adenina e a guanina dos danos provocados pelos radicais.
Com os biossensores de cadeia simples de ADN os radicais livres usados foram o
hidróxilo (OH•) e o superóxido (O2•-). Neste caso o dano oxidativo e a proteção produzida
pelo ácido ascórbico foram avaliados através da medição da corrente eletrocatalítica do NADH.
Estes biossensores foram usados para determinar a capacidade antioxidante total das águas aromatizadas, tendo-se verificado capacidade de proteção ao dano causado por radicais livres.
ABSTRACT
The continuous production of free radicals during the metabolic process is balanced by antioxidant defense mechanisms. These mechanisms aim to eliminate or reduce the levels of these radicals in the cells and thus protect the organism from its deleterious effects.
Food and beverages are good exogenous sources of antioxidants. Flavoured water, which has natural flavours, vegetable extracts (like tea) and fruit juices, should have some antioxidant capability. This type of beverage (flavoured water) is quite recent and so, its beneficial health factors, namely antioxidant capability, are not yet assessed.
The main goal of this dissertation consisted in improving the knowledge concerning the chemical and antioxidant composition of the several flavoured waters available in the Portuguese consumer market.
In a first stage, a minerologic caracterization of the waters was done; a total of 18 mineral were assessed: 4 macrominerals (Ca, Mg, K and Na), 3 microminerals (Fe, Cu and Zn), and 11 trace elements (Al, As, Cd, Cr, Co, Hg, Mn, Ni, Pb, Se and Si). The levels of all these minerals were within legal limits but varied from brand to brand, due to its different sources.
Then, an assessment of antioxidant capability parameters was done. Conventional optical methods were used, namely, total phenolic content, total flavonoid content, reducing power and DPPH radical scavenging activity of the waters and flavours used. To better understand the chemical composition of flavours, the terpenoid profile was assessed, using HP-SPME/GC-MS.
According to the results, the water samples and flavours presented antioxidant capacity and radical scavenging activity. However, no flavonoids were found. The analysis of flavour detected the presence of monoterpenes and sesquiterpenes.
In the work flow, alternative methods were developed to quantify the antioxidant capacity of flavoured waters. DNA biosensors were assembled, using purine bases (adenine and guanine) or single strainded DNA, immobilized on the glassy carbon electrode surface or carbon paste electrode surface, respectively.
The operating principle of these biosensors was based in assessing damage promoted by free radicals (hydroxyl, superoxide, sulfate) and the protection made by the antioxidants (ascorbic acid, gallic acid, caffeic acid, coumaric acid and resveratrol), using square wave voltammetry, cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry, as the detection technique.
It was verified that the free radicals hydroxyl (OH•), superoxide (O2•-)and sulfate (SO4•-)
surface. On the other hand, antioxidants, ascorbic acid, gallic acid, caffeic acid, coumaric acid and resveratrol protect adenine and guanine from free radical damage.
With DNA-based biosensors, hydroxyl and superoxide were the free radicals used. In this case, the oxidative damage and the protection granted by ascorbic acid were assessed through measuring electrocatalytic current of NADH.
These biosensors were used to determine the total antioxidant capability of flavoured waters, and it was verified that these waters present antioxidant capacity.
RÉSUMÉ
La production continue de radicaux libres au cours du processus métabolique est contrebalancé par des mécanismes de défense antioxydante. Ces mécanismes visent à éliminer ou à réduire les niveaux de ces radicaux dans les cellules et donc de protéger l'organisme contre ses effets délétères.
Les aliments et les boissons sont de bonnes sources d'antioxydants exogènes. Les eaux aromatisées, qui ont des arômes naturels, des extraits de végétaux (comme le thé) et des jus de fruits, devraient avoir une certaine capacité antioxydante. Ce type de boissons (eaux aromatisées) sont assez récente et donc, ses effets bénéfiques pour la santé, à savoir la capacité antioxydante, ne sont pas encore évalués. L'objectif principal de cette thèse a consisté à améliorer les connaissances concernant la composition chimique et antioxydantes de diverses eaux aromatisées disponibles sur le marché des consommateurs portugais.
En premier, une caractérisation minéralogique des eaux a été faite; un total de 18 minéraux ont été évalués: 4 macrominéraux (Ca, Mg, K et Na), 3 microminéraux (Fe, Cu et Zn), et 11 éléments résiduels (Al , As, Cd, Cr, Co, Hg, Mn, Ni, Pb, Se et Si). Les niveaux de tous ces minéraux étaient dans les limites légales, mais variaient d'une marque à l'autre, en raison de ses différentes sources.
Ensuite, une évaluation des paramètres de la capacité antioxydante a été faite. Les méthodes classiques optiques ont été utilisés, à savoir, le contenu totale en phénoliques, le contenu totale en flavonoïdes, le pouvoir réducteur et l'activité antioxydant mesurée par le radical DPPH des eaux et arômes utilisés. Pour mieux comprendre la composition chimique des saveurs, le profil de terpénoïdes a été évaluée, en utilisant HP-SPME/GC-MS.
Selon les résultats, les échantillons d'eaux et de saveurs présentent des capacités antioxydantes et une activité anti-radicale. Toutefois, aucune flavonoïdes n’ont été trouvées. L'analyse des aromes détecte la présence de monoterpènes et sesquiterpènes.
Dans le deroulement des travaux, d'autres méthodes ont été développées pour quantifier la capacité antioxydante des eaux aromatisées. Des biocapteurs d'ADN ont été assemblés, en utilisant des bases puriques (adénine et la guanine) ou brin simple l'ADN immobilisé sur la surface de l'électrode de carbone vitreux ou sur la surface de l’électrode de pâte de carbone, respectivement.
Le principe de fonctionnement de ces biocapteurs a été fondé dans l'évaluation des dommages provoqués par les radicaux libres (hydroxyle, superoxyde, sulfate) et la protection faites par les antioxydants (l’acide ascorbique, l’acide gallique, l’acide caféique,
l'acide coumarique et le resvératrol), en utilisant la voltamétrie à onde carrée, voltamétrie cyclique et la voltamétrie à impulsion différentielle, ainsi que la technique de détection.
Il a été vérifié que les radicaux libres hydroxyles (OH•), superoxyde (O2• -) et de sulfate
(SO4• -) induisent des lésions oxydatives dans l'adénine et la guanine qui a été
immobilisée dans la surface de l'électrode. D’ une autre part, les antioxydants, l’acide ascorbique, l’acide gallique, l’acide caféique, l'acide coumarique et le resvératrol protégent l’adénine et la guanine des dommages provoqués par les radicaux libres. Avec les biocapteurs basés sur l'ADN, les radicaux libres qui ont été utilisées ont été l’hydroxyle et le superoxyde. Dans ce cas, les dommages oxydatifs et la protection accordée par l'acide ascorbique ont été évalués par le mesure de courant électrocatalytique de NADH.
Ces biocapteurs ont été utilisés pour déterminer la capacité antioxydante totale des eaux aromatisées, et l’on observe que ces eaux présentent des capacités antioxydantes.
RESUMEN
La continua producción de radicales libres en los procesos metabólicos es contrarrestada por los mecanismos antioxidantes de defensa. El objetivo de dichos mecanismos es eliminar o reducir los niveles de estos radicales en las células y, por lo tanto, proteger el organismo de sus efectos nocivos.
Los alimentos y las bebidas son una buena fuente de antioxidantes. Las aguas con sabores, las cuales contienen aromas naturales, extractos vegetales (como el te) y zumos de frutas, deberían tener actividad antioxidante. Este tipo de bebidas (aguas de sabores) es bastante reciente y, por tanto, su efecto beneficioso sobre la salud en relación con su capacidad antioxidante aún no ha sido estudiada.
El principal objetivo de esta Tesis Doctoral consiste en mejorar el conocimiento relacionado con la composición química y de antioxidantes de varias agua de sabores disponibles en el mercado portugués.
En una primera etapa, se llevó a cabo la caracterización mineralógica. Un total de 18 minerales fueron estudiados: 4 macrominerales (Ca, Mg, K y Na), 3 microminerales (Fe, Cu y Zn) y 11 elementos traza (Al, As, Cd, Cr, Co, Hg, Mn, Ni, Pb, Se y Si). El nivel encontrado de estos minerales está dentro de los límites legales aunque varía entre marcas debido a su diferente origen.
Posteriormente, se estudiaron los parámetros relacionados con la capacidad antioxidante. Para ello se emplearon métodos ópticos convencionales como el contenido fenólico total, contenido de flavonoides total, el poder reductor y la actividad de eliminación del radical DPPH. Para comprender mejor la composición química de los aromas, el perfil de terpenoides fue estudiado por HP-SPME/GC-MS.
Los resultados obtenidos permiten afirmar que las muestras de agua y aromas presentan capacidad antioxidante y de eliminación de radicales. Sin embargo, no se encontraron flavonoides. El análisis de aroma detectó la presencia de monoterpenos y sesquiterpenos.
En el curso del trabajo también se desarrollaron métodos alternativos para cuantificar la capacidad antioxidante de aguas de sabores. Se prepararon sensores usando las bases púricas (adenina y guanina) o ADN monocatenario inmovilizado sobre electrodos de carbono vítreo o de pasta de carbono, respectivamente.
El principio de operación de estos biosensores está basado en la detección del daño ocasionado por los radicales libres (hidroxilo, superóxido, sulfato) y la protección ejercida por los antioxidantes (ácido ascórbico, ácido gálico, ácido cafeico, ácido cumárico y resveratrol) usando voltametría de onda cuadrada, voltametría cíclica y voltametría de pulso diferencial como técnicas de detección.
Se comprobó que los radicales libres hidroxilo(OH•), superóxido (O2•-) y sulfato (SO4•-)
inducen daño oxidativo en adenina y guanina inmovilizada sobre la superficie electródica. Por otra parte, los antioxidantes ácido ascórbico, ácido gálico, ácido cafeico, ácido cumárico y resveratrol protegen a la adenina y a la guanina del daño de los radicales libres.
Con los biosensores basados en ADN, los radicales libres usados fueron el hidroxilo y el superóxido. En estos casos, el daño oxidativo y la protección ejercida por el ácido ascórbico fue estudiada a través de la medida de la corriente electrocatalítica de NADH.
Estos biosensores fueron usados para determinar la capacidad antioxidante total de aguas con sabores comprobándose que, en efecto, estas aguas presentan capacidad antioxidante.
TRABALHOS (PUBLICAÇÕES E COMUNICAÇÕES) DESENVOLVIDOS NO ÂMBITO DO PROJETO DE DOUTORAMENTO
Publicações de artigos em revistas de circulação internacional com arbitragem científica referenciadas no Journal Citation Reports da ISI Web of Knowledge:
1. Flavoured versus natural waters: Macromineral (Ca, Mg, K, Na) and micromineral (Fe, Cu, Zn) contents
M. Fátima Barroso, Aurora Silva, Sandra Ramos, M. T. Oliva-Teles, Cristina Delerue-Matos, M. Goreti F. Sales, M.B.P.P. Oliveira
Food Chemistry, 2009, 116 (2), 580-589
2. Survey of trace elements (Al, As, Cd, Cr, Co, Hg, Mn, Ni, Pb, Se, and Si) in retail samples of flavoured and bottled waters
M. F. Barroso, S. Ramos, M. T. Oliva-Teles, C. Delerue-Matos, M. G. F. Sales, M. B. P. P. Oliveira
Food Additives and Contaminants: Part B – Surveillance, 2009, 2 (2), 121-130
3. Flavored waters: Influence of ingredients on antioxidant capacity and terpenoid profile by HS-SPME/GC-MS
M. Fátima Barroso, J. P. Noronha, Cristina Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira
Journal of Food and Agricultural Chemistry, 2011, 59 (9), 5062-5072
4. DNA-based biosensor for the electrocatalytic determination of antioxidant capacity in beverages
M. F. Barroso, N. de-los-Santos-Álvarez, M.J. Lobo-Castañón, A. J. Miranda-Ordieres, C. Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira, P. Tuñón-Blanco
Biosensors and Bioelectronics, 2011, 26 (5), 2396-2401
5. Electrochemical DNA-sensor for evaluation of total antioxidant capacity of flavours and flavoured waters using superoxide radical damage
M. F. Barroso, C. Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira
6. Electrocatalytic evaluation of DNA damage by superoxide radical for antioxidant capacity assessment
M. F. Barroso, N. de-los-Santos-Álvarez, M. J. Lobo-Castañón, A. J. Miranda-Ordieres, C. Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira, P. Tuñón-Blanco
Journal of Electroanalytical Chemistry, 2011, em publicação
doi:10.1016/j.jelechem.2011.04.022
7. Electrochemical evaluation of total antioxidant capacity of beverages using a purine- biosensor
M. F. Barroso, C. Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira
Food Chemistry (submetido)
8. Evaluation of total antioxidant capacity of flavoured waters using sulfate radical damage of purine-based sensors
M. F. Barroso, C. Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira
Electrochimica Acta (submetido)
9. Towards a reliable technology for antioxidant capacity and oxidative damage evaluation: electrochemical (bio)sensors
M. Fátima Barroso, N. de-los-Santos-Álvarez, C. Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira Biosensor and Bioelectronics (submetido)
Publicações de artigos ou resumos alargados em atas de encontros científicos
1. Águas naturais versus aromatizadas: Influência dos ingredientes adicionados na composição mineral
M. F. Barroso, C. Delerue-Matos, M. G. Sales, M. B. P. P. Oliveira
Atas do 9º Encontro de Química dos Alimentos, 29 Abril-2 Maio, 2009, Angra do
Heroísmo, Açores
Comunicações em poster em encontros científicos internacionais:
1. Evaluation of trace elements in flavoured waters: a case study
M. F. Barroso, M. T. Oliva-Teles, C. Delerue-Matos, M. G. Ferreira Sales, M. B. P. P. Oliveira
Rapid Methods Europe 2008 for Food and Feed Safety and Quality, P34, 21-23 Janeiro, 2008, Noordwijkerhout, Holanda, 2008
2. Macrominerals in flavoured waters
M. Fátima Barroso, M.T. Oliva-Teles, Cristina Delerue-Matos, M. Goreti F. Sales, M. B. P. P. Oliveira
AOAC Europe Section International Workshop e II encontro Nacional de Bromatologia, Hidrologia e Toxicologia, P3FNFA, 17-18 Abril, 2008, Lisboa, Portugal
3. Antioxidant capacity evaluation in flavour and flavoured waters by total phenolic and flavonoid contents, reuducing power and DPPH scavenging assays
Maria Fátima Barroso, Cristina Delerue-Matos, João Paulo Noronha, Maria Beatriz Oliveira, Maria Goreti Sales
1st European Food Congress, P208, 4-9 Novembro, 2008, Ljubljana, Slovenia
4. Investigations on the electrocatalytic assessment of antioxidant capacity using a DNA-Modified carbon paste electrode
M. F. Barroso, N. de-los-Santos-Álvarez, M. J. Lobo-Castanon, A. J. Miranda-Ordieres, M. G. Ferreira Sales, M. B. P. P. Oliveira, C. Delerue-Matos
Euro Analysis 2009, P081-B2, 6-10 Setembro, 2009, Innsbruck, Áustria
5. Development of a DNA-modified sensor to evaluate the total antioxidant capacity of flavoured waters
M. Fátima Barroso, J. Paulo Noronha, M. Goreti F. Sales, Cristina Delerue-Matos, M. Beatriz P. P. Oliveira
4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis, N-23, 4-6
Novembro, 2009, Prague, Czech Republic
6. Antioxidant capacity of flavoured waters by electrochemical DNA-Biosensor M. Fátima Barroso, M. Goreti Sales, Cristina Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira
13th International Conference on Electroanalysis, Pin-40, 20-24 Junho, 2010, Gigon,
Spain
7. DNA damage generated by a sulphate radical and the protective effect of dietary antioxidants using an electrochemical DNA biosensors
M. Fátima Barroso, M. Goreti Sales, Cristina Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira
13th International Conference on Electroanalysis, Pin-41, 20-24 Junho, 2010, Gigon,
Comunicações em poster em encontros científicos nacionais:
1. Aguas naturais versus aromatizadas: Influência dos ingredientes adicionados na composição mineral
M. F. Barroso, S. Ramos, C. Delerue-Matos, M. G. Sales, M. B. P. P. Oliveira
9º Encontro de Química dos Alimentos, P42, 29 Abril-2 Maio, 2009, Angra do Heroísmo, Açores.
ÍNDICE Agradecimentos IX Resumo XI Abstract XIII Résumé XV Resumen XVII
Trabalhos desenvolvidos no âmbito do projeto de doutoramento XIX
Índice XXIII
Lista de Abreviaturas e Símbolos XXV
I. REVISÃO DO ESTADO DA ARTE 1
Organização e estrutura da dissertação 3
Objetivos 5
Introdução geral 7
Referências 12
CAPÍTULO 1. Métodos eletroquímicos 17
Towards a reliable technology for antioxidant capacity and oxidative
damage evaluation: electrochemical (bio)sensors 19
II. INVESTIGAÇÃO E DESENVOLVIMENTO 51
CAPÍTULO 2. Composição mineralógica 53
2.1. Flavoured versus natural waters: Macromineral (Ca, Mg, K, Na) and
micromineral (Fe, Cu, Zn) contents 55
2.2. Survey of trace elements (Al, As, Cd, Cr, Co, Hg, Mn, Ni, Pb, Se, and
Si) in retail samples of flavoured and bottled waters 77
CAPÍTULO 3. Perfil antioxidante – métodos convencionais 99 Flavored Waters: Influence of Ingredients on Antioxidant Capacity and
Terpenoid Profile by HS-SPME/GC-MS
101
CAPÍTULO 4. Construção de biossensores de bases púricas 127 4.1. Electrochemical evaluation of total antioxidant capacity of beverages
4.2. Electrochemical DNA-sensor for evaluation of total antioxidant capacity of flavours and flavoured waters using superoxide radical damage
149
4.3. Evaluation of total antioxidant capacity of flavoured waters using sulfate radical damage of purine-based sensors
167
CAPÍTULO 5. Construção de biossensores de ADN 187
5.1. DNA-based biosensor for the electrocatalytic determination of antioxidant capacity in beverages
189
5.2. Electrocatalytic evaluation of DNA damage by superoxide radical for antioxidant capacity
207
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Na lista apresentada constam termos em português e em inglês, consoante a língua em que são utilizados ao longo da dissertação.
A• reactive radical
AA ascorbic acid
AAS atomic absorption spectrophotometry
ACu ácido cumárico
AdSV Adsorptive stripping voltammetry
AH phenolic antioxidant
AOC antioxidant capacity
APHA American Public Health Association
AuE gold electrode
BHA tert-butylhydroxy anisole
BHT butylated hydroxytolurene
CA caffeic acid
CF carbon fiber
CMEs chemically modified electrodes
CNTECE carbon nanotube epoxy composite electrode
CPE carbon paste electrode
CV cyclic voltammetry
DA dopamine
dA21 deoxyadenylic acid oligonucleotide
DCTMACl docosyltrimethylammonium chloride
DNA deoxyribonucleic acid
DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
DPV differential pulse voltammetry
dsDNA double strainded DNA
E potential
EFSA European Food Safety Authority
EI electronic impact
Eº´ formal potential
Ep peak potential
EPA Environmental Protection Agency
FAO Food and Agriculture Organisation
FC Folin-Ciocalteu
FDA Food and Drug Administration
FIA flow injection analysis
FNB/IOM Food and Nutrition Board of the Institute of Medicine
FRAP ferric reducing antioxidant power
GA gallic acid
GCE glassy carbon electrode
GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
GPES general purpose electrochemical system
H2O2 hydrogen peroxide
HAT hydrogen atom transfer
HOCl hypochorous acid
HOPC highly oriented pyrolytic graphite
HRP horseradish peroxidase
HS-SPME Headspace-solid-phase microextraction
i current
Ia electrocatalytic current in the presence of an antioxidant
ICP–AES inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy
ICP–MS inductively coupled plasma-mass spectrometry
Id electrocatalytic current in the absence of an antioxidant
ip peak current
JECFA Joint Expert Committee on Food Additives
LDL low-density lipoprotein
LOD limit of detection
LOQ limit of quantification
LSV linear sweep voltammetry
LSW linear sweep voltammetry
M metal
m/m massa/massa
MAE microwave-assisted extraction
MWCNs multi-walled carbon nanotubes
NADH nicotinamide adenine dinucleotide disodium salt, reduced form
NiHCF nickel hexacyanoferrate
NO• nitric oxide radical
O2•- Superoxide radical, radical superóxido
OH• hydroxyl radical, radical hidroxilo
ORAC oxygen radical absorbance capacity
PAMAM poly(amidoamine)
PBS phosphate buffer saline
PCL photochemiluminescence
PDMS/DVB polydimethylsiloxane/divinylbenzene
PGE pyrolytic graphite electrode
PGEs pencil graphite electrodes
PPO polyphenol oxidase
PRTC peroxyl radical trapping capacity
PS polystyrene
PTDI provisional tolerable daily intake
PtE platinium electrode
PTWI provisional tolerable weekly intake
RDA recommended dietary allowance
RE relative error
REC recovery
RES resveratrol
RfD reference dose
RNS reactive nitrogen species
RO• alkoxyl radical
ROO• peroxyl radical
ROS reactive oxygen species
RSA radical-scavenging activity
RSD relative standard deviations
SAM self assembled monolayer
SAMe s-adenosyl-L-methionine
SD standard deviation
SET single electron transfer
SFE supercritical fluid extraction
SO4•– sulfate radical, radical sulfato
SOD superoxide dismutase
SPE screen printed electrode
SPE-Au gold-screen printed electrode
ssDNA single strainded DNA
SSPE concentrated saline sodium phosphate EDTA
SV stripping voltammetry
SWCNs single-walled carbon nanotubes
SWV square wave voltammetry
TAC total antioxidant capacity
TEAC trolox equivalent antioxidant capacity assay
TFC total flavonoid content
TOSC total oxidant scavenging capacity
TPC total phenol content or total phenolic content
TRAP total radical-trapping antioxidant parameter
Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid
UV / VIS ultraviolet-visible
v/v volume/volume
WHO World Health Organization
XOD xanthine oxidase
Γ surface coverage
I.
REVISÃO DO ESTADO DA ARTE
ORGANIZAÇÃO E ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
A presente dissertação inclui todos os artigos científicos (6 publicados e 3 submetidos) resultantes do projeto de doutoramento, pretendendo-se assim que todos os trabalhos desenvolvidos tivessem já sido objeto de análise crítica por parte de diferentes revisores internacionais, especialistas na área de investigação em que se inserem, e selecionados de acordo com os critérios de cada revista em que o respetivo artigo foi publicado.
Todos os artigos estão escritos em inglês. Optou-se por manter a formatação original, adaptada ao corpo da tese, com a qual os textos foram submetidos ou publicados, de acordo com as normas específicas de cada revista. Assim, encontram-se variações na estrutura dos diferentes artigos apresentados ao longo dos capítulos e no modo como são indicadas as referências. Toda a bibliografia que não está integrada nas publicações, é apresentada de acordo com a norma de Vancouver aconselhado pelas “normas de formatação das dissertações de mestrado e teses de doutoramento” da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto.
Os textos que se apresentam em português foram elaborados de acordo com o novo acordo ortográfico.
A dissertação está organizada em duas partes: a Parte I corresponde à Revisão do
Estado da Arte; a Parte II é designada por Investigação e Desenvolvimento, onde se
inclui toda a investigação desenvolvida na componente experimental.
Assim, na Parte I, com uma abordagem mais teórica, faz-se inicialmente uma introdução geral ao tema “águas com sabores”, com o objetivo de contextualizar o trabalho desenvolvido, abordando questões como o consumo desta bebida em Portugal e fazendo referência à legislação nacional sobre sobre águas de consumo. A esta breve introdução, segue-se a descrição dos objetivos do trabalho. Ainda dentro desta primeira parte, é apresentado o Capítulo 1 constituído por um artigo, em que se faz a Revisão do Estado da Arte no que se refere a todos os métodos eletroquímicos utilizados para a determinação da capacidade antioxidante de diversas matrizes.
A Parte II da dissertação é constituída por 4 capítulos (capítulos 2 a 5). No geral, cada capítulo é constituído por um ou mais artigos. O Capítulo 2 integra 2 artigos científicos correspondentes à determinação mineralógica das águas com sabores e respetivas águas naturais. O primeiro artigo refere-se à determinação de macrominerais (Ca, Mg, K e Na) e microminerais (Fe, Cu e Zn) enquanto que o segundo aborda a determinação dos minerais vestigiais (Al, As, Cd, Cr, Co, Hg, Mn, Ni, Pb, Se e Si). O Capítulo 3 (1 artigo) corresponde à determinação do perfil antioxidante das águas com sabores e seus aromas através de métodos óticos convencionais. O perfil antioxidante foi feito através da determinação do teor fenólico total, teor total de flavonóides, poder redutor e atividade
anti-radicalar. O trabalho apresentado neste capítulo foi elaborado em colaboração com o Laboratório de Cromatografia da Linha de Química Orgânica Física/Química Radicalar do departamento de Química da FCT-UNL. O Capítulo 4 (3 artigos) e Capítulo 5 (2 artigos) correspondem ao desenvolvimento das metodologias analíticas alternativas, para a determinação da capacidade antioxidante, baseadas em técnicas eletroquímicas e na construção de biossensores. No Capítulo 4 refere-se a construção de biossensores de adenina e de guanina. Estes biossensores foram sujeitos ao ataque oxidativo induzido por 3 radicais livres (hidroxilo, superóxido e sulfato) e avalia-se o efeito protetor promovido por 5 antioxidantes (ácido ascórbico, ácido gálico, ácido cafeico, ácido cumárico e resveratrol). Cada artigo corresponde a um dos radicais. No Capítulo 5, os artigos descrevem a construção de biossensores de cadeia simples de ADN em que se usaram o radical hidroxilo e o superóxido para a promoção do dano oxidativo. O trabalho experimental associado a este capítulo foi desenvolvido no Grupo de Electroanálisis da Faculdade de Química da Universidade de Oviedo.
No final da dissertação apresentam-se as Considerações Finais. Optou-se por esta designação, uma vez que se foram apresentando conclusões parciais ao longo dos diferentes capítulos. Nesta medida, o final desta dissertação não é necessariamente um culminar de um projeto, mas pretende apenas apresentar um conjunto de reflexões sobre o trabalho realizado, perspetivando projetos e atividades de investigação futuras.
OBJETIVOS
Considerando a ausência de estudos científicos na matriz água aromatizada, considerou-se importante avaliar algumas propriedades desta nova bebida lançada no mercado. Por isso os objetivos desta dissertação foram:
• Caraterizar quimicamente, no que diz respeito ao teor de macrominerais,
microminerais e minerais vestigiais, as águas com sabores;
• Analisar os aromas adicionados a estas águas por HS-SPME/GC-MS;
• Avaliar o perfil antioxidante destas águas e dos aromas usados na sua formulação,
através da avaliação do teor fenólico total, do teor de flavonóides total, poder redutor e atividade anti-radicalar usando os métodos óticos convencionais;
• Desenvolver metodologias analíticas alternativas para a determinação da capacidade
antioxidante das águas com sabores:
• Construir biossensores eletroquímicos de cadeia simples de ADN ou de bases
púricas (adenina ou guanina);
• Estudar o dano oxidativo induzido por radicais livres (hidroxilo, superóxido e
sulfato) na superfície modificada do elétrodo.
• Estudar a proteção promovida por antioxidantes na superfície modificada do
elétrodo;
• Avaliar a capacidade antioxidante total das águas com sabores utilizando estes
INTRODUÇÃO GERAL
É do conhecimento geral que a água é indispensável à vida sendo um fator primordial na qualidade de vida e imprescindível a todos os aspetos da existência humana. A água representa cerca de 60 a 70 % do peso corporal e é responsável pelo controlo da temperatura corporal, pela manutenção do volume vascular, por possibilitar as reações enzimáticas envolvidas na digestão, e pela absorção e metabolismo. Além de transportar substâncias como nutrientes e oxigénio para as células, promove a excreção de toxinas através dos rins. Uma hidratação correta contribui para o bem-estar e para a manutenção da saúde.
A ingestão diária de água deve compensar as perdas de fluidos que ocorrem através da excreção urinária, transpiração e respiração (1,2). Dependendo do género e da idade do indivíduo, as quantidades diárias recomendadas para a ingestão de água podem variar entre 0,7 L (bebés entre os 0-6 meses) 2,7 L (mulheres com idade superior a 19 anos) e 3,7 L (homens com idade superior a 19 anos). As quantidades de água recomendadas incluem a água presente nos alimentos sólidos e líquidos (como por exemplo a sopa) e bebidas. De acordo com Ershow and Cantor (1989), 28 % da água ingerida pelos adultos corresponde à água dos alimentos, 28 % à água potável, enquanto 44 % corresponde a outro tipo de bebidas (3,4).
A qualidade e quantidade de água disponível para consumo humano tem sido uma preocupação ao longo da história. As principais fontes deste bem essencial são as massas de água superficial e subterrânea. A população atual, preocupada com a qualidade da água, tem aumentado o consumo de água engarrafada (5).
Estão disponíveis no mercado vários tipos de água engarrafada: água mineral natural, água mineral gasosa, água mineral natural gaseificada e água de nascente. A água mineral natural é uma água de circulação subterrânea, considerada bacteriologicamente própria, com caraterísticas físico-químicas estáveis na origem, caraterizada por um teor de substâncias minerais, oligoelementos ou outros constituintes, de que podem eventualmente resultar efeitos favoráveis à saúde e que se distingue da água de consumo. Este tipo de água pode conter gás natural (água mineral natural gasosa), ser reforçada com gás (água mineral natural reforçada com gás carbónico) ou conter somente gás adicionado (água mineral natural gaseificada). Por outro lado, a água de nascente é uma água subterrânea, considerada bacteriologicamente própria, com caraterísticas físico-químicas que a tornam adequada para consumo humano no seu estado natural (5,6). Estas águas encontram-se regulamentas pelo Decreto-Lei nº 156/98 que define e carateriza as águas minerais naturais e as águas de nascente e estabelece as regras relativas à exploração, acondicionamento e comercialização (6).
No entanto, em determinadas águas minerais naturais, devido à sua origem hidrogeológica, podem estar presentes, no estado natural, elementos químicos que, a partir de uma certa concentração, podem representar um risco para a saúde pública (7). Assim, o decreto-Lei nº 72/2004 estabelece uma lista com os limites máximos de constituintes que se encontram, naturalmente, nas águas minerais naturais. Os constituintes presentes nessa lista são o antimónio, arsénio, bário, boro, cádmio, cromo, cobre, cianeto, fluoretos, chumbo, manganês, mercúrio, níquel, nitratos, nitritos e o selénio (7).
Embora a água seja muito importante para o ser humano, muitos indivíduos não consomem água, preferindo ingerir outro tipo de bebidas (sumos, refrigerantes ou chás/infusões). Em resposta às necessidades atuais do consumidor e conhecedores das suas preferências, os industriais de bebidas desenvolvem com frequência novos tipos de bebidas. É o caso das águas com sabores, baseadas na adição de um ou mais aromas (naturais ou sintéticos) à água natural. Estas águas podem conter, para além do aroma, sumos de fruta, conservantes, reguladores de acidez e edulcorantes. De acordo com a Portaria nº 703/96, as águas com sabores podem, legalmente, ter diferentes designações. No caso de estas águas conterem entre 6 % e 16 % (m/m) de sumo de fruta, a designação será “refrigerante de sumo de frutos”; e refrigerante aromatizado no caso desta bebida resultar da diluição de aromatizantes. Se estas bebidas não contiveram açúcares nem edulcorantes a designação será “água aromatizada” (8). Neste trabalho optou-se pela designação de águas com sabores.
O consumo de água com sabores é um mercado em ascensão, tendo sido vendidos em Portugal e no 1º semestre de 2010 cerca de 6,07 milhões de litros (9). No mercado português existe uma grande oferta destas bebidas. As mais usuais e frequentes são as águas com aroma de limão, mas também podem ser encontradas bebidas com aroma de laranja, ananás, pêssego, melão, morango, maçã e goiaba. Há marcas comerciais que apostaram no desenvolvimento de águas com dois aromas em simultâneo (laranja/framboesa, pêssego/ananás, maçã/chá, framboesa/ginseng, pêssego/chá, manga/biloba, melão/hortelã). Sendo estas bebidas relativamente recentes, não havia publicações científicas abordando o estudo deste tipo de águas quando se iniciou este trabalho.
Analisando os rótulos das garrafas de águas com sabores das diferentes marcas comerciais disponíveis no mercado português, verifica-se uma grande diversidade nos ingredientes adicionados à água. Para além dos aromas (naturais ou sintéticos) algumas marcas referem a adição de fibras alimentares (ex, dextrina de trigo), sumos de fruta (concentração máxima de 2,3 %) compostos bioativos (ginseng, L-carnitina, chá verde e branco, ginkgo biloba), vitaminas (vitamina C e complexos da vitamina B) e ingredientes
que, não tendo uma relação positiva com o bem-estar e saúde do consumidor, são necessários para garantir a qualidade desejada, tais como, agentes acidificantes (ácido cítrico e citrato de sódio), edulcorantes (acessulfame-K, aspartamo e sucralose) e conservantes (sorbato de potássio e benzoato de sódio).
Em termos energéticos, as águas com sabores que contêm edulcorantes apresentam um valor energético inferior (0,4 a 1,3 kcal/ 100 mL) ao de águas com sabores que não contêm edulcorantes (9 a 13 kcal/ 100 mL). Comparativamente com os refrigerantes, néctares e sumos de fruta, as águas com sabores um baixo valor calórico, apresentando os primeiros um valor calórico que oscila entre os 21 kcal/ 100 mL e os 46 kcal/ 100 mL.
Naturalmente que as águas com sabores não devem substituir a água potável, mas podem ser uma alternativa interessante aos refrigerantes. Estes possuem na sua composição ingredientes com efeito negativo na saúde dos consumidores, especialmente crianças. O consumo moderado de águas com sabores pode ser feito com prazer e sem grandes preocupações de saúde. No entanto, será importante referir que são mais caras (20-40 %) do que as águas naturais engarrafadas (2, 10-13).
Considerando que as águas com sabores podem conter, além da sua composição normal, sumos de fruta e aromas naturais, extraídos de frutas ou vegetais (exemplo do chá), é esperado que estas águas possam apresentar valores de capacidade antioxidante superiores.
De acordo com Laguerre e colaboradores (2010), os antioxidantes são substâncias que, mesmo quando presentes em baixas concentrações, comparativamente com um substrato oxidante, protegem (por si mesmo ou através dos seus produtos de oxidação) o substrato dos danos provocados pela oxidação (14). Os alimentos (fruta, vegetais, legumes e cereais) e bebidas (sumos, chá, café e vinho) são boas fontes externas de antioxidantes (15-20). Os compostos que vulgarmente conferem capacidade antioxidante aos alimentos são o ácido ascórbico, os ácidos fenólicos, os tocoferóis, os terpenos, entre outros (21). Por isso, aumentar a ingestão de antioxidantes na dieta alimentar (incluindo as águas com sabores) pode ajudar a fortalecer os mecanismos de defesa antioxidante do organismo humano (21). Conscientes da importância que estes alimentos e bebidas têm na defesa do organismo, contra os radicais livres produzidos durante o metabolismo celular, têm sido efetuados muitos estudos para caraterizar o perfil antioxidante de uma diversidade de alimentos e bebidas, bem como no desenvolvimento de novos produtos alimentares fortificados com antioxidantes.
Embora não existam estudos (nacionais ou internacionais) publicados sobre a capacidade antioxidante de águas com sabores (somente existem os trabalhos realizadas nesta dissertação) alguns grupos portugueses têm-se dedicado ao estudo e valorização, quer de recursos naturais quer de produtos locais, a fim de desenvolver sistemas
económicos, social e ambientalmente sustentáveis. Uma das formas de valorizar esses produtos é conhecer o seu perfil antioxidante.
Há vários grupos de investigação portugueses que têm contribuído para o conhecimento do perfil antioxidante destes produtos. Das diversas matrizes estudadas salienta-se o estudo da capacidade antioxidante de cogumelos (20,22,23), ervas aromaticas (15), verduras (24), castanha e amêndoa (25), plantas aromáticas (26), frutos e sumos de fruta (18) e vinho (27). Sendo o vinho um produto muito produzido em Portugal e valorizado nacional e internacionalmente, alguns grupos de investigação traçaram o perfil antioxidante de vários tipos de vinhos produzidos no nosso país (17, 28-31). O café é uma das bebidas mais consumidas em Portugal e nesta área o Laboratório de Bromatologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto tem desenvolvido um amplo trabalho de investigação incluindo a avaliação da capacidade antioxidante desta bebida (32,33).
Outro tipo de matrizes, como por exemplo chá, frutos vermelhos (romã, mirtilos e morangos) e óleos têm sido avaliados por grupos de investigação da Universidade do Minho (34) e da Universidade do Porto (35,36).
A nível internacional há um grande número de publicações visando a avaliação da capacidade antioxidante de diferentes tipos de alimentos e produtos processados. Dada a extensão da bibliografia serão apenas citados alguns artigos mais recentes (37-39).
A metodologia analítica mais vulgarmente usada para quantificar a capacidade antioxidante de produtos é a espetrofotometria de UV-Vis (40). Estes métodos convencionais têm a desvantagem de ter tempos de reação e análise longos; as amostras com cor precisarem de um pré-tratamento; e, sendo o alimento uma matriz complexa, conter muitos interferentes (40). Considerando ser importante encontrar alternativas aos métodos convencionais, foram desenvolvidos e construídos, ao longo deste projeto, biossensores para a quantificação da capacidade antioxidante total de águas com sabores. A nível da literatura, encontram-se algumas publicações envolvendo a utilização de biossensores de ADN para a avaliação da capacidade antioxidante de extratos vegetais e chás (41,42).
Esta dissertação surge no seguimento da investigação científica desenvolvida sobre sensores e biossensores eletroquímicos no Grupo de Reacção e Análise Química (GRAQ) do Instituto Superior de Engenharia do Instituto Politécnico do Porto e sobre antioxidantes realizada no Laboratório de Bromatologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. Pretende-se assim dar mais um passo num processo cumulativo em relação ao estado da arte.
Alguns dos trabalhos apresentados foram também desenvolvidos no Laboratório de Cromatografia da Linha de Química Orgânica Física/Química Radicalar do Departamento
de Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa sob supervisão do Professor Doutor João Paulo Noranha e no Laboratório de Electroanálisis do Departamemto de Química Física e Analítica da Faculdade de Química da Universidade de Oviedo, sob orientação da Professora Doutora Noemí de los Santos Álvarez.
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Capítulo 1
Métodos eletroquímicos
Towards a reliable technology for antioxidant capacity and oxidative damage evaluation: electrochemical (bio)sensors M. Fátima Barroso, N. de-los-Santos-Álvarez, C. Delerue-Matos, M. B. P. P. Oliveira Biosensors and Bioelectronics (submetido)
Towards a reliable technology for antioxidant capacity and
oxidative damage evaluation: electrochemical (bio)sensors
M. Fátima Barrosoa,b, N. de-los-Santos-Álvarezc, C. Delerue-Matosa, M. B. P. P. Oliveirab
aREQUIMTE/Instituto Superior de Engenharia do Porto, Dr. Bernardino de Almeida 431,
4200-072 Porto, Portugal
bRequimte, Serviço de Bromatologia, Faculdade de Farmácia, Universidade do Porto, R.
Aníbal Cunha n.◦ 164, 4050-047 Porto, Portugal
cDepartamento de Química Física y Analítica, Universidad de Oviedo, Julián Clavería 8,
33006 Oviedo, Spain
Abstract
To counteract and prevent the deleterious effect of free radicals the living organisms have developed complex endogenous and exogenous antioxidant systems. Several analytical methodologies have been proposed in order to quantify antioxidants in food, beverages and biological fluids. This paper revises the electroanalytical approaches developed for the assessment of the total or individual antioxidant capacity. Four electrochemical sensing approaches have been identified, based on the direct electrochemical detection of antioxidant at bare or chemically modified electrodes, and using enzymatic and DNA-based biosensors.
Keywords: Antioxidants; free radicals; electrochemistry; chemically modified electrode;
enzymatic biosensors; DNA-based biosensor.
Disponível online em ww.sciencedirect.com
Bionsensor and Bioelectronics submitted
1. Introduction
The field of antioxidants has grown over the past decades invading a large number of areas that affect food and health such as nutrition, biochemistry, pharmacology, physiology, food processing and analytical chemistry. In general, researchers have been focused on the i) study of the antioxidant pathway on free radical scavenging activity to stop radical chain reactions; ii) study of the antioxidant protective role on proteins, lipids and DNA against the free radical generated in vivo; iii) evaluation of the antioxidant profile of natural foodstuffs and beverages because of their increasing appreciation; iv) synthesis of antioxidants and development of novel artificially antioxidant-enriched food products; v) study of the antioxidant efficacy on the preservation of foodstuff against deterioration carried out by free radicals produced by food; vi) development of analytical methods for the evaluation of the antioxidant content in food, beverages and biological samples.
The definition of antioxidant has been adjusted over the time (Halliwell and Gutteridge, 1990; Krinkly, 1992) and recently Laguerre et al. (2010) defined a biological antioxidant as a substance that, when present at low concentrations compared to an oxidizable substrate, protects (by itself and through its oxidation products) that substrate from oxidation, and ultimately protects the organism from harmful effects of oxidative stress. An imbalance between the generation of oxidants, either free radical or non-free radicals, and the antioxidant system is known to cause oxidative stress, which is frequently associated with many complex diseases (cardiovascular diseases, inflammatory disorders and cancer) (Laguerre et al., 2010). Oxidation of key biological molecules (e.g. proteins, carbohydrates, lipids and nucleic acids) is usually the mechanism that triggers these pathologies along with modulation of gene expression and the inflammatory response (Laguerre et al., 2007). Fortunately, nature has developed complex endogenous and exogenous antioxidant systems to counteract and prevent the deleterious effect of oxidants and minimize the oxidative stress in most living beings. Endogenous antioxidants include enzymes that have the ability to promote an efficient repair of oxidative damaged sites on macromolecules such as DNA. In general, hydrophilic antioxidants react with oxidant compounds in the cell and blood plasma while hydrophobic antioxidants protect cell membranes from lipid peroxidation (Barroso et al., 2011a). Fig. 1 sumarizes the antioxidant defence system.
Fig. 1. Antioxidant defence system
Foodstuffs constitute an excellent exogenous source of natural antioxidants. Although further and more conclusive studies must be done to establish the precise correlation between the intake of antioxidants and the reduction in the oxidative stress level, it seems reasonable that increasing intake of dietary antioxidants may help to maintain an adequate antioxidant status and, so, the normal physiological functions of a living system. Some functional foods, vegetables, fruits, whole-grain cereals, juice, tea, wine are good sources of exogenous antioxidants (Almajano et al. 2008; Frankel, 2007; Huang et al. 2009; Lee et al. 2009).
Oxidant compounds (radicals and non-radicals) can be generated as a consequence of normal aerobic metabolism, and are able to induce damage to the cells by reacting with biomolecules (proteins, lipids, among others) and causing serious lesions on DNA.
Radical species such as nitric oxide (NO•), superoxide (O2•-), hydroxyl (OH•), peroxyl
(ROO•) and alkoxyl (RO•) radicals, are known as reactive oxygen species (ROS) and
reactive nitrogen species (RNS) produced during the mitochondrial respiratory chain (electron transport) or during the lipid oxidation chain reaction. Hypochlorous acid (HClO)
obtained by the enzymatic system myeloperoxidase/H2O2/Cl- is another free radicals
involved. All of them tend to donate or take another electron to attain stability, which confers their characteristic high reactivity (Halliwell and Gutteridge, 1999; Rice-Evans C.A.
antioxidant defence system
endogenous exogenous (dietary source) ascorbic acid phenolic acid tocopherol carotenes terpenes enzymatic
superoxide dismutase (SOD) catalase
peroxidase myeloperoxidase
Cofactor
Cu/Zn SOD (cytoplasm) Mn/SOD (mitochondria) non-enzymatic glutathione carnosine histidine uric acid repair mechanism DNA-repair enzymes prevention mechanism
inhibition of radical generation (scavenger activity) stop radical chain reaction
stabilization of biological sites
antioxidant defence system
endogenous exogenous (dietary source) ascorbic acid phenolic acid tocopherol carotenes terpenes enzymatic
superoxide dismutase (SOD) catalase
peroxidase myeloperoxidase
Cofactor
Cu/Zn SOD (cytoplasm) Mn/SOD (mitochondria) non-enzymatic glutathione carnosine histidine uric acid repair mechanism DNA-repair enzymes prevention mechanism
inhibition of radical generation (scavenger activity) stop radical chain reaction
