Redução da contagem
bacteriana no leite cru
Um guia com oportunidades em citometria de fluxo
ebook
Prefácio
Por décadas, uma tecnologia analítica chamada citometria
de fluxo tem desempenhado um papel vital em melhorar a
qualidade higiênica do leite cru e, hoje em dia, sua
impor-tância não para de crescer. Em particular, novos
desenvol-vimentos com a tecnologia estão criando a possibilidade
de mais testes de higiene no local, conforme o leite cru é
recebido no laticínio ou mesmo antes de sair da fazenda.
Com a perspectiva de testes mais rápidos em toda a cadeia
de suprimentos, os dias das amostras com baixa qualidade
de higiene e com centenas de milhares de bactérias por ml
podem estar literalmente contados.
Este e-book tem como objetivo deixá-lo atualizado com os
desenvolvimentos em citometria de fluxo através de
arti-gos, contexto técnico de fácil acompanhamento e
entrevis-tas em vídeo.
Esperamos que você o ache útil no contínuo esforço das
indústrias em reduzir os níveis bacterianos no leite cru.
FOSS
Artigo: A luta contra bactérias no leite
4
A vantagem da citometria de fluxo
6
Dentro de um instrumento de citometria de fluxo
7
Testes de contagem bacteriana de grandes
volumes no laboratório
8
Contagem bacteriana no laticínio com o
apertar de um botão
9
O que uma boa solução em citometria
de fluxo deve ter
11
Soluções em citometria de fluxo da FOSS
13
Artigo:
A luta contra bactérias no leite
Uma nova aprovação oficial para testar a contagem bacteriana no leite
cru com a citometria de fluxo é apenas a mais última conquista na
constante batalha para reduzir a contagem bacteriana no leite cru.
Mesmo apesar de uma amostra de leite cru de hoje ser exatamente o que era há 50 anos, a contagem bacteriana provavelmente é muito menor.
Para os consumidores e produtores de laticínios, isso é uma boa notícia pois a qualidade bacteriológica do leite é um parâmetro importante para os procedimentos de tratamento térmico, previsão da data de validade e determinação da adequabilidade do leite cru para processar diferentes produtos.
Por décadas, os níveis médios de bactérias no leite cru vêm gradualmente caindo no mundo todo, de centenas de milhares de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por milímetro na década de 70 a menos de 10.000 UFCs por mililitro hoje em dia. Em muitos países, os produtores consistentemente alcançam 5.000 UFC/ml em suas entregas de leite cru.
Os instrumentos de citometria de fluxo surgiram na década de 80 e o método hoje em dia é aprovado tanto pelo EU-RL na Europa e pelo NCIMS/FDA nos EUA.
Entretanto, a batalha para reduzir os níveis bacterianos ainda continua, sendo que a rápida análise da contagem bacteriana de amostras de leite cru utilizando a tecnologia de citometria de fluxo é mais importante do que nunca na linha de frente.
A importância dos testes de citometria de fluxo
Os métodos de citometria de fluxo foram aplicados pela primeira vez nos testes de leite cru no começo da década de 80, como uma forma de automatizar e acelerar o tradicional processo de análise.
O método tradicional dá uma indicação de qualidade de acordo com nas Unidades Formadoras de Colônias, ao passo que a citometria de fluxo dá a mesma indicação, mas de acordo com o número de células bacterianas individuais em menos de 10 minutos, em comparação aos dois a três dias que a contagem em placa leva.
Os rápidos resultados se mostraram importantes, pois a identificação precoce de problemas de higiene no leite cru é essencial para minimizar o impacto na qualidade do leite cru. Apesar da pasteurização matar a maioria das bactérias, seus metabólitos podem causar sabores desagradáveis e as enzimas continuam suas atividades, resultando em defeitos no produto e redução da vida de prateleira. Com informações mais rápidas, os produtores podem ser informados sobre possíveis problemas, permitindo que corrijam a tempo os vazamentos ou uma limpeza ou resfriamento impróprios no sistema de ordenha, ou os problemas de saúde no rebanho.
Aceitação cada vez maior
Não é de se espantar que a citometria de fluxo atraiu o interesse dos laboratórios de testes de leite como um método rápido para a contagem bacteriana, visto que, particularmente, mais e mais países estão ficando mais exigentes com relação à qualidade do leite e regulamentações nacionais cada vez mais rigorosas da qualidade higiênica foram implementadas.
As aprovações oficiais, no entanto, não têm acompanhado o passo. A lógica diz que algo capaz de acelerar a análise de bactérias seria rapidamente aprovado. Porém, a aceitação e aprovação são um processo complicado, que já se arrasta por cerca de 35 anos.
Com vários órgãos da indústria e do governo envolvidos, muitas pessoas precisam ser convencidas da complexidade do parâmetro contagem bacteriana total. Em particular, a necessidade de correlacionar o método de citometria de fluxo, baseado na contagem de bactérias individuais, ao método tradicional, baseado na contagem de Unidades Formadoras de Colônias, vem causado muita discussão até os dias de hoje.
Apesar da discussão contínua, a citometria de fluxo se tornou o padrão da indústria para a contagem de bactérias no leite cru em muitos países; por exemplo, o instrumento FOSS BactoScanTM FC+ ganhou a aprovação tanto dos laboratórios de referência europeus (EU-RL)
e do NCIMS/ FDA nos EUA, sendo que hoje, mais de 90% de todo o leite da Europa é pago de acordo com os resultados do BactoScan.
Um outro desenvolvimento é o uso da citometria de fluxo em instrumentos compactos para utilização no laticínio, a fim de verificar a qualidade higiênica das entregas, iniciando um novo capítulo na batalha contra bactérias no leite cru. Leia mais na página 9.
A vantagem
da citometria de fluxo
Com apenas alguns minutos por teste, a citometria de fluxo é muito mais rápida do que o método tradicional de contagem em placa, que requer de dois a três dias para gerar um resultado. Esta disponibilidade de dados de teste é importante à produtividade da propriedade leiteira e ao subsequente uso do leite na fase de processamento e distribuição da cadeia de fornecimento. Por exemplo, a rápida contagem de células bacterianas permite a rápida identificação dos problemas de higiene na propriedade e a adoção de medidas para manter a qualidade do leite entregue ao laticínio.
O leite com alta carga bacteriana é uma matéria-prima indesejada para a produção de laticínios, especialmente no caso de produtos como a manteiga. Apesar da pasteurização matar a maioria das bactérias, seus metabólitos podem causar sabores desagradáveis e as enzimas continuam suas atividades, resultando em defeitos no produto e redução da vida de prateleira. A maioria dos esquemas de pagamento de leite classifica, portanto, o leite de acordo com o nível de bactéria.
Com uma rápida contagem de células bacterianas, os produtores podem ser informados sobre possíveis problemas de higiene, permitindo que corrijam a tempo os vazamentos ou uma limpeza ou resfriamento impróprios no sistema de ordenha, ou os problemas de saúde no rebanho. A citometria de fluxo também é altamente consistente. O tradicional método de contagem em placa está sujeito a variáveis entre os testes, tais como a preparação da amostra em uma placa de Petri, o tempo do período de incubação e uma contagem ao olho nu. A citometria de fluxo, por outro lado, é um teste automático e feito a máquina, que conta, com precisão, a repetibilidade e a reprodutibilidade. Ela é capaz de analisar diretamente as amostras de leite cru sem um aquecimento ou diluição prévios, os quais poderiam afetar a precisão.
Excelente precisão por toda a contagem individual de bactérias
Devido ao fato do método de citometria de fluxo contar todas as bactérias como células individuais e não como aglomerados, ele proporciona um desempenho alto e uniforme, com reprodutibilidade dos resultados. Ao contrário do método de contagem em placa, os resultados não podem ser influenciados pelo operador e as amostras de leite cru podem ser testadas diretamente, sem o aquecimento ou diluição prévios, o que poderia afetar a precisão.
Precisão: Tipicamente Sy,x < 0,25 unidades logarítmicas em toda a faixa de medição. Método de referência: Contagem em placa convencional (Norma IDF 100B: 1991.
Dentro de um instrumento
de citometria de fluxo
A citometria de fluxo por fluorescência é usada para analisar as características físicas e químicas de partículas em um fluido, conforme ele passa através da luz de laser. No contexto de análise agrícola e de alimentos, ela fornece uma análise rápida da contagem bacteriana e de células somáticas em amostras de leite.
Um sistema de seringas é usado para passar as células por uma célula de fluxo, uma a uma, onde elas são
expostas a um feixe de luz de uma fonte de laser
Método de contagem
bacteriana
A contagem bacteriana exige uma etapa de incubação inicial para a coloração das bactérias e para a separação de todas as partículas, com exceção das células a serem contadas.
1. Durante a incubação, as células são coradas por um meio de coloração com especificidade ao DNA, um corante fluo-rescente.
2. Um sistema preciso de seringas é usado para passá-las por uma célula de fluxo, uma a uma, onde elas são expostas a um feixe de luz de uma fonte de laser.
3. O laser excita a fluorescência do corante e as células coradas emitem um longo pulso luminoso para cada célula que pas-sa pelo feixe.
4. A luz fluorescente é detectada por um detector altamente sensível, que emite impulsos eletrônicos.
5. Os pulsos são contados e exibidos em um diagrama de análise de altura de pulso (PHA) no visor do instrumento.
A contagem bacteriana leva 9,5 minutos, incluindo o elemento de incubação.
Testes de grandes
volumes no laboratório
O interior de uma instalação moderna de testes de leite cru.
As esteira de transporte levam e trazem as amostras de leite dos instrumentos de análise, por todo o laboratório, com filas de frascos plásticos alinhados como soldados em um desfile, marchando perfeitamente em direção aos analisadores, que os aguardam. A identificação por frequência de rádio (RFID) rastreia as amostras utilizando uma identificação inteligente, que emprega chips programados que contêm todos os dados relevantes da amostra, afixados ao fundo dos frascos. Hoje em dia, a citometria de fluxo é usada por laboratórios de testes de leite cru em todo o mundo para realizar milhares de testes de contagem bacteriana por dia nas amostras coletadas de propriedades leiteiras. Mas se um único teste gasta nove minutos, como isso é possível?
O segredo é realizar a demorada etapa de incubação de maneira inteligente, com várias instalações de incubação para processar várias amostras ao mesmo tempo. Mas as exigências não param por aí. O manuseio, teste e rastreamento de milhares de amostras também precisam ser realizados de forma eficiente e, não raro, o teste de contagem bacteriana precisa ser combinado a outros testes, tais como um conjunto de testes de qualidade do leite realizados por outros instrumentos por infravermelho no laboratório.
Os instrumentos de citometria de fluxo modernos estão, portanto, cada vez mais integrados a sistemas automatizados de entrega de amostras, sistemas de verificação e sistemas de software, para monitorar todos os dados gerados. Até recentemente, a citometria de fluxo para contagem de células bacterianas era grandemente limitada aos sofisticados ambientes laboratoriais. Agora, com o advento de novos instrumentos especificamente concebidos para menores volumes de teste no laticínio, esse cenário mudou.
Contagem bacteriana no
laticínio com o apertar de
um botão
O uso cada vez mais comum da citometria de fluxo no laboratório de análise de leite naturalmente suscitou dúvidas sobre como compartilhar a eficácia e a conveniência dos testes com os produtores de leite para acompanhar os passos de outras tecnologias analíticas, tais como a análise por infravermelho próximo e médio. Isso possibilitou a chegada de testes sem produtos químicos rápidos e simples à maioria das áreas de controle de qualidade do laticínio, com exceção de uma – a de higiene.
Aqui, também, observamos progressos capazes de abrir novos horizontes na luta contra as bactérias no leite cru.
BacsomaticTM vídeo sobre como ele funciona
Medindo apenas 40 x 40 x 40cm, um pequeno instrumento de citometria de fluxo da FOSS oferece uma alternativa rápida aos métodos de ensaio manual ou semi-automatizado que requerem o manuseio de reagentes. Ele proporciona resultados tanto para a contagem bacteriana e de células somáticas em 9,5 minutos, sendo que o seu formato prático o torna ideal para uso no laticínio, em grandes propriedades ou em laboratórios menores que realizam testes de leite.
O método de citometria de fluxo é o mesmo usado nos grandes instrumentos totalmente automatizados dos laboratórios que realizam testes em leite para processar centenas de testes por hora, mas com o intuito de reduzir as necessidades de rendimento de laticínios que precisam testar as entregas de leite cru que chegam todos os dias em caminhões-tanque. A disponibilidade de um teste rápido e fácil de realizar permite a tomada rápida de decisões sobre como lidar com as entregas e a melhor forma de processar o leite de acordo com a qualidade higiênica.
Com seu inteligente sistema de fluxo, também é possível integrar a contagem bacteriana e de células somáticas em um pequeno e prático instrumento, conforme explicado nesta entrevista em vídeo com os cientistas responsáveis pela nova solução.
Elementos de um bom
instrumento de citometria
de fluxo
1. Repetibilidade
A contagem bacteriana envolve muitos zeros, por exemplo cerca de 10.000 bactérias por ml é uma contagem perfeitamente normal em uma amostra de leite de alta qualidade, e os números podem chegar até 1.000.000 por ml em uma amostra de baixa qualidade. Uma minúscula quantidade de carreamento de amostra pode, portanto, ter um profundo impacto no resultado do próximo teste e, para evitar isso, qualquer sistema de citometria de fluxo deve possui uma eficiente lavagem de limpeza entre os testes. Algumas bactérias também têm tendência de se aglomerar e, por isso, uma eficiente preparação da amostra como parte do sistema de fluxo do instrumento é um importante fator para se obter uma boa repetibilidade.
2. Capacidade de processamento
Para as aplicações nos laboratórios de testes de leite cru, a capacidade de processamento é vital a um atendimento ao consumidor eficiente e aos lucros do laboratório.
Alimentado por trilhos de amostras automatizados, os instrumentos modernos de citometria de fluxo podem testar até 600 amostras por hora para a contagem de células somáticas e até 200 por hora para a contagem bacteriana.
A contagem bacteriana é mais lenta devido à etapa de incubação, conforme explicado acima na descrição do método de contagem bacteriana. No entanto, apesar de que uma incubação leva oito minutos, um uso inteligente de várias câmaras de incubação permite a realização concomitante de vários testes, a fim de se obter uma alta capacidade de processamento dos testes.
Uma compensação de design é feita para menores instrumentos portáteis, onde a colocação manual de amostras reduz a capacidade de processamento, em comparação às grandes soluções laboratoriais totalmente automatizadas usado em laboratórios que realizam testes em leite. No entanto, o tempo para o resultado de
testes individuais deve se o mesmo, permitindo aplicações úteis na cadeia de fornecimento, por exemplo através de inspeções rápidas do leite cru que chega em caminhões-tanques no laticínio.
3. Robustez
Conforme implícito pelas demandas de alta capacidade de processamento, uma solução em citometria de fluxo de alto volume deve lidar com um fluxo praticamente constante de amostras ou líquidos de limpeza (lavagem). Pontos críticos no sistema de fluxo, tais como as bombas e válvulas, devem ser robustos e qualquer manutenção deve ser a mais simples possível.
4. Tabela de conversão de CBI para UFC
Os instrumentos BactoscanTM e BacSomaticTM comunicam os
resultados como Contagem Individual de Bactérias (CBI). No entanto, muitos laboratórios são obrigados a apresentar seus resultados em Unidades Formadoras de Colônias (UFC), os quais são obtidos através de um método tradicional de contagem em placa. Um software que possibilite o uso de uma tabela de conversão para converter CBI para UFC deve, portanto, fazer parte da solução em citometria de fluxo.
5. Manuseio de reagentes
O método envolve o uso de reagentes líquidos, tais como para a coloração e para a limpeza. Para tornar o ambiente de trabalho dos operadores o mais fácil e seguro possível, é possível fornecer reagentes prontos para uso em sistemas de bolsas fechadas, que efetivamente evita o contato com a pele. A dosagem também pode ser controlada automaticamente para assegurar sempre a mesma mistura e dosagem de reagentes, reduzindo o risco de erro humano para produzir resultados altamente consistentes.
6. Verdadeira capacidade de trabalho
em rede para o gerenciamento efetivo
do instrumento
Um verdadeiro trabalho em rede é muito mais do que uma conexão de Internet. Ele deve lhe permitir olhar dentro do instrumento para verificar o desempenho e a estabilidade. Isto é fundamental para permitir o gerenciamento remoto e a supervisão de múltiplos instrumentos a partir de um mesmo local para, por exemplo, verificar os resultados dos testes regulares de verificação de amostras piloto.
Através da comprovada tecnologia da FOSS, o BactoScan™ mede a qualidade higiênica do leite, analisando as bactérias no leite cru. Apresentando resultados em questão de minutos, o BactoScan permite aos produtores ou laboratórios de teste de leite agirem rápido, a fim de preservar e aumentar a qualidade do leite. É possível realizar até 200 testes por hora.
O BacSomatic™ é o primeiro contador de células
somáti-cas e bacterianas integrado, concebido para o teste da
qualidade higiênica do leite.
O instrumento, pequeno e fácil de usar, oferece uma alternativa rápida aos métodos de ensaios manuais ou semi-automatizados que requerem o manuseio de reagentes. Ele fornece resultados precisos para a contagem de bactérias e células somáticas em menos de 9,5 minutos, ou 1,5 minutos para apenas a contagem de células somáticas. O formato prático o torna ideal para uso em laticínios, em grandes propriedades ou em laboratórios menores de teste de leite.
Saiba mais sobre o BactoScanTM aqui
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