Serotonin ELISA
Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa de Serotonina
em soro humano, plasma, plaquetas, urina. Além disso, o teste pode ser
usado para pesquisa em homegeneizados de tecido e sobrenadantes de
culturas celulares.
RE59121
96
2-8°C
I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H
Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com
1.
APLICAÇÕES
Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa de Serotonina em soro humano, plasma, plaquetas, urina. Além disso, o teste pode ser usado para pesquisa em homegeneizados de tecido e sobrenadantes de culturas celulares.
2.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
A serotonina é um produto intermediário do metabolismo do triptofano e está localizada principalmente nas células enterocromafins do intestino, neurónios serotonérgicos cerebrais e plaquetas sanguíneas. É bem reconhecida como um neurotransmissor do sistema nervoso central.
Quase toda a serotonina na circulação sanguínea encontra-se concentrada nas plaquetas. Alterações nas concentrações de serotonina em circulação estão implicadas em várias condições patológicas incluindo cefaleia de tensão crónica, esquizofrenia, hipertensão, doença de Huntington, distrofia muscular de Duchenne e apendicite aguda precoce. A determinação dos níveis de serotonina no soro é de elevada importância clínica para a avaliação do diagnóstico de síndrome carcinóide. Um aumento do interesse na determinação de serotonina em plaquetas, incluindo cinética de captação e libertação, é esperado num futuro próximo.
3.
PRINCÍPIO DO TESTE
A preparação de amostras (derivatização de serotonina a N-acilserotonina) faz parte da diluição de amostras e é conseguida por incubação da respectiva amostra com o Reagente de Acilação.
O procedimento obedece ao princípio básico de ELISA competitivo, segundo o qual existe competição entre um antigénio biotinilado e outro não-biotinilado por um número fixo de locais de ligação de anticorpos. A quantidade de antigénio biotinilado que liga ao anticorpo é inversamente proporcional à concentração da amostra. Quando o sistema está em equilíbrio, o antigénio biotinilado livre é removido por um passo de lavagem e o antigénio biotinilado ligado ao anticorpo é determinado usando estreptavidina fosfatasa alcalina como marcador e p-nitrofenil fosfato como substrato. A quantificação de amostras é conseguida comparando a actividade enzimática das amostras com uma curva resposta preparada usando padrões conhecidos.
4.
AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais.
9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
5.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes.
A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8 °C.
6.
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Certas comidas contêm quantidades substanciais de serotonina. Além disso, algumas medicações podem causar libertação de serotonina, levando a níveis alterados. Os pacientes devem-se abster de tais comidas ricas em serotonina (ex: abacates, bananas, café, ameixas, ananás, tomates, nozes) assim como de algumas medicações (ex: aspirina, corticotropina, inibidores MAO, fenacetina, catecolaminas, reserpina, nicotina).
Soro
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento: 18-25°C 2-8°C -20°C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa.
Evitar congelar-descongelar repetidamente. Para envio, as amostras devem ser congeladas.
Estabilidade 2 h 6 h 3 meses
Urina
É possível usar tanto a primeira urina do dia como urina de 24 h. O volume total de urina excretada durante o período de 24 h deve ser recolhido e misturado num único frasco contendo como conservante 10-15 mL de HCl 6 N. Determinar o volume total para cálculo de resultados. Misture e centrifugue as
amostras antes de iniciar o ensaio.
Armazenamento: -20°C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente.
Estabilidade 6 meses
Plasma, Plaquetas
Mais de 98% da serotonina em circulação está localizada nas plaquetas e é libertada durante a coagulação sanguínea. O sangue deve ser recolhido, por punção venosa, para tubos de plástico contendo EDTA ou Citrato como anticoagulante (ex: 10 mL Monovette NC com 1 mL de Solução Citrato da SARSTEDT).
As amostras são mantidas e centrifugadas à temperatura ambiente, durante 10 min a 200 x g, para obter
plasma rico em plaquetas (PRP). O sobrenadante PRP é então transferido para outro tubo e as
plaquetas são contadas.
Para obter o pellet de plaquetas, uma alíquota de 200 µL de PRP (contendo entre 350 000 e 500 000 plaquetas/µL) é adicionada a 800 µL de solução salina fisiológica e centrifugada a 4500 x g durante 10 min a 4°C (ou a 10 000 x g durante 2 min a 4°C). O sobrenadante é então rejeitado.
200 µL de água bidestilada são adicionados ao pellet, que após isso pode ser armazenado congelado a < -20°C durante várias semanas sem haver qualquer alteração no conteúdo em serotonina.
Após descongelamento das amostras congeladas centrifugar a 10 000 x g durante 2 min à temperatura ambiente. 20 µL do sobrenadante são usados no ELISA (ver Acilação).
Se se quiser medir serotonina em plasma sem plaquetas (PFP), centrifugar uma alíquota de PRP
a 4500 x g durante 10 min a 4°C (ou a 10 000 x g durante 2 min a 4°C) para obter plasma sem plaquetas (PFP). 50 µL do sobrenadante são usados no ELISA para medição da serotonina livre (não ligado a plaquetas) (ver Acilação).
NOTA: A determinação directa de serotonina em PRP mostrou que em cerca de 10 % das amostras PRP foram medidas concentrações de serotonina imprevisivelmente elevadas (resultados obtidos por HPLC e Fluorometria). Para evitar tais discrepâncias, recomenda-se a medição em separado da serotonina em plaquetas e em plasma sem plaquetas.
Plasma sem Plaquetas
Plaquetas
(após separação do plasma) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente. Para envio, as amostras devem ser congeladas. Armazenamento: -20°C (Alíquotas) -20°C (Alíquotas) -80°C (Alíquotas)
Estabilidade: 2 semanas 4 semanas 12 meses
Homogeneizados de tecido, Sobrenadantes de Culturas Celulares
Homogeneizados de tecido centrifugados e sobrenadantes de culturas celulares podem ser usados sem precauções especiais. Cuidado: O meio da cultura celular pode conter serotonina!
Armazenamento: -20°C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente.
7.
MATERIAIS FORNECIDOS
Os reagentes fornecidos com este kit são suficientes para determinações simples na preparação de amostras (acilação) e para duplicados no ensaio. Reagentes adicionais serão disponibilizados se pedidos.
Quantidade Símbolo Componente
1 x 12 x 8 MTP Microplaca Tiras separáveis. Revestida com antisoro anti-coelho (cabra).
1 x 8 mL ANTISERUM Serotonina Antisoro Cor azul. Pronto a usar. Contêm: Antisoro (coelho), tampão fosfato, < 0.1 % NaN
3.
1 x 8 mL BIOTIN Serotonina Biotina Colorido Amarelo. Pronto a usar. Contêm: < 0.1 % NaN
3.
1 x 0.3 mL ENZCONJ CONC Conjugado Enzimático, Concentrado (100x) Contêm: Estreptavidina fosfatasa alcalina, Tampão Tris, HCl, < 0.1 % NaN
3.
1 x 7 x 1 mL CAL A-G Padrão A-G 0; 0.08; 0.24; 0.73; 2.2; 6.6; 19.8 ng/mL
0; 0.45; 1.4; 4.1; 12.5; 37.4; 112.3 nmol/L
Pronto a usar. Contêm: Serotonina (acilado), tampão fosfato, < 0.1 % NaN3.
1 x 2 x 0.5 mL CONTROL 1+2 LYO Controlo 1+2, liofilizado Contêm: Soro humano, < 0.1 % NaN
3.
Para concentrações / intervalos aceitáveis consultar etiquetas dos frascos.
1 x 3 mL ACYLREAG Reagente de Acilação Ácido Acético Anidro, acetona. Pronto a usar.
1 x 50 mL ASSAYBUF CONC Tampão de Reacção Concentrado (10x) Contêm: tampão fosfato, BSA, < 1 % NaN
3.
2 x 50 mL WASHBUF CONC Tampão de Lavagem Concentrado (20x) Contêm: tampão fosfato, Tween, < 0.1 % Thimerosal.
2 x 13 mL PNPP SUBS Solução de Substrato PNPP Pronto a usar. Contêm: p-nitrofenil fosfato (PNPP).
1 x 15 mL PNPP STOP Solução de Paragem PNPP Pronto a usar. Contêm: 1 M NaOH
3 x FOIL Película Aderente
8.
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 20; 25; 50; 100; 1000 µL 2. Tubos de ensaio de vidro descartáveis (12 x 75 mm)
3. Suporte para tubos de ensaio 4. Agitador orbital (500 rpm) 5. Vortex
6. Banho de água, 37 °C
7. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
8. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 9. Centrífuga; 1500 x g
10. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 405 nm (comprimento de onda de referência 600-650 nm)
11. Água bidestilada ou bi-destilada
12. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro
9.
NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Alguns componentes contêm volume de solução 250 µL. Assegurar que a solução está toda no fundo do recipiente antes de abrir.
5. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem.
6. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.
7. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços.
8. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.
9. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante. 10. A força centrífuga relativa (g) não é equivalente a rotações por minuto (rpm) e tem que ser calculada de
acordo com o raio do rotor.
10.
INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
Para a versão manual e automatizada
Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas. Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações).
Se o cliente quiser reduzir o número de padrões de 7 para 6, pode omitir o Padrão G. O intervalo relevante será então reduzido para 155 µg/L (plasma) ou 706 µg/L (soro, urina, homogenados de tecido, sobrenadantes de culturas celulares).
O procedimento de teste pode ser realizado numa versão reduzida com 3.5h de incubação para soro, urina, plaquetas, homogenados de tecido e sobrenadantes de culturas celulares MAS NÃO PARA PLASMA, ou numa versão alternativa, com uma incubação de um dia para o outro para as mesmas amostras E PLASMA. O plasma deverá ser incubado SEMPRE de um dia para o outro.
10.1. Preparação de componentes liofilizados ou concentrados Diluir /
dissolver Componente Diluente Relação Observações
Armazena-mento Estabilidade 15 mL ASSAYBUF CONC juntar 150 mL agua bidest. 1:10
Pode aparecer uma coloração castanho-amarelada, que não influencia os resultados dos
testes.
2-8°C 2 semanas
15 mL WASHBUF
CONC
juntar
300 mL agua bidest. 1:20 2-8°C 4 semanas
CONTROL 1+2 LYO
com
0.50 mL agua bidest.
Deixar repousar 15 min. Misturar sem fazer espuma.
-20°C
(Alíquotas) Data Validade
60 µL ENZCONJ CONC com 6.0 mL Tampão de Reacção diluído
1:101 Preparar mesmo antes de usar
e utilizar apenas uma vez. 18-25°C 2 h 10.2. Diluição de Amostras
As amostras de que se suspeite conterem concentrações mais elevadas que o maior padrão têm que ser diluídas com Tampão de Reacção.
10.3. Acilação de Amostras e Controlos (Padrões não)
O seguinte procedimento tem que ser executado de duas maneiras:
Amostra A: Soro, Urina, extracto de plaquetas, homogeneizados de tecido e controlos Amostra B: plasma sem plaquetas
Não acilar os padrões. Já estão acilados!
A preparação de amostras conduz a uma diluição de 107 vezes para soro, urina, plaquetas, homogeneizados de tecido, sobrenadantes de culturas celulares e controlos e a uma diluição de 23.5 vezes para amostras de plasma. Isto tem que ser considerado para o cálculo dos resultados.
10.3.1. Amostra A: Soro, Urina, extracto de plaquetas, homogeneizados de tecido e controlos 1. Pipetar 20 µL de cada Controlo e amostra A para tubos de ensaio de vidro.
2. Pipetar 100 µL de Tampão de Reacção diluído para cada tubo. Agitar no vortex.
3. Pipetar 25 µL de Reagente de Acilação para cada tubo. Agitar cada tubo no vortex imediatamente após pipetagem.
4. Tapar os tubos. Incubar 15 min a 37 °C en um banho-maria.
5. Pipetar 2 mL de Tampão de Reacção diluído para cada tubo. Agitar no vortex.
6. Centrifugar todos os tubos durante 10 min a 1500 x g.
As amostras preparadas têm que ser testadas imediatamente. O sobrenadante é estável apenas durante 1 h à 18-25 °C.
10.3.2. Amostra B: plasma sem plaquetas
1. Pipetar 50 µL de cada amostra B para tubos de ensaio de vidro.
2. Pipetar 100 µL de Tampão de Reacção diluído para cada tubo. Agitar no vortex.
3. Pipetar 25 µL de Reagente de Acilação para cada tubo. Agitar cada tubo no vortex imediatamente após pipetagem.
4. Tapar os tubos. Incubar 15 min a 37 °C. en um banho-maria
5. Pipetar 1 mL de Tampão de Reacção diluído para cada tubo. Agitar no vortex.
6. Centrifugar todos os tubos durante 10 min a 1500 x g.
As amostras preparadas têm que ser testadas imediatamente. O sobrenadante é estável apenas durante 1 h à 18-25 °C.
11.
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
11.1. Versão reduzida (Nota: apenas para amostras A, mas não para plasma)
1. Pipete 50 µl de cada Padrão, Controlo acilado e amostra acilada para os respectivos poços da
Placa de Microtitulação.
2. Pipetar 50 µL de Biotina para Serotonina para cada poço. 3. Pipetar 50 µL de Antisoro para Serotonina para cada poço. 4. Tapar a placa com película adesiva.
Incubar 90 min à TA (18-25 °C) num agitador orbital (500 rpm).
5. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 250 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
6. Pipetar 150 µL de Conjugado Enzimático acabado de preparar para cada poço. 7. Tapar a placa com película adesiva.
Incubar 60 min à TA (18-25 °C) num agitador orbital (500 rpm).
8. Retire a folha. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 3 x com 250 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
9. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem
deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de positive displacement e evitar a formação de bolhas de ar.
10. Pipetar 200 µL de Solução de Substrato PNPP para cada poço. 11. Incubar 60 min à TA (18-25 °C) num agitador orbital (500 rpm).
12. Parar a reacção de substrato adicionando 50 µL de Solução Stop PNPP a cada poço. Misturar
rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa.
13. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 405 nm (Comprimento de onda de referência:
11.2. Versão Alternativa com incubação de um dia para o outro (Amostras A E B) 11.2.1. Primeiro Dia
1. Pipetar 50 µL de cada Padrão, Controlo acilado e amostra acilada para os respectivos poços da
Microplaca.
2. Pipetar 50 µL de Serotonina-Biotina para cada poço.
3. Pipetar 50 µL de Antisoro para Serotonina para cada poço. Agitar cuidadosamente a placa. 4. Tapar a placa com película adesiva. Agitar cuidadosamente a placa.
Incubar 16-20 h (de um dia para o outro) a 2-8 °C. 11.2.2. Segundo Dia
1. Retire a folha. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 3 x com 250 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
2. Pipetar 150 µL de Conjugado Enzimático acabado de preparar para cada poço.
3. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min à TA (18-25 °C) num agitador orbital (500 rpm). 4. Retire a folha. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 3 x com 250 µL de Tampão de
Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
5. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem
deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.
6. Pipetar 200 µL de Solução de Substrato PNPP para cada poço. 7. Incubar 30 min à TA (18-25 °C) num agitador orbital (500 rpm).
8. Parar a reacção de substrato adicionando 50 µL de Solução Stop PNPP a cada poço. Misturar
rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa.
9. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 405 nm (Comprimento de onda de referência:
600-650 nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução Stop.
12.
CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é válida e deve ser repetida.
Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados.
Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e métodos de lavagem.
13.
CÁLCULO DE RESULTADOS
Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo logit-log.
Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado). A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração.
Devido à diluição das amostras, os valores têm que ser multiplicados pelo factor de diluição correspondente para se obter as concentrações de serotonina em ng/mL:
Soro, urina, plaquetas, homogeneizados de tecido, sobrenadantes de culturas celulares, controlos: x 107
Os resultados de amostras com uma pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição. O ensaio pode ser declarado válido se forem cumpridos os seguintes critérios:
50% D.O./D.O.max (ED 50): 0.60 - 1.00 ng/mL (média 0.8 ng/mL).
D.O. Padrão A - Padrão G: 0.80 D.O. Conversão:
Serotonina (ng/mL) x 5.67 = nmol/L
Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.
13.1. Cálculos para plaquetas
O conteúdo de serotonina em plaquetas é referido relativamente a 109 plaquetas. Em seguida é dado um
exemplo:
Concentração de serotonina: 100 ng/mL.
Número de plaquetas no PRP: 300000/µL equivalente a 60000000/200µL PRP e 200 µL de volume de extracção. Ao usar 20 µL no teste, tem-se um equivalente plaquetário de 6 x 106 plaquetas.
O conteúdo de serotonina refere-se a 1 mL. Por isso os equivalentes plaquetários usados em 20 µL têm que ser multiplicados por 50.
6 x 106 x 50 = 0.3 x 109 plaquetas/ml com um conteúdo de serotonina de 100 ng.
O conteúdo de serotonina em plaquetas resultante é 333 ng/109 plaquetas (100 ng serotonina x 1.0 x 109 /
0.3 x 109 ).
Curva de Calibração Típica (Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão Serotonina (ng/mL)
DOMédia DO/DOmax
(%) A 0.0 2.118 100.0 B 0.08 1.883 88.9 C 0.24 1.568 74.0 D 0.73 1.089 51.5 E 2.2 0.641 30.3 F 6.6 0.369 17.4 G 19.8 0.245 11.6
14.
VALORES ESPERADOS
Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico.
Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores: (97.5 % percentil)
Espécime n Unidade Média Intervalo
Soro 99 ng/mL 88.6 30 – 200
Plasma sem Plaquetas 35 ng/mL 3.7 1.8 – 7.5
Plaquetas 35 ng/109 Plaquetas 490 217 – 861
24 h Urina 49 µg/dias 83.1 200
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade.
15.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.
Azidas e timerosal em concentrações > 0.1 % interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos. Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito significativo (+/-20%) nos resultados do teste se estiverem em concentrações inferiores às indicadas:
Hemoglobina 8.33 mg/mL Bilirrubina 0.33 mg/mL OD 405nm 0.01 0.1 1 10 100 Serotonin ng/mL 2.500 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000
16.
DESEMPENHO
Especificidade Analítica (Reactividade Cruzada) Substância Reactividade Cruzada (%) N-Acil-Serotonina 100 5-HIAA 0.110 Melatonina 0.040 5-Metoxi-Triptamina 0.015 3-Indolacrylic acid < 0.01 Indole-3-pyruvic acid 3-Indolacetic acid 5-Metoxytryptophol L-5-OH-Triptofano Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção)Média do Sinal (Padrão Zero) - 2SD
(como lido a partir da curva padrão)
Durante a noite: 0.014 ng/mL versão reduzida: 0.025 ng/mL Soro, Urina, Plaquetas, Homogeneizados de
tecido, Sobrenadantes de Culturas Celulares (multiplicado pelo factor de diluição)
Durante a noite: 1.50 ng/mL versão reduzida: 2.68 ng/mL
Plasma Durante a noite: 0.33 ng/mL
Precisão Intervalo (ng/mL) CV (%) Intra-Ensaio Soro 91 - 327 3.8 – 6.6 Urina 114 - 625 4.8 – 8.2 Plasma 7.1 - 247 3.7 – 11.5 Inter-Ensaio Soro 23 – 355 6.7 – 17.3 Urina 87 – 626 9.4 – 18.1 Plasma 8.9 - 30 6.8 – 17.9 Linearidade Intervalo (ng/mL) Diluição em Série até Intervalo (%) Soro 226 – 1503 1:16 90 - 125 Urina 677 - 1264 1:32 89 - 117 Plasma 404 - 597 1:16 89 - 117 Recuperação Média (%) Intervalo (%)
% Recuperação após adição de “reforço” Soro 104 85 – 119 Urina 98 85 – 116 Plasma 100 83 –120 Comparação Método Usado versus HPLC / outro ELISA
Soro Teste IBL = 0.90 x HPLC + 19.5 r = 0.945; n = 28
Urina Teste IBL = 0.86 x ELISA + 20.0 r = 0.987; n = 32
Plaquetas * Teste IBL = 0.992 x HPLC + 0.008 r = 0.992; n = 50 *Reference: Kluge, H; Serotonin in Platelets; J Lab Med, 23 (6): 360-364 (1999)
17.
PROTOCOLO CURTO (DE UM DIA PARA O OUTRO E VERSÃO CURTA)
Tempo total do ensaio <5h
(versão reduzida) 18-22 h (Durante a noite) 18-22 h (Durante a noite) Espécime
Soro, Urina, Plaquetas-extracto, Homogeneizados de tecido e Controlos Soro, Urina, Plaquetas-extracto, Homogeneizados de tecido e Controlos Plasma sem Plaquetas
Pré-tratamento do amostra Não acile os padrões! Eles já são acilados.
Acilação
Volume de amostra 20 µL 20 µL 50 µL
Tampão de Reacção diluído 100 µL 100 µL 100 µL
Reagente de Acilação 25 µL 25 µL 25 µL
Condição de incubação,
Banho de água 15 min 37 °C 15 min 37 °C 15 min 37 °C
Tampão de Reacção diluído 2000 µL 2000 µL 1000 µL
Centrifugação 10 min à 1500 x g 10 min à 1500 x g 10 min à 1500 x g
Pipetagem da Placa de
Microtitulação
Padrões/ amostra acilada 50 µL 50 µL 50 µL
Serotonina Biotina 50 µL 50 µL 50 µL
Serotonina Antisoro 50 µL 50 µL 50 µL
Incubação da amostra
Tempo de incubação 90 min 16-20 h 16-20 h
Temperatura de incubação TA (18-25 °C) 2-8 °C 2-8 °C
Condição de incubação Agitador 500 rpm não agitador não agitador
Fases de lavagem 3 x 250 µL 3 x 250 µL 3 x 250 µL Incubação enzimático Conjugado Enzimático diluído 150 µL 150 µL 150 µL
Tempo de incubação 60 min 60 min 60 min
Temperatura de incubação TA (18-25 °C) TA (18-25 °C) TA (18-25 °C)
Condição de incubação Agitador 500 rpm Agitador 500 rpm Agitador 500 rpm
Fases de lavagem 3 x 250 µL 3 x 250 µL 3 x 250 µL
Incubação do Substrato
Volume de pipetagem 200 µL 200 µL 200 µL
Tempo de incubação 60 min 30 min 30 min
Temperatura de incubação TA (18-25 °C) TA (18-25 °C) TA (18-25 °C)
Condição de incubação Agitador 500 rpm Agitador 500 rpm Agitador 500 rpm
Solução de Paragem 50 µL 50 µL 50 µL
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO
1. Lahiri, D. K., Ge, Y.-W., Sharman, E. H., Bondy, St. C., Age-related changes in serum melatonin in mice: higher levels of combined melatonin and 6-hydroxymelatonin sulfate in the cerebral cortex than serum, heart, liver and kidney tissues. J. Pineal Res. May 2004, Vol. 36, issue 4, 217-223
2. Bethea, C. L., Lu, N. Z., Reddy, A., Shlaes, T., Streicher, J. M., Whittemore, S. R., Characterization of reproductive steroid receptors and response to estrogen in a rat serotonergic cell line. Journal of Neuroscience Methods 127, 31-41 (2003). Address: Bethea, C. L., Oregon National Primate Research Center, Beaverton, USA.
3. Pan, J et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance regulator Modulates Neurosecretory Function in Pulmonary Neuroendocrine Cell-Related Tumor Cell Line Models. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol. 27, 553 – 560 (2002)
4. Khan, I., Thomas, P., Disruption of Neuroendocrine Control of Luteinizing Hormone Secretion by Aroclor 1254 involves Inhibition of Hypothalamic Tryptophan Hydroxylase Activity. Biology of Reproduction, 64, 955-964 (2001). Address: Khan, I.A., University of Texas at Austin, U.S.A.
5. Harenberg, J, Huhle, G., Giese Ch., Wang, L., Feuring, M., Song, X., Hofmann, U.: Determination of serotonin release from platelets by enzyme immunoassay in the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia. British Journal of Hematology, 109, 182-186 (2000) Address: Harenberg J., University of Heidelberg, Germany
6. Kluge, H., Bolle, M., Reuter, R., Werner, S., Zahlten, W., Prudlo, J., Serotonin in Platelets: Comparative Analyses using New Enzyme Immunoassay and HPLC Test Kits and the Traditional Fluorimetric Procedure. J Lab Med, 23 (6): 360-364 (1999) Address: Kluge, H., University of Jena, Germany
7. Balaskas, E., Bamihas, G., Karamouzis M., Voyiatzis, G., Tourkantonis, A. Histamine and Serotonin in uremic pruritus: effect of ondansetron in CAPD-pruritic patients. Nephron, 78:395-402 (1998) Address: Elias Balaskas, MD Ahepa University Hospital, Thessaloniki, Greece
8. Sprott,H., Kluge,H., Franke,S, Hein,G. Altered Serotonin-Levels in Patients with Fibromyalgia. In: Journal of Musculoskeletal Pain, Abstracts from the 3rd World Congress on Myofascial Pain and Fibromyalgia San Antonio, Texas, USA, Editor: I. J. Russel, p. 65. (1995) Address: Kluge,H., University of Jena, Jena, Germany
9. Thomas Stratz, Wlodzimierz Samborski, Pawel Hrycaj, Thomas Pap, Stefan Mackiewicz, Pierre Mennet, Wolfgang Müller Die Serotoninkonzentration im Serum bei Patienten mit generalisierter Tendomyopathie (Fibromyalgie) und chronischer Polyarthritis. In: Medizinische Klinik, 88, 458-462 (1993).
Address: Thomas Stratz, Hochrhein-Institut für Rheumaforschung und Rheumaprävention, Bad Säckingen/Rheinfelden, Germany
