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EVERSON THIAGO SANTOS GERÔNCIO DA SILVA
CONSTRUÇÃO E DESENVOLVIMENTO DE DISPOSITIVOS DE TESTE POINT-OF-CARE COM DETECÇÃO ELETROQUÍMICA EM
PAPEL
CAMPINAS 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
EVERSON THIAGO SANTOS GERÔNCIO DA SILVA
CONSTRUÇÃO E DESENVOLVIMENTO DE DISPOSITIVOS DE TESTE POINT-OF-CARE COM DETECÇÃO ELETROQUÍMICA EM
PAPEL
ORIENTADOR: PROF. DR. LAURO TATSUO KUBOTA CO-ORIENTADOR: PROF. DR. ARBEN MERKOÇI
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM CIÊNCIAS.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR EVERSON THIAGO SANTOS GERÔNCIO DA SILVA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. LAURO TATSUO KUBOTA.
______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2015
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química
Simone Lucas Gonçalves de Oliveira - CRB 8/8144
Silva, Everson Thiago Santos Gerôncio da,
Si38c SilConstrução e desenvolvimento de dispositivos de teste point-of-care com detecção eletroquímica em papel / Everson Thiago Santos Gerôncio da Silva. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
SilOrientador: Lauro Tatsuo Kubota. SilCoorientador: Arben Merkoçi.
SilTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Sil1. Dispositivos em papel. 2. Tecnologia Point-of-care. 3. Detecção eletroquímica. 4. Selagem. 5. Triboeletrização. I. Kubota, Lauro Tatsuo. II.
Merkoçi, Arben. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Construction and development of point-of-care testing devices with electrochemical detection in paper
Palavras-chave em inglês: Paper-based devices Point-of-care technology Electrochemical detection Sealing Triboelectrification
Área de concentração: Físico-Química Titulação: Doutor em Ciências
Banca examinadora:
Lauro Tatsuo Kubota [Orientador] Lúcio Angnes
Rodrigo Alejandro Abarza Muñoz Pablo Sebastián Fernández Diego Pereira dos Santos Data de defesa: 19-05-2015
Programa de Pós-Graduação: Química
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In memoriam
Francisco Carlos Pilar de Araújo (um pai)
“Investir em conhecimento sempre nos dá grande retorno” “O ato de estudar deve ser natural. Imagine algo intrigante, desafiador,
interessante e ao mesmo tempo divertido...”
“O conhecimento liberta! Além de ser a única coisa que você pode doar a outra pessoa sem perder nada”
Nunca esquecerei. Dedico esta tese a você, pai
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AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer primeiramente a Deus e à minha família.
Agradeço imensamente e também dedico esta tese à pessoa que esteve do meu lado sempre durante essa jornada: minha noiva, amiga e futura esposa Irlene Maria Pereira e Silva
Aos meus pais: Maria do Socorro Rocha Santos e Raimundo Gerôncio da Silva; irmãs: Thayse Santos Gerôncio da Silva e Thayná Santos Araújo; e ao meu irmão Rafael Gerôncio
Gostaria de deixar um agradecimento especial ao meu orientador Prof. Dr. Lauro T. Kubota pela orientação, oportunidade, paciência, amizade e, principalmente, por não ter me deixado desistir da minha carreira. Obrigado pelo apoio e confiança depositada, no momento de incerteza.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Arben Merkoçi pelo apoio, paciência e ajuda de sempre.
À Rúbia M. Rapelli pelo suporte, amizade e por se disponibilizar a ajudar todos do laboratório sempre que precisamos; seja na parte burocrática ou nas questões científicas.
Aos amigos irmãos: Lucas, Sol, Samuel e Michel. Além de toda a turma que o IQ-Unicamp e o coração ajudaram a unir e que permanecem assim até hoje
Aos meus irmãos da banda Outro Lado: Rafael, Zé Luis, Ricardo e Felipe. Aos amigos do grupo LEEDS; em especial Murilo Santhiago e José Tiago C. Barragan, por me acompanharem durante este trabalho de tese e pela paciência durante minha adaptação em uma nova área de pesquisa À CAPES, pela bolsa concedida.
Aos funcionários do IQ que contribuíram, direta ou indiretamente, na realização deste projeto.
Não posso deixar de agradecer: EngHaw, S.O.A.D., Metallica, Iron Maiden,
Validuate (Piauiense), dentre outras...que foram extremamente exigidas nos dias difíceis de trabalho, principalmente na parte escrita.
xi
CURRÍCULUM
Formação acadêmica
o Licenciatura em Química – Universidade Federal do Piauí – UFPI (2005 – 2008). o Mestrado em Química (AC: Fisico-Química) – UNICAMP (2008 – 2010).
Publicações
o Artigos
Gravagnuolo, A. M., Narváez, E. M., Longobardi, S., Silva, E. T. S. G., Giardina, P. and
Merkoçi, A. In Situ Production of Biofunctionalized Few-Layer Defect-Free Microsheets of Graphene. Adv Funct Mater (2015) DOI: 10.1002/adfm.201500016.
Silva, E. T. S. G., Santhiago, M., Souza, F. R., Coltro, W. K. T. and Kubota, L. T.
Triboelectric effect as a new strategy for sealing and controlling the flow in paper-based devices. Lab Chip 15 (2015) 1651-5.
Silva, E. T. S. G., Miserere, S., Kubota, L. T. and Merkoçi, A. Simple On-Plastic/Paper
Inkjet-Printed Solid-State Ag/AgCl Pseudoreference Electrode. Anal Chem 86 (2014) 10531-4.
Silva, E. T. S. G., Barragan, J. T. C., Santhiago, M. and Kubota, L. T. Construction of a new
versatile point-of-care testing device with electrochemical detection employing paper as a microfluidic platform. Anal Methods 6 (2014) 6133-6136.
o Livros
Silva, E. T. S. G.; Sousa, R. F.; Coelho, A. G.; Farias Filho, B. B.; Barros, E. D. S.;
Goncalves, J. S.; Santos, L. M.; Santos, L. S. S.; Sousa, M. V. N.; Soares, M. F. C.; Gomes, M. S. S. O.; Moraes, R. R.; Luz, R. A. S. ; Coelho, R. C., “Química na Escola Pública”.
Fortaleza: Funcap, 1 (2007).
Silva, E. T. S. G.; Sousa, R. F.; Coelho, A. G.; Farias Filho, B. B.; Barros, E. D. S.;
Goncalves, J. S.; Santos, L. M.; Santos, L. S. S.; Sousa, M. V. N.; Soares, M. F. C.; Gomes, M. S. S. O.; Moraes, R. R.; Luz, R. A. S. ; Coelho, R. C., “Química na Escola Pública”.
xii o Outros
Santos, R. S., Oliveira, B. H., Silva, E. T. S. G., Oliveira, H. G., Leite, C. A. P., Giles, C.
and Longo, C. EXAFS study of Fe-doped TiO2 and α-Fe2O3/TiO2 photocatalysts. Activity
Report– LNLS (2010).
Participação em reuniões científicas
o III School of Bioanalytical Chemistry.Use of triboelectric effect as a simple method for sealing microfluidic paper-based devices. 2014. (Encontro).
o III Escola de Bioanalítica.Uso do efeito triboelétrico como um método simples para a selagem de dispositivos microfluídicos a base de papel. 2014. (Encontro).
o Electrochem 2013. Construction of a new versatile point-of-care testing device with electrochemical detection in paper platform. 2013. (Congresso).
o II Workshop em Microfluídica.Construção de um dispositivo point-of-care para separação e detecção eletroquímica em papel. 2012. (Oficina).
o I School of Bioanalytical Chemistry.Dispositivos microfluídicos point-of-care testing, com separação e detecção eletroquímica em plataforma de papel. 2012. (Encontro). o 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. ZnO e ZnO dopado com
enxofre: foto-estabilidade em meio aquoso. 2011. (Congresso). o XXII Congresso da ANPG. 2010. (Congresso).
o 33ra Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química. Síntese e caracterização de ZnO dopado com enxofre para aplicação em conversão de energia solar. 2010. (Congresso).
o Materiais para sensores químicos e processos ambientais. 2009. (Oficina).
o Workshop International on Nanomaterials and Functional Materials. 2009. (Oficina). o 11th International Conference on Advanced Materials.Porous S-doped ZnO electrode
for application in solar energy conversion. 2009. (Outra).
o II Congresso Norte-Nordeste de Química. Caracterização a Síntese de Polímeros Semicondutores. 2008. (Congresso).
xiii
o XLVII Congresso Brasileiro de Química CBQ. Blendas Poliméricas a Base de Polianilina e Poli(Óxido de Etileno): Caracterização Elétrica e Mecânica. 2007. (Congresso).
o XLVI Congresso Brasileiro de Química CBQ. Síntese e Caracterização de Filmes Auto-Sustentados de Blendas de Polianilina e Poli(Óxido de Etileno). 2006. (Congresso).
o XV Seminário de Iniciação Científica da UFPI. Caracterização Elétricas de Blendas Poliméricas de Polianilina e Poli(Óxido de Etileno). 2006. (Seminário).
Apresentação de trabalhos em eventos científicos
o SILVA, E. T. S. G. ; SANTHIAGO, M. ; Souza, F. R. ; Kubota, L. T. . Uso do efeito triboelétrico como um método simples para a selagem de dispositivos microfluídicos a base de papel. 2014. (Apresentação de Trabalho/Outra).
o SILVA, E. T. S. G. ; SANTHIAGO, M. ; Souza, F. R. ; Kubota, L. T. . Use of triboelectric effect as a simple method for sealing microfluidic paper-based devices. 2014. (Apresentação de Trabalho/Outra).
o SILVA, E. T. S. G. ; Kubota, L. T. . Construction of a new versatile point-of-care testing device with electrochemical detection in paper platform. 2013. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
o SILVA, Everson Thiago Santos Gerôncio da ; SHIROMA, L. Y. ; SANTHIAGO, M. ; Kubota, L. T. . Dispositivos microfluídicos point-of-care testing, com separação e detecção eletroquímica em plataforma de papel. 2012. (Apresentação de Trabalho/Conferência ou palestra).
o SILVA, Everson Thiago Santos Gerôncio da ; Kubota, L. T. . Construção de um dispositivo point-of-care para separação e detecção eletroquímica em papel. 2012. (Apresentação de Trabalho/Outra).
o SILVA, Everson Thiago Santos Gerôncio da ; BOSSHARD, G. Z. ; SIGOLI, F. A. ; LONGO, C. . ZnO e ZnO dopado com enxofre: foto-estabilidade em meio aquoso. 2011. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
o SILVA, Everson Thiago Santos Gerôncio da ; BOSSHARD, G. Z. ; SIGOLI, F. A. ; LONGO, C. . Sintese e caracterização de ZnO dopado com enxofre para aplicação em conversão de energia solar. 2010. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
xiv
o SILVA, Everson Thiago Santos Gerôncio da ; BOSSHARD, G. Z. ; SIGOLI, F. A. ; LONGO, C. . 11th International Conference on Advanced Materials | VIII Encontro da SBPMat. 2009. (Apresentação de Trabalho/Conferência ou palestra).
o SILVA, Everson Thiago Santos Gerôncio da ; HIDALGO, Angel Alberto ; CUNHA, Helder Nunes da . Caracterização e Síntese de Polímeros Semicondutores. 2008. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
o SILVA, Everson Thiago Santos Gerôncio da ; EIRAS, Carla . Blendas Poliméricas a Base de Polianilina e Poli(Óxido de Etileno): Caracterização Elétrica e Mecânica. 2007. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
o SILVA, Everson Thiago Santos Gerôncio da ; EIRAS, Carla ; CUNHA, Helder Nunes da ; SOUZA, Cleide Maria Leite de . Síntese e Caracterização de Filmes Auto-Sustentados de Blendas de Polianilina e Poli(Óxido de Etileno). 2006. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
o SILVA, Everson Thiago Santos Gerôncio da ; EIRAS, Carla ; CUNHA, Helder Nunes da ; SOUZA, Cleide Maria Leite de . Caracterização Elétrica de Blendas Poliméricas de Polianilina e Poli(Óxido de Etileno). 2006. (Apresentação de Trabalho/Seminário).
Experiência didática
o Auxiliar didático (PED B) nas disciplinas QG 109 (Química geral experimental) e QF 632 (Físico-química experimental I); ministradas no Instituto de Química da Unicamp, no 2º semestre de 2012 e 2014, respectivamente.
o Auxiliar didático (PED C) na disciplina QF 335A (Físico-química); minisrtada no Instituto de Química da Unicamp, no 2º semestre de 2009.
o Professor de Química no pré-vestibular popular do Colégio Melvin Jones – Teresina-PI, Março a Julho de 2008.
o Professor de Química (Ensino Fundamental), Colégio Humanos – Teresina-PI, Agosto de 2005 a Julho de 2008.
o Professor do projeto “Química na escola Pública” organizado pela coordenação da Olimpíada Brasileira de Química – OBQ no 1º semestre de 2007.
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Resumo
CONSTRUÇÃO E DESENVOLVIMENTO DE DISPOSITIVOS DE TESTE POINT-OF-CARE COM DETECÇÃO ELETROQUÍMICA EM PAPEL
Os dispositivos microfluídicos fabricados em plataforma de papel (PADs) têm recebido enorme atenção nos últimos anos, principalmente devido ao seu baixo custo, capacidade natural de transporte de fluidos por capilaridade, biodegradabilidade/biocompatibilidade, elevada área superficial, dentre outros. Entretanto, apesar do grande avanço recente no desenvolvimento e aplicação desta tecnologia, ainda existem vários campos a serem explorados, e fim de melhorar esta plataforma para aplicações analíticas em campo. Assim, a primeira etapa deste trabalho consistiu na construção de um dispositivo analítico novo e versátil, com detecção eletroquímica que permitiu a utilização de diferentes tipos de papel como plataforma microfluídica em ambiente fechado, sem a necessidade de mudar o sistema de detecção. A estrutura fechada deste dispositivo, bem como o uso de fechaduras magnéticas, serviu de base para o desenvolvimento de uma nova metodologia de selagem para dispositivos analíticos à base de papel empregando o efeito triboelétrico, o qual foi relatado aqui pela primeira vez. Por último, uma tecnologia simples para microfabricação de eletrodos (com destaque para os eletrodos de pseudo-referência de Ag/AgCl) foi demonstrada, utilizando impressora inkjet. PET e papel Whatman #1 foram usados como substratos para demonstrar as possibilidades da técnica, além de permitir posteriormente o uso do efeito triboelétrico para a construção do dispositivo final. Como conclusão desse trabalho de tese, pode-se afirmar que a construção de diferentes dispositivos microfluídicos a base de papel, bem como a implementação de novos métodos de fabricação foram realizados com sucesso.
xvii
Abstract
CONSTRUCTION AND DEVELOPMENT OF POINT-OF-CARE TESTING DEVICES WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION IN
PAPER
The microfluidic paper-based analytical devices (PADs) have received considerable attention in the past few years, mainly due to its low cost, natural ability to transport fluids by capillary force, biodegradability/biocompatibility, high surface area, and more. However, despite the recent major breakthrough in the development and application of this technology, there are still many fields to explore, and improve this platform for analytical point-of-care applications. Thus, the first step of this work was to develop a new and versatile analytical device with electrochemical detection, which allows the use of different types of paper as microfluidic platform in an enclosed space without the need of changing the detection system. The closed structure of the device as well as the use of magnetic locks provides the basis for the development of a new analytical method for sealing paper-based devices by using triboelectric effect, which was reported here by the very first time. Finally, a simple technology for microfabrication of electrodes (especially the Ag/AgCl pseudo-reference electrode) was demonstrated by using an inkjet printer. PET and Whatman #1 paper were used as substrates to demonstrate the possibilities of the technique. Then, this technology was coupled with the sealing method shown earlier (using triboelectric effect) to build the final microfluidic device. As a conclusion of this thesis, it can be stated that the construction of different microfluidic paper-based analytical devices as well as the implementation of new manufacturing methods were carried out successfully.
xix
Sumário
Lista de abreviaturas e siglas xxi
Lista de tabelas xxv
Lista de figuras xxvii
1. Introdução geral e objetivos 01
1.1. Introdução 03
Referências 05
1.2. Objetivos 07
2. Revisão da Literatura 09
2.1. Um breve histórico sobre PADs 11
2.1.1. Uso do papel como plataforma microfluídica 11 2.1.2. Metodologias de fabricação dos PADs 12
2.1.3. Selagem e controle de fluxo 17
2.1.4. Sistemas de detecção em PADs 22
2.1.5. Fabricação de eletrodos para PADs 27
2.1.6. Uso de impressoras inkjet 30
Referências 33
3. Construção de um novo e versátil dispositivo de teste POC com detecção
eletroquímica em papel 39
3.1. Motivação 41
3.2. Experimental 42
3.2.1. Materiais, equipamentos e reagentes 42
3.2.2. Construção do dispositivo 43
3.2.3. Preparação do eletrodo de trabalho (WE) 43 3.2.4. Preparação do contra-eletrodo/pseudo-referência (CE/pRE) 44
3.3. Resultados e discussão 46
3.3.1. Otimização do dispositivo 46
3.3.2. Descrição e caracterização do dispositivo otimizado 47
3.3.3. Aplicação do dispositivo 54
3.4. Conclusões parciais 63
Referências 64
4. Uso do efeito triboelétrico na selagem e controle de fluxo em dispositivos
microfluídicos a base de papel 65
4.1. Motivação 67
4.2. Experimental 68
4.2.1. Construção dos canais microfluídicos em papel 68 4.2.2. Corte das folhas de poliéster para selagem 70
4.2.3. Procedimento experimental 70
4.3. Resultados e discussão 72
4.3.1. Taxa de fluxo em dispositivos de papel tribosselados 72 4.3.2. Influência das cargas eletrostáticas na taxa de fluxo 79 4.3.3. Controle do fluxo utilizando o efeito triboelétrico (TEE) 83
4.4. Conclusões parciais 90
xx
5. Fabricação de um simples eletrodo de pseudo-referência de Ag/AgCl utilizando plataformas de papel/plástico para o acoplamento com PADs 93
5.1. Motivação 95
5.2. Experimental 96
5.2.1. Materiais e reagentes 96
5.2.2. Equipamentos e métodos 97
5.2.3. Parâmetros de impressão da Dimatix DMP-2800 98
5.3. Resultados e discussão 99
5.3.1. Fabricação dos pRE de Ag/AgCl em PET 99 5.3.2. Fabricação dos pRE de Ag/AgCl em substrato de papel 106 5.3.3. Caracterização eletroquímica dos pRE de Ag/AgCl 110
5.3.4. Fabricação de um PAD 118 5.4. Conclusões parciais 123 Referências 124 6. Conclusões do trabalho 127 6.1. Considerações finais 129 7. Perspectivas Futuras 131
xxi
Lista de abreviaturas e siglas
Permeabilidade do material poroso (neste caso, papel) Significado geral: micro / Equação de Darcy: viscosidade dinâmica
Tensão superficial do líquido Viscosidade do fluido
Ângulo de contato líquido-substrato (Equação de Lucas-Washburn) C Unidade de carga elétrica microcoulomb
E Variação de potencial (eletroquímica)
P Variação de pressão ao longo do canal microfluídico
PAD do inglês microfluidic paper-based analytical device (dispositivo microfluídico a base de papel)
4-AF 4-Aminofenol
a Atividade química de uma espécie em solução
AgNP Nanopartículas de prata AuNP Nanopartículas de ouro CA Cronoamperometria CE Contra-eletrodo
CE/pRE Contra-eletrodo/pseudo-referência (eletrodo único)
Cgrafite Carbono grafite
CLD do inglês chemiluminescence detection (detecção por quimioluminescência) cPs Unidade de viscosidade (centipoise)
CV do inglês ciclic voltammetry (voltametria cíclica)
DNA do inglês deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico) DOD do inglês drop-on-demand (deposição de gotas por demanda)
ds do inglês drop spacing (espaçamento entre gotas)
E Potencial (eletroquímica) E0 Potencial padrão
xxii
ECLD do inglês electrochemiluminescence detection (detecção por
eletroquimioluminescência)
EDS do inglês Energy-dispersive X-ray Spectroscopy (espectroscopia de energia dispersiva de raios X)
ELISA do inglês enzime-linked immunosorbent assay (tipo de imunoensaio enzimático)
F Constante de Faraday h Espessura do papel i Corrente (eletroquímica) ipa Corrente de pico anódica
ipc Corrente de pico catódica
Kps Constante de solubilidade (ou produto de solubilidade)
L Comprimento do canal (distância percorrida pelo líquido)
LBL do inglês Layer-by-Layer (técnica de deposição camada-por-camada) LOD do inglês limit of detection (limite de detecção)
m Unidade de distância: metro
MIP do inglês molecularly imprinted polymer (polímero molecularmente impresso) Nozzle Bico injetor
OCP do inglês open circuit potential (potencial de circuito aberto)
PA Paracetamol
Pa Unidade de pressão: Pascal
PCR Reação em cadeia da polimerase (método de amplificação de DNA) PDMS Polidimetilsiloxano
PET Polietilenotereftalato (um poliéster) PI Poliimida
PMMA Poli(metil metacrilato) ou acrílico
POC do inlês point-of-care (dispositivo de teste portátil para diagnóstico no local) pRE Eletrodo de pseudo-referência
PTFE Politetrafluoroetileno ou Teflon
xxiii
r Significado geral: coeficiente de correlação / Equação de Lucas-Washburn:
Raio do poro
R Constante universal dos gases RE Eletrodo de referência
s Unidade de tempo: segundo s/n Relação sinal/ruído
SEM do inglês Scanning Electronic Microscopy (microscopia eletrônica de varredura)
SPE do inglês screen-printed electrode (eletrodos serigrafados)
SPRE do inglês screen-printed reference electrodes (eletrodos de referência serigrafados)
SSREs do inglês solid-state reference electrodes (eletrodos de referência de estado sólido)
t Tempo
T Temperatura expressa em Kelvin
TEDs do inglês triboelectric delays (atraso no fluxo através do efeito triboelétrico) TEE do inglês triboelectric effect (efeito triboelétrico)
w Largura do papel
xxv
Lista de tabelas
Capítulo 4
Tabela 4.1. Série triboelétrica, considerando alguns materiais comuns 71
Tabela 4.2. Influência do comprimento dos TEDs, condições para a parte linear do gráfico e equações da reta 89
xxvii
Lista de figuras
Capítulo 2
Figura 2.1. Representação esquemática do processo de fotolitografia em
papel 14
Figura 2.2. Representação esquemática da construção dos canais microfluídicos em plataforma de papel utilizando uma impressora à base de cera
16
Figura 2.3. Exemplos de metodologias de selagem em µPADs já relatadas na literatura: (a) laminação, (b) impressão de cera e (c) combinação da impressão de cera para a formação dos canais microfluídicos com a impressão de toner para promover a selagem
18
Figura 2.4. Exemplos de metodologias para o controle de fluxo em µPADs: (a) uso de sacarose como barreira solúvel para atrasar o fluxo; (b) barreira física com acionamento magnético; (c) uso de papel absorvedor; (d) confecção de ranhuras no papel; (e) uso de barreiras plásticas (formação de gaps microfluídicos) e (f) confecção de canais abertos
21
Figura 2.5. Exemplos de metodologias de detecção em µPADs: (a) detecção colorimétrica; (b) eletroquimioluminescência; (c) eletroquímica e (d) quimioluminescência
26
Figura 2.6. Representação esquemática do mecanismo de formação da gota em uma impressora DOD piezoelétrica, através da aplicação de pulsos de potencial
32
Capítulo 3
Figura 3.1. Representação esquemática da montagem do WE 44
Figura 3.2. Representação esquemática da construção do contra-eletrodo/pseudo-referência (CE/pRE) 45 Figura 3.3. Representação esquemática da (a) base e da tampa do dispositivo
(vista de cima), onde: i) é o reservatório de eluente, ii) o CE/pRE,
iii) uma peça de aço inox responsável pelo contato elétrico do
CE/pRE fora do dispositivo, iv) cavidade para posição dos papéis
xxviii
absorvedores, v) ímã de neodímio usado para fechar o dispositivo,
vi) entrada do analito, vii) orifícios utilizados para adicionar e/ou
remover eluente, viii) entrada para a rosca de PTFE e WE (concêntrico à peça de PTFE). (b) Vista do dispositivo fechado, com o WE no posicionado no topo; (c) posicionamento do papel no dispositivo; (d) vista detalhada (detalhe: Peça de PTFE com entrada de rosca)
Figura 3.4. (a) Vista lateral do dispositivo durante o ensaio de fluxo e (b) os voltamogramas cíclicos obtidos em solução de [Fe(CN)6]3-/4- 5,0
mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1 (v = 50 mV s-1) com seis mudanças
consecutivas da tira de papel usada como plataforma microfluídica, sem remover ou deslocar o WE durante estas mudanças
52
Figura 3.5. (a) Fotografia ilustrativa da configuração experimental e (b) Voltamogramas cíclicos obtidos em 50 L de solução [Fe(CN)6]3-/4- 5,0 mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1 (v = 50 mV s-1) com
o dispositivo proposto (sem papel) e em uma célula convencional com sistema de três eletrodos
53
Figura 3.6. Voltamogramas cíclicos obtidos a partir de uma solução de 4-AF 10 mmol L-1 em tampão acetato 0,1 mol L-1 (▬) e do branco (▬),
com velocidade de varredura de 50 mV s-1
55
Figura 3.7. (a) Ilustração do procedimento de injeção do analito (4-AF) durante o ensaio, sob fluxo contínuo de eluente (tampão acetato 0,1 mol L-1 – pH 4,5), utilizando uma micropipeta graduada.
Detalhe: Visão de cima do dispositivo indicando a região de
entrada do analito (a 1,0 cm do sistema de detecção). (b) Cronoamperogramas obtidos para a detecção do 4-AF (0,5 mmol L-1), com aplicação de 0,30 V (vs. C
grafite) de potencial
56
Figura 3.8. Voltamogramas cíclicos obtidos a partir de uma solução contendo 4-AF e PA (5 mmol L-1 cada) em tampão fosfato 0,1 mol L-1 (▬)
e do branco (▬), com velocidade de varredura de 50 mV s-1
57
Figura 3.9. Cronoamperogramas obtidos demonstrando a separação e detecção de 4-AF e PA, aplicando 0,65 V vs. Cgrafite, utilizando
dois papéis cromatográficos diferentes
59
Figura 3.10. Cronoamperograma obtido após injeções sucessivas de uma solução contendo PA 0,5 mmol L-1 em fluxo constante de tampão
fosfato 0,1 mol L-1 (pH 7,4) e sob 0,65 V (vs. C
grafite) de potencial
aplicado
xxix
Figura 3.11. (a) Cronoamperogramas obtidos após injeções sucessivas de soluções padrão contendo PA (de 0,5 a 2,5 mmol L-1) num fluxo
constante de tampão fosfato 0,1 mol L-1 (pH 7,4) e sob 0,65 V (vs.
Cgrafite) de potencial aplicado. Detalhe: Curva analítica. (b)
Cronoamperogramas obtidos para a detecção de PA 10 µmol L-1,
em triplicata
62
Capítulo 4
Figura 4.1. Fotografias dos μPADs construídos pela impressão de cera, seguido de tratamento térmico à 150 °C por alguns segundos, formando canais de 2 mm de largura e com duas configurações: (a) com canais retos de 80 mm de comprimento e (b) com um canal em forma de “U” invertido (~130 mm, total), com duas entradas de eluente
69
Figura 4.2. (a) Imagens do tribocarregamento manual das folhas de PET por fricção em teflon ou acrílico, e (b) representação esquemática do processo de tribosselagem por contato eletrostático do tipo "sanduiche". Procedimento para a medida de fluxo no μPAD posicionado verticalmente (c)
72
Figura 4.3. (a) Distância percorrida pelo fluido no papel em função do tempo para os µPADs abertos ou selados eletrostaticamente com PET (tribosselagem) à 32% de umidade ambiente. Detalhe: distância percorrida pelo fluido em função da raiz quadrada do tempo. (b) Imagem do ensaio realizado após 10 minutos
74
Figura 4.4. (a) Imagem ilustrativa do experimento controle (com selagem sem carga). (b) Distância percorrida pelo fluido em função do tempo para o µPAD selado com PET à 32% de umidade; Detalhe: distância percorrida pelo fluido em função da raiz quadrada do tempo
76
Figura 4.5. Distância percorrida pelo fluido no papel em função do tempo para os µPADs abertos ou selados eletrostaticamente com PET (triboselagem) à 63% de umidade ambiente. Detalhe: distância percorrida pelo fluido em função da raiz quadrada do tempo
78
Figura 4.6. (a) Gota pendente de uma solução aquosa de corante alimentício preenchida em uma bureta de vidro e (b) sua deformação pela aproximação da folha de PET tribocarregada. (c) Fluxo contínuo
xxx
da solução aquosa de corante (c) antes e (d) após a aproximação da folha de PET tribocarregada
Figura 4.7. (a) Representação esquemática do processo de selagem, com duas folhas de PET perfuradas (i e ii) usadas como espaçadores, e duas folhas de PET carregadas (iii e iv) utilizadas para promover a selagem e para retardar o fluxo. (b) Distância percorrida pelo fluido após 10 min de análise (em triplicata), para os dispositivos carregados e o controle
82
Figura 4.8. (a) Fotografias obtidas durante o experimento controle e (b) com TEDs de 25 mm e (c) 45 mm de comprimento (ambos com 2 mm de largura). As setas amarelas indicam o ponto de encontro das soluções aquosas de corante
85
Figura 4.9. Configuração experimental para controlar o fluxo através do emprego de TEDs com comprimentos diferentes em ambos os lados do canal. Onde (i) representa o experimento controle; (ii) e (iii) representam TEDs com 20 e 40 mm de comprimento, respectivamente
86
Figura 4.10. Tempo necessário para o encontro entre as soluções no experimento de controle e com TEDs de diferentes tamanhos 87 Figura 4.11. Distância percorrida pelo fluido em função da raiz quadrada do
tempo, utilizando TEDs com diferentes comprimentos (as tiras de papel foram posicionadas verticalmente)
88
Capítulo 5
Figura 5.1. Fotografia ilustrativa (a) da impressora Dimatix e (b) seu cartucho
de 10 pL com 16 jatos de tinta 97
Figura 5.2. (a) Fotografia ilustrativa da impressora de materiais Dimatix e um desenho representativo de um dos 16 jatos de tinta piezoelétricos (nozzles) presentes no cartucho. (b) Etapa de formação de cloreto nos eletrodos em solução de NaClO para a formação dos pRE de Ag/AgCl
100
Figura 5.3. (a) Fotografia dos eletrodos de AgNP antes e após o processo de cloração química com NaClO. (b) Imagens de SEM da superfície do eletrodo de prata impresso em PET antes e (c) após a formação da camada de AgCl por imersão em solução de NaClO por 60 s
xxxi
Figura 5.4. Medidas de EDS dos eletrodos impressos em PET antes (▬) e após (▬) a reação de cloração com solução de NaClO (40mg/mL) por 60s
103
Figura 5.5. Formação eletroquímica de AgCl na superfície do eletrodo de prata impresso em PET por CA em 0,5 mol L-1 de NaCl, aplicando
0,5 V de potencial (vs. Platina)
104
Figura 5.6. Imagens de SEM da superfície do eletrodo de prata impresso em PET antes (a) e após (b) a formação eletroquímica da camada de AgCl por CA em solução de NaCl 0,5 mol L-1 e sobre aplicação
de 0,5V de potencial (vs. Platina) durante 30 s
105
Figura 5.7. Medidas de EDS dos eletrodos impressos em PET antes (▬) e após (▬) a cloração eletroquímica por CA em solução de NaCl 0,5 mol L-1 e sobre aplicação de 0,5 V de potencial (vs. Platina)
durante 30s
105
Figura 5.8. Etapa de formação da barreira hidrofóbica por impressão de cera, seguida de tratamento térmico a 120°C por 1 minuto 107 Figura 5.9. (a) Fotografia dos eletrodos de AgNP (com dimensões diferentes,
porém fabricados no mesmo dia) antes e após o processo de cloração química com NaClO. (b) Imagens de SEM da superfície do eletrodo de prata impresso em papel antes e (c) após a formação da camada de AgCl por imersão em solução de NaClO por 30 s
108
Figura 5.10. Medidas de EDS dos eletrodos impressos em papel antes (▬) e após (▬) a cloração química por imersão em solução de NaClO (40 mg/mL) por um período de 30s
109
Figura 5.11. Medidas de CA comparando o comportamento dos eletrodos de prata impressos em PET e os pRE de Ag/AgCl produzidos pelo método químico ou eletroquímico (além de um SPRE utilizado para comparação), contra um eletrodo comercial de Ag/AgCl||3,0 mol L-1. Detalhe: Visão aproximada do gráfico destacando a
estabilização do potencial dos pRE
110
Figura 5.12. Medidas de CA dos pRE impressos em PET, preparados via cloração química com solução de NaClO (durante 1 ou 5 min) contra um eletrodo comercial de Ag/AgCl||3,0 mol L-1. Detalhe:
Uma fotografia do pRE após 10 minutos de cloração química
112
Figura 5.13. Medidas de cronoamperometria dos pRE impressos em papel, preparados via cloração química com solução de NaClO (30 ou 114
xxxii
60 s) contra um eletrodo comercial de Ag/AgCl||3,0 mol L-1.
Detalhe: Fotografía dos pRE de Ag/AgCl impressos em papel
Figura 5.14. Gráfico de barras representando as medidas de CA para os pRE impressos em papel e PET, seguido por cloração com uma solução de alvejante (SPRE foi utilizado para comparação) vs. o eletrodo comercial de Ag/AgCl||3,0 mol L-1.O gráfico em escala
maximizada está apresentado em detalhe
115
Figura 5.15. A estabilidade de armazenamento dos pRE impressos em PET, seguido por cloração em solução de alvejante durante 1 min, foram avaliadas por cronopotenciometria contra eletrodo de referência comercial de Ag/AgCl||3,0 mol L-1. Um pRE
eletroquimicamente produzido foi utilizado para efeitos de comparação
117
Figura 5.16. (a) Visão detalhada do µPAD preparado combinando o método de tribosselagem demonstrado no Capítulo 4 com o uso do pRE de Ag/AgCl preparado, em um sistema de 3 eletrodos. (b) Visão ampliada da região de detecção eletroquímica, com CE e WE de ouro, pRE de Ag/AgCl e contatos elétricos de prata. (c) Representação esquemática do ensaio de fluxo realizado
120
Figura 5.17. (a) Imagem do µPAD construído, durante o ensaio eletroquímico em fluxo e (b) os voltamogramas cíclicos obtidos a partir do fluxo da sonda redox de [Fe(CN)6]3-/4- (2,5 mmol L-1 em KCl
0,5 mol L-1) através dos poros da plataforma de papel, com
diferentes velocidades de varredura. Detalhe: Comportamento das correntes de pico em função da raiz quadrada da velocidade de varredura
1
Capítulo 1
3
1.1. Introdução
Plataformas de papel têm sido utilizadas há séculos como substrato para ensaios analíticos, sendo o primeiro relato científico datado em meados de 1800 com o uso do papel de tornassol, comumente empregado para medidas qualitativas de pH. O uso desse material oferece inúmeras vantagens em relação a outros substratos utilizados em aplicações analíticas, incluindo sua elevada área superficial, baixo custo, capacidade natural de transporte de fluidos por capilaridade sem a necessidade de bombas, possibilidade de purificação/separação de amostras por filtração ou cromatografia, dentre outras.1-3 Por esta razão, diversos dispositivos de teste portáteis (dispositivos
point-of-care, POC) têm sido desenvolvidos para serem operados em ambientes externos ao laboratório, como por exemplo, os testes rápidos para detecção de metais4, além dos imunoensaios de fluxo lateral.5 Entretanto, apesar de suas inúmeras vantagens, esta plataforma foi subutilizada com o passar dos anos e, em muitos casos, ignorada (como em ensaios microfluídicos, por exemplo), limitando seu potencial apenas a aplicações qualitativas e de baixa complexidade.
No entanto, em 2007 Martinez e colaboradores introduziram um conceito mais avançado de fabricação e detecção de diferentes analitos utilizando plataformas de papel.6 Os dispositivos, denominados dispositivos microfluídicos à base de papel (µPADs, do inglês microfluidic paper-based analytical devices), consistiam na modificação de papéis cromatográficos por meio da geração de barreiras hidrofóbicas poliméricas pela técnica de fotolitografia, criando canais e regiões de detecção bem definidos para a realização de bioensaios. Neste trabalho, os autores realizaram a detecção simultânea de glicose e proteína utilizando apenas 5 µL de uma amostra de
4
urina, o que demonstra o baixo volume de amostra necessária para a realização dos ensaios, e consequentemente, a diminuição do desperdício de reagentes. Além disso, os limites de detecção alcançados foram comparáveis com os ensaios comerciais.6 Desde então, o desenvolvimento dos dispositivos microfluídicos para diagnóstico rápido em plataforma de papel vem sendo amplamente investigado e aprimorado para uso nas mais variadas e complexas aplicações, que vão desde o monitoramento ambiental até os diagnósticos clínicos, incluindo multi-detecção, ensaios com PCR7 e culturas celulares.8
Com o objetivo de aprimorar os µPADs como ferramenta analítica, diferentes métodos de detecção vêm sendo explorados visando uma melhora do sinal analítico e a diminuição do limite de detecção. Os métodos mais explorados relatados na literatura são o colorimétrico,9, 10 o eletroquímico (ECD),11, 12 a quimioluminescência (CLD)13 e a eletroquimioluminescência (ECLD)14. Dentre estes, o colorimétrico é o mais utilizado, sendo geralmente empregado em sistemas de reações enzimáticas e químicas com geração de coloração, o qual na maioria dos casos, os resultados podem ser vistos a nível macroscópico, ou seja, a “olho nu”. Porém, este método é mais adequado quando respostas simples como “SIM/NÃO” ou semi-quantitativas são suficientes para o diagnóstico. Por outro lado, o sistema de detecção eletroquímico é um dos mais promissores, devido sua fácil miniaturização, baixo tempo de resposta, alta sensibilidade e seletividade, além da possibilidade de obtenção de medidas quantitativas, o que torna o µPAD uma poderosa ferramenta para diferentes aplicações (mais detalhes serão abordados no Capítulo 3 – Revisão Bibliográfica).
Apesar do enorme avanço na fabricação dos dispositivos à base de papel, bem como no desenvolvimento dos seus sistemas de detecção, ainda existem
5
vários campos a serem explorados a fim de melhorar essa plataforma, os quais estão relacionados a processos alternativos de microfabricação, selagem, modificação e controle de fluxo. O investimento no desenvolvimento deste tipo de plataforma pode ser bastante interessante não só para a comunidade científica, mas também para sua implantação em situações práticas de grande relevância, como por exemplo, em países em desenvolvimento (onde o acesso a instalações laboratoriais e pessoal capacitado é normalmente limitado à regiões mais nobres), campo militar, regiões remotas e situações de emergência, caracterizada quando a obtenção de resultados rápidos são cruciais para o tratamento de um paciente, por exemplo.
Considerando a atual importância dos sensores fabricados utilizando plataformas de baixo custo e que forneçam diagnósticos rápidos, este trabalho de tese tem como base a construção de novos dispositivos de teste POC utilizando papel como plataforma microfluídica e o sistema eletroquímico como método de detecção. Será demonstrado o uso de novas abordagens, a fim de expandir as possibilidades para a fabricação desse tipo de dispositivo para ser empregado em diferentes aplicações, bem como o desenvolvimento de novas tecnologias de fabricação, visando contribuir para a simplificação e aprimoramento desses dispositivos.
Referências
1. D. M. Cate, J. A. Adkins, J. Mettakoonpitak and C. S. Henry, Anal Chem, 2015, 87, 19-41.
2. J. Noiphung, T. Songjaroen, W. Dungchai, C. S. Henry, O. Chailapakul and W. Laiwattanapaisal, Anal Chim Acta, 2013, 788, 39-45.
3. R. F. Carvalhal, M. S. Kfouri, M. H. D. Piazetta, A. L. Gobbi and L. T. Kubota, Anal
6 4. P. W. West, Ind Eng Chem, 1945, 17, 740-741.
5. G. Posthuma-Trumpie, J. Korf and A. van Amerongen, Anal Bioanal Chem, 2009, 393, 569-582.
6. A. W. Martinez, S. T. Phillips, M. J. Butte and G. M. Whitesides, Angew Chem Int Ed, 2007, 46, 1318-1320.
7. B. A. Rohrman and R. R. Richards-Kortum, Lab Chip, 2012, 12, 3082-3088.
8. M. Funes-Huacca, A. Wu, E. Szepesvari, P. Rajendran, N. Kwan-Wong, A. Razgulin, Y. Shen, J. Kagira, R. Campbell and R. Derda, Lab Chip, 2012, 12, 4269-4278.
9. A. W. Martinez, S. T. Phillips, E. Carrilho, S. W. Thomas, H. Sindi and G. M. Whitesides,
Anal Chem, 2008, 80, 3699-3707.
10. B. S. Miranda, E. M. Linares, S. Thalhammer and L. T. Kubota, Biosens Bioelectron, 2013, 45, 123-128.
11. W. Dungchai, O. Chailapakul and C. S. Henry, Anal Chem, 2009, 81, 5821-5826. 12. M. Santhiago, J. B. Wydallis, L. T. Kubota and C. S. Henry, Anal Chem, 2013, 85,
5233-5239.
13. J. Yu, L. Ge, J. Huang, S. Wang and S. Ge, Lab Chip, 2011, 11, 1286-1291.
7
1.2. Objetivos
O objetivo geral deste trabalho de tese consiste no desenvolvimento de dispositivos de teste POC com detecção eletroquímica utilizando plataforma de papel, que apresentem uma estrutura fechada e eletrodos posicionados externamente à plataforma, visando contornar problemas relacionados à evaporação do solvente e contaminação do sistema, além de garantir versatilidade devido ao uso da plataforma livre de modificações. Os objetivos específicos incluem:
i. A construção de um dispositivo versátil, que permite a fácil substituição do papel, a reutilização de seus eletrodos, bem como a possibilidade de substituição do eletrodo de trabalho para diferentes aplicações;
ii. O desenvolvimento de uma nova estratégia para a selagem e controle de fluxo em dispositivos microfluídicos a base de papel utilizando o efeito triboelétrico;
iii. Fabricação de um eletrodo de pseudo-referência de Ag/AgCl em plataformas de papel e PET utilizando impressora inkjet: pela impressão de prata, seguido de tratamento químico com solução de NaClO;
iv. Desenvolvimento de um µPAD simples com detecção eletroquímica, utilizando a técnica de selagem triboelétrica, e o pseudo-referência de Ag/AgCl desenvolvido previamente.
v. Síntese de uma tinta de ouro para a fabricação do eletrodo de trabalho e do contra-eletrodo, a fim de obter um sistema de detecção eletroquímico impresso completo, para a construção do µPAD;
9
Capítulo 2
*
Revisão da literatura
* Todas as figuras de outros trabalhos demonstradas neste capítulo foram adaptadas e
reproduzidas com permissão das respectivas entidades detentoras dos direitos autorais (Royal
11
2.1. Um breve histórico sobre µPADs
Nesse capítulo serão abordados os principais conceitos relacionados à temática desse trabalho de tese, bem como um breve histórico das tecnologias de fabricação, desenvolvimento e evolução dos µPADs. Em um primeiro momento será discutido o uso do papel como plataforma microfluídica, os métodos de fabricação e as principais problemáticas envolvendo esses dispositivos. Em seguida, os diferentes sistemas de detecção, métodos de preparação e deposição de eletrodos (para o sistema de detecção eletroquímico), e o uso de impressoras inkjet serão também brevemente explorados.
2.1.1. Uso do papel como plataforma microfluídica
O papel é um material bastante conhecido, principalmente para escrita, impressão, desenho e confecção de embalagens. Entretanto, suas propriedades físicas corroboram para o uso desse material além das aplicações tradicionais, como uma potencial ferramenta de uso científico e tecnológico. O papel é um material altamente sofisticado, que pode ser confeccionado fino, leve e flexível de acordo com o seu processamento de fabricação. O principal constituinte do papel são as fibras de celulose, as quais podem ser altamente atrativas para certas aplicações, uma vez que permitem o transporte de fluidos por capilaridade, sem a necessidade de uma bomba ou uma fonte externa ativa.1
No laboratório, fibras de papel são bastante utilizadas, principalmente para separação cromatográfica e filtração; processos esses que são de extrema importância na pesquisa científica para separação do analito em misturas complexas e purificação de amostras. Recentemente, o papel (ou celulose em geral) tem chamado bastante atenção como um potencial material para aplicação em sensores e dispositivos clínicos portáteis, principalmente devido
12
sua versatilidade, abundância e baixo custo.2 Além dessas, outras vantagens do uso dessa plataforma têm atraído bastante interesse da comunidade científica, como: i) fabricação a partir de recursos renováveis; ii) abundância; iii) é reciclável e biodegradável; iv) adequado para aplicações biológicas devido a sua biocompatibilidade; v) a superfície do papel pode ser facilmente manipulada/funcionalizada para se adequar ao tipo de aplicação requerida; vi) possibilidade de fabricação em larga escala; vii) facilidade de armazenamento, transporte e eliminação (por incineração, por exemplo); viii) apresenta uma elevada área superficial.1
Após a invenção da cromatografia em papel no início de século XX, os dispositivos de diagnóstico em papel começaram a surgir, passando pelos sensores colorimétricos de pH3 e testes de gravidez,4 até a construção de sensores quantitativos mais complexos.5 Nos últimos anos, diversos grupos de pesquisa têm demonstrado uma grande variedade de dispositivos analíticos construídos em plataforma de papel, também conhecidos como µPADs. Estes dispositivos analíticos podem ser construídos de maneira a serem flexíveis, portáteis, descartáveis e fáceis de operar, tornando o seu uso mais acessível ao paciente, consumidor ou à população em geral.
2.1.2. Metodologias de fabricação dos µPADs
A fabricação dos dispositivos microfluídicos a base de papel normalmente envolve a criação de canais hidrofílicos, os quais são responsáveis por controlar e direcionar o fluxo de acordo com a necessidade. Os canais microfluídicos são criados basicamente pela incorporação de barreiras hidrofóbicas nas fibras da celulose, ou pelo simples corte da plataforma utilizando equipamentos de precisão (mais detalhes adiante). Nos últimos anos, uma variedade de
13
tecnologias vem sendo desenvolvidas e aplicadas para esse fim, e os principais métodos reportados serão discutidos neste tópico.
Uma das primeiras tecnologias aplicadas na construção de µPADs foi a fotolitografía, apresentada primeiramente pelo grupo do pesquisador Whitesides (Harvard University).6-9 O primeiro passo do processo de fotolitografia para esse tipo de dispositivo é a impregnação do papel com um material foto-sensitivo (foto-resist), seguido pela foto-polimerização desse material, e remoção localizada da barreira hidrofóbica formada pela imersão do papel em uma solução específica para a remoção do foto-resist. Apesar da eficácia na formação da barreira hidrofóbica, essa técnica passou a ser questionada para essa aplicação devido às várias etapas necessárias para a construção do dispositivo, levando a um aumento do custo de produção, além da fragilidade observada quando os substratos são flexionados ou dobrados, ocorrendo a quebra da barreira hidrofóbica e exposição das fibras.† Uma representação esquemática do processo de fotolitografía descrito pode ser observado na Figura 2.1.
Desde então, outras metodologias vêm sendo exploradas para a fabricação de barreiras hidrofóbicas, porém utilizando materiais poliméricos mais flexíveis e resistentes, como o polidimetilsiloxano (PDMS), por exemplo.10 Técnicas como a flexografia,11 a serigrafia12 e a utilização de marcadores permanentes,13 surgem como métodos alternativos para a construção desse tipo de dispositivo. A primeira consiste na deposição de tintas hidrofóbicas, preparadas a partir do poliestireno diluído em tolueno, através de uma impressão roll-to-roll similar à
† Vestígios do material hidrofíbico na região hidrofílica e necessidade de tratamento da
superfície da plataforma de papel com plasma, são exemplos de outros problemas relacionados à essa tecnologia.
14
uma impressora convencional, porém nesse caso, com a necessidade da fabricação de máscaras posicionadas junto à um dos rolos de impressão quando diferentes configurações de dispositivo são requisitadas. Esta mesma desvantagem pode ser observada nos outros métodos mencionados (serigrafia com tintas à base de cera, e uso de marcadores permanentes), em que máscaras, geralmente construídas utilizando técnicas e materiais com elevado custo, se tornam necessárias à cada mudança na configuração do dispositivo.
Figura 2.1. Representação esquemática do processo de fotolitografia em papel.
Outros métodos relatados na literatura demonstram a formação de canais microfluídicos de maneira inversa à normalmente empregada, ou seja, com
15
completa hidrofobização da plataforma de papel em uma primeira etapa, seguido de uma hidrofilização seletiva para a formação dos canais. Uma das tecnologias que se enquadram nesse modelo é a hidrofilização por plasma,14 a qual é realizada após a hidrofobização do substrato de papel com solução de alquil cetona (dímero). Nesse método, os padrões microfluídicos são obtidos pelo posicionamento de máscaras de metal em ambas as faces do papel (configuração do tipo “sanduiche”) antes do tratamento com plasma. Entretanto, o uso de máscaras para a formação dos padrões microfluídicos mais uma vez revela a problemática envolvida na fabricação desse tipo de dispositivo, limitando as configurações possíveis e aumentando o custo do processo.
Como alternativa aos problemas encontrados, impressoras do tipo inkjet foram empregadas para a hidrofilização seletiva do papel hidrofobizado, de modo a diminuir o custo de produção e melhorar a prototipagem do processo de fabricação.15 Nesse caso, uma solução de poliestireno foi utilizada para hidrofobização da plataforma que, em seguida, é submetida a um processo de impressão com tinta de tolueno (apenas tolueno é usado na composição), responsável por dissolver o material orgânico e, consequentemente, formar os canais hidrofílicos de maneira seletiva. Uma outra maneira de realizar essa hidrofilização seletiva é pelo tratamento com um laser capaz de decompor o material orgânico de maneira seletiva para a formação dos canais.16
Um dos métodos mais simples de fabricação desses dispositivos microfluídicos em plataforma de papel é através do corte dessa plataforma, tanto manualmente (com estilete, tesoura ou guilhotina) como com uma impressora de corte X-Y computadorizada (maior precisão e reprodutibilidade), evitando assim incorporação de outros materiais na plataforma.17-22 Entretanto,
16
apesar da maior simplicidade desse processo de fabricação, essa metodologia tem sido pouco explorada, sendo utilizada basicamente em dispositivos de ensaios colorimétricos mais simples.
Por outro lado, o método mais comumente utilizado para a construção de canais microfluídicos em dispositivos à base de papel é a deposição de cera, realizada normalmente utilizando uma impressora de sólidos específica para esse tipo de material (Wax Printer).5, 23-27 Essa impressora opera exatamente como uma impressora convencional, porém com elevada temperatura para promover a fusão da cera antes da deposição.
Figura 2.2. Representação esquemática da construção dos canais microfluídicos em
plataforma de papel utilizando uma impressora à base de cera.
Após a etapa de impressão dos padrões microfluídicos, é necessária a realização de um tratamento térmico para promover a penetração da cera nos poros do papel, formando assim as barreiras hidrofóbicas. A grande vantagem desse método é sua simplicidade, possibilidade de fabricação de diversos dispositivos em uma única impressão, além do seu baixo custo e possibilidade de utilização de qualquer programa para a confecção do dispositivo.
Tratamento térmico
Papel Cera
17
2.1.3. Selagem e controle de fluxo
Embora a maioria dos µPADs fabricados para efeitos de investigação ou provas de conceito apresentem seus canais e zonas de detecção abertas (expostas ao ambiente), é importante e muitas vezes necessário a proteção física desses dispositivos. A selagem dos µPADs, especialmente quando reações de longa duração estão em andamento na plataforma de papel, contribui no sentido de evitar a contaminação do dispositivo, além de favorecer no processo de armazenamento deste, considerando sua aplicação real e comercialização. Dependendo da configuração do dispositivo, a selagem também tem se mostrado bastante útil para minimizar, ou mesmo controlar, a evaporação do solvente, a qual pode melhorar a sensibilidade de detecção do dispositivo.3
Tendo em vista a importância desse processo, diversas técnicas e materiais têm sido utilizados para promover a selagem dos µPADs. De maneira geral, peças de plástico são empregadas nesse procedimento devido a sua estabilidade mecânica e natureza transparente, contribuindo para uma melhor visualização do ensaio e garantindo suporte ao dispositivo.3 Na literatura, fitas adesivas são frequentemente utilizadas no processo de selagem, devido seu baixo custo, alta disponibilidade no mercado e, na maioria dos casos, são transparentes.8, 28 Entretanto, um potencial problema do uso desse tipo de material é a interferência que a cola presente na fita pode provocar na reatividade química dos analitos ou na detecção, além da possibilidade de mudanças na molhabilidade da plataforma de papel.
Outra maneira simples de promover a selagem de µPADs é utilizando folhas de laminação, composta por termoplásticos flexíveis, empregadas normalmente na plastificação de documentos através de uma laminadora térmica de escritório (Figura 2.3a).29, 30 No entanto, o uso de temperaturas
18
elevadas pode ser um problema quando reagentes sensíveis ao calor são impregnados no papel antes da laminação. Esse problema pode ser evitado utilizando folhas auto-adesivas no processo de laminação em temperatura ambiente, ou aquecimento seletivo apenas nas bordas do dispositivo.18, 31 Apesar das possibilidades apresentadas, todos os métodos citados necessitam de uma etapa experimental adicional, a qual consiste na confecção de orifícios nas folhas de laminação (ou fitas adesivas) para a injeção dos reagentes e leitura dos resultados, afetando o tempo de fabricação dos dispositivos e adicionando uma etapa de alinhamento.
Figura 2.3. Exemplos de metodologias de selagem em µPADs já relatadas na literatura: (a)
laminação,30 (b) impressão de cera32 e (c) combinação da impressão de cera para a formação
dos canais microfluídicos com a impressão de toner para promover a selagem.33
Dependendo do método de fabricação do µPAD, a selagem pode ser realizada na mesma etapa de construção dos canais através da impressão do material hidrofóbico (cera, por exemplo) não só nas bordas, mas também nas faces da plataforma de papel (Figura 2.3b). Isto permite a obtenção de um canal
Cera Papel Canal aberto Semi-aberto Fechado
(a)
(b)
(c)
Corante vermelho 3. Adição de reagente 2. Impressão de toner na parte de baixo 4. Impressão de toner na parte de cima 1. Formação dos canais Canal Cera Toner Papel Cera Zona de teste Zona de reagente Canal Entrada de amostra19
hidrofílico fechado (ou semi-fechado) delimitado por cera em todas as direções, evitando dessa forma, o uso de outros materiais para a selagem.32 Uma outra estratégia, a qual combina a impressão de cera para a construção dos canais microfluídicos com a impressão de toner para a selagem do dispositivo, foi também demonstrada (Figura 2.3c).33 Porém, nesse caso, foram necessárias pelo menos 6 impressões para a obtenção de um dispositivo fechado (com mínimo de evaporação), elevando o tempo de preparo do µPAD e aumentando o consumo de material, além do custo de produção.
Mesmo após a criação dos canais microfluídicos e selagem dos µPADs, o controle da taxa de fluxo nesses dispositivos é uma etapa a ser considerada, principalmente em análises que requerem múltiplas etapas. Normalmente a taxa de fluxo depende apenas da configuração e tamanho dos poros do papel que, por capilaridade, tem a capacidade de transportar fluidos sem o auxílio de bombas ou equipamentos externos. No entanto, para a realização de análises de diagnósticos mais complexas, como reações enzimáticas do tipo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) e ensaios com DNA, os quais envolvem etapas de incubação e lavagem, por exemplo, um maior controle na taxa de fluxo em cada etapa do ensaio pode ser bastante útil, tornando o µPAD uma ferramenta ainda mais poderosa e versátil.34, 35
Recentemente, várias abordagens para a “entrega” sequenciada de fluidos em dispositivos de papel têm sido demonstradas. Um dos primeiros métodos desenvolvidos para o controle de fluxo foi demonstrado em 2010 por Matinez e colaboradores,36 onde um dispositivo 3D à base de papel foi elaborado de maneira a bloquear o fluxo em uma determinada posição do ensaio pela adição de espaçadores entre dois canais de papel verticalmente alinhados. Nesse caso, para que os canais toquem um ao outro e o reagente passe através destes, é
20
necessário pressionar o papel na região onde os canais estão alinhados, com o auxílio de uma caneta ou algo similar, configurando assim um sistema de interruptores equivalente aos normalmente utilizados em eletrônica.
Desde então, outros grupos têm desenvolvido novas maneiras de controlar o fluxo, inicialmente a partir de variações na geometria do canal (largura, comprimento, etc.),19, 21, 37-40 e posteriormente com adições de açúcares (geralmente sacarose) e barreiras hidrossolúveis (Figura 2.4a).41, 42 A modificação da molhabilidade dos canais no papel,40, 43 incorporação de diodos e válvulas que operam manualmente,14, 36, 44 magneticamente45 (Figura 2.4b) ou através da adição de surfactantes,46 são exemplos de métodos de controle de fluxo já reportados. Além destas, a adição de papel absorvedor em uma determinada região no centro do canal tem sido utilizada como uma maneira alternativa para atrasar a entrega do fluido no canal, através do desvio no caminho percorrido pelo líquido (Figura 2.4c).20 Essa tecnologia se mostrou bastante interessante, pois com uma simples mudança na espessura, largura ou comprimento do papel absorvedor utilizado, pode-se atrasar a “entrega” do fluido de 3 a 20 minutos, com coeficiente de variação abaixo de 10%.
No entanto, uma característica comum entre as metodologias mencionadas é que o controle do fluxo se dá principalmente pelo atraso ou interrupção na entrega do reagente, o qual muitas vezes resulta em um aumento no tempo de análise. Para contornar esse problema, alguns autores têm demonstrado interesse em acelerar o fluxo em algumas etapas do ensaio, diminuindo assim o tempo total de análise e tornando a essa plataforma microfluídica ainda mais prática e eficiente.35 Dentre os métodos de aceleração do fluxo relatados na literatura, pode-se destacar o uso da impressora de corte para a confecção de uma ranhura na superfície do canal no sentido do fluxo, favorecendo um fluxo
21
laminar na região da ranhura, que contribui no aumento da velocidade (Figura 2.4d).47 Esse método se mostrou ainda mais interessante quando a possibilidade de redução da taxa de fluxo foi demonstrada com uma simples modificação no sentido da ranhura (nesse caso, perpendicular ao fluxo).47
Figura 2.4. Exemplos de metodologias para o controle de fluxo em µPADs: (a) uso de
sacarose como barreira solúvel para atrasar o fluxo;41 (b) barreira física com acionamento
magnético;34 (c) uso de papel absorvedor;20 (d) confecção de ranhuras no papel;47 (e) uso de
barreiras plásticas (formação de gaps microfluídicos)48 e (f) confecção de canais abertos.49
Outras técnicas de aceleração do fluxo têm sido demonstradas pela formação de canais microfluídicos entre a superfície da celulose e folhas de poliéster utilizadas na selagem do dispositivo,48 ou pela formação de canais abertos, ou seja, uso de estruturas perfuradas para aceleração do fluxo vertical.49
papel Canal aberto Controle Atraso T em po Fonte líquido Interface L/Ar/Solido Canal à base de papel Estruturas perfuradas Papel Cera Camada hidrofílica Área perfurada Reservatório de corante % Saturação de sacarose () Filme de poliéster Papel Vista lateral Gap Superior Gap Inferior
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
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No primeiro caso, folhas de PET foram posicionadas nas duas faces do papel, a uma distância de aproximadamente 800 µm da superfície, criando uma região de fluxo capilar com velocidade maior (entre a superfície do papel e o PET) do que através dos poros (Figura 2.4e). Já no segundo caso, para que o fluxo vertical ocorra de maneira mais rápida, as folhas intermediárias de um dispositivo 3D do tipo origami foram perfuradas, facilitando a passagem do reagente e diminuindo o tempo de análise (Figura 2.4f).
2.1.4. Sistemas de detecção em µPADs
Análises qualitativas, semi-quantitativas ou quantitativas em µPADs podem ser realizadas através da incorporação de métodos adequados de transdução, o qual pode requerer a adição de reagentes e equipamentos sofisticados. Com o objetivo de criar um dispositivo analítico, mantendo simplicidade, acessibilidade e portabilidade, técnicas de detecção com baixo consumo energético, como a detecção óptica ou mesmo a eletroquímica, têm se mostrado bastante adequadas para aplicação em µPADs.50
De maneira geral, quatro técnicas de transdução têm se destacado na literatura para o acoplamento com os dispositivos microfluídicos a base de papel; são estas a detecção colorimétrica, a quimioluminescência (CLD), a eletroquimioluminescência (ECLD) e a detecção eletroquímica (ECD). Neste tópico será apresentado um breve histórico e serão abordados aspectos relativos ao funcionamento e as principais vantagens relacionada a cada um dos métodos de detecção, bem como algumas aplicações já relatadas na literatura.
A detecção colorimétrica é uma das tecnologias mais simples e baratas já utilizada em µPADs e, por esta razão, tem sido um dos métodos de detecção mais empregados nesse tipo de dispositivo para os mais diversos tipos de
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analitos. Essa tecnologia apresenta ainda uma grande variedade de formas de transdução da resposta analítica, que de maneira geral, estão associadas ao surgimento ou variação de coloração, normalmente associada à uma reação química ou enzimática.2, 51 Dentre estas formas de identificação e transdução do sinal analítico, pode-se destacar a utilização de aparelhos portáteis como os smartphones, câmeras ou scanners, além de aparelhos mais sofisticados como os espectrofotômetros, ou ainda a detecção na ausência de qualquer aparelho externo ao dispositivo (detecção a olho nu).7, 51, 52
Os primeiros exemplos de ensaios colorimétricos utilizando µPADs foram demonstrados através de testes de pH, glicose e proteína em urina artificial.15, 53 Quando as amostras são depositadas nos dispositivos de papel, estas se distribuíram nas zonas de detecção, levando eventualmente à mudança de coloração, permitindo a quantificação dos níveis de analito na amostra através da construção de uma curva analítica. Nos ensaios de glicose, o resultado positivo era observado quando havia o aparecimento de uma coloração de tom marrom, característica da oxidação do iodeto a iodo, por meio de uma reação enzimática.15 De maneira similar, a detecção de proteína pôde ser observada quando a coloração do ensaio variou de amarelo para azul devido à presença do azul de tetrabromofenol.15 Além destes, outros estudos relacionados à detecção colorimétrica em µPADs foram publicados nas mais diversas áreas, incluindo testes biomédicos, monitoramento ambiental e controle de qualidade.3, 28, 54, 55
Uma desvantagem conhecida dos ensaios colorimétricos em dispositivos de papel está relacionada com a distribuição da coloração na zona de detecção, principalmente em ensaios de fluxo lateral, o qual muitas vezes apresentam uma baixa homogeneidade, dificultando o julgamento da coloração observada.15 Além disso, variações na iluminação ambiente e qualidade/configuração dos
