Mapa metabólico da intoxicação por chumbo

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE INSTITUTO METRÓPOLE DIGITAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOINFORMÁTICA. IARA DANTAS DE SOUZA. MAPA METABÓLICO DA INTOXICAÇÃO POR CHUMBO. NATAL - RN 2017.

(2) IARA DANTAS DE SOUZA. MAPA METABÓLICO DA INTOXICAÇÃO POR CHUMBO. Defesa de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioinformática da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.. Área de concentração: Bioinformática Linha de Pesquisa: Biologia de Sistemas Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin. NATAL-RN 2017.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB. Souza, Iara Dantas de. Mapa metabólico da intoxicação por chumbo / Iara Dantas de Souza. - Natal, 2017. 83 f.: il. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Instituto Metrópole Digital. Programa de Pós-Graduação em Bioinformática. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin.. 1. Chumbo - Dissertação. 2. Intoxicação por chumbo Dissertação. 3. Envenenamento por chumbo - Dissertação. 4. Metais pesados - Dissertação. 5. Biologia de sistemas Dissertação. 6. Toxicologia de sistemas - Dissertação. I. Dalmolin, Rodrigo Juliani Siqueira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 546.815.

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(5) Dedico este trabalho à minha mãe, Ana Maria, que em vida sempre me incentivou a seguir meus sonhos..

(6) AGRADECIMENTOS. Agradeço à minha família, em especial minha tia Izaneide Cortez, pelo apoio incondicional durante minha vida acadêmica aqui em Natal. Agradeço especialmente ao meu orientador, Rodrigo Dalmolin, que foi extraordinário comigo durante este tempo de mestrado e é minha grande referência acadêmica. Espero continuar trabalhando para fazer jus à confiança depositada em mim. As minhas amigas de infância: Carol, Joyce, Emmily, Ellyda, Edwiges, Thalita, Izadora e Ylana pelo companheirismo que atravessa os anos. Aos amigos que a Biomedicina me proporcionou: Hannaly, Jéssyca, Kamila, Felipe, Brenda Alves e Brenda Cardoso, por acreditarem em mim e me incentivarem a tentar o mestrado. Aos amigos do BioME, os quais são muitos para citar, que tornaram estes dois anos de formação muito mais divertidos. Obrigado pelo companheirismo nesta jornada acadêmica, pelas viagens, pelos forrós das antigas, pelos “piqueniques” na casa de Ricardo/Lucas, pelos karaokês, pelas edições divertidíssimas da disciplina BioME Beach Party, pelas inúmeras conversas depressivas do almoço, pelas conversas restauradoras na piscina, pela ajuda mútua durante as disciplinas (e fora delas também), e pela confiança em mim que levou alguns a apostar a própria mão caso não passe na seleção de doutorado. Vocês são perigosamente inspiradores..

(7) RESUMO Desde a antiguidade, o chumbo (Pb) vem sendo utilizado pela humanidade em virtude das suas propriedades físico-químicas, como maleabilidade, ductilidade, resistência à corrosão, baixo ponto de fusão e baixa condutividade elétrica. Entretanto, além de sua importância econômica, o chumbo possui uma importância quanto à saúde humana, uma vez que causa intoxicação. Muitos efeitos da intoxicação pelo chumbo já foram relatados. na. cardiovascular,. literatura,. sendo. imunológico,. responsável ósseo,. pela. reprodutivo,. toxicidade. nos. hematopoiético,. sistemas renal,. gastrointestinal e, principalmente, no sistema nervoso. Embora haja evidências sobre como o chumbo afeta a homeostase em nível celular, a descrição das vias metabólicas afetadas na intoxicação por chumbo não está estabelecida. Para esclarecer os efeitos da intoxicação, o objetivo deste estudo é propor vias metabólicas das interações do chumbo com os componentes celulares, através da curadoria das informações presentes na literatura e em repositórios públicos. Após a busca na literatura, encontramos um total de 23 proteínas, incluindo o tripeptídeo glutationa, as quais são capazes de interagir com o chumbo e estão relacionadas com a base celular da intoxicação. Estas informações, em conjunto com outras provenientes de repositórios especializados, permitiram a integração do conhecimento em uma via metabólica da intoxicação por chumbo. Por meio dela, observou-se que o chumbo atua de maneira sistêmica no organismo, em especial, interferindo na função normal de proteínas as quais se ligam a metais essenciais, como zinco e cálcio. Palavras-chave: Chumbo, intoxicação por chumbo, envenenamento por chumbo, metais pesados, biologia de sistemas, toxicologia de sistemas..

(8) ABSTRACT. Since ancient times, lead (Pb) has been used by mankind because of its physicochemical properties, such as malleability, ductility, corrosion resistance, low melting point and low electrical conductivity. However, in addition to its economic importance, lead is an important human health issue since it causes intoxication. Many effects of lead intoxication have been reported in the literature, affecting the organism as a whole and causing symptoms in cardiovascular, immune, skeletal, reproductive, hematological, renal, gastrointestinal and nervous systems. Although there is evidence on how lead affects cellular homeostasis, the description of the metabolic pathways affected in lead poisoning is not fully established. To elucidate the effects of lead poisoning, the aim of this study is to propose pathways of lead interactions with cell components, through manual curation of information present in literature and public repositories. After a search in literature, it was found a total of twenty-three proteins, including glutathione, which can directly interact with lead and are related to the cellular basis of intoxication. This knowledge taken together with the information present in pathways repositories allowed the integration of the current information in a map of lead poisoning. It was observed that lead acts in a systemic way, specially interfering with the normal function of metalloproteins which rely on essential metals to the organism, such as calcium and zinc.. Keywords: Lead, lead intoxication, lead poisoning, heavy metals, systems biology, systems toxicology..

(9) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Relação entre uso de compostos de chumbo na gasolina e a concentração média do chumbo no sangue de crianças do período de 1976 a 1980 nos EUA. Adaptado de Jarup, 2003 .......................................................................................... 15. Figura 2. Níveis de chumbo no sangue considerados seguros pelo CDC do período de 1960-2014. Adaptado de Burns & Gerstenberger, 2014. ..................................... 16.

(10) LISTA DE ABREVIATURAS. ALA. Ácido aminolevulínico. ALAD. Enzima ácido aminolevulínico desidratase. BLL. Concentração de chumbo no sangue (do inglês, blood lead levels). CDC. Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos (do inglês, U.S. Centers for Disease Control and Prevention). COBRAC. Companhia Brasileira de Chumbo. DMT1. Proteína transportadora de metais divalentes-1. GO. Gene ontology. KEGG. Enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (do inglês, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Pb. Chumbo (Símbolo).

(11) SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11 1.1 Aspectos gerais do chumbo ................................................................................ 11 1.2 Ocorrência do chumbo no ambiente ................................................................... 11 1.3 Importância econômica ....................................................................................... 12 1.4 Aspectos epidemiológicos da intoxicação ........................................................... 13 1.5 Toxicocinética ...................................................................................................... 18 1.6 Sintomatologia da intoxicação por chumbo ......................................................... 19 1.7 Biomarcadores da intoxicação ............................................................................ 21 1.8 Justificativa do estudo ......................................................................................... 22 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23 2.1 Geral.................................................................................................................... 23 2.2 Específicos .......................................................................................................... 23 CAPÍTULO I .............................................................................................................. 24 3 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 70 3.1 Biologia de sistemas e repositórios públicos de informação ............................... 70 3.2 Metais pesados e sua relação com o metabolismo celular ................................. 71 3.3 Grupos de risco acerca da intoxicação por chumbo ............................................ 72 3.4 Bases moleculares da intoxicação por chumbo .................................................. 73 4 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 76 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 77.

(12) 11 1 INTRODUÇÃO. 1.1 Aspectos gerais do chumbo. O chumbo é um dos metais pesados mais utilizados pela humanidade. O chumbo é classificado como metal pesado em virtude do seu elevado número atômico, massa molecular e densidade. Possui como símbolo Pb, número atômico 82, massa atômica relativa 207,2 e densidade de 11.34 g/cm3, sendo o elemento estável de maior número atômico. É encontrado na natureza sob uma mistura de quatro isótopos diferentes, sendo aquele com maior massa atômica (208Pb) o mais comum. Os isótopos do chumbo são provenientes do decaimento dos elementos urânio, actínio e tório. O principal minério de extração do chumbo na natureza é a galena, o qual contém chumbo na forma sulfatada, além de uma pequena proporção de prata. Na sua forma pura, apresenta-se com coloração cinza-azulada brilhante. Apresenta valência de +2 ou +4 que permite a formação de compostos inorgânicos de chumbo, como o fluoreto de chumbo e o cloreto de chumbo, além de compostos orgânicos, como o chumbo tetrametílico e o chumbo tetraetílico. Além disso, o chumbo apresenta a capacidade de fazer ligações com outros átomos de chumbo, formando cadeias (IARC, 2006). Há relatos da utilização do chumbo nas sociedades da antiguidade, como Egito, Grécia e Roma. A vasta utilização pela sociedade se deve às suas propriedades físico-químicas. O chumbo é um metal com alta maleabilidade e ductibilidade, baixo ponto de fusão e resistência à corrosão. Essas características possibilitaram seu uso na confecção de utensílios domésticos, ferramentas, adornos e canos que levavam água dos aquedutos para as cidades antigas. Por isso, o termo “Pb” é proveniente do latim “plumbum” que significa “tubo”. Ainda, desde esta época já se relatavam condições patológicas que se assemelhavam às da intoxicação pelo chumbo (HERNBERG, 2000; HONG, S. et al., 1994).. 1.2 Ocorrência do chumbo no ambiente. O chumbo ocorre de forma ubíqua no ambiente e sua distribuição se deve aos processos naturais e às atividades antropogênicas. O intemperismo, a erosão e as atividades vulcânicas são responsáveis pela liberação e dispersão do chumbo.

(13) 12 presente na forma mineral para o ambiente (IARC, 2006). Estes processos naturais de distribuição do chumbo correspondem a apenas uma pequena parcela do chumbo liberado anualmente na crosta terrestre. A exploração mineral realizada pelo homem passou a ter um peso maior para a dispersão do chumbo a partir do século XVIII, com a Revolução Industrial (HERNBERG, 2000). Atualmente, estima-se que a concentração de chumbo no ambiente é mil vezes maior do que aquela encontrada em regiões não expostas à atividade exploratória, mostrando, desta maneira, a importância da exploração humana como fonte de contaminação (PATTERSON, C. et al., 1991). O chumbo pode ser acumulado no solo, na água e no ar e o intercâmbio entre estes repositórios ocorre por forças físicas e naturais. Considerando as atividades antropogênicas, o aumento da concentração do chumbo na atmosfera foi resultado da exaustão de motores que utilizavam combustíveis com aditivos contendo compostos de chumbo (MORE et al., 2017). Esta prática passou a ser abolida a partir da década de 1970, nos Estados Unidos, sendo posteriormente também banida em outros países. A mineração e fundição também influenciam no aumento dos níveis de chumbo no ar, especialmente nas proximidades onde estas atividades ocorrem. Além disso, processo de decaimento do radônio constitui uma fonte alternativa de liberação de partículas de chumbo na atmosfera (IARC, 2006; TONG; SCHIRNDING, VON; PRAPAMONTOL, 2000). A contaminação do solo ocorre principalmente pela deposição do chumbo atmosférico e pela liberação de resíduos provenientes de áreas de mineração. A contaminação dos lençóis freáticos e das coleções externas de água é resultado do desgaste natural dos minérios de chumbo e, em maiores proporções, da atividade industrial. Os sistemas de encanamento, por exemplo, que usam tubulações com soldas de chumbo, representam um risco adicional para a contaminação da água (ATSDR, 2007; IARC, 2006).. 1.3 Importância econômica. A produção do chumbo segue as vias primária e secundária. A produção primária corresponde à extração do chumbo por meio da atividade mineradora; a produção secundária, por sua vez, está relacionada às atividades de reciclagem dos produtos que contém chumbo (IARC, 2006). Em virtude da versatilidade das suas características físico-químicas, o chumbo é amplamente utilizado pela indústria..

(14) 13 Grande parte da sua versatilidade pode estar relacionada à formação de ligas metálicas com outros metais, como o antimônio, cobre, cálcio e prata. As ligas são usadas na fabricação de soldagens, lâminas e materiais de construção (KING et al., 2005). O chumbo produz compostos resistentes à oxidação, sendo usado também na produção de baterias, tintas e tubulações. Possui resistência à radiação ionizante e à vibração mecânica, sendo usado na proteção contra raios-X e no isolamento acústico. Em razão da sua elevada densidade e baixo custo, é usado na fabricação de munições (JOHNSON, C. K.; KELLY; RIDEOUT, 2013). Alguns compostos de chumbo apresentam coloração vermelha ou amarelada, sendo usados na fabricação de ornamentos de vidro e cerâmica (IARC, 2006). A maior parte dos materiais produzidos a partir do chumbo podem ser reutilizados. A fabricação de baterias automotivas pode ser considerada atualmente a principal aplicação econômica do chumbo, sendo também o produto com maior índice de reciclagem deste metal (IARC, 2006; MEYER, P. A.; BROWN, M. J.; FALK, 2008).. 1.4 Aspectos epidemiológicos da intoxicação. A intoxicação pelo chumbo é uma das doenças relacionadas à toxicologia ambiental de maior importância para a saúde humana. Desde a antiguidade são reportados casos de intoxicação pelo chumbo: a colica Pictorum era uma condição bem conhecida da sociedade romana. Era caracterizada pela presença de fortes cólicas abdominais seguidas de paralisia e outras disfunções do sistema nervoso central, sendo estas manifestações patognomônicas da intoxicação crônica por chumbo (EISINGER, 1982). Sabe-se que o chumbo é uma potente neurotoxina capaz de causar danos irreversíveis, especialmente em crianças expostas a níveis crônicos (SANDERS et al., 2009). Apesar de haver na história relatos do conhecimento dos efeitos nocivos do chumbo, as medidas de prevenção não eram prioridade. Desde que o chumbo começou a ser explorado até a Revolução Industrial, a população exposta perecia sem o conhecimento da causa da sua enfermidade ou como poderiam tratála. A partir da segunda metade do século XX, a intoxicação pelo chumbo tornou-se mais evidente, ganhando os holofotes da mídia e dos governos (HERNBERG, 2000). Nos Estados Unidos, país que liderou muitas das discussões sobre o assunto, houve inicialmente controvérsias por partes dos grupos de estudo.

(15) 14 sobre a real influência do chumbo na saúde humana (NEEDLEMAN, 2000). Entretanto, após alguns anos, o efeito tóxico do chumbo foi amplamente reconhecido e medidas começaram a ser tomadas para o controle da exposição. Nesta época, estas discussões incidiam sobre a adição de compostos de chumbo como antidetonantes nos combustíveis, fato este que aumentou consideravelmente a dispersão de partículas de chumbo pela atmosfera. Esta nova forma de exposição é apontada como uma das principais causas relacionadas ao aumento dos níveis de chumbo no sangue da população, especialmente urbana (MAHAFFEY, 1998; RICHMOND-BRYANT et al., 2013, 2014). Em 1973, o governo estado-unidense resolveu eliminar gradualmente o uso de compostos de chumbo nos combustíveis, cuja eliminação completa só foi conseguida anos mais tarde, em 1988 (NIEBOER et al., 2013). O primeiro incentivo à eliminação do chumbo é apontado como um dos principais marcos no controle da exposição e iniciou uma era de políticas públicas em outros países visando a prevenção e o combate à intoxicação pelo chumbo (Figura 1) (PIRKLE et al., 1994; THOMAS, 1995). Neste período, outros marcos importantes foram a eliminação da adição de compostos de chumbo em tintas e do uso de soldagens de chumbo em latas usadas no armazenamento de alimentos (NIEBOER et al., 2013)..

(16) 15. Figura 1. Relação entre uso de compostos de chumbo na gasolina e a concentração média do chumbo no sangue de crianças do período de 1976 a 1980 nos EUA. Adaptado de Jarup, 2003. Os estudos epidemiológicos auxiliam na caracterização de populações susceptíveis à intoxicação e no planejamento de estratégias de ação para a prevenção da intoxicação. As investigações têm como principais amostras populacionais os trabalhadores que atuam na exploração e na indústria do chumbo, além da população de forma geral. Podemos classificar a intoxicação pelo chumbo como aguda ou crônica. A intoxicação aguda é definida como uma exposição à grandes quantidades de chumbo em um curto espaço de tempo, ocasionando sintomas mais graves que podem resultar em risco de vida se não houver um manejo rápido e adequado. A intoxicação crônica, por sua vez, muitas vezes está relacionada à exposição ocupacional e é resultado da exposição a quantidades baixas ou moderadas de chumbo por um longo período de tempo. Os indivíduos cronicamente intoxicados desenvolvem os sintomas gradualmente, tornando-se, com o passar do tempo, tão graves quanto os da intoxicação aguda (FLORA; GUPTA, D.; TIWARI, 2012; ROSIN, 2009)..

(17) 16 Não há nenhuma função conhecida no organismo para a qual o chumbo seja necessário. Assim, qualquer nível de exposição ao chumbo pode ser considerado prejudicial. Apesar disso, em função da ampla dispersão dos compostos de chumbo no ar, solo e água, é aceito que virtualmente todas as populações estão expostas e apresentem. concentrações. variáveis. do. chumbo. no. sangue. (BURNS;. GERSTENBERGER, 2014). Em 1991, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (U.S. Centers for Disease Control and Prevention - CDC) estabeleceu a concentração de 10 µg/dL como limiar preocupante para o chumbo no sangue, após o amplo monitoramento da população infantil (CDC, 1991). Este valor de referência passou a ser usado em todo o mundo como forma de avaliação de populações susceptíveis. Entretanto, alguns grupos continuaram mostrando os efeitos nocivos do chumbo em níveis menores que o limiar até então estabelecido, especialmente relacionando baixos níveis de chumbo com o detrimento irrecuperável do desenvolvimento cognitivo em crianças. Observou-se ainda que níveis de chumbo no sangue menores que o limiar de 10 µg/dL estavam relacionados a disfunções comportamentais, imunológicas, cardiovasculares e endócrinas. Assim, em 2012, o CDC aboliu o termo “limiar de preocupação” e adotou como nível máximo para desencadeamento de ações de combate à intoxicação o valor de 5 µg/dL de sangue (Figura 2) (ACCLPP, 2012).. Figura 2. Níveis de chumbo no sangue considerados seguros pelo CDC do período de 1960-2014. Adaptado de Burns & Gerstenberger, 2014..

(18) 17. Para fins de acompanhamento epidemiológico, a concentração de chumbo no sangue total é a métrica mais usada para avaliar a exposição (SAKAI, 2000). As medidas de controle tomadas ao longo dos últimos cinquenta anos, sobretudo com relação à diminuição da emissão de compostos de chumbo no ar, foram responsáveis pela diminuição dos níveis de chumbo no sangue em muitos países (RICHMONDBRYANT et al., 2014). Apesar desta diminuição, a intoxicação pelo chumbo segue sendo um problema atual, especialmente nos países em desenvolvimento, os quais, em geral, não possuem políticas públicas fortes de vigilância, prevenção e combate à intoxicação. A exposição da população em geral, aquela que não está submetida à exposição ocupacional, varia em função da localização e da situação socioeconômica. Nos EUA, houve uma diminuição de 87% na concentração de chumbo no sangue do período de 1976 a 2000, chegando a uma média de 1.8 µg/dL em homens e mulheres. A Austrália também seguiu esta tendência de diminuição. Na Ásia, a maior parte dos países apresentaram níveis de chumbo menores que 10 µg/dL, com algumas áreas urbanizadas apresentando níveis elevados. Na América Latina, a maior parte dos países apresentam níveis de chumbo menores que 10 µg/dL. No continente africano, por sua vez, a maioria dos países apresentam níveis de chumbo maiores que 10 µg/dL (IARC, 2006). No Brasil, poucos relatos epidemiológicos foram feitos nos últimos 50 anos para acompanhar a situação da população quanto à exposição ao chumbo. Assim como ocorreu em outros países, na década de 1980, houve uma preocupação por parte do governo brasileiro em diminuir a presença de compostos de chumbo na gasolina. Esta iniciativa fez parte da política econômica brasileira voltada para a promoção de combustíveis de origem vegetal, como o etanol. A adição progressiva do etanol à gasolina eliminou a necessidade de adição de compostos de chumbo nos combustíveis usados nos veículos de passeio. Atualmente, os dados de estudos em algumas localidades do país mostram que em populações não expostas pelas atividades ocupacionais, a concentração de chumbo no sangue é baixa. Entretanto, alguns casos pontuais foram observados, resultados de acidentes ambientais (ALMEIDA LOPES et al., 2017; KIRA, 2014; PAOLIELLO; CAPITANI, 2005).

(19) 18 1.5 Toxicocinética. O chumbo pode ser absorvido por meio do trato gastrointestinal, pelo trato respiratório e pela pele. A via de absorção pode depender do tipo de composto, se orgânico ou inorgânico, e pelo tamanho da partícula. Ainda, alguns fatores podem alterar a susceptibilidade à intoxicação, como idade, estado nutricional e características genéticas (BARBOSA JR. et al., 2005). Dependendo do tamanho da partícula, os compostos inorgânicos podem ser absorvidos pela via respiratória e pela via gastrointestinal, sendo a primeira mais eficiente. Ao chegar aos alvéolos, as partículas de chumbo são fagocitadas pelos macrófagos alveolares e o chumbo é liberado na corrente sanguínea (NEAL; GUILARTE, 2013). Considerando que atualmente a emissão de compostos de chumbo no ar em função da queima de combustíveis é um evento raro, esta forma de exposição é mais comum em populações localizadas próximas aos parques industriais (IARC, 2006). No intestino, o chumbo é absorvido principalmente por transporte facilitado. A proteína transportadora de metais divalentes-1 (DMT1) é uma proteína expressa na superfície dos enterócitos e está envolvida no transporte de íons de ferro, cogitando-se a relação desta proteína com a absorção de chumbo (NEAL; GUILARTE, 2013). Há um aumento da presença desta proteína na superfície intestinal em casos de deficiência de ferro, o que pode acarretar um aumento na capacidade de absorção ao chumbo (MEYER, P. A.; BROWN, M. J.; FALK, 2008). Em virtude da maior hidrofobicidade, os compostos orgânicos de chumbo são melhor absorvidos pela pele. Esta forma de exposição também se tornou rara com a eliminação dos compostos alquilados nos combustíveis (ATSDR, 2007). Uma vez absorvido, a maior parte dos íons de chumbo liga-se aos eritrócitos, associando-se às proteínas intracelulares e às membranas. Há um equilíbrio entre o chumbo eritrocítico e o chumbo plasmático, de modo que este corresponde à fração biodisponível aos tecidos (SAKAI, 2000). O chumbo pode permanecer por cerca de 40 dias no sangue e, através da corrente sanguínea, alcança diversos órgãos, como cérebro, fígado, músculos, rins e pulmões, e os tecidos ósseos, incluindo dentes (FOWLER, 1998). Apesar da grande seletividade, as barreiras endoteliais, como a barreira hematoencefálica e a barreira placentária, são permeáveis à passagem dos íons de chumbo, embora o mecanismo subjacente a este transporte. não. tenha. sido. completamente. desvendado. (GUNDACKER;.

(20) 19 HENGSTSCHLÄGER, 2012). Uma vez nestes tecidos, o chumbo deposita-se e apresenta uma meia vida variável. O principal local de armazenamento do chumbo no organismo são os ossos e dentes, correspondendo a 94% da carga total em adultos e 73% em crianças (BARBOSA JR. et al., 2005). Os íons de chumbo substituem os íons de cálcio presentes nos cristais de hidroxiapatita necessários à deposição óssea, permanecendo armazenados neste tecido por décadas. Além disso, o processo de reabsorção óssea contribui para a liberação para o sangue do chumbo armazenado, sendo influenciado por fatores hormonais causados pela menopausa, lactação e pelo crescimento (RABINOWITZ, 1991). Assim, a concentração de chumbo no sangue reflete não somente o nível de exposição externa ao metal, mas também a reexposição endógena, contribuindo para a cronificação da intoxicação. O chumbo pode ser excretado por meio das fezes e da urina, podendo estar presente nas unhas, suor, pelos e cabelos (ATSDR, 2007).. 1.6 Sintomatologia da intoxicação por chumbo. A intoxicação por chumbo provoca uma vasta gama de sintomas, cuja gravidade dependerá do tempo e nível de exposição, além do diagnóstico precoce e adoção de medidas de tratamento e prevenção. Um dos sintomas mais evidentes da intoxicação pelo chumbo é a anemia, resultado do bloqueio da via de biossíntese do heme pelo chumbo e da retirada precoce dos eritrócitos da circulação pelo sistema monocítico-macrofágico presente nos órgãos hematopoiéticos. O bloqueio da via de biossíntese do heme ocasiona o acúmulo de metabólitos, como o ácido aminolevulínico (ALA) e a zincoprotoporfirina, os quais são usados como marcadores da intoxicação. A degradação precoce dos eritrócitos está diretamente relacionada à meia-vida do chumbo na corrente sanguínea, estando envolvida com comprometimento das membranas celulares em virtude do processo oxidativo desencadeado pelo chumbo. Na intoxicação aguda, prevalece a anemia hemolítica, definida como um excesso de destruição dos eritrócitos; na intoxicação crônica, contudo, há uma franca anemia, caracterizada tanto pelo excesso de destruição quanto pela diminuição da síntese de hemoglobina (FLORA; GUPTA, D.; TIWARI, 2012; KIM, H.-C. et al., 2015). O dano renal é uma das principais consequências da intoxicação. A exposição sustentada a altos níveis de chumbo no sangue (70–80 μg/dl) já foi.

(21) 20 associada à insuficiência renal crônica, através de estudos epidemiológicos e modelos animais. Nos dias atuais, tal concentração de chumbo no sangue é rara, especialmente nos países desenvolvidos; todavia, deve ser levada em consideração em populações residentes próximas a áreas de contaminação. Contudo, como mostrado por Ekong et al, o chumbo, mesmo em concentrações mínimas no sangue, atua com outros fatores de risco bem estabelecidos para promover a doença renal crônica (EKONG; JAAR; WEAVER, 2006). Alguns estudos mostram a relação da exposição ao chumbo com a ocorrência de doenças cardiovasculares. Sabe-se que a exposição crônica ao chumbo aumenta a frequência de hipertensão arterial, bem como acidentes cerebrovasculares e doença vascular periférica (ALMEIDA LOPES et al., 2017; KIM et al., 2015). O mecanismo por trás deste processo ainda não foi desvendado, mas há evidências do papel do estresse oxidativo na ocorrência deste processo (SIRIVARASAI et al., 2015). Os efeitos do chumbo nos ossos afetam o desenvolvimento, formação e reabsorção ósseas. Mostrou-se que o chumbo é capaz de ser depositado no esqueleto fetal e provocar aberrações ósseas, especialmente o esqueleto axial. O chumbo deposita-se na região trabecular, a qual mantém a liberação de chumbo no sangue, e na região cortical, onde o chumbo permanece armazenado e ficando pouco disponível para trocas com o plasma. A reabsorção óssea é responsável por 40-70% do chumbo no sangue, constituindo uma fonte de exposição endógena (SMITH; OSTERLOH; FLEGAL, A. R., 1996). As consequências mais graves da intoxicação pelo chumbo estão relacionadas ao funcionamento do sistema nervoso. A encefalopatia é observada na intoxicação aguda e crônica e manifesta-se como apatia, irritabilidade, falta de atenção, dor de cabeça, tremor muscular, perda de memória e alucinações, e nos casos mais graves, ocorre delírio, falta de coordenação, convulsões, paralisia, coma e ataxia (FLORA; GUPTA, D.; TIWARI, 2012). Os efeitos no sistema nervoso periférico são mais pronunciados em adultos que em crianças, enquanto que os efeitos centrais são mais importantes na infância. Fetos e crianças tem maior susceptibilidade aos efeitos centrais em função da maior capacidade de absorção do sistema nervoso em desenvolvimento (NEEDLEMAN, 2004). Em baixas concentrações, o chumbo pode prejudicar o desenvolvimento cognitivo, com diminuição do QI, alterações comportamentais e habilidade de concentração (BELLINGER; NEEDLEMAN, 2003)..

(22) 21 1.7 Biomarcadores da intoxicação. Na toxicologia, biomarcadores são medidas biológicas usadas no diagnóstico ou na avaliação de risco de potenciais agentes tóxicos. Os biomarcadores de exposição ao chumbo podem ser classificados como biomarcadores de exposição e biomarcadores de efeito. Ambos representam mecanismos de interação do chumbo com o organismo (SAKAI, 2000). Os biomarcadores de exposição reportam o contato, recente ou não, com o chumbo. O mais utilizado é a concentração de chumbo no sangue total, já que a maior parte do chumbo na corrente sanguínea está associado aos eritrócitos, ficando disponível por cerca de 40 dias (BARBOSA JR. et al., 2005). A concentração do chumbo plasmático reflete o equilíbrio entre sangue e outros compartimentos do organismo, mas possui uma meia-vida muito curta, de cerca de uma hora (SAKAI, 2000). O chumbo urinário, de forma menos frequente, também pode ser usado como medida de exposição. As concentrações de chumbo plasmático e urinário, entretanto, relacionam-se diretamente com o chumbo no sangue e tendem a aumentar exponencialmente conforme o aumento deste (BERGDAHL et al., 1997). Deve-se lembrar que a concentração de chumbo no sangue é resultado da combinação de exposições ambientais ao chumbo bem como da exposição endógena às reservas presentes nos ossos e dentes (SAKAI, 2000). Os marcadores de efeito são biomoléculas cujo metabolismo é interferido pela ação toxicodinâmica do agente tóxico. Em geral, correspondem a metabólitos os quais são acumulados após a interferência do chumbo. Dentre eles, temos o ácido aminolevulínico (ALA), substrato usado pela enzima ácido aminolevulínico desidratase (ALAD) na segunda reação da via de biossíntese do heme, a qual é fortemente inibida pelo chumbo. A exposição ao chumbo interfere na via de biossíntese do heme e acarreta o aumento de ALA em vários tecidos, resultando em aumento da concentração de ALA no sangue, plasma e urina; embora o aumento no plasma e no sangue seja melhores indicadores do efeito do chumbo sobre a medula óssea. Ainda, a atividade da enzima ALAD eritrocitária também pode ser usada como marcador de efeito, uma vez que sua atividade é especificamente inibida por baixos níveis de chumbo no sangue (AJIOKA; PHILLIPS; KUSHNER, 2006; MEYER, U. A.; SCHUURMANS; LINDBERG, 1998). A zincoprotoporfirina é produzida como resultado da inibição da transferência dos íons de ferro pelo chumbo para a protoporfirina, na.

(23) 22 última etapa da via de biossíntese do heme. O acúmulo de zincoprotoporfirina nos eritrócitos também mostra-se um bom marcador do efeito do chumbo sobre a medula óssea (MARTIN, C. J.; WERNTZ; DUCATMAN, 2004). Por fim, o coproporfirinogênio III é outro metabólito da via de biossíntese do heme, sendo excretado anormalmente na urina de trabalhadores expostos pelo menos duas semanas depois do início dos sintomas da intoxicação (SAKAI, 2000).. 1.8 Justificativa do estudo. A preocupação sobre a influência do chumbo na saúde humana que surgiu nas últimas décadas estimulou inúmeros estudos os quais visaram a identificação dos alvos moleculares para este metal no organismo. Muitos destes trabalhos conseguiram identificar proteínas as quais apresentavam alterações de suas funções quando submetidas à ação do chumbo, resultando em modificação da homeostase celular e relacionando-se aos sintomas observados na intoxicação (GARZA; VEGA; SOTO, 2006). A identificação de componentes celulares envolvidos na fisiopatologia de doenças seguiu uma linha reducionista desde o surgimento da biologia molecular. Nesta premissa, cada componente celular é estudado separadamente do sistema o qual faz parte na busca do entendimento da contribuição deste para o processo. Com o desenvolvimento de novas tecnologias, tornou-se possível o estudo do metabolismo celular de forma coordenada, contribuindo para a expansão da biologia de sistemas (BARABASI; OLTVAI, 2004). A biologia de sistemas permitiu a observação da funcionalidade dos componentes celulares integradamente. Apesar de haver repositórios especializados na montagem e representação dos processos celulares, estes não possuem vias celulares que demonstrem de maneira coordenada, a interação do chumbo com os diversos componentes celulares e como esta interação pode explicar os sintomas da intoxicação..

(24) 23 2 OBJETIVOS. 2.1 Geral. Este trabalho tem como objetivo principal propor vias que possam explicar os mecanismos celulares subjacentes à intoxicação por chumbo.. 2.2 Específicos •. Analisar os dados presentes na literatura e buscar proteínas de interação com o chumbo por meio de mineração de texto;. •. Fazer uma busca utilizando o banco de dados KEGG Pathway sobre as vias metabólicas as quais as proteínas de interação com o chumbo participam;. •. Reunir as informações presentes na literatura com aquelas adquiridas do banco de dados citado e integrar este conhecimento em vias da intoxicação por chumbo;. •. Elucidar a base molecular pela qual o chumbo é capaz de interferir nos sistemas do organismo e provocar os sintomas observados na intoxicação;.

(25) 24 CAPÍTULO I. Artigo: Lead poisoning metabolic map. Escrito por: Iara Dantas de Souza, Abraão Silveira de Andrade, Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin. Manuscrito submetido ao periódico Critical Reviews in Toxicology.

(26) Critical Reviews in Toxicology. rR. ee. rP Fo Lead poisoning metabolic map. Manuscript ID. Date Submitted by the Author:. Review n/a. de Souza, Iara; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Bioinformatics Multidisciplinary Environment de Andrade, Abraão; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Bioinformatics Multidisciplinary Environment Dalmolin, Rodrigo; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Bioinformatics Multidisciplinary Environment; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Biochemistry. On. heavy metals, lead intoxication, environmental toxicity, systems toxicology, environmental health, systemic effect of lead poisoning. ly. Keywords:. Draft. w. Complete List of Authors:. Critical Reviews in Toxicology. ie. Manuscript Type:. ev. Journal:. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(27) Page 1 of 43. Lead poisoning metabolic map Iara Dantas de Souzaa, Abraão Silveira de Andradea, Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolina,b* a. Bioinformatics Multidisciplinary Environment, Federal University of Rio Grande do Norte,. Natal, Brazil; bDepartment of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil.. rP Fo. BioME – Bioinformatics Multidisciplinary Environment. Address: Rua Odilon Gomes de Lima, 1722, Natal – RN. Brazil. Zip code 59078-400. Phone number: +55 84 33422216 *Corresponding author. ee. Iara Dantas de Souza. e-mail: [email protected]. rR. Abraão Silveira de Andrade. e-mail: [email protected] *Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin. e-mail: [email protected]. w. ie. ev. ly. On. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Critical Reviews in Toxicology. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(28) Critical Reviews in Toxicology. Abstract Lead is an important heavy metal used worldwide in several applications, especially in industry. People exposed to lead can develop a wide range of symptoms associated with lead poisoning. Many effects of lead poisoning were reported in the literature, showing a compromising of whole body health, with symptoms related to cardiovascular, immune, bone, reproductive, hematological, renal, gastrointestinal, and nervous system. However, the molecular lead targets as well as the pathways affected by lead. rP Fo. poisoning are not completely described. The aim of this study was to construct a map of metabolic pathways impaired in lead poisoning by evaluating which biomolecules are directly affected by lead. Through manual literature curation, we identified proteins which physically interact with lead and subsequently determined the metabolic pathways those proteins are involved with. At total, we identified 23 proteins involved with. ee. heme synthesis, calcium metabolism, neurotransmission, among other biological systems, which helps to understand the wide range of lead poisoning symptoms.. rR. Keywords: heavy metals; lead intoxication; environmental toxicity; systems toxicology; environmental health; systemic effect of lead poisoning;.. w. ie. ev ly. On. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Page 2 of 43. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(29) Page 3 of 43. Table of contents. Introduction4 Methods6 Inclusion Criteria6. rP Fo. Exclusion Criteria6 Results7. Lead poisoning symptoms7. ee. Systemic effects of lead poisoning8. Proteins related to hematological system8. rR. Proteins related to oxidative stress10. ev. Proteins related to calcium metabolism10 Proteins of nuclear function11. Proteins involved with lead bioavailability11. Proteins related to nervous system metabolism13. Synaptotagmin16. ly. Acetylcholine Receptors15. On. NMDA Receptors14. w. ie. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Critical Reviews in Toxicology. Voltage-Gated Calcium Channels17 Discussion and perspectives17 Acknowledgments20 Declaration of interest20. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(30) Critical Reviews in Toxicology. References20. Introduction Lead is one of the most important heavy metals due to its impact on the economy and human. rP Fo. health. It has been used since ancient times for several purposes, such as household utensil manufacturing, plumbing systems, and even in food (Hernberg 2000). After the Industrial Revolution, lead has been used in paint manufacturing, maritime industry, automotive battery manufacturing, metal soldering, nuclear industry, and fuel. Despite the decrease of lead use in. ee. past years, lead containing compounds are still essential for industries and relevant for the. rR. economy in several countries. The Centers for Disease Control and Prevention from the US (CDC) establishes blood lead levels (BLL) at 5 µg/dL as reference for health surveillance. ev. (ACCLP 2012). However, studies using animal models to assess the effects of lead poisoning have shown that BLL lower than the established by CDC are capable of impairing some bio-. ie. logical systems, especially the nervous system (C.M. Bouton et al. 2001; Gillis et al. 2012).. w. The consequences of lead exposure remain a significant public health problem especially in developing countries.. On. Lead compounds are absorbed mainly through respiratory and gastrointestinal tract. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Page 4 of 43. (Figure 1), being the former more efficient when compared to the latter (Hodgkins et al. 1991). It can also be absorbed through skin, particularly when forming hydrophobic organic compounds such as tetraethyl lead. Once in the bloodstream, 99% of lead is associated with erythrocytes (Schütz et al. 1996). Lead can also interact with plasma and cellular proteins, mainly thiol and sulfhydryl containing proteins (Al-Modhefer et al. 1991). Bones and teeth can store lead, retaining it for decades. Lead compounds might be released back to the blood-. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(31) Page 5 of 43. stream through processes as bone remodeling. Additionally, lead can accumulate in soft tissues, especially liver, kidney, and brain. Adults have greater lead storage capacity than children, causing the latter to have greater lead available in the blood (Liu et al. 2013). Lead might crosses the blood-brain barrier through active transport by protein channels that carry ions to the brain tissues (Simons & Pocock 1987). Lead has a special affinity for blood-brain barrier and the choroid plexus endothelial cells. Therefore, those structures can protect central. rP Fo. nervous system against the deleterious effects of lead poisoning (Strużyńska et al. 1997). On the other hand, there is no consensus in the literature whether lead has a preferential deposition area in the brain (Neal & Guilarte 2013). There are no lead detoxification systems de-. ee. scribed and its half-life in the blood is approximately 40 days. It is excreted mainly in urine and feces, and additionally in hair, skin, sweat, milk, and nails (Barbosa Jr et al. 2006). [Figure 1 near here]. rR. The symptoms associated to lead intoxication might vary depending on whether the. ev. exposure is acute or chronic. The primary effects of lead in the body are related to neurologi-. ie. cal, hematological, cardiovascular, immune, bone, reproductive, and renal dysfunctions (Flo-. w. ra et al. 2012). The broad spectrum of symptoms indicates that lead can impair several systems by interacting with many cellular components and/or affect signaling cascades. The. On. complexity and heterogeneity of the lead intoxication symptoms reflect the systemic impairment of cellular functions. Many studies on lead poisoning report the effects of lead on pro-. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Critical Reviews in Toxicology. teins and show the influence of this metal on the metabolic functions by affecting leadinteracting proteins. The aim of this work is to organize and combine the lead influence on metabolism, in a broad and coordinated way, to describe the lead poisoning metabolic map focusing on systemic, neuronal, and cellular levels.. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(32) Critical Reviews in Toxicology. Methods Proteins that directly interact with lead were identified by systematical literature curation. Briefly, PubMed Database search was performed using the following terms: “Lead intoxication”, “Lead poisoning”, “Lead binding proteins”, and “Lead(II) and Pb(II)”. Also, the following filters have been established: article types (“classical articles”, “reviews”, “case reports”, and “datasets”) and language (“English”). In total, 83 articles that report the effects of. rP Fo. lead poisoning in the human body, focusing on systemic effects, have been selected. From those 83 articles, 34 studies showing proteins that directly interact with lead have been selected, resulting in a list of 23 proteins (including the tripeptide glutathione). The Gene Sym-. ee. bol of each selected protein was checked using HUGO Gene Nomenclature Committee (Yates et al. 2017). The pathways associated with each retrieved protein was obtained using. rR. KEGG Pathways Database (Supplemental Table S1) (Kanehisa et al. 2016). Disease-related pathways have been excluded.. ie. Inclusion Criteria. ev. The proteins included in the metabolic map were chosen based on whether they can directly. w. interact with lead. Structural studies showing the molecular interaction between the lead ions. On. and proteins were considered the gold standard for our purposes. Additionally, previous studies regarding the interference of lead on the enzyme and membrane channel activity were considered.. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Page 6 of 43. Exclusion Criteria Proteins reported in the literature having their expression altered by lead without any information supporting the inclusion criteria cited above were excluded.. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(33) Page 7 of 43. Results Lead poisoning symptoms Acute and chronic exposure to lead produces a set of systemic symptoms. The clinical features observed in lead poisoning are non-specific and may be confused by porphyrias and intoxication by other metals. The most prominent symptoms are related to central nervous sys-. rP Fo. tem, such as dullness, irritability, and poor attention. The aggression of blood-brain barrier results in encephalopathy with cerebral edema and hemorrhages (Strużyńska et al. 1997; Flora et al. 2012). Animal studies showed that prenatal exposure is particularly relevant considering the ineffectiveness of the blood-brain barrier in protecting the nervous system against. ee. lead during development (Toews et al. 1978). In severe cases, the intoxication outcomes in-. rR. clude convulsions, paralysis, and coma (Flora et al. 2012). Chronic kidney disease occurs with chronic BLL of 70–80 mg/dl (Khalil-Manesh et. ev. al. 1992; Said & Hernandez 2015). The high and stead lead levels cause the lead nephropathy, defined by chronic tubulointerstitial nephritis. High chronic levels of exposure are rare,. ie. particularly in developed countries. Despite the worldwide lead exposure reduction, there is. w. still evidence to support renal damage at chronic low lead levels (Ekong et al. 2006). Bones. On. are the main lead reservoir in the human body and the skeletal lead level reflects long term exposure (Álvarez-Lloret et al. 2017). Animal studies showed developing effects of prenatal lead exposure, resulting in impairment of axial skeleton (Ferm & Carpenter 1967; Jacquet et. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Critical Reviews in Toxicology. al. 1977). Lead intoxication also comprises the development of bones and teeth through life (Lee et al. 2016; Beier et al. 2016). Resolving lead intoxication symptoms requires continued treatment in order to eliminate the skeletal lead content to avoid endogenous exposure (Wedeen 1992). Lead can also accumulate at bone marrow affecting the maturation process of blood components, while strongly inhibits the heme synthesis (Ajioka et al. 2006).. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(34) Critical Reviews in Toxicology. Systemic effects of lead poisoning Lead effects on cellular metabolism may be due to its interaction with susceptible proteins, especially those with prosthetic groups composed of calcium and zinc (Gorkhali et al. 2016). Those ions act in the cell by regulating the electrochemical gradient between intra- and extracellular environments, controlling transmission of secondary signals, and/or altering gene expression (Baranowska-Bosiacka et al. 2012). Lead interacts with ion-binding sites, interfering. rP Fo. with normal protein activity affecting the cellular processes they participate in. We identified 23 proteins (including the tripeptide glutathione) described to physically interact with lead (Table 1). Among them, 5 proteins are able to bind lead acting as chela-. ee. tors (e.g. metallothioneins), 15 have its functions inhibited by lead, and 3 are described to be stimulated by lead. Lead binding proteins act in several pathways such as signal transduction,. rR. proliferation, cell survival, secretion, and regulation of gene expression (Figure 2)(Verstraeten et al. 2008; Gonick 2011). In the following sessions, we will discuss interac-. ev. tion aspects of lead and lead-interacting proteins, and the cellular basis of symptoms provoked by lead toxicity. [Table 1 near here]. w. Proteins related to hematological system. ie On. The interaction of lead with hematological cells induces changes in cell homeostasis and culminates in anemia (Suwalsky et al. 2003). Proteins affected by lead play essential func-. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Page 8 of 43. tions in blood stream metabolism, controlling biomolecules synthesis and metabolites processing. The inhibition of the enzymes related to hematological pathways results in substrate accumulation, decreasing the concentration of final pathway metabolites. The δ-aminolevulic acid dehydratase (ALAD) is one of the main targets of lead (Jaffe et al. 2001). This cytoplasmic enzyme catalyzes the asymmetric condensation of two molecules of δ-aminolevulic acid to form one molecule of porphobilinogen, in a rate-limiting step. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(35) Page 9 of 43. of heme biosynthesis (Ajioka et al. 2006). Replacement of zinc in the enzyme metal binding site strongly inhibit ALAD activity (Figure 2), making the enzyme a good biomarker of lead exposure (Talia Sanders et al. 2009). The inhibition of ALAD promotes the increase of δaminolevulic acid concentration in blood, plasma, and urine (Barbosa Jr et al. 2006). The two ALAD most common alleles, ALAD-1 and ALAD-2, have different distributions among ethnic groups and they were related to distinct susceptibilities to lead poisoning (Wetmur et al.. rP Fo. 1991). Lead also stimulates the accumulation of other metabolites derived from heme biosynthesis, such as zinc protoporphyrin. Collectively, the metabolites mentioned are used as biomarkers of lead exposure (Sakai 2000).. ee. Pyrimidine 5'-nucleotidase 1 is an erythrocyte enzyme involved in pyrimidine nucleotide metabolism, catalyzing the hydrolysis of cytidine monophosphate (CMP) or 7-. rR. methylguanosine monophosphate nucleotides (Valentine et al. 1976). Lead inhibits Pyrimidine 5'-nucleotidase 1 by a yet unclear mechanism (Figure 2). The enzyme inhibition causes. ev. the accumulation of pyrimidine nucleotides, which affects RNA catabolism (Paglia et al.. ie. 1975). The accumulation of RNA molecules stimulates its aggregation and it appears as a basophilic stippling in erythrocytes. The presence of those histological features in peripheral. w. blood is another indication of lead poisoning. On the other hand, basophilic stipplings are. On. present in the pyrimidine 5'-nucleotidase 1congenital deficiency, which makes it difficult to use basophilic stipplings as a specific biomarker for lead poisoning (Chiarelli et al. 2006).. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Critical Reviews in Toxicology. The inhibition of pyrimidine 5'-nucleotidase 1 and ALAD disturb blood cells physiology (Suwalsky et al. 2003). In consequence, intoxicated individuals present anemia as a combination of decreasing in heme biosynthesis and impairment of hemoglobin synthesis (Sakai 2000). The accumulation of metabolites and the lipid oxidation result in early removal and destruction of erythrocytes from blood stream on spleen, liver, and/or bone marrow (Adonaylo & Oteiza 1999; Jang et al. 2011). [Figure 2 near here]. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(36) Critical Reviews in Toxicology. Proteins related to oxidative stress Lead intoxication is well-known to disrupt redox balance by inducing oxidative stress (Flora et al. 2012). The oxidative stress in lead poisoning is a result of at least two mechanisms: the increase of reactive oxygen species (ROS) production and the depletion of antioxidant molecules reserves. The inhibition of ALAD synthesis accumulates ALA substrate, which generates hydroxyl radical (Jan et al. 2015). Additionally, lead can directly interact with membrane. rP Fo. lipids, leading to lipid peroxidation (Flora et al. 2012). Lead also impairs glutathione recycling systems by affecting glutathione peroxidase (Gpx) and glutathione reductase (Grx), which become inactive and therefore no longer capable of recycling glutathione (Figure 2). ee. (Flora et al. 2012). As a consequence of the disrupted redox state, chronic lead-induced oxidative stress causes extensive DNA damage (Danadevi et al. 2003). Moreover, lead is able of. rR. interfering with nucleotide excision repair (NER) through the inhibition of Ape endonuclease. This often introduces critical DNA mutations and it consequently prompts apoptosis (Jan et al. 2015).. w. ie. Proteins related to calcium metabolism. ev. Pb2+ can replace other divalent metals, such as Zn2+ (Ordemann & Austin 2016) and Ca2+. On. (Gorkhali et al. 2016). This binding often implies in protein function loss or hyperactivation. This property is crucial for several clinical manifestations of lead poisoning. For example, it. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Page 10 of 43. enables lead to cross blood-brain barrier tight junctions through ion channels by substituting Ca2+ (T. Sanders et al. 2009). Also, calcium replacement can impair calmodulin-mediated pathways. Calmodulin is a ubiquitous calcium-binding protein, which affects and stimulates many intracellular functions such as inflammation, metabolism, apoptosis, muscle contraction, intracellular movement, nerve growth, and immune response (Hudmon & Schulman 2002; Xia & Storm 2005). Lead has a higher affinity for calmodulin binding sites (Figure 2). URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(37) Page 11 of 43. and it is able to bind it in lower concentrations when compared to calcium (Fullmers et al. 1985; Richardt et al. 1986). Consequently, lead-bound calmodulin undergoes conformational changes and may cause inappropriate activation of several proteins, many belonging to the protein kinase C (PKC) family and N-methyl-D-aspartate glutamate receptor subtype (Gorkhali et al. 2016). These protein complexes are deeply involved in learning and cognitive functions and they are also thought to interact significantly with each other to mediate cogni-. rP Fo. tive functions (Marchetti 2003).. Proteins of nuclear function. Lead often forms large granular aggregates called inclusion bodies when inside the cell (Gon-. ee. ick 2011). Lead ions that do not associate in inclusion bodies are left free in the cytosol and. rR. eventually reach the nucleus, affecting nuclear enzymes (Figure 2). Lead has been described to have a strong affinity for apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) (McNeill et al.. ev. 2004). APE1 is one of the main proteins involved in DNA repair and its activity is greatly inhibited when the enzyme is bound to lead, making DNA nucleotide repair systems progres-. ie. sively inefficient (McNeill et al. 2004). Lead also binds to human protamine P2 (HP2), a pro-. w. tein that acts as a histone in sperm cells (Quintanilla-Vega et al. 2000). HP2 condenses DNA protecting it during spermatogenesis. Lead binds to the zinc site on HP2, leading to a con-. On. formational change that results in chromatin instability and that may affect fertility and offspring development (Quintanilla-Vega et al. 2000).. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Critical Reviews in Toxicology. Proteins involved with lead bioavailability Several proteins can protect against heavy metals by acting as chelators. The expression of those proteins is stimulated after the ions enter the cell, preventing heavy metal toxic effects. Some chelators may have other physiological functions which could be comprised by the interaction with the heavy metal (Gonick 2011). One of the first studies to understand proteins. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(38) Critical Reviews in Toxicology. associated to lead intoxication was conducted by Raghavan and Gonick in the 1970's, which used human erythrocytes to identify a protein capable of sequestering lead available in the cell (Raghavan & Gonick 1977). Metallothionein corresponds to a family of small molecular weight proteins rich in cysteine residues (Ruttkay-Nedecky et al. 2013), involved with metal detoxification and reac-. rP Fo. tive oxygen species scavenging (Vallee 1995; Kang 2006; Carpenè et al. 2007). Oxidative stress stimulates its expression, serving as a free radical acceptor. Due to its ability to bind metal ions inside the cell, metallothionein is an important biomarker for heavy metal poisoning (Ademuyiwa et al. 2010). Metallothionein is also expressed in placenta, being present in. ee. syncytiotrophoblast and the villous interstitial layer (Gundacker et al. 2012). The presence of metallothionein in placenta can prevent the passage of lead into the fetal circulation and, pre-. rR. sumably, protect the fetus against lead (Adonaylo & Oteiza 1999; Gundacker et al. 2012).. ev. Lead intoxication induces the formation of inclusion bodies in kidney and brain. Such structures are formed by aggregates of lead and proteins, especially metallothionein. Inclu-. ie. sion bodies formation is initiated in the cytoplasm and then the complex is transported to the. w. nucleus (Figure 3) (Qu et al. 2002; Waalkes et al. 2004; Zuo, Qu, Ryan N. Cooper, et al. 2009). There is no concrete evidence about how these inclusion bodies can impair cellular. On. homeostasis. They could play a protective role against lead intoxication by sequestering the ions, preventing lead from accessing cell structures sensitive to their toxic effects. Knockout. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Page 12 of 43. mice for the two major isoforms of metallothionein (MT-I/II) have not shown inclusion bodies in their renal cells (Zuo, Qu, Ryan N. Cooper, et al. 2009), and are more susceptible to the occurrence of carcinogenic events (Zuo, Qu, Ryan N Cooper, et al. 2009). Besides metallothionein, other proteins have been suggested to be lead-binding proteins, such as α2µmicroglobulin, diazepam binding inhibitor, and thymosin β4 (Fowler 1998). [Figure 3 near here]. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(39) Page 13 of 43. Studies have shown that glial cells can accumulate higher lead levels than the extracellular medium (Tiffany-Castiglioni et al. 1989), implying a possible protective function in nerve tissues. Following these assumptions, Qian and collaborators have conducted a study using rat glial cells to verify which proteins were involved in resistance to lead intoxication (Qian et al. 2000). They have observed that lead was able to bind to 78 kDa glucose-regulated protein (GRP78), also known as heat shock 70 kDa protein, an endoplasmic reticulum protein. rP Fo. (Figure 2) responsible for the correct folding of newly synthesized proteins and the maintenance of intracellular calcium levels (Qian et al. 2000). In addition to providing a binding site for lead, its expression was stimulated in a time-dependent manner and remained elevated. ee. until the last day of cell exposure, suggesting that increased protein synthesis may be a defense mechanism against the toxic effects of lead. However, it is unknown if this mechanism. rR. of cell resilience may compromise other important functions performed by GRP78. Interactions involving the proteins mentioned above and lead need to be better under-. ev. stood, and it is still necessary to comprehend the protein content of inclusion bodies since. ie. studies made so far are not conclusive about the structure’s protein identity.. Proteins related to nervous system metabolism. w On. The most known effects of lead on human physiology are related to its ability to cause chronic and acute damage to the nervous system. In the 1990’s, research groups began to discuss. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Critical Reviews in Toxicology. safe BLL for the population. It was noted that BLL below the level of concern designated by CDC could also result into complications and irreversible damages (Gilbert & Weiss 2006; Betts 2012). Studies have shown that the developmental period of the nervous system is more susceptible to chronic imbalances in neural pathways essential for cognition, resulting in nervous system development deficiency mostly in spatial learning pathways and memory consolidation processes (Toscano & Guilarte 2005; Guilarte et al. 2012). Chronic exposure to. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(40) Critical Reviews in Toxicology. lead during childhood may result in deleterious consequences that persist into adult life. Early and chronic exposure to lead is associated with several cognitive disorders in children (Nigg 2008; Baranowska-Bosiacka et al. 2012). Chronic lead exposure during adulthood may be associated with increased susceptibility to neurodegenerative diseases, probably due to the interaction of lead with enzymes and transcription factors associated with Parkinson, Alzheimer, and Schizophrenia (Ordemann & Austin 2016).. rP Fo. NMDA Receptors. Glutamatergic neurons mediate the larger proportion of excitatory neural pathways with an essential role in the memory process through a cellular mechanism called Long Term Poten-. ee. tiation (LTP) (Nihei et al. 2000; Nihei & Guilarte 2001). The most abundant NMDA receptor. rR. subtypes in nervous system are NR1/NR2A and NR1/NR2B, being present in synaptic density and glial cells, respectively (Monyer et al. 1994; Luo et al. 1996; Toscano & Guilarte. ev. 2005). The extracellular part of the receptor has binding sites for glutamate and glycine, and a metal-binding site occupied by zinc. This ion binding site regulates the affinity of glycine to. ie. the receptor. The channel allows the transit of Na+, K+, and Ca+2, and its structural features. w. make it more selective to Ca+2 (Garza et al. 2006). [Figure 4 near here]. On. Lead is a potent NMDA receptor antagonist (Figure 4) (Ujihara & Albuquerque 1992; Omelchenko et al. 1997). The inhibition caused by lead possibly occurs through the substitu-. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Page 14 of 43. tion of zinc at the regulatory site, causing the receptor to have a lower glycine affinity. The inhibition of glycine binding to the receptor inhibits its activation interfering with intracellular calcium-dependent processes (Hashemzadeh-Gargari & Guilarte 1999). Lead blocks the calcium influx to cytoplasm due to the higher affinity of lead ions with the channel glutamate residues (Garza et al. 2006). Studies have concluded that lead selectively affects NMDA receptor-mediated LTP in the hippocampus, but does not cause injury to LTP mediated by oth-. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].

(41) Page 15 of 43. er non-NMDA pathways, showing the selectivity of lead in this particular receptor (Gutowski et al. 1998). This is probably the mechanism by which chronic exposure to lead, especially in periods of the nervous system development, triggers cognitive deficits in memory and learning. Lead intoxication is reported to change the ontogeny pattern of NMDA receptor sub-. rP Fo. units during the nervous system development in addition to the direct NMDA receptors inhibition. NR1/NR2B receptors are present in major proportions during the primary stages of nervous system development. Over time, there is a change in the composition of those receptors, which in the adult brain are composed mainly of NR2A subunits. This shift in subunit. ee. predominance reflects the need for neural pathway consolidation through synaptic plasticity (Sun et al. 2017). Receptors containing the NR2B subunits have slower deactivation kinetics. rR. and have the optimum performance for the early stages of development. Then, after increasing the stimuli, the NR2A receptors are more efficient since their deactivation kinetics is fast-. ev. er (Toscano & Guilarte 2005). NR2A receptors are required for the acquisition of more effi-. ie. cient neuronal responses end its increased expression remains through life in the mature brain. It has been observed that lead may decrease the expression of NR2A subunits and in-. w. crease the expression of NR2B subunits during the early stages of brain development (Gui-. On. larte & McGlothan 1998). The perturbation of the ontogeny of NMDA receptors, through the change in the composition of their subunits, can alter the normal development and maturation. ly. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60. Critical Reviews in Toxicology. of the nervous system, especially in the hippocampal areas (Guilarte & McGlothan 1998; Nihei & Guilarte 1999).. Acetylcholine Receptors Acetylcholine is one of the main neurotransmitters involved in neuromodulation, a process related to attention, memory, learning, and synaptic plasticity (Teles-Grilo Ruivo & Mellor. URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected].