UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
EMILIA ANGELA SIPPERT
ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS COM A ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA EM PACIENTES PORTADORES DE ANEMIA FALCIFORME
CAMPINAS
EMILIA ANGELA SIPPERT
ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS COM A ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA EM PACIENTES PORTADORES DE ANEMIA FALCIFORME
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências na área de concentração Clínica Médica.
ORIENTADORA: LILIAN MARIA DE CASTILHO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA EMILIA ANGELA SIPPERT, ORIENTADA PELA
PROFa. DRa. LILIAN MARIA DE CASTILHO.
CAMPINAS
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
EMILIA ANGELA SIPPERTORIENTADORA: LILIAN MARIA DE CASTILHO
MEMBROS:
1. PROF(A). DR(A). LILIAN MARIA DE CASTILHO
2. PROF(A). DR(A). ANA MARIA SELL
3. PROF(A). DR(A). CARINE PRISCO ARNONI
4. PROF(A). DR(A). NICOLA AMANDA CONRAN ZORZETTO
5. PROF. DR. FERNANDO FERREIRA COSTA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
A minha mãe por todo amor, compreensão e incentivo, pelos esforços em todas as etapas da minha vida! Por acreditar e confiar em mim!AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pelas infinitas bênçãos concedidas e pela força nos momentos difíceis.
Agradeço à minha orientadora Professora Doutora Lilian Castilho por acreditar em minha capacidade, por me incentivar e me dar força em todos os momentos! Obrigada pela contribuição com o meu crescimento científico, acadêmico e pessoal! Agradeço a sua dedicação como orientadora, a maneira compreensiva e amiga com a qual sempre me atendeu e orientou. O seu direcionamento foi essencial para a realização deste trabalho. Agradeço por todas as oportunidades de crescimento que me proporcionou.
À FAPESP (Fundação de amparo a pesquisa do Estado de São Paulo) pela concessão da bolsa de doutorado Processo nº 2013/01426-1 (EAS) e pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento deste projeto Processos nº 2012/04651-3 (LMC) e nº 2014/00984-3 (FFC).
Ao INCTs (Instituto de Ciência e Tecnologia do Sangue) pelo apoio financeiro e ao Hemocentro da Unicamp, pela estrutura adequada para a realização do trabalho.
Aos membros titulares da banca: Dra. Ana Maria Sell, Dra. Carine Arnoni, Dra. Nicola Amanda Conran Zorzetto, Dr. Fernando Costa e aos membros suplentes: Dra. Flavia Roche Moreira Latini, Dr. José Mauro Kutner e Dra. Andrana Karla Calgarotto pelo tempo dedicado, para a leitura e discussão deste trabalho.
À minha mãe pelo seu apoio e palavras de coragem nos momentos que mais precisei, por confiar em mim e por estar sempre presente. Obrigada Mãe! TE AMO!
Ao meu grande amor Henrique, que sempre me apoiou e compreendeu minha ausência! Obrigada pelo carinho que sempre teve comigo e pela sua paciência.
Às minhas irmãs Luciane e Fabiane que muito me incentivaram durante o desenvolvimento deste trabalho, obrigada pelas boas energias transmitidas e pelas orações!
À Sueli, Mario, Sâmia e Ary que acompanharam todos os meus passos durante esses anos, obrigada pelo incentivo, força, carinho e atenção!
À minha amiga Josielle que sempre esteve do meu lado me apoiando e me dando coragem para enfrentar todos os desafios que apareceram durante o doutorado.
Aos amigos da Pós-graduação e do laboratório: Ane, Beatriz, Carol, Mayra e Dr. Vagner pela convivência harmoniosa, pelo aprendizado e incentivo.
À Marcela pela ajuda na seleção dos pacientes e nas análises laboratoriais. Muito Obrigada!
Aos amigos Andrana, Matheus, Irene e Ana Leda que me ajudaram a entender o mundo da citometria. Muito obrigada pela atenção e ajuda!
À Dra. Simone Gilli e ao Dr. Marcelo Addas que ajudaram no delineamento do projeto e sempre contribuíram com valiosas sugestões para a melhoria do mesmo.
Ao Dr. Jordão pela amizade, atenção, incentivo e contribuições científicas prestadas durante o desenvolvimento deste trabalho.
À Ucha e à Dulcineia que compartilharam gentilmente seus ensinamentos e sempre estiveram prontas em ajudar, sempre me apoiando e incentivando durante o trabalho.
Aos pacientes que com muita paciência e boa vontade colaboraram com o desenvolvimento deste trabalho.
À todos do Laboratório de Imunogenética da Universidade Estadual de Maringá por todo apoio que me foram prestados desde o mestrado e, especialmente à Professora Doutora Jeane L. Visentainer, à Camila Rodrigues e ao Hugo Vicentin, pela colaboração para realização desse trabalho.
Agradeço a Professora Doutora Ana Maria Sell que me introduziu nos estudos de Imunohematologia e Imunogenética, muito obrigada por compartilhar seu conhecimento comigo desde o Mestrado e pelas valiosas discussões que engrandeceram este trabalho.
À todos os funcionários do Hemocentro e a todos aqueles que indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. Muito obrigada!
Trabalho realizado no Laboratório de Biologia Molecular de Grupos
Sanguíneos Eritrocitários do Hemocentro da UNICAMP, com auxílio financeiro da
FAPESP Processos nº 2012/04651-3 (LMC), nº 2013/01426-1 (EAS) e nº
2014/00984-3 (FFC), e do Instituto Nacional de Ciências e Tecnologia do Sangue
RESUMO
A aloimunização eritrocitária é uma das sérias complicações da terapia transfusional em pacientes com Anemia Falciforme (AF). A presença de aloanticorpos além de dificultar a obtenção de sangue compatível para esses pacientes pode resultar a reações transfusionais hemolíticas tardias (RTHTs) e na formação de autoanticorpos. A maioria dos anticorpos desenvolvidos por estes pacientes são direcionados aos antígenos do sistema Rh. No entanto, diferenças na resposta imunológica de pacientes transfundidos que desenvolvem aloanticorpos (respondedores) e dos que não desenvolvem anticorpos (não respondedores) não são totalmente conhecidas. A hipótese é de que a susceptibilidade a aloimunização seja governada por vários fatores inclusive pela diversidade genética entre os indivíduos. O objetivo geral deste estudo foi identificar o perfil genético de grupos sanguíneos de 161 pacientes com doença falciforme em regime de transfusão crônica (67 aloimunizados e 94 não aloimunizados) e as possíveis associações de polimorfismos presentes em genes imunologicamente relevantes (genes HLA e de citocinas) com a aloimunização eritrocitária. A genotipagem eritrocitária foi realizada pela técnica de microarray com os Kits HEA BeadChipTM, RHD BeadChipTM e RHCE BeadChipTM (BioArray Solutions). Os polimorfismos em genes de citocinas foram analisados pelas técnicas de PCR, PCR-RFLP e pelo ensaio de genotipagem TaqMan (Applied Biosystems), enquanto a genotipagem HLA de classe II foi realizada por PCR-SSO (One Lambda). Para a determinação do equilíbrio de Hardy-Weinberg e das frequências alélicas e genotípicas foi utilizado o software Arlequin e a comparação das frequências dos polimorfismos foi analisada pelo teste exato de Fisher. A determinação do perfil eritrocitário dos pacientes revelou que o fenótipo C– E–, K–, Fy(a–), Jk(b–), S– é prevalente. Também constatou-se que 65% dos pacientes com anticorpos anti-Rh possuíam antígenos Rh variantes que levaram ao desenvolvimento de anticorpos clinicamente significantes. Além disso, a análise dos polimorfismos em genes de citocinas mostrou que o alelo A e o genótipo GA do polimorfismo TNFA–308G/A foram mais frequentemente encontrados em pacientes aloimunizados do que em não aloimunizados (alelo A: 16,4% vs 6,8%; P=0,004;
genótipo GA: 32,8% vs 11,7%; P=0,0021). As frequências do alelo IL1B–511T e
dos genótipos IL1B–511TT e CT foram significativamente maiores em aloimunizados quando comparado com os pacientes não aloimunizados (alelo T: 53,0% vs 37,5%;
P= 0,0085; genótipos CT + TT: 81,82% vs 60,87%; P=0,0071). Com relação aos alelos HLA classe II, encontrou-se uma alta frequência do alelo HLA-DRB1*15 em pacientes aloimunizados aos antígenos Rh comparados aos não aloimunizados (15,63% vs 6,98%; P=0,044). Os resultados demonstraram que polimorfismos nos genes TNFA, IL1B e HLA-DRB1 estão associados com um maior risco de desenvolvimento de anticorpos anti-eritrocitários em pacientes com doença falciforme. Os achados deste trabalho podem contribuir futuramente para melhorar as estratégias transfusionais e terapêuticas para os pacientes com doença falciforme.
Palavras-chave: Anemia Falciforme, antígenos HLA, citocinas, antígenos de grupos
ABSTRACT
Red blood cell (RBC) alloimmunization is one of the serious complications associated with transfusion therapy in patients with sickle cell disease (SCD). The presence of the alloantibodies also hinders the provision of compatible blood for these patients and can lead to delayed hemolytic transfusion reactions (DHTR) and autoantibody formation. Most developed antibodies are directed to the Rh antigens. However, differences in the immune response of transfused patients who develop alloantibodies (responders) and who do not develop antibodies (non-responders) are not completely known. The hypothesis is that susceptibility to RBC alloimmunization is governed by many factors including genetic diversity among individuals. The aim of this study was to identify blood group alleles of 161 patients with SCD in chronic transfusion therapy (67 alloimmunized and 94 non-alloimmunized) and associations of polymorphisms on immunologically relevant genes (HLA genes and cytokines) with RBC alloimmunization. RBC genotyping was performed by microarray analysis with HEA BeadChipTM, RHD BeadChipTM and RHCE BeadChipTM (Immucor). Cytokine gene polymorphisms were analysed by PCR, PCR-RFLP and TaqMan genotyping assay (Applied Biosystems) while, HLA class II typing was performed using PCR-SSO (One Lambda). The Hardy-Weinberg equilibrium and the allelic and genotypic frequencies were obtained by Arlequin software. Allele and genotype frequencies were compared using the Fisher’s exact test. The RBC antigen profile determination revealed that the C–E–, K–, Fy(a–), Jk(b–), S– phenotype is prevalent. Also it was also found that 65% of patients with alloantibodies anti-Rh had Rh antigens variants which led to the development of clinically significant antibodies. Furthermore, analysis of cytokine gene polymorphisms revealed increased percentage of A allele and GA genotype of the TNFA–308G/A in alloimmunized compared to non-alloimmunized patients (A allele: 16.4% vs 6.8%; P=0.004; GA genotype: 32.8% vs 11.7%; P=0.0021). Moreover, IL1B–511T allele and IL1B–511TT and CT genotype frequencies were significantly higher in alloimmunized than in non-alloimmunized patients (T allele: 53.0% vs 37.5%; P=0.0085; CT + TT genotypes: 81.82% vs 60.87%; P=0.0071). In relation to HLA class II, we found a higher frequency of HLA-DRB1*15 in alloimmunized patients to Rh antigens compared to non-alloimmunized (15.63% vs 6.98%; P=0.044). Results showed that TNFA, IL1B and HLA-DRB1 gene polymorphisms are associated with an increased risk of developing RBC antibodies
in Brazilian patients with SCD. These findings can contribute, in the future, to improve transfusion and therapeutic strategies for patients with SCD.
Key words: Sickle Cell Disease, HLA antigens, cytokines, blood group antigens,
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fisiopatologia da Doença Falciforme.. ... 22
Figura 2 - Mecanismo de aloimunização eritrocitária.. ... 25
Figura 3 - Complexo gênico HLA presente no cromossomo 6.. ... 30
Figura 4 - Estrutura das moléculas HLA classe I e II.. ... 31
Figura 5 - Etapas do protocolo de genotipagem de alelos de grupos sanguíneos em larga escala pela plataforma HEA BeadChipTM.. ... 49
Figura 6 - Etapas da tipificação HLA pela técnica de PCR-SSO.. ... 52
Figura 7 - Géis de eletroforese evidenciando os padrões polimórficos dos genes estudados.. ... 55
Figura 8 - Discriminação alélica do SNP IL10–819T/C obtido por PCR em Tempo real.. ... 57
Figura 9 - Frequências e especificidades dos aloanticorpos desenvolvidos pelos pacientes com Anemia Falciforme politranfundidos.. ... 61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sequências das sondas utilizadas para determinação da zigozidade RHD.
... 42
Tabela 2 - Alelos e SNPs presentes no HEA BeadChipTM ... 48
Tabela 3 - Variantes RHD analisadas pelo RHD BeadChipTM ... 50
Tabela 4 - Sequência de primers para detecção dos SNPs IL17F 7488A/G, IL17A –
197G/A, IL1B–511C/T, IL10(–1082A/G, –592 A/C), TNFA–308G/A, condições de ciclagem da PCR, produto da PCR, enzima de restrição utilizada e tamanho dos fragmentos obtidos. ... 54
Tabela 5 - Características da população estudada ... 60 Tabela 6 - Variantes RH encontradas em 13 pacientes com Anemia Falciforme
associados com anticorpos clinicamente significativos envolvidos em RTHT ou diminuição da sobrevivência de hemácias transfundidas. ... 65
Tabela 7 - Frequências alélicas e genotípicas dos SNPs TNFA–308G/A (rs1800629)
em pacientes portadores de Anemia Falciforme aloimunizados e não aloimunizados e em controles. ... 68
Tabela 8 - Frequências alélicas e genotípicas do SNP IL1B –511C/T (rs16944) em
pacientes portadores de Anemia Falciforme aloimunizados e não aloimunizados e em controles. ... 69
Tabela 9 - Frequências alélicas e genotípicas do SNP IL10 –1082G/A (rs1800896)
em pacientes portadores de Anemia Falciforme aloimunizados e não aloimunizados e em controles. ... 70
Tabela 10 - Frequências dos diplótipos formados pelos polimorfismos IL10
(–1082G/A, –819T/C, –592C/A) em pacientes portadores de Anemia Falciforme aloimunizados e não aloimunizados e em controles. ... 71
Tabela 11 - Frequências dos diplótipos formados pelos polimorfismos IL4-590C/T e
IL4 íntron 3 VNTR em pacientes portadores de Anemia Falciforme aloimunizados e não aloimunizados e em controles. ... 72
Tabela 12 - Distribuição das frequências dos grupos alélicos HLA-DRB1 entre
pacientes portadores de Anemia Falciforme aloimunizados a antígenos eritrocitários e pacientes não aloimunizados. ... 74
Tabela 13 - Frequências dos grupos alélicos DRB1 em pacientes com aloanticorpos
contra antígenos Rh (D, C, c, E e/ou e), em pacientes com aloanticorpos não Rh e pacientes não aloimunizados. ... 75
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AF Anemia Falciforme
RTHTs Reações transfusionais hemolíticas tardias
HbS Hemoglobina S
Hb Hemoglobina A
TRALI Lesão pulmonar aguda relacionada à transfusão
APCs Células apresentadoras de antígenos
TCR Receptor de célula T
Treg Células T reguladoras
IFN-γ Interferon gama
IL-10 Interleucina-10
HLA Antígenos Leucocitários Humanos
TNF-α Fator de necrose tumoral-α
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade
IL-2 Interleucina-2 IL-4 Interleucina-4 IL-5 Interleucina-5 IL-6 Interleucina-6 IL-9 Interleucina-9 IL-13 Interleucina-13 IL-17A Interleucina-17A IL-17F Interleucina-17F IL-21 Interleucina-21 IL-22 Interleucina-22 IL-8 Interleucina-8 IL-1β Interleucina-1β
TGF-β Fator de transformação do crescimento beta
NFAT Fator nuclear de células T ativadas
Células NK Células natural killer
IL-3 Interleucina-3
GM-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos
FcεRI Receptor de IgE de alta afinidade
IL-15 Interleucina-15
VNTR Número variável de repetições in tanden, do inglês: variable number of
tanden repet
DNA Ácido desoxirribonucléico
DO Densidade óptica
eMAP Elongation-mediated multiplex analysis of polymorphisms
FY Sistema de grupo sanguíneo Duffy
HEA
BeadChipTM Plataforma de microarray
PCR Reação em cadeia da polimerase
PCR-AS Reação em cadeia da polimerase alelo específica
PCR-RFLP Análise dos fragmentos da digestão enzimática dos produtos da
reação em cadeia da polimerase
PCR-SSO Reação em cadeia da polimerase sequência específica de
oligonucleotídeos, do inglês: Sequence-Specific Oligonucleotide
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
RHD*Ѱ RHD*pseudogene
dNTP Desoxinucleotídeos
μL Microlitro
mL Mililitro
CTLA-4 Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4
CCR7 CC-chemokine receptor 7
μg Micrograma
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 22
1.1 ANEMIA FALCIFORME E ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA ... 22
1.2 FATORES DE RISCO ASSOCIADOS À ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA .. 26
1.2.1 Gênero ... 26
1.2.2 Imunogenicidade do antígeno ... 26
1.2.3 Inflamação ... 27
1.2.4 Desregulação Imune ... 28
1.2.5 Genes de resposta imune ... 28
1.2.5.1 Sistema HLA ... 29 1.2.5.2 Citocinas ... 31 2 OBJETIVOS ... 38 2.1 OBJETIVO GERAL ... 38 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 38 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 39 3.1 CASUÍSTICA ... 39
3.1.1 Grupo de pacientes com Anemia Falciforme ... 39
3.1.2 Grupo controle ... 39
3.1.3 Aspectos éticos da pesquisa ... 40
3.2 MATERIAIS ... 40
3.2.1 Kit de extração de DNA ... 40
3.2.2 Água livre de nuclease ... 40
3.2.3 Etanol absoluto (CH3CH2OH) ... 40
3.2.4 Taq DNA Polimerase ... 40
3.2.5 dNTP 10Mm ... 41
3.2.6 Primers ... 41
3.2.7 Sondas TaqMan para determinação da zigozidade RHD ... 41
3.2.8 Marcador de peso molecular ... 42
3.2.9 Tampão Tris-EDTA-Borato (TEB) 10X ... 42
3.2.10 Enzimas de restrição ... 42
3.2.11 Gel de agarose ... 42
3.2.13 Plataformas HEA BeadChipTM, RHCE BeadChipTM e RHD BeadChipTM
... 43
3.2.14 Kit de extração Qiaex II ... 43
3.2.15 Trizol ... 43
3.2.16 Superscript II Kit... 43
3.2.17 Big Dye ... 44
3.2.18 Marcador de peso Molecular Low Mass ... 44
3.2.19 Kit LABType® SSO... 44
3.2.20 Ensaios TaqMan® para genotipagem de SNPs em genes de citocinas... 44
3.2.21 Mastermix de genotipagem Taqman® ... 44
3.3 MÉTODOS ... 45
3.3.1 Dados transfusionais ... 45
3.3.2 Avaliação sorológica ... 45
3.3.3 Coleta da amostra e Extração de DNA ... 45
3.3.4 Análise molecular de antígenos eritrocitários ... 46
3.3.4.1 Genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala ... 46
3.3.4.2 Genotipagem RHD e RHD*Ѱ ... 49
3.3.4.3 Determinação da zigozidade do gene RHD ... 49
3.3.4.4 Identificação de variantes RHD e RHCE ... 49
3.3.4.5 Sequenciamento do DNA e Clonagem ... 50
3.3.5 Avaliação do significado clínico dos anticorpos anti-Rh em pacientes portadores de variantes Rh ... 51
3.3.6 Genotipagem HLA de classe II (-DRB1, -DQA1, -DQB1) ... 51
3.3.7 Genotipagem de polimorfismos em genes de citocinas ... 52
3.3.8 Análise estatística ... 57
4 RESULTADOS ... 59
4.1 CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA ... 59
4.2 PERFIL DE ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA DOS PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME ... 60
4.3 PERFIL GENÉTICO DOS GRUPOS SANGUÍNEOS EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME ... 61
4.4 VARIANTES RH E IMUNIZAÇÃO RH EM PACIENTES COM ANEMIA
FALCIFORME ... 62
4.4.1 Análise sorológica dos antígenos e anticorpos Rh ... 62
4.4.2 Análise molecular de variantes RHD e RHCE ... 62
4.4.3 Imunização Rh e significado clínico dos anticorpos Rh ... 63
4.5 FREQUÊNCIA DOS POLIMORFISMOS EM GENES DE CITOCINAS E A ASSOCIAÇÃO COM A ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME ... 66
4.6 FREQUÊNCIAS DOS GRUPOS ALÉLICOS HLA DE CLASSE II E A ASSOCIAÇÃO COM A ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME ... 73
5 DISCUSSÃO ... 76
5.1 CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA ... 76
5.2 PERFIL DE ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA DOS PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME ... 76
5.3 PERFIL GENÉTICO DOS GRUPOS SANGUÍNEOS EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME ... 77
5.4 VARIANTES RH E IMUNIZAÇÃO RH EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME ... 78
5.5 INFLUÊNCIA DOS POLIMORFISMOS EM GENES DE CITOCINAS NA ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA EM PACIENTES PORTADORES DE ANEMIA FALCIFORME ... 79
5.6 INFLUÊNCIA DOS GRUPOS ALÉLICOS HLA DE CLASSE II NA ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME ... 82
5.7 APLICAÇÃO CLÍNICA DOS RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS EM GENES DE CITOCINAS E DOS ALELOS HLA... 84
6 CONCLUSÃO ... 86
7 REFERÊNCIAS ... 88
8 APÊNDICE ... 103
___________________________________________________________________
1 INTRODUÇÃO
1.1 ANEMIA FALCIFORME E ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA
A Anemia Falciforme é um distúrbio genético das hemoglobinas que ocorre devido a uma mutação de ponto envolvendo a troca do nucleotídeo adenina pela timina (GAG>GTG), no gene da β-globina, presente no cromossomo 11. Consequentemente a esta troca ocorre a substituição de um ácido glutâmico por uma valina na sexta posição da cadeia polipeptídica (glu6val; rs334) e a subsequente formação de uma hemoglobina anômala – a hemoglobina S (HbS - α2β2S
) (1).
Como resultado desta mutação pontual, a HbS, em seu estado desoxigenado (desoxi-HbS) e em concentração elevada, é capaz de estabelecer interações intermoleculares hidrofóbicas que promovem a sua polimerização no interior da célula, causando a deformação, enrijecimento, diminuição da flexibilidade (hemácias falcizadas) e diminuição da sobrevida das hemácias levando à hemólise intravascular crônica e à oclusão da microvasculatura (2,3), como demonstrado na Figura 1.
Figura 1 - Fisiopatologia da Doença Falciforme. A síntese de HbS é resultado de uma mutação de ponto; quando está desoxigenada, a HbS, forma polímeros no interior da hemácia, deformando-a e tornando-a rígida (formato de foice). O processo de vaso-oclusão, em que participam hemácias, neutrófilos e reticulócitos, e a hemólise intravascular de hemácias são eventos que caracterizam a Anemia Falciforme. Fonte: Adaptado de Steinberg (3).
Quando os níveis de oxigênio são restabelecidos ocorre o retorno da hemácia a sua forma bicôncava original, porém, eventos sucessivos de falcização podem alterar a estrutura da membrana eritrocitária, tornando as hemácias irreversivelmente falcizadas (4,5). Estas células apresentam uma alta concentração de HbS, alto conteúdo de cálcio e pouco potássio, não retornando à forma original mesmo quando há um aumento da tensão de oxigênio (6).
O quadro clínico dos indivíduos com AF é heterogêneo, com gravidade elevada, podendo apresentar retardo no crescimento e desenvolvimento, bem como alterações em vários órgãos, sempre em decorrência da hemólise contínua e de fenômenos vaso-oclusivos (4). Outras complicações associadas à doença incluem: o acidente vascular cerebral, a retinopatia, a síndrome torácica aguda, úlceras de perna, sequestro esplênico, alterações pulmonares, priapismo, infecções, entre outras (5). Infecções e crises vaso-oclusivas estão entre as principais causas de hospitalização entre esses indivíduos (4,5).
A transfusão de concentrado de hemácias é uma das terapias utilizada para prevenir e tratar as complicações agudas e crônicas associadas à doença falciforme (7) e tem por objetivo aumentar o hematócrito e desta forma aumentar a oxigenação sanguínea, e assim diminuir a hipóxia tecidual (7).
Entretanto, apesar das transfusões de concentrados de hemácias diminuírem significativamente a morbidade e mortalidade nesta população de pacientes (8,9), sua utilização é complicada devido à alta incidência de aloimunização, uma vez que 18% a 52% dos pacientes tornam-se imunizados (10– 12). A aloimunização eritrocitária pode causar diminuição da sobrevida das hemácias transfundidas, reação transfusional hemolítica (aguda ou tardia) e consequentemente um aumento dos riscos inerentes à transfusão como a lesão pulmonar aguda relacionada à transfusão (TRALI), doenças infecciosas e a síndrome de hiperhemólise que pode por a vida do paciente em risco (13,14). Além disso, a presença de aloanticorpos, que muitas vezes está associada com a presença concomitante de autoanticorpos, pode levar a atrasos na liberação da transfusão devido à complexidade dos testes para identificação dos anticorpos formados e a dificuldade de encontrar unidades compatíveis (15).
Adicionalmente, pacientes que se tornam aloimunizados estão 20 vezes mais propensos a formar anticorpos adicionais após um ou mais eventos de
transfusões (16). Reações transfusionais hemolíticas são mais comuns em pacientes falciformes do que na população geral, mas são difíceis de serem diagnosticadas, pois os sintomas da doença e os dados laboratoriais que geralmente encontram-se alterados nos pacientes com hemólise crônica podem mascarar este diagnóstico (17–19).
Com o objetivo de prevenir a formação de aloanticorpos contra antígenos de grupos sanguíneos e as consequências negativas subsequentes às RTHTs, muitos serviços tem adotado o protocolo transfusional de compatibilidade fenotípica para os antígenos ABO, Rh (D, C, c, E, e) e K (20,21), enquanto outros tem implementado um protocolo de compatibilidade mais estendida envolvendo os antígenos Fya/Fyb, Jka/Jkb e Ss (22). A transfusão fenótipo compatível com base no perfil genotípico dos pacientes falciformes demonstra ser ainda mais eficiente na prevenção da aloimunização e de RTHTs em pacientes em regime de transfusão crônica (23–25). No entanto, embora estes programas tenham contribuído significativamente para a redução da aloimunização, o custo-benefício ainda é controverso porque nem todos os pacientes desenvolvem anticorpos, e outros continuam ainda a desenvolver anticorpos contra antígenos de outros sistemas e principalmente contra variantes do sistema Rh (26,27). Alelos RH alterados que codificam antígenos D, C e e variantes em grupos Afrodescendentes são responsáveis pela produção de autoanticorpos e aloanticorpos complexos muitas vezes dirigidos a antígenos de alta frequência populacional.
A alta frequência de alelos RH alterados devido a grande diversidade genética do locus RH em Afrodescendentes e as limitações dos métodos sorológicos para distinguir os antígenos variantes contribuem para a alta taxa de aloimunização Rh em pacientes com AF (28–30). A genotipagem RH revelou que muitos pacientes com AF apresentam alelos que codificam antígenos Rh parciais, mas poucas evidências clínicas ou biológicas relacionadas com aloimunização e reações transfusionais hemolíticas foram relatadas para todos os alelos RH variantes.
A aloimunização eritrocitária envolve vários passos, tais como: o reconhecimento do antígeno alogênico pelas células apresentadoras de antígeno (APCs); o processamento e a apresentação de antígenos por moléculas HLA de classe II para o receptor de célula T CD4+ (TCR); a ativação de células T CD4+; a interação de células T e B e a liberação de citocinas que ativam as células B a se
diferenciarem em células produtoras de anticorpos (plasmócitos) (13), que secretam anticorpos específicos para os determinantes antigênicos (Figura 2).
Figura 2 - Mecanismo de aloimunização eritrocitária. I: Reconhecimento do antígeno pelas células dendríticas, II: apresentação do peptídeo pelas moléculas HLA de classe II ao receptor de linfócitos T CD4+ (TCR), III: ativação de linfócitos T CD4+, IV: interação de células T e B e liberação de citocinas, V: Citocinas ativam os linfócitos B a diferenciarem-se em plasmócitos que secretam anticorpos específicos aos determinantes antigênicos. Fonte: Adaptado de Yazdanbakhsh et al. (13).
Este processo de aloimunização eritrocitária é desencadeado pela transfusão de concentrados de hemácias contendo antígenos de grupos sanguíneos que estão ausentes no receptor (31). No entanto, tem se verificado que alguns pacientes, mesmo recebendo transfusões antígeno incompatível, não produzem aloanticorpos eritrocitários, e são chamados de não respondedores, enquanto outros apesar de receberem transfusões fenótipo compatível para os principais antígenos clinicamente significantes desenvolvem anticorpos adicionais contra antígenos de outros sistemas inclusive contra variantes dos sistema Rh e são considerados como indivíduos respondedores (22,27,31,32).
Devido a estas diferenças na resposta imunológica de pacientes transfundidos que desenvolvem aloanticorpos (respondedores) e dos que não desenvolvem anticorpos (não respondedores), diversos estudos têm sido realizados na tentativa de esclarecer quais são os fatores de risco associados à aloimunização eritrocitária. Entre os principais fatores estudados estão: o gênero (33–36), a
imunogenicidade do antígeno (37), a inflamação (38–41), fatores imunes (42–45) e fatores genéticos (46,47).
1.2 FATORES DE RISCO ASSOCIADOS À ALOIMUNIZAÇÃO ERITROCITÁRIA
1.2.1 Gênero
As investigações com relação à influência do gênero feminino e masculino na aloimunização eritrocitária têm mostrado resultados conflitantes. Alguns estudos têm relatado um risco elevado para as mulheres (32–34), enquanto outros não mostraram diferença de risco entre homens e mulheres (35). Em uma revisão sistemática realizada por Verduin et al. (36) em que foram analisados 30 estudos com relação à influência do gênero na aloimunização eritrocitária observou-se que as mulheres com doença falciforme apresentaram um aumento do risco relativo para a produção de aloanticorpos em comparação com os homens. De acordo com os autores, isso pode ser explicado pela maior exposição das mulheres com doença falciforme a eventos que podem levar à imunização, como por exemplo, a gravidez e/ou transfusões sanguíneas (36).
1.2.2 Imunogenicidade do antígeno
Os antígenos eritrocitários variam na sua capacidade de induzir uma resposta humoral. A imunogenicidade de um antígeno é, em parte, determinada pelo processamento dos antígenos, o número de peptídeos gerados e a medida em que estes peptídeos eficientemente estimulam as células T alorreativas (37).
O antígeno D é significativamente mais imunogênico do que os outros antígenos de grupos sanguíneos e também o mais imunogênico dentro do sistema Rh. Em parte isso ocorre devido às diferenças de aminoácidos entre a proteína D e a proteína RhCE. A proteína RhD difere em cerca de 35 aminoácidos da proteína RhCE e, portanto, a possibilidade de geração de epitopos imunogênicos é muito maior do que para os alelos caracterizados por uma única diferença de aminoácido como por exemplo os antígenos Fya e Fyb (37).
Os antígenos K, E, c, Jka e Fya que consistem de apenas um polimorfismo de nucleotídeo único podem não ser tão imunogênicos quanto o antígeno D, mas possuem capacidade de imunizar um número significativo de receptores (48). Os
outros antígenos menos imunogênicos possuem uma capacidade de imunização menor que 1% (48,49).
1.2.3 Inflamação
A hipótese de que o aumento da inflamação sistêmica predisponha a aloimunização eritrocitária foi estudada em modelos animais. Hendrickson et al. (38) verificaram que o estado inflamatório desencadeia uma melhor apresentação antigênica por células dendríticas, levando consequentemente a uma maior resposta proliferativa dos linfócitos T CD4+. Adicionalmente, Smith et al. (41) demonstraram que a transfusão de concentrados de hemácias, na ausência de inflamação, pode levar a uma tolerância antigênica. Contudo, em um estudo com animais homozigotos para o gene da globina βs
, não se verificou a associação de inflamação e aloimunização eritrocitária (40).
Adicionalmente aos modelos em animais, vários estudos em humanos têm demonstrado que a condição inflamatória encontrada em algumas doenças predispõe o indivíduo ao desenvolvimento de aloanticorpos. Por exemplo, Ramsey et al. (50) verificaram uma alta taxa de formação de anticorpos contra antígenos de baixa incidência e baixa imunogenicidade entre pacientes com doenças autoimunes. Outro estudo desenvolvido por Papay et al. (51) encontrou que pacientes com doença inflamatória intestinal apresentaram 2-3 vezes mais chance de desenvolver aloanticorpos quando comparado com um grupo controle saudável. Um terceiro grupo (52) encontrou que a taxa de aloimunização em receptores que apresentaram reação transfusional febril à transfusão de plaquetas era maior do que no grupo controle que também havia recebido transfusões. Recentemente, um estudo que avaliou a relação entre a presença de manifestações clínicas do paciente com AF no momento da transfusão de concentrados de hemácias e a aloimunização eritrocitária verificou que pacientes com síndrome torácica aguda e crises vaso oclusivas apresentavam maior risco de aloimunização demonstrando, portanto, uma relação positiva entre a inflamação do receptor e a aloimunização subsequente a transfusão de hemácias (53).
1.2.4 Desregulação Imune
Além do estado inflamatório do receptor, outros fatores imunes podem afetar a aloimunização. As células T reguladoras (Tregs) são conhecidas por suprimir a ativação e as funções efetoras de vários tipos de células e em diferentes situações (54). Estudos mostraram uma menor atividade de células Tregs, altos níveis de interferon gama (IFN-γ) e baixos níveis de Interleucina-10 (IL-10) em indivíduos respondedores quando comparados com indivíduos não respondedores, especulando-se que a IL-10 pode ter um papel na desativação da apresentação de antígenos/ativação das células T nestes pacientes (42,43). Além disso, verificou-se que as células B reguladoras de pacientes com AF aloimunizados e não aloimunizados diferem na sua capacidade de produzir IL-10 e atenuar a ativação de monócitos (44).
Outro grupo de pesquisa, no entanto, não encontrou diferenças funcionais das células Tregs de pacientes aloimunizados e não aloimunizados com AF (45), mas verificou que pacientes com AF exibem um fenótipo especial de Treg, ou seja, têm uma proporção elevada de Treg naive (nTreg) expressando CTLA-4 e CD39 (marcadores relacionados com a atenuação da ativação de células T), e uma alta proporção de Treg ativada (aTreg) com baixos níveis de expressão HLA-DR (menor atividade supressora). Os autores também sugerem que tanto as células Treg naives quanto as Tregs ativadas podem apresentar defeitos de migração em pacientes com AF devido aos seus baixos níveis de expressão CCR7 (45).
1.2.5 Genes de resposta imune
Nos últimos anos, diversos estudos demostraram que fatores genéticos também podem estar envolvidos na susceptibilidade à aloimunização eritrocitária. Na AF, foi demonstrado que o polimorfismo rs660 no gene TRIM21 (Ro52) pode ser um marcador da eficiência da indução de tolerância na primeira infância e desenvolvimento de competência imunitária a antígenos eritrocitários em pacientes com AF pré-adolescentes / adolescentes. Neste estudo, foi verificado que a maioria dos pacientes com genótipo rs660CT desenvolveram anticorpos nos primeiros anos de vida, enquanto pacientes com genótipo rs660TT o fizeram predominantemente após os cinco anos de idade (46). Posteriormente, o mesmo grupo de pesquisa
verificou que dois SNPs presentes no gene que codifica a molécula envolvida no sinal de modulação de linfócitos B (gene CD81), podem conferir um maior risco à aloimunização eritrocitária (47).
Estudos mais recentes envolvendo a pesquisa de um amplo número de polimorfismos no genoma humano (GWAS - do inglês genome wide association studies) têm demonstrado diferentes resultados, por exemplo, Milton et al. (55) encontraram que vários genes de resposta imune podem estar relacionados com a susceptibilidade à aloimunização eritrocitária, seja a nível antigênico específico ou a nível global, enquanto Hanchard et al. (56) não encontraram associações significantes.
Outros genes importantes no contexto da aloimunização eritrocitária incluem os genes de citocinas e genes do sistema HLA que ainda não foram completamente estudados em pacientes com AF politransfundidos e que, portanto, tornaram-se objetos deste estudo.
1.2.5.1 Sistema HLA
O sistema HLA (antígenos leucocitários humanos, do inglês: Human Leukocyte Antigen) representa um conjunto de genes altamente polimórficos que desempenham um papel de grande importância no sistema imunológico. As proteínas codificadas por estes genes são responsáveis pela apresentação de antígenos aos receptores de linfócitos T e B e estão situadas na membrana celular de quase todas as células do sistema imune (57).
Os genes responsáveis pela codificação dos antígenos HLA estão localizados no complexo HLA, que corresponde a um pequeno segmento cromossômico, no braço curto do cromossomo 6, na região p21.3. O complexo contém mais de 220 genes que codificam três classes de moléculas, denominadas classe I, II e III (57).
A região classe I (mais telomérica) contém genes que codificam as moléculas clássicas de histocompatibilidade HLA-A, -B e -C. A região de classe II (mais centromérica) contém os genes que codificam as moléculas clássicas HLA -DR, -DQ e -DP e a região de Classe III que é telomérica à região classe II não contém genes que codificam moléculas de histocompatibilidade, e sim outras
moléculas, tais como os componentes do complemento (C2, Fator B e C4), 21-hidroxilase, linfotoxina e Fator de necrose tumoral-α (TNF-α) (57–59). A localização do complexo gênico HLA está representada na Figura 3.
Figura 3 - Complexo gênico HLA presente no cromossomo 6. Esquema da localização dos genes HLA no cromossomo 6, as três regiões e a disposição dos genes de classe I, II e III. Fonte: Adaptado de Westover et al. (60).
As moléculas HLA de classe I são expressadas constitutivamente em todas as células nucleadas e plaquetas, e são responsáveis pela apresentação de peptídeos endógenos aos linfócitos T CD8+, enquanto que as moléculas de classe II têm uma distribuição mais restrita, sendo encontradas na superfície das APCs (células dendríticas, linfócitos B e macrófagos) com a função de apresentação de peptídeos exógenos aos linfócitos T CD4+ (57,58).
As moléculas de classe I e II são estruturalmente semelhantes. Os resíduos de aminoácidos polimórficos que caracterizam as diversas moléculas estão localizados nas fendas de ligação com o peptídeo, como pode ser visualizado na Figura 4. Na molécula de classe I, o sulco de ligação ao peptídeo é formado pela interação dos segmentos α1 e α2 e na molécula de classe II, pela interação dos segmentos α1 e β1 (57,58).
Figura 4 - Estrutura das moléculas HLA classe I e II. O diagrama da esquerda ilustra as diversas regiões da molécula de classe I. Os domínios α1, α2 e α3 da cadeia α. Cadeia polipeptídica β2-microglobulina não codificada pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC), ligada não-covalentemente à cadeia α. A estrutura da porção extracelular de uma molécula HLA classe l ligada a um peptídeo, é exibida pela cristalografia de raios X. O diagrama da direita mostra a estrutura das moléculas HLA classe II que consistem de duas cadeias peptídicas que dobram-se em dois domínios: α1 e α2 ou β1 e β2. Ao seu lado direito é exibido pela cristalografia de raios X a estrutura da porção extracelular da molécula ligada a um peptídeo. Fonte: Abbas et al. (57).
O grande polimorfismo apresentado pelos genes HLA tem sido utilizado para obtenção de histocompatibilidade entre doadores e receptores de órgãos e tecidos, em estudos que tentam verificar a existência de associações de genes HLA com doenças e em estudos de associação de moléculas HLA com a aloimunização eritrocitária e plaquetária em populações transfundidas.
Devido à importância das moléculas HLA no mecanismo de aloimunização eritrocitária, estudos em populações transfundidas têm documentado uma possível relação entre alelos HLA e a resposta imune a uma variedade de antígenos eritrocitários, incluindo os antígenos D (61), Jka (62,63), K (64,65), Fya (65,66), Mia (67) e Dia (68). No entanto, até o momento não foram demonstradas associações consistentes entre moléculas HLA e o risco de aloimunização em pacientes com AF (69,70).
1.2.5.2 Citocinas
As citocinas são glicoproteínas de baixo peso molecular que são secretadas pelas células da imunidade natural e imunidade adquirida em resposta a
um estímulo que modula o comportamento da célula alvo. A atuação dessas proteínas pode ser parácrina, autócrina ou endócrina, alcançando células alvo distantes via corrente sanguínea (58). Essas moléculas agem mediante ligação a receptores específicos presentes na superfície de células alvo e participam tanto dos processos inflamatórios quanto na resposta imune (71).
Na fase de ativação das respostas imunes adquiridas, as citocinas estimulam o crescimento e a diferenciação de linfócitos, e nas fases efetoras da imunidade natural e imunidade adquirida, elas ativam diferentes células efetoras para eliminar microrganismos e outros antígenos (57).
As citocinas Th1 típicas incluem IFN-γ, TNF-α e IL-2 e direcionam a imunidade celular na defesa, principalmente contra vírus e células cancerosas, enquanto que as citocinas produzidas por células Th2 tais como: 4, 5, 6, IL-9, IL-10 e IL-13 favorecem ativação de células B, a produção de imunoglobulinas e inibição da resposta Th1. Citocinas Th1 inibem citocinas Th2 e vice-versa (57). Tal como as células Th1 e Th2, as células Th17 produzem um grupo de citocinas distintas: a interleucina-17 (também chamado de interleucina-17A), IL-17F, IL-22 e IL-21, todas participam na produção de um tipo específico de resposta inflamatória (72).
As citocinas podem ser também divididas em dois grupos de acordo com a função: citocinas anti-inflamatórias (IL-4 e IL-10) e pró-inflamatórias (TNF-α, IL-8, IL-1, IL-6, IFN-γ e IL-17). A falta de equilíbrio entre citocinas pró e anti-inflamatórias desativa a função adequada do sistema imunológico (73).
Indivíduos portadores de AF, até mesmo no estado estável, têm como principal característica uma produção exacerbada de citocinas inflamatórias (1,TNF-α, 6) (74–76). No entanto, o padrão de citocinas anti-inflamatórias como IL-4 (77,78) e IL-10 (7IL-4,79) são divergentes entre os estudos.
Como a produção de citocinas é controlada geneticamente, variações devido a polimorfismos na região promotora ou outras regiões reguladoras dos genes de citocinas, podem afetar a produção dessas moléculas e, o equilíbrio da resposta imune (80). Os polimorfismos podem ser de 3 formas principais: polimorfismo de único nucleotídeo (do Inglês: single nucleotide polymorphisms - sigla SNPs), o de número variável de repetições in tanden (do inglês variable number of
tanden repet – sigla VNTR) ou microssatélites. Alguns polimorfismos levam à substituição de um aminoácido na cadeia proteica, porém a maioria, encontram-se na região promotora do gene, na região intrônica ou na região 3’. Assim, um indivíduo pode ter diferentes fenótipos de produção de citocinas dependendo do seu genótipo ou haplótipo para cada citocina (58,80).
Os avanços nas áreas de genética e da biologia molecular permitiram a identificação dos genes que codificam a produção de diferentes citocinas, bem como, a identificação dos polimorfismos relacionados a estes genes. Estas descobertas trouxeram novas perspectivas, permitindo avaliação da distribuição, o perfil genético de produção e a associação destes polimorfismos com diversas condições clínicas em que as citocinas tenham um papel importante.
Algumas citocinas e genes de citocinas que parecem possuir um papel importante na aloimunização eritrocitária incluem o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e o gene TNFA; Interleucina-6 (IL-6) e o gene IL6; Interleucinas17A e 17F(IL-17A, IL-17F) e os genes IL17A e IL17F; 1β (IL-1β) e gene IL1B; Interleucina-10 (IL-Interleucina-10) e o gene ILInterleucina-10; Interleucina-4 (IL-4) e o gene IL4.
O TNF-α é uma citocina produzida principalmente por macrófagos, células natural killer (células NK), linfócitos T e B (57,58). Esta citocina contribui para o processo inflamatório por meio da ativação dos leucócitos, do estímulo ao aumento da expressão de moléculas de adesão nas células endoteliais contribuindo para a adesão leucocitária. Além disso, o TNF-α induz a degranulação de neutrófilos e o aumento da permeabilidade capilar, inibe a proliferação celular e induz a célula à morte (57,81). O TNF-α contribui ainda para o estado vascular inflamatório presente em várias doenças, incluindo a AF (74,82).
O gene que codifica a citocina TNF-α (gene TNFA) está situado no cromossomo 6, na região p21.3. O SNP mais estudado neste gene é o –308G/A (rs1800629) que está presente no sítio de ligação para o fator de transcrição AP1 na região promotora do gene (83) sendo o alelo TNFA-308A associado à alta produção desta citocina (83). Em estudos com doenças, foi encontrado associações entre o SNP TNFA–308G/A e o prognóstico por infecção pelo vírus da Hepatite B (84), a proteção ao acidente vascular cerebral em pacientes com AF (85,86), ao lúpus eritematoso sistêmico, a diabetes e suas complicações (87–91).
A Interleucina-6 é uma citocina pró-inflamatória, produzida por uma variedade de células, tais como: linfócitos B e T, fibroblastos, monócitos, queratinócitos, células endoteliais, entre outras células (92). IL-6 não é expressa constitutivamente, mas pode ser expressa em resposta a estímulos inflamatórios diversos tais como IL-1 e TNF-α (93). É uma citocina que atua em vários processos fisiológicos incluindo: hematopoese, crescimento celular, indução da produção de proteínas de fase aguda, manutenção do processo inflamatório, indução a diferenciação de células T auxiliares em células Th2 e diferenciação de células B em plasmócitos, estimulando a secreção de imunoglobulinas e controle do equilíbrio entre as células T regs e células Th17 (94–97).
O gene IL6 está localizado no cromossomo 7, na região p21, possui cinco éxons e quatro íntrons distribuídos em uma região de aproximadamente 5kb. Na posição –174 do gene IL6 foi descrito o polimorfismo IL6–174G/C rs1800795 que resulta em três possíveis genótipos: G/G, G/C e C/C. Estas variações podem influenciar a ligação de fatores de transcrição influenciando a taxa de transcrição e de expressão da citocina. Estudos anteriores encontraram o alelo C associado a menor expressão de IL-6 (93,98). Este polimorfismo tem sido estudado em muitas doenças onde o componente inflamatório é importante (99–102)
As citocinas IL-17A e IL-17F são secretadas por células Th17, que são geradas a partir da diferenciação de células CD4+ efetoras. A diferenciação destas células é induzida por TGF-β + IL-6 e também na presença de IL-1 e IL-21. Além disso, IL-17 atua como uma citocina pró-inflamatória que induz o recrutamento de neutrófilos durante a resposta inflamatória e a secreção de citocinas, entre as quais IL-1, IL-6 e TNF-α (72,103,104).
IL-17A e IL-17F compartilham uma forte homologia na sequência, e os genes que as codificam estão localizados próximos, no cromossomo 6, na região p12 (105). O polimorfismo no gene IL17A−197G/A (rs2275913) está localizado dentro do motivo de ligação para o fator nuclear de células T do gene IL17, sendo o alelo A, relacionado com a alta produção de IL-17 (106,107) e também com a produção mais eficiente, isto porque possui alta afinidade pelo regulador essencial do promotor de IL17 (NFAT). Este polimorfismo tem sido associado com um maior risco ao desenvolvimento e severidade de doenças inflamatórias como doença do
enxerto contra o hospedeiro (106), colite ulcerativa (107,108) e câncer gástrico (109).
O gene IL17F contém 2 éxons, o segundo éxon compartilha uma homologia significante com o éxon 3 do gene IL17. O polimorfismo IL17F (7488T/C) que leva a substituição do aminoácido histidina por arginina na posição 161 da proteína (His161Arg, rs763780) (110) tem sido associado com a proteção a doenças autoimunes (107,110,111), risco de câncer gástrico (112), colite ulcerativa (107,108) e susceptibilidade a leucemia mielóide aguda (113).
IL-1β é uma citocina pro-inflamatória, fortemente expressa por monócitos, macrófagos teciduais, células dendríticas, linfócitos B, células NK e células epiteliais (114). IL-1β afeta quase todos os tipos de células, é importante na imunidade inata e adaptativa, na patogênese de doenças infecciosas, autoimunes e doenças auto inflamatórias, bem como na mediação de respostas inflamatórias sistêmicas compreendendo febre, proteínas hepáticas de fase aguda, e ativação de leucócitos (114–116). IL-1β também possui um papel adjuvante na expansão e diferenciação de células T CD4+ e produção de anticorpos (117).
O gene IL1B está localizado no cromossomo 2, na região q14. O polimorfismo IL1B–511C/T rs16944 localiza-se na região promotora do gene. O alelo menos comum (IL1B–511T) foi associado com o fenótipo de alta capacidade produtora e tem sido associado com doenças que tem a inflamação como componente na sua fisiopatologia (118–120).
IL-10, membro da família de citocinas Th2, é produzida por quase todos os tipos de células do sistema imune inato (macrófagos, monócitos, células dendríticas, mastócitos, neutrófilos, eosinófilos e células natural Killer) e adaptativo (incluindo células T CD4+, T CD8+ e células B). Ao contrário das células da imunidade inata, que podem produzir IL-10 imediatamente após um estímulo ambiental, as células T CD4+ naives necessitam reconhecer o peptídeo apresentado por APCs, após a interação de moléculas HLA, peptídeo e TCR, para posteriormente se diferenciarem em Th1, Th2 e Th17 e ocorrer a produção de IL-10 (121,122).
IL-10 está envolvida no controle das reações da imunidade natural e da imunidade mediada por células (57,122,123), mas possui também atividade anti-inflamatória, como inibidor da síntese de IFN-γ, IL-2, IL-3, TNF-α e GM-CSF
produzidas por macrófagos ativados e células T helper. Ela regula negativamente a expressão de citocinas Th1, a expressão de antígenos HLA de classe II e moléculas CD54 (ICAM-1), CD80 (B7), e CD86 (B7.2) em monócitos (124). A expressão reduzida destas moléculas pode afetar significativamente a capacidade de ativação de células T por monócitos (APCs)(124–126).
O gene IL10, localizado no cromossomo 1q31-32, contém cinco éxons e ocupa aproximadamente 5,1 kb. A produção celular de IL-10 parece ser influenciada
por três SNPs localizados na região promotora do gene IL10: –1082G/A
(rs1800896), –819T/C (rs1800871) e –592C/A (rs1800872) por resultarem em alteração de sítios específicos de reconhecimento de fatores transcricionais (127,128). Os estudos mostram que os SNPs –1082G/A, –819C/T e –592C/A estão em desequilíbrio de ligação e podem formar 8 possíveis haplótipos (GCC, GCA, GTC, GTA, ACC, ACA, ATC e ATA), sendo apenas 3 encontrados em populações caucasóides: GCC, ACC e ATA os quais podem determinar 3 fenótipos possíveis: alto produtor (GCC/GCC), médio produtor (GCC/ACC e GCC/ATA) e baixo produtor (ACC/ACC, ACC/ATA e ATA/ATA) (127–129).
A citocina IL-4 é membro da família de citocinas Th2, sendo produzida principalmente por linfócitos T CD4+, mas também por mastócitos e basófilos (57). Ela estimula o desenvolvimento de células Th2 a partir de células Th naives, aumenta a expressão de HLA-II, possibilitando maior ativação de Th2, aumenta ainda a expressão de receptores de alta afinidade para IgE (FcεRI) em mastócitos e basófilos e de baixa afinidade para IgE (FcεRII) em células B não-ativadas. Nas células B ativadas a IL-4 estimula a síntese principalmente de IgE e de IgG1, sendo seu efeito antagonizado por IFN-γ (57).
O gene IL4 está localizado no cromossomo 5q31-q33 em um cluster de genes de citocinas (IL-3, IL-5, IL-9, IL-13, IL-15, GM-CSF e fator regulatório de IFN). O polimorfismo –590C/T (rs2243250), descrito na região promotora do gene IL4, está localizado próximo a região de controle do gene e pode afetar a atividade transcricional da proteína (130). Outro polimorfismo localizado no terceiro íntron é o VNTR (número variável de repetições in tanden, do inglês variable number of tanden repet). Tanto o alelo T na posição –590 quanto o alelo RP1 do polimorfismo íntron 3 VNTR foram associados com maior produção de IL-4 ou atividade de células T (130– 132). Estes polimorfismos presentes no gene IL4, foram associados a determinadas
condições autoimunes (133,134) e inflamatórias (135–137).
Considerando que as citocinas tem um importante papel na inflamação e na regulação da resposta imune, que os níveis de produção de citocinas frente a um estímulo podem variar entre os indivíduos e ainda considerando que moléculas HLA possuem diferentes capacidades para o encaixe de peptídeos e sua consequente apresentação ao sistema imune, acreditamos que os polimorfismos em genes de citocinas, acima descritos e alelos HLA possam estar relacionados com a susceptibilidade a aloimunização eritrocitária em pacientes falciformes.
Ao identificar marcadores genéticos de aloimunização eritrocitária, como os polimorfismos em genes de citocinas e alelos HLA, pode ser possível prever com antecedência respondedores e não-respondedores. Este conhecimento pode auxiliar futuramente no direcionamento de unidades fenotipadas ou genotipadas, inclusive em relação aos haplótipos RH, apenas para os pacientes respondedores, evitando-se assim o alto custo da utilização de unidades fenótipo compatível para não-respondedores.
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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Este trabalho teve como objetivo geral identificar o perfil genético de grupos sanguíneos, os haplótipos RH em pacientes que desenvolveram anticorpos contra antígenos Rh e as possíveis associações de polimorfismos presentes em genes imunologicamente relevantes (genes HLA e genes de citocinas) com a aloimunização eritrocitária em pacientes portadores de AF politransfundidos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
– Identificar a taxa de aloimunização eritrocitária e a frequência dos aloanticorpos e autoanticorpos encontrados na população de pacientes falciformes politransfundidos.
– Identificar a frequência dos principais antígenos de grupos sanguíneos entre os pacientes falciformes através da análise molecular.
– Realizar a genotipagem de alelos RHD e RHCE em pacientes com AF que desenvolveram anticorpos contra antígenos Rh e avaliar a significância clínica dos anticorpos produzidos.
– Determinar as frequências de alelos, genótipos e haplótipos dos polimorfismos IL17F (7488A/G), IL17A–197G/A, IL4 (–590C/T e íntron 3 VNTR), IL10 (–1082A/G, –819T/C, –592A/C), TNFA–308G/A, IL1B–511C/T e IL6–174C/G e as possíveis associações com a aloimunização eritrocitária em pacientes portadores de AF com múltiplas transfusões.
– Determinar a frequência dos alelos HLA classe II (HLADRB1, DQA1, -DQB1) e as possíveis associações com a aloimunização eritrocitária em pacientes portadores de AF com múltiplas transfusões.
– Determinar as frequências dos haplótipos formados por HLA-DRB1 e o polimorfismo TNFA–308G/A e as possíveis associações com a aloimunização eritrocitária em pacientes portadores de AF com múltiplas transfusões.
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3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 CASUÍSTICA
3.1.1 Grupo de pacientes com Anemia Falciforme
Participaram deste estudo 161 pacientes portadores de AF
politransfundidos que foram atendidos no Hemocentro da UNICAMP, Centro Infantil Boldrini e Hemonúcleo de Taubaté durante o período de setembro/2012 a maio/2015. Foram incluídos pacientes homozigotos para HbS, de ambos os sexos independentemente da idade. Cada voluntário concordou em participar deste estudo mediante entrevista e esclarecimentos verbais, sendo submetidos à coleta sanguínea, segundo proposto no projeto aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Institucional. A coleta das amostras foi realizada no dia da consulta de rotina dos pacientes que apresentavam condição clínica estável (steady-state). Os dados demográficos de cada paciente foram obtidos por meio de entrevista com os pacientes e pais.
Foram incluídos pacientes que apresentavam histórico de transfusão sanguínea nos últimos 6 meses antes da data de inclusão do paciente. Todos os
pacientes transfundidos receberam unidades de sangue HbS-negativas,
leucoreduzidas e não irradiadas.
Foram excluídos da casuística pacientes aparentados, pacientes que haviam recebido menos de 5 transfusões sanguíneas ou que somente haviam recebido transfusões compatíveis para os principais antígenos clinicamente significantes.
3.1.2 Grupo controle
O grupo controle foi constituído de 288 doadores de sangue e medula óssea autodeclarados como Afro-Brasileiros, que foram atendidos no Hemocentro da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Esses indivíduos possuíam nível normal de Hb, ausência de anemia ou HbS, ausência de condições inflamatórias e doenças hematológicas. Este grupo foi utilizado para determinação das frequências
dos polimorfismos em genes de citocinas e alelos HLA em uma população saudável de etnia similar aos pacientes.
3.1.3 Aspectos éticos da pesquisa
Este estudo foi aprovado em 10/08/2012 pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, Parecer no 68683/2012 (Anexo I), conforme previsto na resolução no 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (CNS). Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, previamente aprovado pelo CEP.
3.2 MATERIAIS
3.2.1 Kit de extração de DNA
Para a extração do DNA do sangue periférico foi utilizado o kit comercial QIAamp DNA Blood Mini Kit da empresa Qiagen® (Qiagen, Valencia, CA, USA). Estão inclusos neste kit os reagentes: Buffer AL, Buffer AW1, Buffer AW2, proteinase K e os materiais: colunas de sílica e tubos de lise.
3.2.2 Água livre de nuclease
A água livre de nuclease (Applied Biosystems®, Foster City, CA, EUA) foi utilizada na etapa final da extração de DNA, na reconstituição dos primers e nas reações de PCR.
3.2.3 Etanol absoluto (CH3CH2OH)
O etanol absoluto (P.A) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi utilizado na preparação dos reagentes de extração de DNA e no protocolo de sequenciamento de DNA.
3.2.4 Taq DNA Polimerase
A enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen®, Carisbad, CA, EUA) foi utilizada nas Reações em Cadeia da Polimerase Alelo Específica (AS), PCR-multiplex, Análise dos Fragmentos da Digestão Enzimática dos Produtos da Reação
em Cadeia da Polimerase (do inglês - restriction fragment length polymorphism – sigla: PCR-RFPL), e Reação em Cadeia da Polimerase Sequência Específica de Oligonucleotídeos (do inglês - sequence specific oligonucleotide – sigla: PCR-SSO). O kit incluía 5 unidades/μL da enzima, 1mL de tampão 10X (200mM Tris-HCL (pH8.4) e 500mM de KCl e 1mL de MgCl2 50mM.
Para a técnica de microarray HEA BeadChipTM (Human Erythrocyte Antigen, BioArray Solutions, Immucor, Warren, NJ, EUA) foi utilizada a enzima Taq polimerase Platinum (Invitrogen®). O kit incluía 5 unidades/μL da enzima, 1mL de tampão 10X (200mM Tris-HCL (pH8.4) e 500mM de KCl e 1mL de MgCl2 50mM.
3.2.5 dNTP 10Mm
As dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) adquiridas da empresa Invitrogen®, foram utilizadas nas técnicas de PCR convencional na concentração de 10mM.
3.2.6 Primers
Os primers utilizados na análise molecular dos grupos sanguíneos estão descritos nas referências (30,138–141). Os primers utilizados na genotipagem dos polimorfismos IL17F (7488A/G), IL17A–197G/A, IL4–590C/T, IL10 (–1082A/G, – 819T/C, –592A/C), TNFA–308G/A, IL1B–511C/T e IL6–174C/G estão descritos na Tabela 4 e os primers utilizados para determinação do polimorfismo IL4 íntron 3 VNTR está descrito na referência (142). Todos os primers foram adquiridos da empresa Invitrogen®.
3.2.7 Sondas TaqMan para determinação da zigozidade RHD
Sondas fluorescentes duplamente marcadas foram sintetizadas pela Applied Biosystems® para determinação da zigozidade RHD por PCR em tempo real pela metodologia de genotipagem TaqMan®. Os fluorocromos utilizados foram: FAM (6-carboxyfluorescein), TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine) e JOE (2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein). As sequências das sondas estão descritas na Tabela 1.
Tabela 1 - Sequências das sondas utilizadas para determinação da zigozidade RHD. Técnica Sequência das sondas
PCR em tempo real (genotipagem TaqMan®) RD-T 5'(FAM)TACGTGAGAAACGCTCATGACAGCAAAGTCT(TAMRA)3' Alb-probe 5’(JOE)-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-(TAMRA)3’
3.2.8 Marcador de peso molecular
Marcador de peso molecular de 100pb (Invitrogen®) foi utilizado nas corridas de eletroforese para análise do tamanho dos fragmentos de DNA.
3.2.9 Tampão Tris-EDTA-Borato (TEB) 10X
Tampão utilizado no preparo do gel de agarose e na corrida de eletroforese. Foi preparado dissolvendo-se 108g de Tris (Sigma-Aldrich®), 55g de ácido bórico (Sigma-Aldrich®) e 40mL de EDTA 0,5M pH 8.0 (Sigma-Aldrich®) em quantidade de água destilada (dH2O) suficiente para 1000mL.
3.2.10 Enzimas de restrição
As enzimas de restrição utilizadas neste trabalho foram adquiridas das empresas New England Biolab® (Beverly, MA, EUA) e MBI Fermentas® (Amherst, NY, EUA) e foram utilizadas para digestão dos produtos de PCR de acordo com o polimorfismo estudado, como pode ser visualizado na Tabela 4.
3.2.11 Gel de agarose
A solução de agarose foi preparada em TEB 1X de acordo com a concentração específica de cada protocolo (1%, 2% ou 3%). Esta solução era aquecida em forno micro-ondas, durante 1 minuto e, após resfriamento, adicionou-se 50µL de brometo de etídio (Invitrogen®).
3.2.12 Gel de poliacrilamida 12%
A solução de poliacrilamida foi preparada misturando 23,3mL de acrilamida 40% (Gibco BRL®, Gaithersburg, MD, EUA); 8,8mL de TEB 10X, 55mL de água destilada, 363μL de persulfato de amônio 10% (Gibco BRL®) e 16μL de
TEMED (Gibco BRL®). Esta solução foi dispensada em uma placa de vidro, previamente preparada, para que ocorresse a sua polimerização.
3.2.13 Plataformas HEA BeadChipTM, RHCE BeadChipTM e RHD BeadChipTM
As plataformas de microarray HEA BeadChipTM, RHCE BeadChipTM e RHD BeadChipTM foram adquiridas da empresa BioArray Solutions (Immucor. NJ, USA) e foram utilizadas para a genotipagem eritrocitária estendida dos grupos sanguíneos e para a pesquisa de variantes nos genes RHCE e RHD, respectivamente.
Estas plataformas utilizam kits que contém todos os reagentes necessários para a execução da técnica, incluindo: lâminas de vidro com chips de DNA (sondas de oligonucleotídeos específicas ao polimorfismo estudado) com capacidade para 8 ou 96 amostras, PCR-Mix (contendo primers, dNTPs e tampão) e as enzima ExoSAPIT, Lambda Exonuclease e Thermo Sequenase, provenientes da Empresa Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, EUA).
Nos Kits de RHCE e RHD também estão inclusos a enzima Hot Start Taq DNA polimerase (BioArray Solutions).
3.2.14 Kit de extração Qiaex II
Este Kit foi adquirido da Empresa Qiagen® e foi utilizado na extração e purificação do DNA contido em gel de agarose para subsequente reação de sequenciamento de DNA.
3.2.15 Trizol
Este regente foi utilizado para extração de RNA segundo as instruções do fabricante (Invitrogen®).
3.2.16 Superscript II Kit
Este Kit foi utilizado na transcrição do mRNA e foi adquirido da Empresa Invitrogen®.
