Análise molecular de antígenos eritrocitários

3.3.4.1 Genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala

A genotipagem para os principais alelos de grupos sanguíneos foi realizada pela técnica de microarray utilizando-se a plataforma HEA BeadChipTM (BioArray Solutions, Immucor) de acordo com o protocolo do fabricante. Os polimorfismos avaliados estão descritos na Tabela 2.

A amplificação das sequências alvo foi realizada por PCR-multiplex, com a utilização do PCR-Mix presente no Kit e a amostra de DNA do paciente. Em todas as reações foram incluídos uma amostra controle positivo (amostra com genótipo e fenótipo conhecido) e um controle negativo (água ao invés de DNA). As amplificações foram feitas no termociclador Veriti (Applied Biosystems®).

Após a PCR-multiplex realizou-se a remoção de todo o excesso de primers e dNTPs através da adição da enzima ExoSAPIT (Amersham Pharmacia Biotech) ao produto de PCR amplificado. A obtenção de fita simples de DNA foi realizada posteriormente através da digestão enzimática com a enzima Lambda Exonuclease (Amersham Pharmacia Biotech).

Em seguida, adicionou-se ao produto da PCR a solução composta pela enzima Thermo Sequenase, tampão (1X) e 1mmol de cada dNTP (dCTP marcada com fluoróforos). Esta mistura foi dispensada em cada BeadChipTM. As lâminas contendo os microchips foram então incubadas para que houvesse ou não a hibridização do DNA alvo amplificado às sondas pré-existentes no BeadChipTM.

Completado o período de incubação, todos os BeadChipsTM foram lavados 3 vezes com água destilada, a fim de remover todo e qualquer excesso de dNTP, para minimizar a emissão indesejada de sinal de fluorescência.

Ao término da hibridização, as lâminas contendo os BeadChipsTM foram levadas ao sistema de captura de imagem, o AIS Data Acquisition BasisTM (BioArray Solutions Information System), responsável pela captura e decodificação da fluorescência. Este sistema é composto por um leitor óptico de código de barras (lâminas) e um microscópio de fluorescência acoplado a uma câmera fotográfica interligada a um software, o wHEATM (Web-Based Human Erythrocyte antigen and Hemoglobinopathy analysis – BioArray Solutions), que possibilitou a identificação e interpretação do alelo hibridizado através da comparação dos valores de fluorescência obtidos com os valores de fluorescência dos polimorfismos depositados no Banco de Dados BasisTM (BioArray Solutions). A emissão dos resultados foi feita na forma de tabelas e gráficos. Um resumo de todos os procedimentos que compõe a técnica de genotipagem em larga escala da plataforma de microarray HEA BeadChipTM estão descritos na Figura 5.

Tabela 2 - Alelos e SNPs presentes no HEA BeadChipTM

Sistema de grupo sanguíneo Alelos SNPs

Rh C/c 307 C>T 109 Ins E/e 676 G>C VS 733 C>G V 1006 G>T Kell K/k 698 T>C Jsa/Jsb 1910 C>T Kpa/Kpb 961 C>T Duffy Fya/Fyb 125 G>A

GATA (Silencing FY) -33 T>C

Fyx[Fy(b+w)] 265 C>T Kidd Jka/Jkb 838 G>A MNS M/N 59 C>T S/s 143 T>C Silencing S Ex5 230 C>T Silencing S Int5 g>t Diego Dib/Dia 2561 C>T

Lutheran Lua/Lub 230 A>G

Dombrock Doa/Dob 793 A>G Hy+/Hy- 323 G>T Jo(a+)/Jo(a-) 350 C>T Landsteiner-Wiener LWa/LWb 308 A>G Colton Coa/Cob 134 C>T Scianna Sc1/Sc2 169 G>A Hemoglobin S HgbS 173 A>T

Figura 5 - Etapas do protocolo de genotipagem de alelos de grupos sanguíneos em larga escala pela plataforma HEA BeadChipTM. Fonte: Adaptado de Da Costa (143).

3.3.4.2 Genotipagem RHD e RHD*Ѱ

A determinação da presença do gene RHD (íntron 4 e éxon 7) e a detecção da inserção de 37pb no gene RHD, conhecida como pseudogene RHD ou RHD*Ѱ, foi realizada conforme protocolo descrito por Singleton et al. (138).

3.3.4.3 Determinação da zigozidade do gene RHD

A determinação da zigozidade do gene RHD foi realizada pela técnica de PCR-RFLP, de acordo com o protocolo descrito por Wagner et al. (144) e por PCR quantitativo em tempo real como previamente descrito por Chiu et al. (139).

3.3.4.4 Identificação de variantes RHD e RHCE

A identificação de alelos RHD variantes foi realizada utilizando-se a plataforma RHD BeadChipTM (BioArray Solutions) que contém 34 marcadores

associados com expressão alterada do gene RHD. Os alelos e SNPs presentes na plataforma RHD BeadChipTM estão descritos na Tabela 3.

Tabela 3 - Variantes RHD analisadas pelo RHD BeadChipTM

D fraco tipo: 1, 1.1, 2, 3, 4.0, 4.1, 4.2/DAR, 4.3, 5, 11, 14, 15, 17, 25, 29, 34, 40, 47, 51 D negativo: RHDΨ; W16X; D-CE(3-7)-D; D-CE(4-7)-D; (C)dceS; DCE(3-9)-D; CE(1-3)-D(4- 10); rG; RHD(Y269X)

Del: 1227 G>A; IVS3+1G>A; M295I

D Parcial: DAR/ D fraco 4.2; DIIIa (DIII tipo 5), DIII tipo 4,6; DIIIc; DIVa; DIVa -2; DIV tipo 3,

4, 5; DIVb; DV tipo 1,2,3 (DBS-0),4,5(DHK),6,7,8,9; DVI tipo 1,2,3,4; DNB; DHMi; DUC-2; DAU 1,2,3,4,5; DBT 1,2; DCS 1, 2; DOL; DOL-3; DFR; DFR -2; DTO; DBS-0,1,2.

A identificação dos alelos RHCE variantes foi realizada com a utilização da plataforma RHCE BeadChipTM (BioArray Solutions, Immucor) que permite a detecção de 25 polimorfismos associados com alterações dos antígenos C (RH2), c (RH4), E (RH3), e (RH5), CW (RH8), CX (RH9), V (RH10), VS (RH20), e Crawford (RH43). Com este método podemos identificar os alelos RHCE variantes: ceRT, ceAR, ceMO, ceRA, ceVG, ceEK, ceBI, CeMA, ceSL, CeVA, ceTI, ceFV, DHAR, E tipo I/II/III/IV, EKH, ceS, (C)ceS, ceS(340,378) e 48C.

Para a determinação das variantes RHD e RHCE pelas plataformas de microarray, RHD e RHCE BeadChip, realizou-se o mesmo procedimento técnico da plataforma HEA BeadChipTM, descrito anteriormente. As plataformas diferem apenas no programa de ciclagem da reação de PCR e nos tempo e temperatura de incubação das reações de purificação, desnaturação e hibridização.

3.3.4.5 Sequenciamento do DNA e Clonagem

A análise da sequência de DNA foi realizada em produtos de PCR amplificados a partir de DNA genômico em todas as amostras que não foram identificadas pelas plataformas BeadChip utilizando-se pares de iniciadores RHD e RHCE específicos descritos previamente (30,140).

Os produtos de PCR foram purificados por eluição a partir de gel agarose 1%, utilizando um kit de extração de gel Qiaex II (Qiagen) e sequenciados diretamente, sem subclonagem, em um sequenciador ABI 373XL Perkin Elmer Biosystems, com o reagente Big Dye BD Half-term (GenPak, Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA, EUA).

A fim de determinar as combinações alélicas RH das amostras identificadas com variantes RHCE, foi realizada a clonagem e sequenciamento de Rh-cDNA. O RNA foi isolado dos reticulócitos com Trizol (Invitrogen). A transcrição reversa foi realizada com Superscript First Strand Synthesis (Invitrogen), utilizando iniciadores específicos para o gene (141). Os produtos de PCR amplificado a partir do cDNA foram purificados com ExoSAP-IT (USB, Cleveland, OH, EUA), clonado em um vetor TA (Invitrogen) e sequenciados utilizando primers previamente descritos (141).

3.3.5 Avaliação do significado clínico dos anticorpos anti-Rh em pacientes