3.2.1 Kit de extração de DNA
Para a extração do DNA do sangue periférico foi utilizado o kit comercial QIAamp DNA Blood Mini Kit da empresa Qiagen® (Qiagen, Valencia, CA, USA). Estão inclusos neste kit os reagentes: Buffer AL, Buffer AW1, Buffer AW2, proteinase K e os materiais: colunas de sílica e tubos de lise.
3.2.2 Água livre de nuclease
A água livre de nuclease (Applied Biosystems®, Foster City, CA, EUA) foi utilizada na etapa final da extração de DNA, na reconstituição dos primers e nas reações de PCR.
3.2.3 Etanol absoluto (CH3CH2OH)
O etanol absoluto (P.A) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi utilizado na preparação dos reagentes de extração de DNA e no protocolo de sequenciamento de DNA.
3.2.4 Taq DNA Polimerase
A enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen®, Carisbad, CA, EUA) foi utilizada nas Reações em Cadeia da Polimerase Alelo Específica (PCR-AS), PCR- multiplex, Análise dos Fragmentos da Digestão Enzimática dos Produtos da Reação
em Cadeia da Polimerase (do inglês - restriction fragment length polymorphism – sigla: PCR-RFPL), e Reação em Cadeia da Polimerase Sequência Específica de Oligonucleotídeos (do inglês - sequence specific oligonucleotide – sigla: PCR-SSO). O kit incluía 5 unidades/μL da enzima, 1mL de tampão 10X (200mM Tris-HCL (pH8.4) e 500mM de KCl e 1mL de MgCl2 50mM.
Para a técnica de microarray HEA BeadChipTM (Human Erythrocyte Antigen, BioArray Solutions, Immucor, Warren, NJ, EUA) foi utilizada a enzima Taq polimerase Platinum (Invitrogen®). O kit incluía 5 unidades/μL da enzima, 1mL de tampão 10X (200mM Tris-HCL (pH8.4) e 500mM de KCl e 1mL de MgCl2 50mM.
3.2.5 dNTP 10Mm
As dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) adquiridas da empresa Invitrogen®, foram utilizadas nas técnicas de PCR convencional na concentração de 10mM.
3.2.6 Primers
Os primers utilizados na análise molecular dos grupos sanguíneos estão descritos nas referências (30,138–141). Os primers utilizados na genotipagem dos polimorfismos IL17F (7488A/G), IL17A–197G/A, IL4–590C/T, IL10 (–1082A/G, – 819T/C, –592A/C), TNFA–308G/A, IL1B–511C/T e IL6–174C/G estão descritos na Tabela 4 e os primers utilizados para determinação do polimorfismo IL4 íntron 3 VNTR está descrito na referência (142). Todos os primers foram adquiridos da empresa Invitrogen®.
3.2.7 Sondas TaqMan para determinação da zigozidade RHD
Sondas fluorescentes duplamente marcadas foram sintetizadas pela Applied Biosystems® para determinação da zigozidade RHD por PCR em tempo real pela metodologia de genotipagem TaqMan®. Os fluorocromos utilizados foram: FAM (6-carboxyfluorescein), TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine) e JOE (2,7- dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein). As sequências das sondas estão descritas na Tabela 1.
Tabela 1 - Sequências das sondas utilizadas para determinação da zigozidade RHD. Técnica Sequência das sondas
PCR em tempo real (genotipagem TaqMan®) RD-T 5'(FAM)TACGTGAGAAACGCTCATGACAGCAAAGTCT(TAMRA)3' Alb- probe 5’(JOE)-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-(TAMRA)3’
3.2.8 Marcador de peso molecular
Marcador de peso molecular de 100pb (Invitrogen®) foi utilizado nas corridas de eletroforese para análise do tamanho dos fragmentos de DNA.
3.2.9 Tampão Tris-EDTA-Borato (TEB) 10X
Tampão utilizado no preparo do gel de agarose e na corrida de eletroforese. Foi preparado dissolvendo-se 108g de Tris (Sigma-Aldrich®), 55g de ácido bórico (Sigma-Aldrich®) e 40mL de EDTA 0,5M pH 8.0 (Sigma-Aldrich®) em quantidade de água destilada (dH2O) suficiente para 1000mL.
3.2.10 Enzimas de restrição
As enzimas de restrição utilizadas neste trabalho foram adquiridas das empresas New England Biolab® (Beverly, MA, EUA) e MBI Fermentas® (Amherst, NY, EUA) e foram utilizadas para digestão dos produtos de PCR de acordo com o polimorfismo estudado, como pode ser visualizado na Tabela 4.
3.2.11 Gel de agarose
A solução de agarose foi preparada em TEB 1X de acordo com a concentração específica de cada protocolo (1%, 2% ou 3%). Esta solução era aquecida em forno micro-ondas, durante 1 minuto e, após resfriamento, adicionou-se 50µL de brometo de etídio (Invitrogen®).
3.2.12 Gel de poliacrilamida 12%
A solução de poliacrilamida foi preparada misturando 23,3mL de acrilamida 40% (Gibco BRL®, Gaithersburg, MD, EUA); 8,8mL de TEB 10X, 55mL de água destilada, 363μL de persulfato de amônio 10% (Gibco BRL®) e 16μL de
TEMED (Gibco BRL®). Esta solução foi dispensada em uma placa de vidro, previamente preparada, para que ocorresse a sua polimerização.
3.2.13 Plataformas HEA BeadChipTM, RHCE BeadChipTM e RHD BeadChipTM
As plataformas de microarray HEA BeadChipTM, RHCE BeadChipTM e RHD BeadChipTM foram adquiridas da empresa BioArray Solutions (Immucor. NJ, USA) e foram utilizadas para a genotipagem eritrocitária estendida dos grupos sanguíneos e para a pesquisa de variantes nos genes RHCE e RHD, respectivamente.
Estas plataformas utilizam kits que contém todos os reagentes necessários para a execução da técnica, incluindo: lâminas de vidro com chips de DNA (sondas de oligonucleotídeos específicas ao polimorfismo estudado) com capacidade para 8 ou 96 amostras, PCR-Mix (contendo primers, dNTPs e tampão) e as enzima ExoSAPIT, Lambda Exonuclease e Thermo Sequenase, provenientes da Empresa Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, EUA).
Nos Kits de RHCE e RHD também estão inclusos a enzima Hot Start Taq DNA polimerase (BioArray Solutions).
3.2.14 Kit de extração Qiaex II
Este Kit foi adquirido da Empresa Qiagen® e foi utilizado na extração e purificação do DNA contido em gel de agarose para subsequente reação de sequenciamento de DNA.
3.2.15 Trizol
Este regente foi utilizado para extração de RNA segundo as instruções do fabricante (Invitrogen®).
3.2.16 Superscript II Kit
Este Kit foi utilizado na transcrição do mRNA e foi adquirido da Empresa Invitrogen®.
3.2.17 Big Dye
O reagente Big Dye (BD Half-term, GenPark, Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA, EUA) foi utilizado nas reações de sequenciamento de DNA.
3.2.18 Marcador de peso Molecular Low Mass
O marcador de peso molecular Low Mass (Invitrogen®) foi utilizado na análise do peso molecular dos fragmentos designados para sequenciamento.
3.2.19 Kit LABType® SSO
O kit LABType® SSO (One Lambda Inc., Canoga Park, CA, EUA), tecnologia Luminex xMap (Luminex Corporation, Austin, EUA) foi utilizado para genotipagem de grupos alelicos HLA de classe II. Foram utilizado os kits LABType® SSO HLA DRB1 e SSO HLA DQA1/DQB1 (One Lambda Inc.) para genotipagem dos alelos HLA dos loci HLA-DRB1 e -DQA1/-DQB1, respectivamente.
Os kits eram compostos por reagentes de pré-PCR: solução de primers (específico para cada loci HLA) e solução D-Mix para primers; e reagentes de pós- PCR (hibridização): tampão de hibridização, tampão de lavagem, solução de desnaturação, tampão de neutralização, tampão de coloração SAPE e mistura de pérolas (microesferas ligadas a sondas de oligonucleotídeos específicos para cada alelo).
3.2.20 Ensaios TaqMan® para genotipagem de SNPs em genes de citocinas
Os ensaios de genotipagem TaqMan® foram confeccionados e sintetizados pela Applied Biosystems®. Os ensaios utilizados foram: rs1800871 (C_1747362_10), rs2243250 (C_16176216_10) e rs1800795 (C_1839697_20).
Cada ensaio possuía um par de iniciadores que flanqueiam o SNP e um par de sondas: uma homóloga do tipo selvagem, marcadas com VIC®, e outra marcada com 6-carboxifluoresceína (FAM®), homóloga ao tipo mutante.
3.2.21 Mastermix de genotipagem Taqman®
O mastermix de genotipagem TaqMan® (Applied Biosystems®) foi utilizado para a genotipagem de polimorfismos por PCR em tempo real. O mix incluía
a enzima DNA polimerase AmpliTaq Gold® UP (Ultra Pura), dNTPs e tampão de forma otimizada.