ANÁLISE NO MFA DA RUGOSIDADE E TOPOGRAFIA
SUPERFICIAL DE DOIS CIMENTOS DE IONÔMERO DE
VIDRO SUBMETIDOS AO DESAFIO CARIOGÊNICO:
ESTUDO IN VITRO
Niterói 2015
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
ANÁLISE NO MFA DA RUGOSIDADE E TOPOGRAFIA
SUPERFICIAL DE DOIS CIMENTOS DE IONÔMERO DE
VIDRO SUBMETIDOS AO DESAFIO CARIOGÊNICO:
ESTUDO IN VITRO
CAMILA OLIVEIRA BORGES FRAZÃO Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Área de Concentração: Clínica Odontológica Orientador: Prof. Dr. Cresus Vinicus Depes de Gouvêa
Co-Orientadora: Profª Drª Maria Elisa Oliveira dos Santos
F848 Frazão, Camila Oliveira Borges
Análise no MFA da rugosidade e topografia superficial de dois cimentos de ionômero de vidro submetidos ao desafio cariogênico: estudo in vitro / Camila Oliveira Borges Frazão; orientador: Prof. Dr. Cresus Vinícius Depes de Gouvêa - Niterói: [s.n.], 2015.
32 f.: il. Inclui tabelas
Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) – Universidade Federal Fluminense, 2015.
Bibliografia: f. 26-28
1.Cimentos de ionômero de vidro 2.Microscopia de força atômica 3.Rugosidade da superfície I.Gouvêa, Cresus Vinícius Depes de [orien.] III.Título
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Cresus Vinícios Depes de Gouvêa - Orientador
Instituição: Faculdade de Odontologia - Universidade Federal Fluminense
Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Profª. Drª. Maria Elisa Oliveira dos Santos – Membro Efetivo
Instituição: Faculdade de Odontologia - Universidade Federal Fluminense
Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Profª. Drª. Maíra do Prado – Membro Efetivo
Instituição: Faculdade de Odontologia - Universidade Federal do Rio de Janeiro Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Ao Único que é digno de receber toda honra e toda glória, ao meu Salvador e Rei. Dedico este trabalho a Deus, pois foi Ele quem me fortaleceu quando o cansaço surgia, me permitindo transformar este sonho em realidade. Tudo o que me vem às mãos para fazer, faço com responsabilidade e compromisso, cumprindo assim o desejo no meu coração de sempre exaltá-lo em minha vida.
Consagre ao Senhor tudo o que você faz, e os seus planos serão bem-sucedidos. Provérbios 16:3
AGRADECIMENTOS
Em minha vida, mais uma etapa é concluída. E eu agradeço a todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para este dia acontecer. Foram dias difíceis, mas Deus sempre me indicou o melhor caminho a ser seguido e agradeço, primeiramente, a Ele por ter permitido que este momento aconteça.
Agradeço aos meus pais, Regina e Frazão, por todo apoio, compreensão e, principalmente, por todo amor que sempre fizeram questão de transmitir para o meu coração. Sem este apoio, nada seria possível. Vocês me inspiram a continuar nesta caminhada! Agradeço também ao meu noivo, Carlos Alberto, por toda preocupação e carinho. Você também foi muito importante na conclusão desta etapa em minha vida. Obrigada, amo vocês!
Agradeço ao Professor Cresus Vinícius Gouvêa, por ter me recebido como sua orientada e ter me permitido conhecer profissionais que foram fundamentais para a realização deste trabalho. A minha co-orientadora, Professora Maria Elisa Santos, por toda sua orientação e amizade. A senhora se tornou em uma grande inspiração para minha vida profissional! E ao Professor Marlus Cazajeira, pela sua importante colaboração. Muito obrigada!
Agradeço a equipe de Odontopediatria da Universidade Federal Fluminense (UFF) por todo apoio. Em especial, a Professora Tereza Graça, pela sua amizade, e a Professora Maristela Portela, por toda a assistência durante este trabalho.
Às Professoras Renata Simão e Maíra do Prado, e toda equipe da Universidade Federal do Rio de Janeiro (COPPE-UFRJ), o meu agradecimento por me receberem e por me terem me orientado. Vocês contribuíram, de forma determinante, para a conclusão deste trabalho. Aos meus colegas de turma, que compartilharam comigo momentos muito especiais durante estes anos. Em especial a minha amiga Dária Cruz, por todo carinho e apoio.
Agradeço a Deus pela vida de cada um de vocês, e peço que Ele abençoe a todos grandemente! Muito Obrigada!
FRAZÃO COB. Análise no MFA da rugosidade e topografia superficial de dois cimentos de ionômero de vidro submetidos ao desafio cariogênico: estudo in vitro [dissertação]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2015.
Os cimentos de ionômero de vidro (CIV) são materiais amplamente utilizados na prática odontológica, em função de suas propriedades anticariogênicas e adesivas. O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro, por meio de microscopia de força atômica (MFA), as alterações provocadas pelo desafio cariogênico na superfície de um CIV de alta viscosidade [Ketac Molar Easymix™ (KM)] e um CIV modificado por resina [Vitremer™ (VT)]. Para tal, foram confeccionados 15 corpos-de-prova com dimensões padronizadas (8,0mm de diâmetro e 2,0mm de espessura) de cada material que foram divididos em 03 grupos experimentais (n=5), definidos de acordo com o meio de armazenamento: Grupo AD (água destilada); Grupo B (BHI suplementado com 2% de sacarose e inóculo de cepas de S. mutans [ATCC 25175]) e Grupo S (BHI suplementado com 2% de sacarose sem inóculo). Depois de mantidos em imersão por 07 dias, e os respectivos meios trocados a cada 24h, a superfície de cada espécime foi avaliada em um microscópio de força atômica a partir do qual foram determinados os valores de rugosidade superficial média (Ra). Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística com os testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney (α=5%). De acordo com os resultados, para o KM, o maior valor de Ra foi registrados no grupo B (p<0.05). Para o VT, o grupo S apresentou o maior valor de Ra (p<0.05), enquanto os grupos DW e B não apresentaram diferença estatisticamente significante. Portanto, a formação de biofilme a partir de S. mutans na superfície de ambos os materiais resultou no aumento da Ra e em alterações na topografia dos espécimes. Para o CIV VitremetTM, o acúmulo de sacarose também apresentou uma influência significativa na Ra.
Palavras-chave: microscopia de força atômica, cimentos de ionômero de vidro, rugosidade da superfície.
A
BSTRACTFRAZÃO COB. MFA analysis of roughness and surface topography of two glass ionomer cements submitted to cariogenic challenge: in vitro study [dissertation]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2015.
Glass ionomer cements (GIC) are materials widely used in dental practice, due to their anticariogenic and adhesive properties. The aim of this study was to evaluate in
vitro using an atomic force microscopy (AFM), the changes caused by cariogenic
challenge on the surface of a high-viscosity GIC [Ketac Molar Easymix ™ (KM)] and resin modified GIC [Vitremer ™ (VT)] induced. For this, 15 specimens were prepared with standardized dimensions (8.0 mm in diameter and 2.0 mm thick) of each material, that were divided into 03 experimental groups (n = 5), determined in accordance with how it group was storaged: Group DW (distilled water); Group B (BHI supplemented with 2% sucrose and inoculum of strains of S. mutans [ATCC 25175]) and Group S (BHI supplemented with 2% sucrose without inoculum). After kept in immersion for 07 days, and their respective media changed every 24 hours, the surface of the each specimen was evaluated in an atomic force microscope (AFM) from which was determined the average values of surface roughness (Ra). Data were statistically analyzed with the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test (α = 5%). According to the results, for the KM, the largest value of Ra was recorded in group B (p <0.05). For the VT, group S had highest value of Ra (p<0.05), while groups DW and B showed no statistically significant difference. Therefore, the formation of biofilm from S. mutans on the surface of both materials resulted in the increase of Ra and changes in topography of the specimens. To the GIC VitremerTM, the sucrose accumulation also had a significant influence on Ra.
1 - INTRODUÇÃO
Parece haver um consenso na literatura científica sobre a participação dos
Streptococcus mutans na etiologia da cárie dentária.1,2,3 Tal participação está provavelmente associada a duas importantes características desses microrganismos: a acidogenicidade e a aciduricidade.1,2,3,4,5,6
A primeira característica está relacionada à capacidade destes microrganismos metabolizarem carboidratos fermentáveis da dieta (p.ex.: sacarose), produzindo com isso, ácidos que diminuem o pH do biofilme. As quedas frequentes do pH provocam um desequilíbrio do fenômeno Des-Re (i.e.: desmineralização – remineralização), fazendo com que os eventos de desmineralização sejam mais frequentes que os de remineralização, favorecendo com isso o desenvolvimento da lesão cariosa.1,2,3,4,7
A segunda característica está associada ao potencial acidúrico desta espécie. Isso significa que os S. mutans são capazes de sobreviver e se reproduzir em ambientes ácidos, ao contrário de outras espécies não-cariogênicas. Dessa forma, a presença de um ambiente ácido por meio do processo de seleção natural, favoreceria apenas a reprodução de bactérias acidúricas.1,2,3,4
Apesar de compreendida hoje como uma doença resultante do desequilíbrio da Des-Re, induzida por algumas bactérias presentes no biofilme, como é o caso dos
S. mutans, a cárie dentária foi tratada durante décadas segundo um modelo
mecanicista que considerava o tratamento restaurador como sinônimo de resolução da doença.3,6,8
A pouca valorização da importância da modificação dos hábitos relacionados ao controle mecânico do biofilme e dos hábitos alimentares conduzia com frequência ao fracasso do tratamento restaurador em virtude da recorrência da doença nas margens da restauração, quadro patológico conhecido como cárie secundária.7,9,10,11
Ainda hoje, a cárie secundária é um grande problema na prática clínica, sendo considerada como a principal causa de falha das restaurações. Acredita-se que a lesão ocorra como resultado do acúmulo de bactérias cariogênicas em sítios onde
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houve dissolução química e/ou desgaste mecânico do material restaurador. A presença de rugosidades na superfície de restaurações facilita o acúmulo de biofilme, favorecendo o desenvolvimento de lesões de cárie secundária, além de inflamação gengival e manchas superficiais.5,7,9,12
A aderência de bactérias nos materiais restauradores está relacionada a vários fatores, tais como: a capacidade de algumas espécies estabelecerem interações eletrostáticas com a superfície do material; e às propriedades do material, particularmente à rugosidade superficial causada pelo desgaste da restauração.4,5,7,10,13
Como a ocorrência de microdefeitos na superfície do material é inevitável, o uso de materiais com características antimicrobianas pode ser interessante na prevenção da cárie secundária. Por exemplo, o potencial de liberação de fluoretos dos cimentos de ionômero de vidro atribui a esse material propriedades antibacterianas.5,8,14,15
Os cimentos de ionômero de vidro (CIV) têm se destacado por sua ampla utilização em odontologia, principalmente no tratamento infantil, em função de importantes propriedades, como: a adesão química ao esmalte e à dentina, o baixo coeficiente de expansão e contração térmicos, a liberação de flluoretos durante longo período de tempo e capacidade de se recarregar com íons de flúor.5,7,8,12
Devido as suas propriedades anticariogênicas, esse material tem sido considerado o restaurador de primeira escolha para pacientes com atividade de cárie, particularmente durante a etapa de adequação do meio bucal.5,7,15,16 Estudos realizados em laboratório têm demonstrado a capacidade dos cimentos de ionômero de vidro em reduzir a desmineralização do esmalte adjacente às margens da restauração.7,15
No entanto, a baixa resistência ao desgaste e à fratura dos cimentos ionoméricos, principalmente em sítios sujeitos ao estresse mastigatório, facilitam a propagação de trincas na superfície do material. Esse desgaste pode ser ainda maior quando a superfície da restauração não apresenta um polimento adequado.5,8,11
A presença de irregularidades na superfície das restaurações favorecem à retenção de bactérias e, em situações em que o controle mecânico do biofilme e da dieta são negligenciados, a ocorrência de cárie secundária.5,10,11,13 Apesar de seu desempenho laboratorial satisfatório, pesquisas clínicas consideram a cárie secundária como a causa mais frequente para a falha das restaurações de cimentos de ionômero de vidro.5,9,13
É importante considerar que o processo de biodegradação de materiais restauradores como os CIV é um fenômeno complexo em que eventos de dissolução e desintegração associam-se ao desgaste mecânico.7,10,17 Além da saliva, pesquisas têm demonstrado a capacidade do desafio cariogênico de degradar a superfície dos materiais restauradores.6,8,9 Contudo, ainda há carência de dados disponíveis na literatura sobre o assunto, particularmente em se tratando dos cimentos de ionômero de vidro.7,10
Em laboratório, parâmetros como a rugosidade superficial média (Ra) vêm sendo utilizados no estudo das alterações causadas pelo estresse químico e mecânico na superfície do material restaurador.12,17,18 Pesquisas têm ressaltado os benefícios da utilização da microscopia de força atômica (MFA) na análise de superfícies em função da alta resolução das imagens obtidas e a possibilidade de se realizarem análises qualitativas e quantitativas.18,19,20
Portanto, o objetivo desde trabalho foi avaliar in vitro os efeitos do desafio cariogênico induzido por um biofilme constituído por S. mutans sobre a rugosidade e topografia superficial de dois CIV, de alta viscosidade (Ketac Molar Easymix™) e modificado por resina (Vitremer™).
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2 - METODOLOGIA
Cimentos de ionômero de vidro testados
Foram avaliados dois cimentos de ionômero de vidro (CIV): um de alta viscosidade (Ketac Molar EasymixTM, 3M, ESPE, Sumaré, SP, Brasil), e um modificado por resina (VitremerTM, 3M, ESPE, Sumaré, SP, Brasil). A composição química, proporção pó/líquido e manipulação de acordo com as recomendações do fabricante estão descritas no quadro abaixo:
Nome
Comercial Classificação Fabricante Composição Química
Proporção
Pó/Líquido Manipulação
Ketac Molar
Easymix™ Convencional 3M ESPE, Brasil
Pó: vidro de flúorsilicato de alumínio, lantânio e cálcio, ácido poliacrílico, eudragit, ácido tartárico, ácido sórbico, ácido benzóico e pigmentos.
Líquido: água, copolímero de ácido acrílico e ácido maleico, ácido tartárico e ácido benzóico.
1:1
Manipular à temperatura ambiente de 20-25°C. Aglutinar o pó ao líquido no máximo em 2 porções, sobre o bloco de mistura ou placa de vidro, até obter uma mistura homogênea.
Vitremer™ Modificado por
resina 3M ESPE,
Brasil
Primer: copolímero do ácido polialcenóico modificado, grupos metacrilatos, etano e canforoquinona.
Pó: cristais de fluoralumíniosilicato, persulfato de potássio, ácido ascótbico e pigmentos.
Líquido: ácido polialcenóico, grupos metacrilatos, água, HEMA e canforoquinona.
Finishing gloss: Bis-GMA, TEGDMA e canforoquinona.
1:1
Misture metade do pó com todo o líquido, e então adicione o remanescente do pó. Misture intensamente até que todo pó esteja incorporado ao líquido, a mistura final deve ter alta consistência. Não misture por mais de 45 segundos.
Quadro 1 – Características dos dois tipos de cimentos de ionômero de vidro utilizados na pesquisa.
Os corpos-de-prova foram confeccionados em temperatura ambiente (≈27ºC), respeitando-se a proporção pó-líquido e manipulados de acordo com as instruções do fabricante. Para cada cimento, foram preparados 15 corpos-de-prova. Os mesmo foram modelados a partir de uma matriz de borracha (Odeme Dental Research, Luzerna, SC, Brasil) de média rigidez, com formato cilíndrico e dimensões padronizadas de 8mm de diâmetro e 2mm de altura.
Os cimentos foram manipulados e misturados sobre placa de vidro com espátula metálica nº 24F (SS White Duflex, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e inseridos na matriz utilizando o Sistema Centrix™ (DFL, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), com ponta accudose anterior LV™ (DFL, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Uma tira de poliéster (TDV, Pomerode, SC, Brasil) e uma placa de vidro foram utilizadas para pressionar a superfície das amostras até o término da reação de presa, no caso do CIV de alta viscosidade (i.e. Ketac Molar Easymix™).
Os corpos-de-prova foram removidos dos moldes após 15 minutos, protegidos contra a perda/incorporação de água pela cobertura com vaselina sólida (Hemafarma, São Gonçalo, RJ, Brasil) e mantidos imersos em recipientes contendo água destilada durante 07 dias, a uma temperatura aproximada de 27ºC. A água foi trocada a cada 24 horas.
Para o CIV modificado por resina (i.e. Vitremer™), todos os procedimentos foram semelhantes, exceto pelo fato de o cimento, depois de pressionado com o conjunto tira de poliéster-placa de vidro, foi fotoativado com uma unidade de luz halógena (GNATUS Equipamentos Médico-Odontológicos LTDA., Ribeirão Preto, SP, Brasil) durante 40 segundos.
Do mesmo modo que o cimento de presa rápida, os corpos-de-prova foram removidos dos moldes após 15 minutos e sua superfície foi protegida por meio da aplicação de resina fotopolimerizável (ou finishing gloss) específica do produto (Vitremer™, 3M ESPE, Sumaré, SP, Brasil). Estes corpos de prova também foram mantidos imersos em recipientes contendo água destilada por 07 dias a uma temperatura aproximada de 27ºC. A água foi trocada a cada 24 horas.
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Os 15 corpos-de-prova de cada cimento foram divididos em 03 grupos experimentais (n=05) relacionados ao meio em que foram armazenados durante o experimento. Os grupos foram identificados da seguinte forma:
Grupo AD (n=5): água destilada por 07 dias.
Grupo B (n=5): meio BHI suplementado com sacarose a 2% inoculado com cepas (ATCC 25175) de S. mutans. Os corpos-de-prova foram desse grupo foram, portanto, submetidos ao desafio cariogênico.
Grupo S (n=5): meio BHI suplementado com sacarose a 2% sem inóculo bacteriano.
Preparo do inóculo bacteriano
O inóculo bacteriano foi constituído por cepas de S. mutans (ATCC 25175). As bactérias foram semeadas em ágar BHI (Brain Heart Infusion) e incubadas em microaerofilia a 37ºC por 48h. Em seguida, as colônias foram transferidas para tubos de ensaio contendo caldo de cultura BHI suplementado com 2% de sacarose com a finalidade de se obter o crescimento bacteriano com turvação referente ao valor de 0.5 na escala de McFarland. A densidade óptica foi analisada com espectrofotômetro (Beckman Coulter DU® 530, LifeScience, UV/Vis Spetrophotometer, San Diego, CA, USA). Por fim, 1,0ml da suspensão bacteriana foi adicionada em cada poço da placa de cultura.
Formação do biofilme de S. mutans
Os corpos-de-prova foram alocados individualmente em poços de placas de cultura esterilizadas em óxido de etileno. Em seguida, 1,0ml da suspensão bacteriana previamente ajustada foi adicionada em cada poço, no grupo B. Para os grupos AD e S, foram utilizadas, respectivamente, água destilada e meio BHI suplementado com sacarose 2%, ambos sem a presença dos microrganismos, no mesmo volume de 1,0mL.
As placas foram incubadas em estufa (≈37°C) durante 07 dias em microaerofilia. Durante esse período, as soluções de armazenamento foram trocadas a cada 24h.
Análise da topografia e da rugosidade no microscópio de força atômica (MFA)
Com o propósito de padronizar as leituras destes parâmetros, somente uma das superfícies dos corpos-de-prova foi selecionada. A superfície considerada como não selecionada recebeu uma marcação como uma ranhura, com auxílio da ponta de uma sonda exploradora nº5, de modo a descartá-la para a mesma análise.
Previamente à análise, a vaselina presente na superfície das amostras foi removida com um microbrush umidecido em álcool, e depois foram submetidas a uma limpeza com água destilada, com auxílio de um aparelho de ultrassom (QUIMIS®, Diadema, SP, Brasil), em 2 ciclos de 30min.
A análise da superfície dos corpos-de-prova foi realizada em um microscópio de força atômica WITec (WITec Instruments Corp., Knoxville, Tennessee, EUA) operado no modo não contato, sob condições ambientais, umidade relativa do ar entre 45 e 55%. Foi utilizada a ponta RTESP (Bruker AFM Probes, Camarillo, CA, EUA), com força constante 20-80 N/m e frequência de ressonância 328-388 kHz. Em cada espécime foram realizadas 10 imagens de 10μm x 10μm, em diferentes locais da amostra. Em cada imagem, foi calculado o valor de rugosidade Ra, com o auxílio do programa Gwyddion-2.41. Através deste programa, foram obtidas imagens 3D da superfície das amostras, permitindo uma análise qualitativa das imagens de topografia e a comparação com os dados quantitativos obtidos.
Análise estatística
Os dados obtidos foram tabulados e submetidos à análise estatística com os testes One-Sample Kolmoforov-Smirnov (verificação do padrão de distribuição dos dados); Krukal-Wallis e Mann-Whitney ao nível de significância de 5%. A análise estatística foi realizada com auxílio do programa SPSS (versão 15.0).
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(Normatização segundo a revista Operative Dentistry)
Análise no MFA de Dois Cimentos de Ionômero de
Vidro Submetidos ao Desafio Cariogênico: estudo
in vitro
AFM Analysis of Two Glass Ionomer Cements Submitted to Cariogenic Challenge: in vitro study
Camila Oliveira Borges Frazãoa
Maria Elisa Oliveira dos Santosb
Marlus Roberto Rodrigues Cajazeirac
Maíra do Pradod
Renata Antoun Simãod
Maristela Barbosa Portelab
Cresus Vinicius Depes de Gouvêae
a DDS. Master's Student in Dentistry, Faculty of Dentistry, Fluminense Federal University, Rio de Janeiro, Brazil.
b DDS, MSc, PhD. Department of Pediatric Dentistry, Faculty of Dentistry, Fluminense Federal University, Rio de Janeiro, Brazil. c DDS, MSc, PhD. Department of Pediatric Dentistry, Faculty of Dentistry, Fluminense Federal University, Nova Friburgo, Brazil. d DDS, MSc, PhD. Department of Metallurgic and Materials Engineering, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,
Brazil.
e DDS, MSc, PhD. Department of Dental Clinic, Faculty of Dentistry, Fluminense Federal University, Rio de Janeiro, Brazil.
Corresponding author at: Travessa Faria, 28/1406, Niterói, RJ, Brasil CEP 24240-170 - Telefone: +55 21 988647488
E-mail: mila.oborges@gmail.com
Clinical Relevance
The formation of a cariogenic biofilm, as well as the accumulation of sucrose, on the surface of glass ionomer cements results in a change in average
surface roughness and topography of this material.
A
Glass ionomer cements (GIC) are materials widely used in dental practice, due to their anticariogenic and adhesive properties. The aim of this study was to evaluate in
vitro using an atomic force microscopy (AFM), the changes caused by cariogenic
challenge on the surface of a high-viscosity GIC [Ketac Molar Easymix ™ (KM)] and resin modified GIC [Vitremer ™ (VT)] induced. For this, 15 specimens were prepared with standardized dimensions (8.0 mm in diameter and 2.0 mm thick) of each material, that were divided into 03 experimental groups (n = 5), determined in accordance with how it group was storaged: Group DW (distilled water); Group B (BHI supplemented with 2% sucrose and inoculum of strains of S. mutans [ATCC 25175]) and Group S (BHI supplemented with 2% sucrose without inoculum). After kept in immersion for 07 days, and their respective media changed every 24 hours, the surface of the each specimen was evaluated in an atomic force microscope (AFM) from which was determined the average values of surface roughness (Ra). Data were statistically analyzed with the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test (α = 5%). According to the results, for the KM, the largest value of Ra was recorded in group B (p <0.05). For the VT, group S had highest value of Ra (p<0.05), while groups DW and B showed no statistically significant difference. Therefore, the formation of biofilm from S. mutans on the surface of both materials resulted in the increase of Ra and changes in topography of the specimens. To the GIC VitremerTM, the sucrose accumulation also had a significant influence on Ra.
Keywords: atomic force microscopy, glass ionomer cements, surface roughness
I
NTRODUCTIONThere seems to be a consensus in the scientific literature about the participation of Streptococcus mutans in the etiology of dental caries.1,2,3 Such
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participation is probably associated with two important characteristics of these microorganisms: the acidogenicity and aciduricity.1-6
The first characteristic relates to the ability of these microorganisms to metabolize fermentable carbohydrates in our diet (eg.: sucrose) producing acids that decrease the pH of the biofilm. The frequent pH decrease causes an imbalance of Des-Re phenomenon (ie: demineralization - remineralization), causing demineralization events more frequently than remineralization, there by favoring the development of caries lesions.1-4,7
The second characteristic is associated with the aciduric potential of this species. This means that S. mutans are able to survive and reproduce in an acid environment, unlike other non-cariogenic species.1-4
Although it’s currently understood as a disease resultant from the imbalance of Des-Re, induced by bacteria present in biofilms, as is the case for S. mutans, the dental caries has been treated for decades according to a mechanistic model.3,6,8 The little appreciation of the importance of habits modifications related to mechanical control of biofilm and food habits often led to the failure of restorative treatment because of recurrence of the disease known as secondary caries.7,9-11
It is believed that the damage occurs as a result of the accumulation of cariogenic bacteria in the areas where there was chemical dissolving and/or mechanical wear of the restorative material. The presence of roughness on the surface restorations facilitates biofilm accumulation, favoring the development of secondary caries lesions and gingival inflammation and superficial spots.5,7,9,12 Adherence of bacteria in restorative materials is related to several factors such as: the ability of some species to establish electrostatic interactions with the surface of the material; and the properties of the material, particularly the surface roughness caused by restauration wear.4,5,7,10,13
As the occurrence of microdefects on the surface of the material is unavoidable, the use of materials with antimicrobial properties can be interesting in preventing secondary caries. For example, the potential of fluoride release from glass ionomer cements attaches to this material antibacterial properties.5,8,14-16
Glass ionomer cements (GIC) have been noted for its wide use in dentistry, especially in child care, because of important properties, such as the chemical adhesion to enamel and dentin, the low coefficient of thermal expansion and
contraction, releasing fluorides for a long period of time and ability to be recharged with fluoride ion.5,7,8,12
Laboratory studies have demonstrated the ability of glass ionomer cements in reducing enamel demineralization adjacent to the restoration margins.7,15 It is important to consider that the biodegradation process of restorative materials as the CIV is a complex phenomenon in which dissolution and disintegration events are associated with the mechanical wear.7,10,17 Besides the saliva, research has shown the ability of cariogenic challenge to degrade the surface of restorative materials.6,8,9 However, there is still a lack of data available in the literature on the subject, particularly in the case of glass ionomer cements.7,10
In laboratory, parameters such as the average surface roughness (Ra) have been used in studies of the variations caused by chemical and mechanical stress on the surface of the restorative material.12,17,18 Research has highlighted the benefits of using atomic force microscopy (AFM) analysis of surfaces due to the high resolution of the images obtained and the possibility of conducting qualitative and quantitative analysis.18-20 Using the MFA in scientific research in dentistry is increasing gradually, it is possible to reconstruct a sample surface image with a high level of resolution, recording the surface data through a set of values that can be analyzed quantitatively by a digital software, so the microscope provides a picture of the topography, and also record other information and data about the surface of the specimen evaluated.19,20
Therefore, the goal from in vitro study was to evaluate the effects of cariogenic challenge induced by a biofilm consisting of S. mutans on the surface roughness and topography of two CIV, high viscosity (Ketac Molar Easymix™) and resin modified (Vitremer™). Therefore, the null hypothesis tested in this study was that the formation of a biofilm cariogenic does not change the surface roughness (Ra) and surface topography of glass ionomer cements.
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M
ETHODS
&
M
ATERIALS
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Two glass ionomer cements (GIC) were evaluated: A fast setting (Ketac Molar EasymixTM, 3M, ESPE, Sumaré, SP, Brazil), and a modified resin (VitremerTM, 3M, ESPE, Sumaré, SP, Brazil). The chemical composition, powder/liquid ratio and manipulating according to the manufacturer’s recommendations are described in Table 1 (annex 1).
Preparation of the specimens
The specimens were made at room temperature (≈27ºC), respecting the powder-liquid ratio and handled in accordance with the manufacturer's instructions. For each cement were prepared 15 specimens of proof. The same were formed from a rubber matrix (Odeme Dental Research, Lucerne, SC, Brazil) average stiffness, with cylindrical shape and standard dimensions of 8 mm diameter and 2 mm in height.
Cements were manipulated and mixed on glass plate with metal spatula No. 24F (SS White Duflex, Rio de Janeiro, RJ, Brazil) and inserted into the array using Centrix™ System (DFL, Rio de Janeiro, RJ, Brazil), with tip LV™ previous AccuDose (DFL, Rio de Janeiro, RJ, Brazil). A polyester strip (TDV, Pomerode, SC, Brazil) and a glass plate were used to press the surface of the samples until the end of the setting reaction in the case of quick-setting CIV (i.e. Ketac Molar Easymix™). The specimens were removed from the molds after 15 minutes, protected from loss/incorporation of water by covering with petroleum jelly (Hemafarma, Sao Goncalo, RJ, Brazil) and kept immersed in cell plates of distilled water for 07 days, at temperature of about 27ºC. The water was changed every 24 hours.
For the GIC resin modified (i.e. Vitremer™), all procedures were similar, except that the cement, after pressed with the set strip of polyester-plate glass was light cured with a halogenlight unit (GNATUS Equipment medical-Dental LTDA., RibeirãoPreto, SP, Brazil) for 40 seconds.
Similarly to the quick-setting cement, the specimens were removed from the molds after 15 minutes, and its surface protected by the application of photopolymerizable resin (or gloss finishing) specific product (Vitremer™, 3M ESPE, Sumaré, SP, Brazil). These samples were also kept immersed in cell plates with distilled water for 07 days at an approximate temperature of 27ºC. The water was changed every 24 hours.
Division of Experimental Groups
The 15 specimens of each cement were divided into 03 experimental groups (n = 05) related to the environment in which they were stored during the experiment. Groups were identified as follows:
Group DW (n = 5) Distilled water for 07 days.
Group B (n = 5): BHI broth supplemented with 2% sucrose inoculated with strains (ATCC 25175) of S. mutans. The specimens in this group were therefore submitted to cariogenic challenge.
Group S (n = 5): BHI broth supplemented with 2% sucrose without bacterial inoculum.
Preparation of bacterial inoculum
The bacterial inoculum consisted of strains of S. mutans (ATCC 25175). The bacteria were plated on agar BHI (Brain Heart Infusion) and incubated in microaerophilic conditions at 37°C for 48h. Then, the colonies were transferred to test tubes containing BHI broth supplemented with 2% sucrose in order to obtain the bacterial growth with turbidity corresponding to the amount in the range of 0.5 McFarland. The optical density was evaluated using a spectrophotometer (Beckman Coulter DU® 530, LifeScience, UV / Vis Spectrophotometer, San Diego, CA, USA). Finally, 1.0ml of the bacterial suspension was added to each well of the culture plate.
Biofilm formation by S. mutans
The specimens were placed individually into wells of culture plates sterilized with ethylene oxide. Then, 1.0 mL of bacterial suspension previously adjusted was added to each well in group B. For groups DW and S were used, respectively,
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distilled water and BHI media supplemented with 2% sucrose, both without the presence of microrganisms with the same volume of 1.0mL.
The plates were incubated in an incubator (≈37° C) for 07 days in microaerophilic conditions. During this period, storage solutions were changed every 24 hours.
Analysis of topography and roughness in the atomic force microscope (AFM)
In order to standardize the readings of these parameters, only one of the surfaces of the specimens was selected. The surface regarded as not selected received an appointment as a slot, using the tip of a explorer # 5 in order to dispose of it for the same analysis.
Before the analysis, this Vaseline on the sample surface was removed with a fine brush (KG Sorensen, Cotia, SP, Brazil) dampened with alcohol, and then were subjected to a cleaning with distilled water with the aid of an ultrasound device (QUIMIS®, Diadema, SP, Brazil) in the second 30min cycles.
The analysis of the surface of specimens was carried out in an atomic force microscope WITec (WITec Instruments Corp., Knoxville, Tennessee, USA) operated in the non-contact manner in environmental conditions, relative humidity between 45 and 55%. RTESP tip was used (Bruker AFM Probes, Camarillo, CA, USA), with constant strength 20-80 N/m, resonance frequency of 328-388 kHz. In each specimen was taken 10 pictures 10μm x 10μm at different locations of the sample. In each image, we calculated the value of roughness Ra, with the aid of Gwyddion-2.41 program. Through this program, it was obtained 3D Images of the sample surface, enabling a qualitative analysis of the topography images and compared with the quantitative data obtained.
Statistical analysis
There were two analyzes in this research: qualitative, from which were observed topographical features of the surface of the specimens and quantitative, through which was measured average roughness (Ra).
Data were tabulated and submitted to statistical analysis using the One-Sample Kolmoforov-Smirnov test (verification of the data distribution pattern); Krukal-Wallis and Mann-Whitney at a significance level of 5%. Statistical analysis was performed with SPSS software (version 15.0).
R
ESULTS
The Ra values found for the different groups tested for each material are shown in Table 2.
Regarding the Ketac Molar Easymix™, it was revealed that the Ra values obtained for group B were higher than those recorded for groups DW and S, with a statistically significant difference (p <0.05). In topographical analysis, it can be seen that the samples of groups B and S were changed to the surface when compared to group DW. Group S shows a more discrete changes, which may be assumed that there was a partial wear of the surface with excavations moderate; while group B suggests a more intense surface wear (Fig. 1).
In the Vitremer™, body-specimens group S had the highest value of Ra, and the topographic analysis can observe the areas with and without gloss, while in group B it is observed a complete removal of the gloss. Groups DW and B show similar values of Ra, but have a completely different topography (Fig. 2). The differences between groups DW and S, and between groups B and S, were statistically significant (p<0.05).
D
ISCUSSION
Studies have shown that the surface roughness of restorations favors the biofilm accumulation, which may cause gingival inflammation, superficial pigmentation and secondary caries.9,18,22 A number of physical and chemical origin factors have been shown capable of altering the surface of restorative materials in the oral cavity.6,10,12,17,18,22-25
The present study after the formation of biofilm on the surface of two kinds of GIC, indicated changes in the surface roughness and topography of both materials.
24
Quantitative analysis of KetacMolarTM (KM) indicated a statistically significant difference in roughness among their groups. Between groups DW and B, a significant increase was observed in the amount of Ra that can be related to the metabolism of sucrose in BHI by S. mutans. The same was observed in the topographic images obtained with AFM, with larger areas of the surface of the excavation group B samples. Therefore, it can be said that the BHI broth supplemented with 2% sucrose and S. mutans negatively modified the properties evaluated in this material.
In the quantitative analysis of VitremerTM (VT), the highest value of R a was found for the S group, while the DW and B groups did not show a statistically significant difference, which can be justified by qualitative analysis of the images of topography of this material. The DW group, you can observe the presence of the superficial covering with gloss, specific to the product, while in group B there was a complete wear this cover, so the DW and B groups have similar values of Ra, but have topographical images completely different. About the S group, it had the highest value of Ra, being justified by their topographic image, because it presents areas with and without gloss on the sample surface, creating a more uneven surface. Therefore, in this study, the surface of VT has changed either by formation of a biofilm as the cariogenic sucrose accumulation.
Different results found in literature can be explained by different methods and analysis applied in each study, as some authors19,20 claim that analyzes using SEM not show similar results when compared to the AFM.
Fúcio et al23 analyzed the roughness and topography by scanning electron microscopy (SEM) of some dental materials, including VitremerTM (VT) and Ketac Molar EasymixTM (KM), where VT and KM specimens showed a roughness of the top surface in the group receiving bacterial inoculum S. mutans after 30 days, compared with the group that was stored in BHI broth with 1% sucrose, partially being in accordance with this study, where a similar result was found only in the KM, because with VT, the largest value of Ra was found in the S group, which can be explained through of the topography of these sample images, where Group S can observe areas with and without finishing gloss while Group B had areas with complete removal of this coverage.
Regarding of KM, other study have also noted an increased roughness in the group with bacterial inoculum23, which is in accordance with this study because when
group S and group B values of this material were compared, it was found that the values Ra increased to group B.
Regarding the use of MFA, this microscope can be used without a prior surface preparation and, if necessary, can prevent the contact of the tip with the sample.19 Regarding the SEM, the data can not be analyzed quantitatively, because only images are obtained through an electron beam that can have its sharp energy and orientation changed and providing information from deeper layers of surface modifying the details of the image and making the results extremely subjective.20
The AFM does not have this disadvantage, since the probe tip is always perpendicular to the surface of the sample, and thus, are being increasingly used in order to resolve these deficiencies in the SEM.20
The data obtained by atomic force microscopy were analyzed as much quantitatively, through the Ra values found on the surface of materials, as qualitatively, through the topographical images provided by Gwyddion program. Therefore, the comparison between both analyzes showed great importance to understanding the results as similar groups Ra values show different images, with specific wear characteristics.
The use of this type of microscopy is interesting for clinical practice because it allows the identification of important changes on the surface of glass ionomer materials, since these materials are especially suitable for patients with high risk / activity to decay. Therefore, these restorations are in contact with the biofilm formation of cariogenic, and possibly with a diet rich in fermentable carbohydrates (eg.: sucrose).
Further studies should be conducted to compare wider variety of brands of GICs, to obtain more reliable parameters in the relationship between their properties after bacterial adhesion and biofilm formation, assisting in the indication of use of this material for patients at high risk caries, which can be assumed to occur most sucrose intake in the diet and high concentration S. mutans in the oral cavity.
C
ONCLUSION
In conclusion, the accumulation of biofilm formed from S. mutans on the surface of KM and VT, and accumulation of sucrose, caused adverse changes in
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roughness and topography of these materials. In this way, these results allow professionals a previous clinical reflection in order to predict the performance of these materials to indicate it as a restorative material in a medium with activity / risk of decay.
R
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ANNEX 1 Table 1 - Dental restorative materials used in this study.
Table 2 - Quantitative analysis of roughness (nm) of the CIV Ketac Molar EasymixTM and VitremerTM
MATERIAL GROUP AVERAGE STANDARD
DEVIATION
MEDIAN* MINIMUM MAXIMUM
Ketac MolarTM DW 99,97 40,37 93,00B 57,10 244,00 B 327,40 193,73 268,00C 63,00 735,00 S 89,02 44,24 88,20A 22,00 228,00 VitremerTM DW 36,90 16,20 29,70 a 13,60 74,20 B 35,20 15,20 34,80a 13,80 73,80 S 74,10 51,70 60,00b 11,60 178,00
* Statistical analysis column. Different letters in the median indicate statistically significant values (Mann-Whitney, p>0.05).
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Fig. 1: Images of the body-of-proof surface topography of CIV Ketac Molar EasymixTM obtained in the AFM. A and B: Group DW; C and D: Group B; E and F: Group S.
Fig. 2:
Images of body-of-proof surface topography of the CIV VitremerTM obtained in the AFM. A and B: Group DW; C and D: Group B; E and F: Group S.
4 - CONCLUSÕES
Concluindo, foi possível observar que o acúmulo de biofilme formado a partir de S. mutans na superfície de ambos os materiais resultou em maior rugosidade e
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alterações na topografia dos espécimes. Portanto, pode-se supor que tais características deste material são diretamente afetadas pelo meio de cultura ácido, e estes resultados podem ser úteis para prever o desempenho de materiais ionoméricos sob condições clínicas.
