Rev. ínst. Med. trop. São Paulo
31 {2): 100-102, março-abril, 1989
UTILIDAD DE L A S MUESTRAS DE S A N G R E TOTAL DESECADA EN PAPEL DE FILTRO EN LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTITOXOPLASMA
J o a q u i m G A S C O N ( 1 ) , J o s e p M . T O R R E S - R O D R I G U E Z (2) & C a r m e n G O N Z A L E Z (2)
R E S U M E N
S e c o m p a r a l a t é c n i c a de A g l u t i n a c i ó n D i r e c t a ( A D ) u t i l i z a n d o m u e s t r a s de sangre total desecada en p a p e l de filtro, con l a técnica de E L I S A y la m i s m a A D utilizando muestras de suero de los mismos pacientes, p a r a l a detección de anti-cuerpos a n t i t o x o p l a s m a .
L o s resultados muestran la validez del método de l a sangre desecada en papel de filtro p a r a l a detección de anticuerpos a n t i t o x o p l a s m a con l a técnica de A D , y se considera s u u t i l i d a d en los estúdios epidemiológicos de c a m p o .
U N I T E R M O S : T o x o p l a s m o s i s ; R e a c c i ó n de A g l u t i n a c i ó n directa; S a n g r e total en p a p e l de filtro.
I N T R O D U C C I O N E l estúdio de l a prevalência de los
anticuer-pos a n t i t o x o p l a s m a en muestras representati-vas de u n a problación constituye u n requisito indispensable p a r a reconocer la extension de l a toxoplasmosis en l a c o m u n i d a d .
D i v e r s o s autores h a n demostrado l a utili-dad dei método de l a sangre desecada en papel de filtro p a r a l a detección de anticuerpos en en-fermedades como el p a l u d i s m o2, l a h e p a t i t i s1 0,
o l a t r i p a n o s o m i a s i s8 y h a n evidenciado Ias
ven-tajas de este método que no requiere personal especializado ni utillaje sofisticado y facilita ade-m á s los envios de Ias ade-muestras h a s t a los centros de procesamiento de Ias m i s m a s .
E n nuestro estúdio hemos e n s a y a d o e s t a técnica, a p l i c a d a a l a detección de anticuerpos
a n t i t o x o p l a s m a mediante la reacción de A g l u t i -nación D i r e c t a ( A D ) . E s t a técnica h a sido
utili-z a d a por otros autores4 5 demostrando que
tie-ne u n a alta sensibilidad y especificidad. S e h a c o m p a r a d o con los r e s u l t a d o s o b t e n i d o s c o n sueros de los m i s m o s pacientes con l a técnica
de A D5 y l a E L I S A1 técnica esta ú l t i m a que se
h a tomado como patrón de referencia. M A T E R I A L Y M É T O D O S
S e h a n estudiado muestras de suero y sangre total desecada en p a p e l de filtro de 32 personas, escogidas al azar, provenientes dei dispensario dei H o s p i t a l dei Mar (Barcelona), a los que se h a b i a pedido l a detección de anticuerpos antito-x o p l a s m a ante l a sospecha de enfermedad o s i m plemente como ' ' s c r e e n i n g " en e m b a r a z a d a s .
(1) H ó p i t a l N e m b a , R w a n d a .
(2) S e r v e i M i c r o b i o l o g i a C l í n i c a , H o s p i t a l d e i M a r , B a r c e l o n a , E s p a ñ a .
D i r e c c i ó n p a r a l a c o r r e s p o n d ê n c i a : D r . J o s e p M . T o r r e s - R o d r í g u e z . S e r v e i M i c r o b i o l o g i a C l í n i c a — H o s p i t a l del M a r . P a s s e i g M a r i t i m , 2 5 - 2 7 . 0 8 0 0 3 B a r c e l o n a , E s p a ñ a .
G A S C O N , J . ; T O R R E S R O D R I G U E Z , J . M . & G O N Z A L E Z , C . — U t i l i d a d d e l a s m u e s t r a s d e s a n g r e t o t a l d e s e c a d a e n p a p e l d e f i l t r o e n l a d e t e c c i ó n d e a n t i c u e r p o s a n t i t o x o p l a s m a . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S ã o P a u l o , 31 ( 2 ) : 100 1 0 2 , 1 9 8 9 .
L a s muestras se obtuvieron por punción ve-nosa. D e c a d a paciente se separaron tres gotas de sangre que se depositaron en papel de filtro. C a d a gota de sangre o c u p a b a un área de 15mm. de diâmetro. L o s papeles de filtro se dejaron se car a la temperatura ambiente y luego g u a r d a -dos a 4 C hasta el momento de su utilización. E l resto de l a sangre se centrifugo p a r a l a obten-ción de suero que se guardo a - 2 0 C h a s t a el momento de ser procesadas.
P a r a l a elución de los papeles de filtro se empleó 0,5 m l de tampón fosfato ( P B S ) durante 24 horas a 4 C .
P a r a l a técnica de A D se utilizaron los kits de T o x o - s c r e e n D A (Biomérieux, L y o n4) . D e c a
-da muestra se emplearon dos diluciones en P B S , a 1/20 y 1/80, que después dei proceso seguido con l a t é c n i c a se encontraron a diluciones de 1/40 y 1/160 respectivamente. E l título de 1/40 es el valor discriminativo entre u n a reacción po sitiva y u n a de negativa.
L a lectura se hace a Ias cinco horas después de la dilución de la sangre o suero problema tra-tados con el 2-mercaptoetanol (2-ME) y l a sus-pension de antigeno, dejando reposar los po-cillos a l a temperatura ambiente, al resguardo de l a desecación y Ias vibraciones.
L a lectura, que es m a c r o s c ó p i c a , puede repe tirse a Ias 18 horas siendo esta m u y fácil: reac-ción positiva cuando l a aglutinareac-ción de los toxo-plasmas en forma de velo t a p i z a como m i n i m o la m i t a d del fondo dei pocillo, pudiendo estar retraido en los bordes; reacción n e g a t i v a cuando los t o x o p l a s m a s sedimentan en botón o anillo.
Como técnica de referencia se empleó u n en-z i m a immuno-ensayo en fase sólida, determinan-do I g G contra T o x o p l a s m a gondii ( L a b s y s t e m s ,
H e l s i n k i1) . Conforme con los fabricantes, un v a
lor de 10 U I (equivalentes a 1.0 de densidad opti-ca) o superior se consideran positivos.
R E S U L T A D O S
Mediante el test de E L I S A , 17 de los sueros dieron resultado positivo y 15 negativo.
C o n la técnica de A D , los resultados fueron 16 positivos y 16 negativos tanto en las muestras
de sangre total desecada en papel de filtro como en las muestras de suero. E x c e p t o en u n a pacien-te que dió positivo en el pacien-test de E L I S A (valor de 21 U I ) y negativo en los tests de A D , la concor d a n c i a de resultados fue total en el resto de las muestras.
S e observaron dos fenômenos de prozona en dos muestras en las que se utilizo suero con la técnica de A D (negativo a 1/40 y positivo a 1/160). E n ambos casos los resultados fueron positivos con las muestras de sangre total desecada, sin que se observara el fenômeno de prozona.
T o m a n d o como técnica de referencia el test de E L I S A , l a sensibilidad dei método fue dei 94% y l a especificidad dei 100%. A l observar los resul tados con l a técnica de E L I S A entre los sueros positivos, se encontraron diferentes grados de reactividad (tabla 1). A l comparar Ias tres técni-cas entre s i , los resultados obtenidos no mues tran diferencias estadisticamente significativas
( X2 - 0.08). T A B L A 1 R e a c t i v i d a d d e I a s m u e s t r a s e n e l t e s t de E L I S A . < 10 10 15 U I 16-20 21 25 26 30 31 35 n s u e r o s 15 2 5 2 6 2 U I : U n i d a d e s I n t e r n a c i o n a l e s . D I S C U S I O N
L a técnica de A D , fue descrita por F U L T O N
& T U R K6 y a m p l i a d a por los trabajos de C O U
-Z I N E A U & B A U F I N E - D U C R O Q4 y D E S
-M O N T S5, que incluyeron en ella el 2-ME y un
antigeno de mayor c a l i d a d que mejoraban tanto la sensibilidad como la especificidad.
E n nuestro estúdio no hubo diferencias entre los resultados de Ias muestras de sangre y pias m a procesados por A D , y tomando como técnica de referencia el test de E L I S A , la especificidad y la sensibilidad fueron similares a Ias de esta última.
L a técnica de A D h a sido y a e v a l u a d a como técnica de " s c r e e n i n g " en estúdios epidemioló
ros. Otros autores h a n valorado la utilidad de la sangre total desecada en papel de filtro con
técnicas d i s t i n t a s de l a A D3 9. L o s resultados
obtenidos en este estúdio muestran que la técni-ca de desetécni-cación de sangre total en papel de filtro es útil para la obtención de muestras váli-das para su procesamiento con l a técnica de A D .
L a posibilidad de obtener la sangre a través de u n a simple p u n c i ó n d i g i t a l2 facilita aún m a s
la obtención de muestras en estúdios epidemio-lógicos de masas.
O t r a ventaja p a r a detectar anticuerpos I g G , es que en l a sangre desecada, se h a descrito l a
desnaturalización de las I g M7 lo que favoreceria
la acción dei 2-ME de l a A D , en el aumento de especificidad de la prueba.
L o s fenômenos de prozona h a n sido descri
tos con esta t é c n i c a5. E n estúdios epidemioló
gicos este fenômeno pierde s u i m p o r t â n c i a , aun-que si se quiere u n a b u e n a precision, pueden procesarse dos diluciones de u n a m i s m a mues-tra.
E n conclusion, l a técnica de la gota de san-gre desecada en papel de filtro y procesada me-diante l a técnica de A D , que es de u n a gran sen cillez y fácil lectura, puede ser de gran u t i l i d a d p a r a los estúdios epidemiológicos sobre la preva-lência de la toxoplasmosis, así como en estúdios en pequenos animales.
S U M M A R Y
Usefulness of dry blood samples on filter paper in the detection of a n t i t o x o p l a s m a antibodies.
D i r e c t A g g l u t i n a t i o n ( D A ) techniques, both, using dry blood samples in filter paper and se-rum samples, were compared with the E L I S A test in order to detect antibodies a g a i n s t T o x o
-p l a s m a gondii.
T h e results show the validity of the dry blood samples in filter paper for detecting antitoxo¬ p l a s m a antibodies with a D A test. O u r results would confirm their usefulness in field epidemio logical surveys. R E F E R E N C I A S 1. B A L F O U R . A . H . & H A R F O R D . J . P. — D e t e c t i o n of s p e ¬ c i f i c I g G a n d I g M a n t i b o d i e s to T o x o p l a s m a g o n d i i w i t h a c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e e n z y m e i m m u n o a s s a y k i t s y s t e m . J . c l i n . P a t h . , 38: 6 7 9 - 6 8 9 , 1985. 2. B R U C E C H W A T T , L . J . — D i a g n o s t i c m e t h o d s i n m a l a r i a . I n : B R U C E C H W A T T , L . J . — E s s e n t i a l m a l a r i o l o g y . 2 n d e d . L o n d o n , H e i n e m a n n , 1985. p. 101 126. 3. C O U T I N H O , S . G . — A p l i c a ç ã o d a t é c n i c a d e c o l e t a de s a n g u e t o t a l e m d i s c o d e p a p e l p a r a o d i a g n ó s t i c o d a t o x o p l a s m o s e p e l a s r e a ç õ e s d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a e S a b i n - F e l d m a n . R e v . S o c . b r a s . M e d . t r o p . , 4 ( s u p l . ) : 21-22, 1970. 4. C O U Z I N E A U , P . & B A U F I N E D U C R O Q . H . — A g g l u t i n a t i o n d i r e c t e d e s t o x o p l a s m e s . P r e p a r a t i o n d e l ' a n t i g è n e et e x a m e n d e 400 s é r u m s . A n n . B i o l , c l i n . , 28: 4 1 1 - 4 1 5 , 1970. 5. D E S M O N T S , G . —- D é p i s t a g e d e l a t o x o p l a s m o s e p a r ag¬ g l u t i n a t i o n d e s p a r a s i t e s . I n t è r ê t d ' u n a n t i g è n e t r ê s s e n s i ¬ b l e p o u r l a r e c h e r c h e d e s i m m u n o g l o b u l i n e s G s p é c i f i ¬ q u e s . A n n . B i o l , c l i n . , 4 1 : 139-143, 1983. 6. F U L T O N , J . D . & T U R K . J . L . — D i r e c t a g g l u t i n a t i o n for T o x o p l a s m a g o n d i i . L a n c e t , 2: 1068-1069, 1959. 7. S E R O L O G I C A L t e s t i n g i n m a l a r i a . B u l l . W l d . H l t h . O r g . , 50: 5 2 7 - 5 3 5 , 1974. 8. S O U Z A . S . L . & C A M A R G O . M. E . — T h e u s e o f f i l t e r p a p e r b l o o d s m e a r s i n a p r a c t i c a l f l u o r e s c e n t t e s t for A m e ¬ r i c a n T r y p a n o s o m i a s i s s e r o d i a g n o s i s . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u l o , 8: 255-258. 1966. 9. W A L L A C E , G . D . — S a b i n F e l d m a n d y e t e s t for t o x o p l a s m o s i s . T h e u s e o f s o d i u m c i t r a t e i n a c c e s s o r y f a c t o r a n d a m e t h o d for c o l l e c t i n g a n d s t o r i n g b l o o d o n p a p e r d i s c . A m e r . J . t r o p . M e d . H y g . , 18: 395-398. 1969. 10. Z H U A N G , H . ; C O U L E P I S , A . G . ; L O C A R N I N I , S . A . & G U S T , I . D . — D e t e c t i o n of m a r k e r s of h e p a t i t i s B i n f e c ¬ t i o n i n s e r u m d r i e d o n to f i l t e r p a p e r : a n a p p l i c a t i o n to f i e l d s t u d i e s . B u l l . W l d . H l t h . O r g . , 60: 7 8 3 - 7 8 7 , 1982. R e c e b i d o p a r a p u b l i c a ç ã o e m 3 0 / 8 / 1 9 8 8
