Robson Cavalcanti Ferreira
DIVERSIDADE E FILOGENIA DE
TRIPANOSSOMAS DE ANUROS
Tese apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Robson Cavalcanti Ferreira
DIVERSIDADE E FILOGENIA DE
TRIPANOSSOMAS DE ANUROS
Tese apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Área de concentração:
Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro
Orientadora:
Prof. Dra. Marta Maria Geraldes Teixeira
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
Candidato: Robson Cavalcanti Ferreira.
Tese: Diversidade e Filogenia de Tripanossomas de Anuros.
Orientadora: Marta Maria Geraldes Teixeira.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a .../.../..., considerou
( ) Aprovado ( ) Reprovado
Examinador (a) Assinatura ... Nome ... Instituição ...
Examinador (a) Assinatura ... Nome ... Instituição ...
Examinador (a) Assinatura ... Nome ... Instituição ...
Examinador (a) Assinatura ... Nome ... Instituição ...
À Profa. Dra. Marta Maria Geraldes Teixeira, por confiar este trabalho a mim, pela orientação, ensinamentos e exemplos de profissionalismo.
Ao Prof. Dr Erney Camargo pelas valiosas contribuições a este trabalho.
À Profa. Dra. Gentilda Takeda, pelos ensinamentos e pela colaboração nos estudos morfológicos deste trabalho.
À Marta Campaner, pelo trabalho indispensável no isolamento e manutenção dos parasitas utilizados neste estudo e pelos valorosos ensinamentos.
À Carmen Takata, pelos ensinamentos, dedicação e colaboração em todos os trabalhos.
Ao Prof. Dr. Miguel Trefaut Rodrigues, pela colaboração na identificação dos anuros.
À Profa. Dra. Sandra Favorito, pela colaboração na coleta dos anuros.
Ao Prof. Dr. Fernando Paiva (UFMS), pela colaboração nas coletas do Pantanal.
Ao Prof. Dr. Carlos Jared, pela inestimável contribuição em disponibilizar seu laboratório e sua coleção de anuros para este trabalho.
Ao Laerte Viola, pelos isolados do Guaporé, pela colaboração nas coletas e pelo companheirismo durante todos esses anos no laboratório.
Ao Arlei Marcili, pela colaboração nas coletas e pelo companheirismo durante todos esses anos no laboratório.
Ao Prof. Dr. Toby Barrett e ao Prof. Dr. Jeffrey Shaw, pela colaboração com culturas de tripanossomas de flebotomíneos.
Ao Prof. Dr. Luis da Neves, pela contribuição em disponibilizar amostras de anuros Africanos.
Ao pessoal do laboratório, Manzélio, Márcia, Adriana Fuzato, Adriana Martins, Flávia, Heracles, Luciana e Paola pelo companheirismo durante todos esses anos no laboratório.
“Mande um barco que transporte a
mim, a meus filhos e a meus
livros.” Hergedef, filho de Queóps
II – 4ª dinastia (2613 a.C. a 2494
Ferreira, R. C. Diversidade e filogenia de tripanossomas de anuros (Tese). São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2007.
Anfíbios da ordem Anura há muito tempo são conhecidos, em todo o mundo, como portadores
de tripanossomas transmitidos por sanguessugas e insetos (mosquitos e flebotomíneos). Esses
tripanossomas têm sido classificados de acordo com a morfologia das formas sanguíneas, hospedeiro
de origem, origem geográfica e experimentos de infecções cruzadas. Contudo, esses parâmetros
tradicionais são insuficientes para a classificação dos tripanossomas de anuros e não há consenso
sobre quais espécies são válidas. Até esse trabalho, os estudos desses tripanossomas se restringiam a
apenas seis espécies, nenhuma da América do Sul. Assim, as relações parasita-hospedeiro e o
relacionamento filogenético entre tripanossomas de anuros são pouco compreendidos, com
controvérsias quanto à monofilia desse grupo, e ausência de parâmetros taxonômicos eficientes. Novos
estudos precisam ser realizados comparando uma grande coleção de isolados de anuros, de espécies
e origens geográficas distintas, assim como isolados de vetores, que vivem em diferentes ecótopos e
nichos. A fim de avaliar a diversidade de tripanossomas de anuros e entender melhor sua filogenia,
assim como rever e definir parâmetros taxonômicos, capturamos anuros de várias espécies dos
seguintes biomas brasileiros: Amazônia, Floresta Atlântica e Pantanal. Avaliamos a prevalência geral
de infecções por tripanossomas nos anuros desses biomas, isolamos e cultivamos tripanossomas,
comparamos suas características morfologias e moleculares e inferimos relacionamentos filogenéticos
entre os isolados. A prevalência de tripanossomas no sangue dos anuros foi alta (45%). As famílias
Leptodactylidae, Hylidae, Leiuperidae e Bufonidae tiveram índices de infecção decrescentes, variando
de 81% a 28%. Os anuros brasileiros apresentaram uma grande variedade de tripanossomas no
sangue, com pelo menos 11 morfotipos e significativo pleomorfismo das formas de cultura. Análises
moleculares revelaram que a mesma espécie de anuro pode ser infectada por tripanossomas distintos,
e que uma mesma espécie de tripanossoma pode infectar espécies mais de uma espécie de anuro,
confirmando que a taxonomia tradicional não é suficiente para avaliar a diversidade e classificar os
tripanossomas de anuros. Os resultados mostraram uma grande diversidade molecular entre os 82
isolados brasileiros avaliados por polimorfismo de ITS rDNA, revelando 11 grupos principais (A-K), que
compreendem 29 genótipos. A análise de 7 novos isolados de anuros africanos também revelou
significativo polimorfismo e quatro genótipos.
Os relacionamentos filogenéticos entre tripanossomas de anuros do Brasil, África, Europa e
tripanossomas de anuros próximos de tripanossomas de peixes, formando o clado Aquático. Apesar da
monofilia, o clado formado por tripanossomas de anuros é bastante complexo, com várias linhagens
filogenéticas. Os padrões de ramificação das árvores filogenéticas revelaram 5 clados principais
(linhagens) de isolados (An01-An05) que podem ser associados com padrões biogeográficos e
filogeográficos dos hospedeiros. Os isolados brasileiros foram distribuídos em 4 clados (An01, 02, 03,
05) enquanto os de anuros exóticos constituíram o clado AN04. A única exceção foi o clado An05,
composto por isolados do Brasil e E.U.A. Os clados An01 e An02 compreendem exclusivamente
isolados brasileiros, aparentemente, associados com hilídeos e bufonídeos, respectivamente. O clado
An03 representou uma linhagem contendo isolados de anuros e de flebotomíneos, indicando
flebotomíneos como hospedeiros e potenciais vetores de tripanossomas de anuros terrestres.
Os resultados desse estudo revelaram considerável grau de concordância entre filogenia,
biogeografia e filogeografia dos anuros com as linhagens de tripanossomas, sugerindo uma longa e
contínua associação desses parasitas com seus hospdeiros vertebrados e um padrão de codivergência
parasita-hospedeiro. Contudo, incongruências demonstraram que os anuros e seus tripanossomas
compartilham com seus vetores uma história evolutiva complexa, com uma estrutura geral
biogeográfica e ecológica. As análises sugerem várias trocas de hospedeiro (host-switching),
provavelmente mediadas por vetores, e com eventos de adaptação biológica (host fiiting) de alguns
tripanossomas a diferentes espécies de anuros, proximamente relacionados. Todos esses processos
evolutivos parecem ter desempenhado um papel importante na evolução dos tripanossomas de anuros.
Ferreira, R. C. Diversity and phylogeny of anuran trypanosomes (Thesis). São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2007.
Amphibians belonging to the orders Anura (frogs and toads) have long been known to be
infected with trypanosomes worldwide, infecting frogs and toads and transmitted by leeches and insects
(mosquitoes and sand flies. Anuran trypanosomes have been classified according to the morphology of
blood trypanosomes, host and geographical origin, and cross-infection experiments. However, this
traditional approach is insufficient for identification and classification of anuran trypanosomes and no
consensus currently exists as to which species are valid. However, so far studies of anuran
trypanosomes have included only six species. No surveys were carried out in South America and
isolates from this region were never characterized. Thus, host-parasite and phylogenetic relationships of
anuran trypanosomes remain far from understood, and a reliable taxonomy of these organisms is still
badly needed. Dealing properly with these questions requires comparative analysis of a large number of
trypanosomes from anuran of distinct species and geographical origins.
Aiming to assess the diversity of anuran trypanosomes and better understand their phylogeny
as well as to evaluate their current taxonomy, we captured anuran of various frog and toad species from
distinct Brazilian biomes (Amazonia, Atlantic Forest and Pantanal). We evaluated overall prevalence of
anuran trypanosome infection in these biomes, isolated trypanosomes in cultures, compared their
morphological and molecular characteristics and inferred their phylogenetic relationships. The
prevalence of blood trypanosomes in anurans was high (45%). The families Leptodactylidae, Hylidae,
Leuperidae and Bufonidae had decreasing infection indices ranging from 81% to 28%. Brazilian anurans
showed a large variety of bloodstream trypanosomes showing at least 11 distinct morphotypes, and
significant pleomorphism of cultured flagellates. Molecular analysis revealed that the same anuran
species could be infected by distinct trypanosomes and that the same species could infect distinct
anuran species, confirming that the traditional taxonomy is not sufficient to properly address the genetic
diversity of anuran trypanosomes. Results showed high molecular diversity among the 82 Brazilian
isolates evaluated by polymorphisms of ITS rDNA, disclosing 11 major groups (A-K) comprising 29
genotypes. Analysis of 7 new isolates from African anurans also disclosed marked polymorphism and 4
genotypes.
Phylogenetic relationships among anuran trypanosomes, from Brazil, Africa, Europe and North
America, inferred in this study based on separated or combined analysis of sequences from SSUrDNA,
clade formed by anuran trypanosomes is undoubtedly a complex taxon comprising distinct phylogenetic
lineages. Overall, the branching pattern of phylogenetic trees disclosed 5 major clades (lineages) of
anuran isolates (An01-An05) separated each other by significant genetic distances, which appear to be
associated with host phylogeny, biogeographic and phylogeographic patterns. Brazilian trypanosomes
were distributed in 4 clades (An-01, 02, 03, 05) whereas trypanosomes from exotic anurans composed
the clade An04. Exception was clade An05, which comprises isolates from Brazil and one isolate from
USA. Clades An01 and An02 were constituted exclusively by Brazilian isolates and could be primarily
associated to hylids or bufonids, respectively. Clade An03 represented a lineage containing anuran and
sand fly isolates, pointing to phlebotomines as hosts and potential vectors of trypanosomes among
terrestrial toads and frogs.
Overall, data from this study revealed a considerable degree of concordance between the
phylogeny, biogeography and phylogeography of anurans and lineages of trypanosomes, suggesting
long and continuous association of these parasites and some patterns of host-parasite codivergence.
However, closer examination disclosed incongruences between lineages of parasites and anuran
phylogenies, demonstrating that anuran and their trypanosomes share with their vectors a complex
evolutionary history, with several events of host-switching, probably mediated by vectors, and biological
adaptation of some trypanosome lineages to closely related hosts (host fitting) within an overall
biogeographic and ecologic framework. All these evolutionary processes appear to have played
important role in the evolution of the anuran trypanosomes.
BAB Blood Agar Base
DNA Ácido desoxiribonucleico
dTTP Desoxitimidina-trifosfato
EDTA Ácido etileno diamino tetracético
Kb Quilobase
LIT Liver Infusion Tryptose
MH Microhematócrito
HE Hemocultura
ml mililitros
mM milimolar
Nº Número
PBS Salina em tampão fosfato
SFB Soro fetal bovino
UV Luz ultravioleta
1 INTRODUÇÃO...17
1.1 O gênero Trypanosoma...18
1.2 Taxonomia dos tripanossomas ...20
1.3 Evolução e filogenia dos tripanossomatídeos ...22
1.4 Tripanossomas de anuros...26
1.4.1 Morfologia ...27
1.4.2 Hospedeiros vertebrados e distribuição geográfica ...31
1.4.3 Ciclo Biológico ...32
1.4.3.1 Desenvolvimento no hospedeiro vertebrado...32
1.4.3.1.1 Patogenia...34
1.4.3.2 Hospedeiros invertebrados ...34
1.4.3.2.1 Sanguessugas ...34
1.4.3.2.2 Insetos hematófagos...36
1.4.4 Filogenia dos tripanossomas de anuros...39
1.5 Parâmetros taxonômicos e métodos utilizados na classificação e caracterização de tripanossomas de anuros...41
1.5.1 Morfologia ...41
1.5.2 Hospedeiro e origem geográfica ...42
1.5.3 Características biológicas ...42
1.5.4 Zimodemas (padrões de isoenzimas) ...43
1.5.5 Métodos baseados em análises de ácidos nucléicos...43
1.5.5.1 Seqüências do gene ribossômico ...43
1.5.5.2 Seqüências do gene “spliced leader” ...44
1.5.5.3 Padrões de RAPD, seqüências polimórficas de DNA amplificadas aleatóriamente (Random Amplification of Polymorphic DNA) ...46
1.5.5.4 DNA do cinetoplasto – kDNA ...46
1.5.5.5 Caracterização cromossômica – Cariotipagem...48
2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS ...49
3. MATERIAIS E MÉTODOS ...52
3.1 Áreas de captura dos anuros ...53
3.2 Captura e identificação dos anuros...53
3.3 Isolamento de tripanossomas ...53
3.3.1 Isolamento de tripanossomas de anuros ...53
3.3.2 Obtenção de tripanossomas de flebotomíneos...54
3.4 Condições de cultivo e manutenção dos tripanossomas ...54
3.5 Caracterização morfológica ...56
3.6 Extração de DNA dos parasitas ...56
3.7 Reações de amplificação - PCR ...56
3.8 Digestão de DNA com enzimas de restrição e eletroforese em gel de agarose (RFLP)...56
3.9 Purificação, clonagem e seqüenciamento dos fragmentos amplificados por PCR ...57
3.10 Alinhamento das seqüências obtidas e inferências filogenéticas...57
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...58
4.1 Relacionamento filogenético, diversidade morfológica e molecular de tripanossomas de anuros dos biomas brasileiros, Amazônia, Floresta Atlântica e Pantanal...59
4.2 Uma nova linhagem monofilética de tripanossomas de anuros (Bufonidae e Leptodactylidae) e flebotomíneos (Díptera: Psychodidae: Phlebotominae) da Amazônia brasileira...60
4.3 Filogenia de tripanossomas de anuros sul americanos e africanos baseada na análise de três loci gênicos. ...61
4.3.1 Introdução ...61
4.3.2.1 Locais de coleta e isolamento de tripanossomas de anuros...64
4.3.2.2 Amplificação, por PCR, dos genes ITS1/5.8S/ITS2 rDNA, SSUrDNA, gGAPDH e Alfa Tubulina ...64
4.3.2.3 Seqüenciamento e inferências filogenéticas ...64
4.3.3 Resultados e Discussão...66
4.3.3.1 Diversidade genética de tripanossomas de anuros Africanos avaliada por polimorfismo de tamanho de ITSrDNA...66
4.3.3.2 Análises filogenéticas de tripanossomas de anuros baseadas em seqüências dos genes SSUrDNA (V7-U4-V8), gGAPDH e Alfa Tubulina ...67
4.3.3.2.1 Análises filogenéticas de tripanossomas de anuros com seqüências combinadas dos genes SSUrDNA, gGAPDH e Alfa Tubulina ...67
4.3.3.2.2 Análises filogenéticas de tripanossomas de anuros com seqüências isoladas dos genes SSUrDNA, gGAPDH e Alfa Tubulina ...69
4.3.3.3 Relacionamento filogenético entre tripanossomas de bufonídeos sul americanos (brasileiros) e africanos (Moçambique e Congo). ...71
4.3.3.4 Relacionamento filogenético entre tripanossomas de leptodactilídeos e leiuperídeos...73
4.3.3.5 Relacionamento filogenético entre tripanossomas de hilídeos da América do Sul. ...73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...75
1.1 O gênero Trypanosoma
O gênero Trypanosoma foi originalmente proposto por Gruby (1843) para classificar um
hemoflagelado de rã que foi denominado Trypanosoma sanguinis (Figura 1). Como o organismo
observado por Gruby (1843) apresentava uma estrutura similar a de um parasita descrito alguns meses
antes com o nome de Amoeba rotatoria (Mayer, 1843), essa espécie passou a ser classificada como
Trypanosoma rotatorium.
Figura 1. Trypanosomasanguinis, sinonímia de T. rotatorium (Gruby, 1843).
Os protozoários do gênero Trypanosoma são flagelados do Filo Euglenozoa classificados
tradicionalmente na ordem Kinetoplastida (Honigberg, 1963) que pertence ao reino Protozoa
(Cavalier-Smith, 1981; 1998; 2004). De acordo com os parâmetros taxonômicos tradicionais (características
morfológicas e ciclos de vida), os cinetoplastídeos foram classificados em duas subordens: Bodonina e
Trypanosomatina. As espécies da subordem Bodonina apresentam 2 flagelos localizados em lados
opostos, sendo habitantes de ambientes aquáticos de água doce ou salgada (vida livre), ectoparasitas
ou endoparasitas de animais aquáticos. A Subordem Trypanosomatina compreende protozoários
uniflagelados, endoparasitas obrigatórios e classificados em apenas uma família, Trypanosomatidae.
Os membros dessa família apresentam uma grande diversidade de hospedeiros, infectando plantas e
animais invertebrados e vertebrados de praticamente todas as ordens, com ampla distribuição nos
diferentes continentes (Vickerman, 1976; Dolezel et al., 2000; Moreira et al., 2004; Simpson et al.,
Com o aumento do número de espécies descritas e o advento de novos parâmetros
taxonômicos, características morfológicas, biológicas e moleculares têm alterado o posicionamento
taxonômico dos membros do filo Euglenozoa. Cavalier-Smith (1981) posicionou os euglenídeos e
cinetoplastídeos no filo Euglenozoa, que mais tarde passou a incluir os diplonemídeos (Preisfeld et al.,
2001; Moreira et al., 2001; Busse e Preisfeld, 2002; 2003; Cavalier-Smith, 1988; 2004). Os organismos
do filo Euglenozoa foram reclassificados com base em estudos filogenéticos moleculares em três
classes: Kinetoplastea, composta por parasitas e comensais de plantas e animais; Euglenoidea, que
compreende apenas organismos de vida livre e Diplonemea, que compreende organismos de vida livre
e ocasionalmente parasitas facultativos. A classe Kinetoplastea compreende duas subordens,
Tripanosomatina e Bodonina (Dolezel et al., 2000; Preisfeld et al., 2001; Moreira et al., 2001; Busse e
Preisfeld, 2002; 2003; Simpson e Roger, 2004; Von der Heyden et al., 2004; Roy et al., 2007; Breglia et
al., 2007).
Os organismos da classe Kinetoplastea se caracterizam pela presença do cinetoplasto, que é
uma região especializada da única mitocôndria destes organismos, constituída por moléculas de DNA
circular concatenadas, localizada na base flagelar e que contém o DNA mitocondrial (Vickerman, 1976).
Um estudo recente baseado em filogenia molecular dividiu a classe Kinetoplastea em duas subclasses:
a) Prokinetoplastina, contendo as espécies basais Ichtyobodo necator e Perkinsiella amoebae; b)
Metakinetoplastina, compreendendo a ordem Tripanosomatida e três novas ordens, Eubodonida,
Parabodonida e Neobodonida (Figura 2). De acordo com esta classificação a ordem Trypanosomatida
passou a abrigar 11 gêneros da família Trypanosomatidae: a) Phytomonas, Endotrypanum,
Leishmania, Sauroleishmania e Trypanosoma, que possuem um ciclo de vida heteroxênico; b) Crithidia,
Blastocrithidia, Wallaceina, Leptomonas, Herpetomonas e Rynchoidomonas, que são monoxênicos
(Moreira et al., 2004). Entretanto, estudos bastante abrangentes, de um conjunto de características
biológicas, celulares, bioqumícas e moleculares, de um maior número de flagelados do filo Euglenoza,
estão sendo realizados a fim de validar, ou não, as novas proposta de classificação dos
cinetoplastídeos, inclusive de alguns gêneros de tripanossomatídeos ainda bastante controversos.
Embora a infecção pela maioria dos tripanossomatídeos não cause danos aparentes aos seus
hospedeiros, algumas espécies dos gêneros Trypanosoma e Leishmania são responsáveis por
patologias de grande importância médica humana e veterinária e algumas espécies de Phytomonas
AT4-96 AT4-103
Perkinsiella amoeba-like
AT4-56
Ichthyobodo necator
Ichthyobodosp AAN2003
Trypanosoma brucei Trypanosoma pestanai Trypanosoma cruzi Trypanosoma cyclops Trypanosoma varani Crithidia oncopelti
Leptomonassp
Leishmania major
Bodosp
Bodo saltans
Bodo saltansSt. Petersburg
Bodoc.f.uncinatus
Bodo edax
Cryptobia salmositica Trypanoplasma borreli Cryptobia catostomi Cryptobia bullocki
AT1-3
Procryptobia sorokini Cryptobia helicis Bodo caldatus Parabodo nitrophilus
Rhynchobodosp ATCC50359
Rhynchomonas nasuta Dimastigella mimosa Dimastigella trypaniformis
AT5-25 AT5-48
Cruzella marina
Bodonid clone LFS2 Bodonid clone LKM101
Bodo designis
AT5-9
Bodo saliens Euglenoidea Diplonemidea
Neobodonida Trypanosomatida
Eubodonida
Parabodonida
Prokinetoplastina
Kinetoplastea
Metakinetoplastina
Figura 2. Relacionamento filogenético entre organismos da classe Kinetoplastea. Modificado de Moreira et al. (2004).
1.2 Taxonomia dos tripanossomas
A diversidade de hospedeiros de espécies do gênero Trypanosoma é imensa, com centenas de
espécies descritas em um grande número de hospedeiros vertebrados, abrangendo répteis, anfíbios,
peixes, aves e todas as ordens de mamíferos (Stevens et al., 2001; Simpson et al., 2006). As espécies
do gênero Trypanosoma são parasitas obrigatórias que apresentam ciclos de vida com alternância
entre vertebrados e invertebrados hematófagos. A maioria das espécies se desenvolve em artrópodes
hematófagos, que podem pertencer a diversas ordens e famílias, exceto algumas espécies parasitas de
espécies de tripanossomas africanos são apenas mecanicamente veiculadas porque não apresentam
mitocôndria funcional (Gardiner e Mahmoud, 1992).
Diferentes espécies deste gênero podem apresentar os estágios amastigota, epimastigota,
promastigota e tripomastigota, presentes em diferentes combinações, no sangue e/ou tecidos, nos
hospedeiros vertebrados e invertebrados. Antes da utilização de marcadores moleculares, a
classificação de tripanossomas de mamíferos era baseada na combinação dos seguintes critérios:
Hospedeiro(s) vertebrado(s) e invertebrado(s) de origem; distribuição geográfica; morfologia; ciclo de
vida; patologia; características bioquímicas e fisiológicas.
De acordo com o desenvolvimento no vetor, Hoare (1972) classificou os tripanossomas de
mamíferos em duas Secções: Stercoraria e Salivaria. Os tripanossomas da Secção Salivaria
(tripanossomas africanos) são todos transmitidos pela mosca tsétsé por inoculação de formas
metacíclicas junto com a saliva do vetor (exceto T. equiperdum e T. evansi cuja transmissão ocorre
apenas mecanicamente; T. vivax, na África é transmitido pela mosca tsetsé, contudo, também pode ser
transferido de um hospedeiro a outro mecanicamente). A multiplicação dos tripanossomas dessa
Secção no hospedeiro vertebrado se dá sob a forma tripomastigota.
A Secção Stercoraria engloba parasitas cujo estágio final no hospedeiro invertebrado ocorre no
intestino posterior, sendo que as formas metacíclicas eliminadas com as fezes contaminam o
hospedeiro vertebrado por meio de solução de continuidade na pele (transmissão contaminativa). Nos
vertebrados, dependendo da espécie, a multiplicação dos flagelados ocorre sob as formas amastigota,
epimastigota, promastigota ou tripomastigota.
Ao contrário dos tripanossomas de mamíferos, não existem parâmetros taxonômicos
claramente definidos e utilizados pela comunidade científica para a classificação de tripanossomas de
anfíbios, répteis, aves e peixes. Estes tripanossomas têm sido classificados arbitrariamente, como
novas ou antigas espécies, adotando o hospedeiro de origem e/ou a origem geográfica como critério
taxonômico. Esta conduta gerou dezenas de espécies de anuros descritas sem critérios confiáveis e
sem estudos comparativos. Uma das primeiras tentativas de classificar os tripanossomas de anfíbios foi
proposta por Doflein (1901) que dividiu o gênero Trypanosoma em três subgêneros: Trypanomona,
Herpetosoma e Trypanosoma, sendo que o último continha o flagelado de anuro T. rotatorium. Porém,
na última revisão do gênero Trypanosoma esta classificação foi abandonada e foi proposta uma
classificação restrita aos tripanossomas de mamíferos (a espécie-tipo do gênero não foi incluída), que
foram agrupados em 8 subgêneros, um deles, o subgênero Megatrypanum, apresentando afinidades
1.3 Evolução e filogenia dos tripanossomatídeos
Os tripanossomatídeos apresentam uma grande diversidade de hospedeiros, infectando
animais invertebrados e vertebrados de praticamente todas as ordens. Estes organismos, depois dos
nematóides, são os eucariotos que apresentam a maior variedade de hospedeiros e distribuição
geográfica (Vickerman, 1976; 1994; Stevens et al., 2001; Simpson et al., 2006). Estudos de inferências
filogenéticas baseados em seqüências dos genes de DNA ribossômico (rDNA) e dados biogeográficos
dos hospedeiros revelaram que os kinetoplastidas estão entre os eucariontes mais antigos que
divergiram, provavelmente, muito antes do aparecimento dos animais, plantas e até mesmo dos fungos
(Fernandes et al., 1993).
Os tripanossomatídeos apresentam inúmeras diferenças em sua biologia e em diversos
aspectos estruturais e funcionais. Algumas espécies de tripanossomatídeos possuem endossimbiontes
bacterianos e virais, com alguns isolados podendo, desta forma, junto com os genomas nuclear e
mitocondrial, apresentar até quatro genomas distintos. O aparato nuclear destes flagelados apresenta
uma série de peculiaridades, incluindo a ausência de condensação da cromatina durante a mitose, a
persistência da membrana nuclear durante a divisão celular e a presença de unidades de transcrição
policistrônicas. O genoma dos tripanossomatídeos está organizado em diversos cromossomos, cujo
número e tamanhos variam de acordo com espécies, isolados, etc. Esses organismos apresentam
ainda como principais características: o cinetoplasto; a composição do citoesqueleto; os glicossomas;
proteínas de membrana ancorada por GPI; a endocitose e exocitose de macromoléculas via bolso
flagelar, o nucleotídeo denominado base J em seu DNA nuclear; variação antigênica; etc. Algumas
destas características são compartilhadas com os diplonemídeos e euglenídeos (Vickerman, 1994;
Dooijes et al., 2000; Gull, 2001; Simpson et al, 2003; Campbel et al., 2003; Uliel et al., 2004; von der
Heyden et al., 2004; Lukes et al., 2005; Michel et al., 2006; Roy et al., 2007; Simpson et al., 2006).
Os tripanossomatídeos, principalmente os de ciclo heteroxênico, vivem em diferentes
hospedeiros e ambientes durante seu desenvolvimento. Esse comportamento exige rápidas
adaptações frente a profundas alterações de temperatura, nutrientes disponíveis, componentes do
hospedeiro e da célula hospedeira, resposta imune do hospedeiro, etc. A rápida adaptação e
diferenciação destes organismos depende de uma grande reprogramação de sua expressão gênica,
gerando repertórios diferentes de genes expressos durante seus ciclos de vida. Os mecanismos de
ativação e regulação da expressão gênica dos tripanossomatídeos ainda são pouco conhecidos.
Dentre os fenômenos funcionais, os mecanismos mais interessantes e estudados do ponto de vista
evolutivo são os mecanismos de variação antigênica (Taylor e Rudenko, 2006) e de processamento de
mRNAs por "trans-splicing" e edição. Os transcritos nos tripanossomatídeos são policistrônicos e os
mRNAs unitários são gerados por "trans-splicing". Além dos cinetoplastídeos, os euglenídeos e
processado por trans-splicing, porém, o processamento por "cis-splicing" tem sido identificado em
alguns genes (Simpson e Maslov, 1999; Mair et al., 2000; Lukes et al., 2002; Simpson et al., 2003; Uliel
et al., 2004; Siegel et al., 2005; Jager et al., 2007).
Os membros da ordem Kinetoplastida apresentam uma única mitocôndria que contém uma
região rica em DNA (kDNA) denominada cinetoplasto, constituída por moléculas dupla-fita circulares,
minicírculos e maxicírculos, concatenadas em uma única rede. Aparentemente, estes organismos
divergiram dos demais eucariotos logo que o ancestral desta linhagem incorporou bactérias aeróbicas
simbiontes que deram origem às mitocôndrias. Os cinetoplastídeos modificaram sua única mitocôndria,
alterando o conteúdo de DNA e sua organização, gerando o cinetoplasto. As reconstruções
filogenéticas sugerem que a origem evolutiva da rede concatenada de kDNA ocorreu no ancestral da
família Trypanosomatidae (Simpson e Maslov, 1999; Simpson et al, 2002; Lukes et al., 2002; 2005; Roy
et al., 2007). Os maxicírculos correspondem ao DNA mitocondrial dos eucariotos, codificando as
proteínas para a atividade mitocondrial, porém, a expressão gênica é bastante complexa e depende de
processamento por edição de RNA, que gera mRNAs mitocondriais com códons de iniciação e de
terminação corretos e com fases abertas de leitura. Neste processo, os minicírculos de kDNA são
transcritos em pequenas moléculas de RNA, denominadas RNA guias (gRNA), que dirigem inserções e
deleções de uridinas nas moléculas transcritas de maxicírculo para a edição de mRNA. (Hadkuk e
Sabatini, 1996; Simpson et al., 2002; Lukes et al., 2002; Worthey et al, 2003; Roy et al., 2007).
Diversos estudos têm demonstrado que recombinações genéticas (reprodução sexuada) são
eventos raros entre os tripanossomatídeos que, em geral, se propagam na natureza como populações
clonais. Porém, a formação de híbridos foi demonstrada para T. brucei durante seu desenvolvimento
em moscas tsetsé (Gibson e Stevens, 1999) e já foi sugerida em T. cruzi (Gaunt e Miles, 2000).
Entretanto, em geral, os estudos de diversidade genética demonstram que a estrutura populacional dos
tripanossomatídeos é basicamente clonal e que, se existentes na natureza, recombinações são muitos
esporádicas para interromper um padrão prevalente de propagação clonal (Tibayrenc, 1995).
O fato dos tripanossomatídeos terem, provavelmente, evoluído dos bodonídeos de vida livre, e
não de bodonídeos parasitas de peixes transmitidos por sanguessugas como Trypanoplasma (Simpson
et al., 2002; Simpson e Roger, 2004; Moreira et al., 2004), levou a hipótese de um bodonideo aquático
ter sido ingerido por insetos, se adaptado ao parasitismo no intestino, dando origem aos
tripanossomatídeos de insetos que foram transmitidos para vertebrados e se adaptaram ao
parasitismo, passando a circular entre insetos e vertebrados terrestres, sendo a origem dos
tripanossomas de peixes, anfíbios e sanguessugas um evento secundário (Hoare, 1972; Hamilton et
al., 2004; 2007). As relações filogenéticas entre os tripanossomatídeos inferidas em diferentes estudos
longo da evolução (Vickerman, 1994; Maslov e Simpson, 1995; Haag et al., 1998; Wrigth et al., 1999;
Stevens et al., 2001; Hamilton et al., 2004; 2007).
Em um dos primeiros estudos filogenéticos utilizando seqüências dos genes de SSUrDNA,
Sogin et al. (1986) posicionaram T. brucei em relação a diversos organismos representantes dos reinos
Protista, Fungi, Plantae e Animalia. Este estudo posicionou T. brucei próximo de Euglena gracilis, que é
um euglenóide. Várias teorias tentam explicar a diversidade e a origem do parasitismo na família
Trypanosomatidae, isto é, se os organismos mais ancestrais eram parasitas de invertebrados que, com
o surgimento do comportamento hematófago, tornaram-se parasitas de vertebrados, ou se estes
organismos eram originalmente parasitas de vertebrados que passaram a infectar insetos hematófagos
(Baker, 1963; 1994; Wallace, 1966; Hoare, 1972; Vickerman, 1994; Maslov e Simpson, 1995; Stevens
et al., 2001; Hamilton et al., 2004; 2007). Contudo, todos os estudos sugerem que, provavelmente,
espécies heteroxênicas divergiram, independentemente, várias vezes ao longo da evolução deste
grupo.
As análises filogenéticas iniciais baseadas em seqüências da SSUrDNA (subunidade menor da
versão nuclear dos genes ribossômicos) sugeriram uma origem parafilética dos tripanossomas,
separando T. brucei dos demais (Gomez et al., 1991; Fernandes et al., 1993; Landweber e Gilbert,
1994; Maslov et al., 1994; 1996, Maslov e Simpson, 1995). Entretanto, com a inclusão de taxa
adicionais, a origem monofilética do gênero Trypanosoma tornou-se a hipótese mais apoiada: Análises
posteriores baseadas em seqüências da SSUrDNA (Stevens et al., 1998; 1999; 2001; Briones et al.,
1999; Haag et al., 1998, Wright et al., 1999) e da LSUrDNA (subunidade maior da versão nuclear dos
genes ribossômica) (Lukes et al., 1997), sugeriram a monofilia do gênero Trypanosoma.
O estudo de Merzlyak et al. (2001), sugere que os tripanossomas sejam o grupo irmão dos
demais tripanossomatídeos. Nesses trabalhos o grupo irmão de Trypanosoma pode ser dividido em
dois grupos: Um contendo as espécies que albergam endossimbiontes bacterianos dos gêneros
Crithidia, Blastocrithidia e Herpetomonas e um grande grupo composto por Phytomonas,
Herpetomonas, Leishmania, Endotrypanum, Leptomonas, Crithidia e Blastocrithidia. Portanto, esses
estudos sugerem que os tripanossomas sejam um grupo monofilético que se originou dos bodonídeos
de vida livre e cujo grupo basal seja constituído por tripanossomas da secção Salivaria (Haag et al.,
1998; Wright et al., 1999; Martin et al., 2002) ou, como posteriormente proposto, os tripanossomas de
peixes e anfíbios (Stevens et al., 1999; 2001). Estes dados contrariam a hipótese inicial de que as
espécies heteroxênicas se originaram das monoxênicas e que essas últimas deveriam ser as mais
relacionadas com os kinetoplastidas de vida livre (Lake et al., 1988).
A questão da monofilia do gênero Trypanosoma foi novamente colocada sob disputa com a
publicação de dois outros trabalhos (Hughes e Piontkivska, 2003a, b). Esses autores questionaram as
relacionados aos demais tripanossomas. Para esses autores, a monofilia do gênero Trypanosoma
obtida nos trabalhos anteriores seria um artefato devido à utilização de grupos externos inadequados.
Hamilton et al. (2004), a fim de refutar os resultados de Hughes e Piontkivska (2003a, b), analisaram
dois loci gênicos (SSUrDNA e gGAPDH) para inferências filogenéticas de um grande número de
tripanossomatídeos. Esse trabalho corrobora estudos anteriores (Stevens et al., 1999; 2001; Stevens e
Gibson, 1999a, b) que suportavam a monofilia do gênero Trypanosoma. A análise do gene de gGAPDH
sugere ainda, diferentemente dos trabalhos anteriores, que os parasitas do gênero Trypanosoma
tenham surgido a partir de ancestrais monoxênicos parasitas de insetos hematófagos (Blastocrithidia),
pois, o clado de tripanossomas aparece como grupo apical dentro do grupo de tripanossomatídeos
predominantemente parasita de insetos. Análises realizadas com seqüências de HSP90 (Lukes et al.,
2002; Simpson et al, 2003) geraram filogenias congruentes com as obtidas com seqüências de
SSUrRNA e gGAPDH, indicando a monofilia de Trypanosoma.
Diversas análises de inferências filogenéticas definiram vários clados no gênero Trypanosoma
(Figura 3):
Clado T. brucei, formado pelos tripanossomas de mamíferos da Secção Salivaria, cuja
distância filogenética dos demais tripanossomas sugere uma história evolutiva distinta, confinada à
África e associada com a mosca tsetsé. Tripanossomas isolados de répteis (T. grayi e T. varani) e de
anfíbios (T. mega) africanos foram posicionados em grupos muito distantes do clado T. brucei. Estes
dados junto com evidências paleogeográficas sugerem que a divergência do clado T. brucei dos outros
tripanossomas data do período médio-Cretáceo, há cerca de 100 milhões de anos, quando a África se
isolou dos outros continentes (Stevens et al., 1999; 2001).
Clado T. cruzi, constituído por tripanossomas de mamíferos americanos transmitidos por
triatomíneos (T. cruzi e T. rangeli), por tripanossomas exclusivos de morcegos do Novo e Velho Mundo
e por um isolado de canguru, indicando que este grupo se originou antes da separação da América do
Sul e Austrália, após a separação da África (Stevens et al., 2001).
Clado Aquático, formado predominantemente por tripanossomas isolados de anuros e peixes
(esse grupo será discutido com maiores detalhes no ítem 4.4).
Clado T. lewisi compreende tripanossomas que parasitam as ordens Rodentia, Lagomorpha e
Insetivora. Os organismos desse grupo são transmitidos por pulgas e apresentam especificidade pelo
hospedeiro vertebrado (Hamilton et al., 2005b).
Clado T. theileri agrupa tripanossomas isolados de mamíferos da ordem Artiodactyla e que
apresentam significativa especificidade pelo hospedeiro vertebrado. Esse grupo está distribuído por
todo o mundo e acredita-se que tabanídeos sejam os principais vetores (Rodrigues et al. 2006).
Clado T. cyclops, composto por um isolado de macaco da Malásia (T. cyclops), um de Wallabia
Haemadipsidae. A presença de isolados de sanguessugas nesse grupo sugere que estes sejam seus
principais vetores (Hamilton et al., 2005a)
Clados T. avium e T. corvi (Votýpka et al. 2004), formados por tripanossomas de aves e
artrópodes de vários grupos, aparentemente, sem restrição a espécie de aves (Sehgal et al., 2001).
Phytomonassp Herpetomonas samuelpessoai Herpetomonas muscarum Herpetomonas megaseliae Leishmania tarentolae Leishmania major Crithidia fasciculata Blastocrithidia gerricola Leptomonas lactosovorans Wallaceina brevicula Leptomonas peterhoffi T. rotatorium T. mega T. fallisi T. binneyi T. boissoni T.sp K&A
T.sp CLAR
T. granulosum T. varani
T.sp Gecko
T. grayi T.sp AAT
T. avium T. avium T. vivax T. evansi T. brucei T. brucei
T. congolensesavannah
T. congolensekilifi
T. congolenseforest
T. simiae T. simiaetsavo
T. godfreyi T.sp D30
T. theileri T. cyclops
T.sp TL.AQ.22
T.sp wallaby ABF
T. lewisi T. microti
T. nabiasi T.sp F4
T. pestanai T.sp wombat AAP
T.sp H25
T. dionisii T. cruzi marinkellei
T. cruzi T. cruzi T. conorhini T. vespertilionis T. rangeli T. minasense Outros tripanossomatídeos Clado “Aquático”
CladoT. avium
CladoT. corvi
CladoT. brucei
CladoT. theileri
CladoT. cyclops
CladoT. lewisi
CladoT. cruzi
Clado Lagarto
Figura 3. Relacionamento filogenético entre organismos da ordem Trypanosomatida. Modificado de Hamilton et al. (2007).
1.4 Tripanossomas de anuros
Cerca de sessenta espécies de tripanossomas de anuros já foram relatadas no mundo inteiro
até 1974, data da última revisão deste grupo de tripanossomas (Bardsley e Harmsen, 1973). Destas 60
espécies, Diamond (1965) em uma detalhada revisão reconheceu apenas 26 (Tabela 1, Figura 4). Esta
confusão se deve ao fato de que estas espécies foram identificadas com base em descrições
morfológicas de formas do sangue. Ainda hoje, estudos sobre a diversidade destes tripanossomas têm
se baseado neste parâmetro (Desser, 2001; Zickus, 2002).
Poucos estudos foram realizados com tripanossomas cultivados, sendo a maioria do Canadá e
haviam sido cultivados, 5 isolados do América do Norte, um isolado da África e um da Europa e
nenhum isolado da América Latina havia sido isolado e mantido em cultura (Clark et al., 1995, Tabela
1). Cinco espécies de tripanossomas de anuros foram descritas no Brasil: quatro em Leptodactylus
ocellatus (T. ocellati, T. leptodactyli, T. celestinoi e T. rotatorium) e uma em Scinax ruber (T. borrelli)
(Bardsley e Harmsen, 1973). Contudo, além de terem sido identificadas apenas por critérios
morfológicos, não foram cultivadas ou criopreservadas.
Atualmente, das mais de sessenta espécies de tripanossomas descritas nesses hospedeiros
(Bardsley e Harmsen, 1973), apenas 7 podem ser consideradas espécies válidas (Tabela 1) baseado
em estudos de isoenzimas (Martin et al., 1992a,b), riboprinting (Clark et al., 1995), filogenias baseadas
no gene ribossômico (Haag et al., 1998; Stevens et al., 2001; Hamilton et al., 2004; Gibson et al., 2005;
Martin et al., 2002) e caracterização dos genes de mini-exon (Gibson et al., 2000). As demais espécies
descritas não foram isoladas em cultura, ou estas foram perdidas, o que impossibilita a validação das
mesmas.
1.4.1 Morfologia
A análise morfológica de tripanossomas de anuros por microscopia de luz revelou uma grande
diversidade de formas dos tripanossomas de anuros. Muitos trabalhos publicados sobre esses
tripanossomas se restringem a extensas descrições morfológicas das formas presentes no sangue dos
anuros. A descrição de novas espécies tradicionalmente está baseada no reconhecimento de tipos
morfológicos, muitas vezes definidos com base em diferenças extremamente sutis. Não sabemos se os
tipos morfológicos (morfotipos) correspondem a diferentes espécies ou a diferentes estágios de uma
mesma espécie.
Anuros infectados por tripanossomas, tanto experimental quanto naturalmente, normalmente
podem apresentar mais de um morfotipo. Desser (2001), em um estudo de diversidade de parasitas em
anuros da Costa Rica, encontrou, em um único indivíduo de Rana vaillanti, cinco espécies de
tripanossomas. É interessante notar que Barta e Desser (1984) e Desser (2001) observaram que
espécies de anuros com hábitos mais aquáticos são mais suscetíveis a infecções por tripanossomas,
talvez pelo contato com vetores aquáticos como sanguessugas, e apresentam uma maior diversidade
de formas no sangue. Vários trabalhos sobre a diversidade de tripanossomas sugerem que esses
parasitas sejam inespecíficos com relação à espécie ou mesmo à família do hospedeiro vertebrado
(Werner e Walewski, 1976; Werner, 1993; Woo e Bogart, 1984; Barta e Desser, 1984). Esses autores
interpretam a variedade de formas encontradas no sangue de anuros como infecções mistas por várias
espécies, sugerindo que tripanossomas de anuros podem normalmente romper a barreira de espécie
do hospedeiro vertebrado. Essa questão levou Scorza e Boyer (1958) a estudar o papel do hospedeiro
Leptodactylus bolivianus) em Hyla crepitans deu origem a infecções por parasitas similares a T. borrelli,
porém, quando esse parasita foi inoculado em L. bolivianus, as formas observadas eram semelhantes a
T. costatum e T. leptodactyli e em Phyllomedusa bicolor, os flagelados no sangue eram similares a T.
arcei. Trypanosoma rotatorium, em ranídeos, é considerado uma espécie polimórfica e foram
agrupados no complexo T. rotatorium, que pode albergar diferentes morfotipos (Bardsley e Harmsen,
1969). De fato, existem muitas dúvidas se esse polimorfismo representa a expressão fenotípica de um
mesmo genoma, infecções por várias linhagens de tripanossomas ou se ambos os fenômenos podem
ocorrer.
Os tripanossomas de anuros apresentam desenvolvimento extremamente pleomórfico
(Bardsley e Harmsen, 1973). Martin e Desser (1991a) observaram que a morfologia dos flagelados em
B. americanus experimentalmente infectado com um clone de T. fallisi varia em função da estação do
ano, com duas fases de infecção. No final da primavera e durante todo o verão são observadas formas
tripomastigotas largas, provavelmente um indício de início de infecção. Formas mais curtas e finas são
observadas em todas as épocas do ano. Esses experimentos mostram uma alteração da forma
tripomastigota curta para larga após períodos de frio, sugerindo que esses flagelados sofram alterações
morfológicas sazonais dependentes da temperatura ou da redução da resposta imunológica do
hospedeiro devido ao abaixamento da temperatura. Reilly e Woo (1982b) também observaram
variações morfológicas relacionadas com tempo de infecção e temperatura em outros dois
tripanossomas.
Poucos são os trabalhos sobre ultra-estrutura de tripanossomas de anuros. Com exceção do
tamanho do cinetoplasto, as demais estruturas celulares nesses organismos parecem não diferir
significantemente das descritas em tripanossomas de mamíferos (Reilly e Woo, 1982c; Martin e
Desser, 1990). Steinert e Novikoff (1960) observaram uma depressão na superfície da membrana
plasmática, próxima da base flagelar de formas de cultura de T. mega, que forma um canal levando ao
interior da célula. Essa estrutura também foi caracterizada em T. fallisi, formas de cultura e formas
encontradas no vetor, a sanguessuga Desserobdella picta (Martin e Desser, 1991a). Essa estrutura é
análoga ao citóstoma dos ciliados e está presente em tripanossomas de peixes e em algumas espécies
de tripanossomas de mamíferos. T. fallisi apresenta microorganismos intracelulares semelhantes aos
observados no tripanossoma de peixe T. cobitis (Martin e Desser, 1990; 1991a).
Diamond (1965) em sua extensa revisão taxonômica de tripanossomas de anuros reconheceu
26 espécies com ampla distribuição e definiu os morfotipos presentes no sangue desses hospedeiros
Tabela 1. Espécies de tripanossomas de anuros depois de Diamond (1965).
Tripanossoma Hospedeiros Origem Geográfica Referência
T. ampanense Rana blythi Malásia Miyata e Yong, 1994
T. andersoni Hyla versicolor América do Norte Reilly e Woo, 1982a
T. arcei * Leptodactylus ocellatus Argentina e Brasil Mazza et al., 1927
T. belli * Rana temporaria China Nabarro, 1907
T. bocagei * Bufo gargarizans, B. melanostictus, B. regularis África e Ásia França, 1911
T. borrelli * Scinax ruber Brasil Marchoux e Salimbeni, 1907
T. boyli Rana boyli boyli América do Norte Lehmann, 1959
T. bufophlebotomi Bufo boreas halophilus América do Norte Ayala, 1970
T. bulat Rana blythi Malásia Miyata e Yong, 1994
T. canadensis Rana pipiens América do Norte Woo, 1969a
T. chalconotae Rana chalconota ? Miyata et al., 1994
T. chattoni * ¶ Bufo arenarum, B. melanostictus, Ceratophrys ornata, Hyla arborea,
H. raddiana, Leptodactylus ocellatus, Phyllomedusa salvagii, Rana catesbiana, R. clamitans, R. pipiens, R. sphenocephala
África, América do Norte, América do Sul (Argentina), Ásia e Europa
Mathis e Léger, 1911
T. clamatae * Rana clamitans América do Norte Stebbins, 1907
T. clelandi * Limnodinastes ornatus, L. tasmaniensis Austrália Johnston, 1916
T. diamondi Rana pipiens América do Norte Pérez-Reyes, 1969a
T. fallisi ¶ Bufo americanus América do Norte Martin e Desser, 1991
T. galba Rana montezumae, R. pustulosa, R. palmipes América do Norte Pérez-Reyes, 1968
T. gaumontis * Bufo americanus América do Norte Fantham et al., 1942
T. grandis Rana pipiens América do Norte Pérez-Reyes, 1969a
T. grylli * Acris gryllus América do Norte Nigrelli, 1945
T. hosei Rana hosei Malásia Miyata e Young, 1990
T. inopinatum * Rana esculenta, R. hexadactyl, R. temporaria, R. tigrina América do Norte, Ásia e Europa
Sergent e Sergent, 1904
T. ishigakiense Rana limnocharis limnocharis Japão Miyata, 1978
T. karyozeukton * B. regularis, R. mascarensis, R. occipitalis, R. oxirhynchus África Dutton e Todd, 1903
T. kuhlii Rana kuhlii ? Miyata et al., 1995
T. lavalia * Bufo americanus América do Norte Fantham et al., 1942
T. leptobrachii Leptobrachium hendricksoni ? Miyata et al., 1995
T. leptodactyli * Ceratophrys ornata, Hyla raddiana, Leptodactylus bufonius, L. ocellatus
Argentina e Brasil Carini, 1910
T. loricatum * Rana esculenta, R. guntheri, R. limnocharis, R. nigromaculata, R. plancyi, R.tigrina
Ásia e Europa (Mayer, 1843) França e Athias,
1906
T. maleisiense Rana blythi Malásia Miyata e Yong, 1994
T. mega * ¶ B. regularis e R. oxirhynchus África Dutton e Todd, 1903
T. melanosticti Bufo melanostictus ? Miyata et al., 1995
T. midaii Rana blythi Malásia Miyata e Yong, 1994
T. miyagii Rana namiyei, Rana narina, Rana holsti, Rana ishikawae, Rana subaspera
Japão Miyata, 1978
T. montezumae Rana montezumae, R. pustulosa, R. palmipes América do Norte Pérez-Reyes et al., 1960
T. montrealis * Bufo americanus América do Norte Fantham et al., 1942
T. nagasakiense Hyla arborea japonica Japão Miyata, 1978
T. nelspruitense * Rana angolensis África Laveran, 1904
T. neveulemairei* ¶ Rana esculenta Córsega Brumpt, 1928
T. oitaense ? Oeste asiático Miyata et al., 1994
T. panjang Polypedates leucomystax Oeste asiático Miyata et al., 1994
T. parroti * Discoglossus pictus Argélia Brumpt, 1923
T. parvum * Rana clamitans América do Norte Kudo, 1922
T. pipientis * Rana pipiens, R. sylvatica América do Norte Diamond, 1950
T. prominani Rhacophorus prominanus Oeste asiático Miyata et al., 1994
T. pseudomiyagii Rana ridibunda Iraque Miyata et al., 1989
T. pseudopodium Bufo americanus América do Norte Werner e Walewski, 1976
T. raksasa Rana erythraea ? ?
T. ranarum * ¶ Rana clamitans, R. esculenta, R. mugiens, R. pipiens América do Norte, Ásia e
Europa
(Lankester, 1871) Danilewsky, 1885
T. rotatorium * ¶ Bufo arenarum, B. regularis, Ceratophrys ornata, Hyla arborea, H.
raddiana, Lepidobatrachus asper, Leptodactylus bufonius, L. ocellatus, Phyllomedusa sauvagii, Rana esculenta, R. guntheri, R. limnocharis, R. mascarensis, R. nigromaculata, R. occipitalis, R. plancyl, R. tigrina,
Ásia, África, Europa e América do Sul (Argentina e Brasil)
(Mayer, 1843) Laveran e Mesnil, 1901
T. rugosae girino de Rana rugosa Japão Miyata, 1978
T. schimidti * ¶ Rana pipiens, R. sphenocephala América do Norte Diamond, 1965
T. sembeli ? Oeste asiático Miyata et al., 1994
T. sergenti * Discoglossus pictus Argélia Brumpt, 1923
T. terbesar Bufo asper Malásia Miyata e Poon, 1992
T. tsukamotoi Rana namiyei Japão Miyata, 1978
T. tsunezomiyatai Rana rugosa, Rana limnocharis limnocharis Japão Miyata, 1978
T. tumida * Rana nutti África Averintsev, 1916
T. wallacei ? Oeste asiático Miyata et al., 1994
T. yongi Bufo asper Malásia Miyata e Poon, 1992
*espécies consideradas válidas por Diamond, (1965).
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D1
Grupo E
Grupo F
Grupo D2
T. rotatorium T. borreli
T. bocagei T. loricatum
T. karyozenkton T. mega T. neveulemairei
T. grylli T. chattoni
T. nelspruitense
T. gaumontis T. montrealis
T. parroti T. leptodactyli
T. parvum T. inopinatum
T. sergenti
T. lavalia
10µm
1.4.2 Hospedeiros vertebrados e distribuição geográfica
A classe Amphibia é constituída por descendentes dos mais antigos vertebrados terrestres,
sendo o primeiro grupo de cordados a viver fora da água. Os grupos atuais dessa classe pertencem a
subdivisão Lissamphibia (Triássico recente) e estão distribuídos em três ordens: Anura (sapos, rãs e
pererecas), Gymnophiona (cobras-cegas) e Caudata (salamandras). Por ser um grupo basal nos
tetrápodes, grupo que engloba o último ancestral comum dos amniotas, anfíbios e seus descendentes,
a ordem Anura tem grande importância nos estudos evolutivos dos tetrápodas (Laurin et al., 2000) e de
outros vertebrados (Graybeal, 1997; Bossuyt e Milinkovith, 2001).
Anfíbios vivem principalmente na água e em ambientes úmidos, mas nunca no mar. A
diversidade de espécies de anfíbios excede a reconhecida para mamíferos (Glaw e Köhler, 1998) e
mais da metade dessa diversidade está concentrada na região neotropical (cerca de 68% das
espécies). A ordem Anura é constituída por 45 famílias, com cerca de 5362 espécies (que corresponde
a cerca de 88% da diversidade de anfíbios) dispersas por todos os continentes, com exceção da
Antártica, sendo mais comuns em regiões temperadas úmidas, embora algumas habitem o círculo polar
ártico e outras vivam em desertos (Frost, 2006; Pough et al., 1996). Duellman (1988) observou que a
região neotropical abriga a maior diversidade de anuros, aproximadamente 44% do número das
espécies reconhecidas até então. O Brasil concentra a maior riqueza de espécies de anuros do
planeta, representada por 747 espécies (SBH 2005) com uma taxa de endemismo de 64% (IUCN
2004).
Até o começo deste século o relacionamento filogenético entre os anuros era muito controverso
ou pouco resolvido (Ford e Cannatella, 1993). Haas (2003) apresentou o primeiro trabalho de filogenia
de anuros baseado em um grande número de espécies de anuros (81) e diversos marcadores (136
caracteres larvais, 6 de biologia reprodutiva e 14 de morfologia dos animais adultos).
Faivovich et al. (2005), em um trabalho muito mais detalhado com 276 espécies (~5100pb de
nove genes mais 37 marcadores anatômicos) cujo enfoque principal era a família Hylidae, propôs a
revisão taxonômica da família Hylidae devido à merofilia de diversos gêneros desse grupo. Um
resultado interessante dessa revisão foi o desmembramento do gênero Hyla, cuja maior diversidade se
localizava na América do Sul e, após essa revisão, ficou restrito à América do Norte, em diversos
gêneros.
Embora os dois trabalhos citados acima tenham representado um grande avanço para o estudo
da sistemática e evolução de anuros, diversos pontos, como o relacionamento entre as três ordens de
anfíbios e a monofilia de diversas famílias e gêneros de anuros, ainda permaneciam controversos. Em
relação a esses pontos, uma grande contribuição foi dada por Frost et al. (2006) que analisaram
Lissamfibia. Os resultados desses autores sugerem que Lissanfibia é um grupo monofilético, tendo as
cecílias como grupo basal. Além disso, esse trabalho corrobora estudos anteriores no que se refere à
parafilia de determinados gêneros (por exemplo, Bufo, Graybeal, 1997) e famílias (como
Leptodactylidae, Haas, 2003). Uma nova classificação para Anura foi proposta com base nesse
extenso estudo (Frost, 2006).
Na revisão de Bardsley e Harmsen (1973) foram listadas 88 espécies de anuros encontradas
com tripanossomas. Essas espécies pertencem a nove famílias representativas da ordem Anura.
Contudo, o número de espécies de anuros em que foram observados tripanossomas é bastante
diferente para cada família. A família “Ranidae” representa 44% dos tripanossomas descritos (38
espécies do gênero “Rana” e uma espécies do gênero Ptychadena), seguida da família “Hylidae” (19
espécies, 22%) e Bufonidae (16 espécies do gênero “Bufo”, 18%).
Todos os estudos realizados até o momento sugerem que tripanossomas são parasitas
ubíquos em anuros e dada a diversidade de espécies, características ecológicas e de ambientes
observadas nesse grupo de vertebrados, é provável que a diversidade desses parasitas suplante a
observada para tripanossomas de mamíferos.
1.4.3 Ciclo Biológico
1.4.3.1 Desenvolvimento no hospedeiro vertebrado
O ciclo biológico melhor estudado de um tripanossoma de anuro foi o de T. fallisi, isolado de
Bufo americanus (Martin e Desser, 1990). Martin e Desser (1991a) analisaram o desenvolvimento dos
flagelados observados no sangue de B. americanus (criado em laboratório) experimentalmente
infectado com um clone de T. fallisi. A infecção experimental apresentou dois estágios, de 8 a 10 dias
após a infecção, as formas tripomastigotas metacíclicas dão origem aos tripomastigotas sangüícolas,
com o corpo largo e membrana ondulante bem desenvolvida, essas formas são gradualmente
substituídas por formas tripomastigotas curtas e finas. Esses autores observaram também que formas
tripomastigotas largas são observadas apenas no verão (Martim e Desser, 1991a).
Espécimes de Hyla versicolor, criadas em laboratório, inoculadas com T. andersoni e T. grylli e
aclimatadas a 10ºC, 22ºC e 30ºC por cinqüenta dias também apresentaram variações de acordo com
tempo de infecção e temperatura (Reilly e Woo, 1982b). Ambas as espécies apresentaram formas
epimastigotas, esferomastigotas e tripomastigotas, contudo o local de ocorrência dos tripanossomas
diferiu: Formas de T. andersoni foram encontradas principalmente no fígado enquanto que as de T.
grylli foram observadas na circulação geral. As três formas foram encontradas em divisões binárias ou
múltiplas em T. grylli, que apresentou aumento no número e tamanho dos parasitas nas três
de tamanho com o tempo e temperaturas testadas. T. andersoni não apresentou formas em divisão e
aumentou em número e tamanho a 22ºC (até 20 dias) e 30ºC (até 50 dias), mas pouco a 10ºC.
Bardsley e Harmsen (1969) testaram o efeito da temperatura sob a parasitemia periférica de T.
rotatorium em Rana catesbeiana, revelando forte correlação entre temperatura e parasitemia. Sob a
menor temperatura testada (10ºC) foi observada grande concentração de tripanossomas em órgãos
como fígado, rins e coração. Variações circadianas foram observadas a 26ºC, mas não a 10ºC. Esses
autores sugerem que as variações de temperatura não são as causas diretas da variação da
parasitemia. Em um estudo posterior (Bardsley e Harmsen, 1970) outros fatores como excitação e
adrenalina foram associados com a liberação para a circulação periférica de tripanosomas estocados
em órgãos como o fígado e os rins. Johnson et al. (1993) observaram variação circadiana na
parasitemia periférica de um tripanossoma de anuro em Hyla cinerea. A parasitemia nesse vertebrado,
que é baixa das 8h às 16h, sofre um incremento dramático até às 21h mantendo seu pico até às 1h.
Neste horário de pico de parasitemia também é observado um pico de ocorrência de Corethrella wirthi
(díptera) se alimentando em machos adultos de H. cinerea, que ao contrário das fêmeas, apresentam
infecção por tripanossoma (Ver item 4.3.2.2). McKeever e French (1991), demostraram que C. wirthi é
atraída pelo canto de machos de anuros. Esses machos interrompem seu canto ao entrarem em
contato físico com as fêmeas de forma que estas raramente entram em contato com o inseto, o que
explicaria a suposta ausência de tripanossomas nas mesmas.
Variações circadianas na parasitemia periferia de tripanossomas de anuros também foram
correlacionadas com a luminosidade (Southworth et al., 1968). Em tripanossomas do complexo T.
rotatorium em R. clamitans observou-se um incremento no número de tripanossomas no sangue em
períodos de luminosidade e retenção desses parasitas nos rins na ausência de luz, mesmo em
fotoperíodos invertidos. Os mesmos resultados foram observados para animais sem os olhos. Animais
mantidos na escuridão por 24h apresentaram tripanossomas apenas nos rins e com 24h de
luminosidade apresentaram o ciclo natural do tripanossoma.
O aparecimento e o aumento de infecções por tripanossomas em anuros aparentemente está
relacionado à idade do hospedeiro (Bardsley e Harmsen, 1973). Barta e Desser (1984), notaram que a
prevalência de T. ranarum em B. americanus aumenta exponencialmente em indivíduos acima de
50mm de comprimento (medida correlacionada à idade em que se alcança a maturidade sexual).
O local de multiplicação de tripanossomas de anuros no hospedeiro vertebrado não está
restrito à circulação sanguínea: T. inopinatum multiplica-se em células da medula óssea e do baço
(Buttner e Bourcart, 1955), T. karyozeukton, T. leptodactyli e T. sp em hemácias (Carini, 1910) e T.
1.4.3.1.1 Patogenia
Tripanossomas de anuros são comumente reportados como não patogênicos para seus
respectivos hospedeiros vertebrados (Bardsley e Harmsen, 1973). Contudo, esses tripanossomas
podem vir a ser patogênicos para girinos ou para anuros adultos quando a infecção atinge altos níveis
de parasitemia (Bardsley e Harmsen, 1973). Brumpt (1906) demonstrou que a linhagem algeriana de T.
inopinatum, que não é patogênico para R. esculenta da mesma região, é letal para anuros europeus da
mesma espécie. O comportamento diferencial de T. inopinatum em diferentes populações do
hospedeiro foi posteriormente investigado por Buttner e Bourcart (1955). Esses autores postularam que
a dieta da população algeriana de R. esculenta é o fator responsável pela sua resistência a T.
inopinatum e que a patogenia no anuro ocorre devido a incapacidade de destruir os tripanossomas nos
primeiros estágios de desenvolvimento. Diamond reportou que tripanossomas de R. sphenocephala do
Estado da Florida (E.U.A.) são letais para R. pipiens de Minnesota (Bardsley e Harmsen, 1973). Esses
dados sugerem a existência de imunidade dos anuros frente às espécies simpátricas de
tripanossomas, com as infecções por anuros mantidas em equilíbrio enzoótico apenas nos seus
habitats naturais.
1.4.3.2 Hospedeiros invertebrados
Os hospedeiros invertebrados e vetores de tripanossomas de anuros estão, aparentemente,
relacionados com o habitat destes animais. No ambiente aquático, os vetores são principalmente
sanguessugas. No ambiente terrestre, a transmissão pode ser realizada por diversos artrópodes
hematófagos.
1.4.3.2.1 Sanguessugas
Sanguessugas, classe Hirudinea, filo Anellida, são um dos ectoparasitas mais prevalentes de
anuros (Bardsley e Harmsen, 1973). Essa classe contém cerca de 500 espécies marinhas, terrestres e
de água doce (Ruppert e Barnes, 1994) divididas em três subclasses: Branchiobdellida,
Achantobdellida e Euhirudinea. Euhirudinea, que compreende a maioria das sanguessugas, possui
duas ordens: Rhynchobdellida e Arhynchobdellida. Dos grupos mencionados acima, apenas a ordem
Rhynchobdellida não é corroborada em inferências filogenéticas moleculares (Siddall e Burreson, 1998;
Siddall et al., 2001).
As sanguessugas terrestres e de água doce estão distribuídas em dez regiões e sub-regiões
zoogeográficas. Na América do Sul predominam espécies endêmicas da família Glossiphoniidae
(Rhynchobdellida) e da sub-ordem Hirudiniformes (Arhynchobdellida) (Sawyer, 1986). Muitas espécies
de sanguessugas são predadoras, porém, a maioria é ectoparasita sugadora de sangue de uma grande
usualmente parasitam apenas uma classe de vertebrados. Apenas as ordens Rhynchobdellida e
Arhynchobdellida possuem espécies que se alimentam em anuros. Algumas espécies da ordem
Rhynchobdellida são vetoras de tripanossomas de anuros. As espécies da ordem Arhynchobdellida
parasitas de anuros são onívoras sugadoras de sangue facultativas como, por exemplo, Helobdella
algira parasita de Rana spp (Sawyer, 1986). Outras espécies, por exemplo, Hirudo medicinalis, se
alimentam em anuros e mamíferos.
A transmissão de tripanossomas por sanguessugas é o mecanismo aceito para as espécies
que parasitam peixes (revisado em Molyneux, 1977). Anfíbios (Bardsley e Harmsen, 1973; Molyneux,
1977), répteis (Siddall e Desser, 1992; Molyneux, 1977) e mamíferos (Hoare, 1972) são parasitados por
tripanossomas transmitidos por sanguessugas ou artrópodes. Nesses modelos não observamos
apenas ciclos “aquáticos” já que determinadas espécies de sanguessugas implicadas na transmissão
de tripanossomas possuem hábitos terrestres: Haemadipsídeos dos gêneros Micobdella, Philaemon,
Haemadipsa e Leiobdella, por exemplo, foram implicados na transmissão de tripanossomas
australianos do grupo T. cyclops, que contêm isolados de “wallaby” e de anuros (Myxophyes fleayi)
(Hamilton et al., 2005a).
Sanguessugas das famílias Glossifoniidae, Piscicolidae e Hirudinidae foram incriminadas como
supostas vetoras de tripanossomas de anuros (Bardsley e Harmsen, 1973). Billet (1904) foi o primeiro a
avaliar o papel de sanguessugas na transmissão de tripanossomas de anuros, encontrando uma
diversidade de formas de T. inopinatum em Helobdella algira. Esse autor, tendo em vista que
sanguessugas são comuns em Rana esculenta postulou que elas seriam vetoras de T. inopinatum, o
que foi corroborado por Brumpt (1906), que mostrou a transmissão desse tripanossoma para R.
esculenta usando como vetor H. algira. Após esses estudos, várias espécies de sanguessugas foram
apontadas como hospedeiras de uma grande diversidade de tripanossomas de anuros (Bardsley e
Harmsen, 1973).
Porém, na maioria desses trabalhos foram utilizados anuros e ou sanguessugas naturalmente
infectados coletados na natureza. Animais coletados do campo podem apresentar resultados
contraditórios quando analisados por métodos tradicionais de detecção de tripanossomas como
esfregaços em lâmina, microhematócrito e hemocultura (Woo, 1983; Jones e Woo, 1989). A detecção
de tripanossomas baseada em esfregaço de sangue pode não revelar infecções crípticas (Buttner e
Boucart, 1955) invalidando, assim, resultados de infecções experimentais. Embora infecções por
tripanossomas tenham sido observadas em girinos (Bardsley e Harmsen, 1973) não encontramos
nenhum relato similar para ovos de anuros. O trabalho de Diamond (1965) foi o primeiro a utilizar
anuros criados em laboratório a partir de ovos, tendo sido seguido por outros (Pérez-Reyes, 1968;
