Volume 112

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Volume 112 Nº601-602

Ano 2017

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RPCV (2017) 112 (601-602) 1-11

1 Maturação epididimária em cães

Epididymal maturation in dogs

Daniel S. R. Angrimani¹*; Cristina F. Lucio¹; João D. A. Losano¹; Maíra M. Brito¹; Gisele A.

L. Veiga¹; Camila I. Vannucchi¹.

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Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP, São Paulo - Brasil

Resumo: Nos dias atuais, os animais de companhia têm ganhado cada vez mais espaço na atuação do médico veterinário, principalmente no âmbito da reprodução assistida. Em consequência, eleva-se também a necessidade de maiores conhecimentos acerca da fisiologia reprodutiva do macho, tal como a maturação epididimária, para que assim se possa evoluir e implementar novas biotécnicas. Para tanto, a presente revisão tem como objetivo dissertar e contextualizar os principais tópicos da maturação espermática em nível epididimário na espécie canina, a fim de compreender os diversos processos envolvidos durante a passagem do espermatozoide pelos três seguimentos do epidídimo (cabeça, corpo e cauda). Tais como secreção e absorção de fluidos, síntese e degradação proteica, alterações na composição lipídica da membrana espermática, remodelamento de membrana, acrossomo e ativação mitocondrial e da motilidade.

*Correspondência: [email protected]

Abstract: Nowadays, the pets have gained more space in veterinary medicine, mainly in the context of assisted reproduction.

As a consequence, also raises the necessity for greater knowledge about male reproductive physiology, such as epididymal maturation, to evolve and implement in new biotechnologies.

Therefore, this review aims to expound and explain the main topics of the epididymal maturation in dogs during sperm transit through the three segments of the epididymis (head, corpus and cauda). In order to comprehend various processes, such as fluid secretion and absorption, protein synthesis and degradation, changes in the lipid composition of sperm

membrane, remodeling of membrane and acrosome, mitochondrial and motility activation.

Introdução

Verifica-se, notoriamente, o interesse cada vez maior da população pelo bem estar e saúde animal, principalmente nos animais de companhia, segmento que se integram os cães.

Porém, acompanhando o interesse por saúde, alimentação e higiene, hoje o perfil do mercado almeja maiores conhecimentos, como por exemplo, a reprodução canina. Portanto, tornou- se desafio desenvolver novas biotécnicas aplicadas para aperfeiçoar a reprodução de animais de alto valor zootécnico (Thomassen e Farstad, 2009; Lucio et al., 2016; Dalmazzo et al., 2017; Brito et al., 2017).

Para o desenvolvimento de biotécnicas aplicadas à reprodução canina, estudos da fisiologia são de suma importância, para que se tornem base científica de referencia nos canídeos (Farstad, 2000). Ainda, ressalta-se que os cães são o modelo biológico de caninos selvagens e, particularmente, no estudo da reprodução humana, substituindo estas espécies em metodologias experimentais (Kirchhoff, 2002). Logo, a recuperação e criopreservação do material genético epididimário são de extrema importância, pois permitem seu uso post- mortem ou após orquiectomia (Bainbridge e Jabbour, 1998). Além disto, o estudo das modificações ocorridas durante o transito dos espermatozoides pelo epidídimo permitirá o desenvolvimento de contraceptivos masculinos (alternativa para a orquiectomia e vasectomia) e a melhoria e incremento de biotécnicas reprodutivas, tais como, a injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (Ma et al., 2013).

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Assim, urgem maiores elucidações sobre o ambiente epididimário dos caninos, visto que as informações científicas ainda são escassas.

Sabe-se que durante o percurso epididimário, os espermatozoides passam por diversas alterações morfofuncionais, tais como: ganho da motilidade progressiva, modificações na membrana plasmática e acrosomal e habilidade de reconhecimento e ligação ao oócito (Jervis e Robaire, 2001; Angrimani et al., 2014a).

Nos mamíferos em geral, os lípidos da membrana plasmática do espermatozoide estão relacionados a propriedades físico-químicas e, consequentemente, funcionais dos espermatozoides. O conteúdo lipídico da membrana plasmática tem origem nas espermatogônias e é modificado durante os processos de espermatogênese e maturação espermática (Jones, 1998). Tal conjunto de modificações permite que o espermatozoide ultrapasse o estado imóvel e infértil para uma célula vigorosamente ativa e apta a se ligar de maneira específico ao oócito (Jervis e Robaire, 2001; Dudiki et al., 2015). Deste modo, na maturação espermática, a membrana plasmática modela-se de acordo com as alterações morfofuncionais pelas quais o espermatozoide atravessa (Angrimani et al., 2017a). É apenas no último estágio da maturação epididimária que a membrana plasmática assume sua forma final e sua composição terminal (Angrimani et al., 2014a; Angrimani et al., 2017a).

Simultaneamente a tais alterações da membrana lipídica dos espermatozoides durante a maturação epididimária, os atributos de motilidade modificam-se gradativamente, desde a imobilidade ou vibração a movimentos progressivos (Jervis e Robaire, 2001). Em relação ao acrossomo, estudos em cães sugerem que o ambiente epididimário colabora com a estabilização da membrana acrossomal, devido a ácidos graxos e proteínas secretadas (Varesi et al., 2013; Angrimani et al., 2014a; Angrimani et al., 2017a). De fato, em mamíferos em geral, na cabeça do epidídimo, encontra-se o acrossomo ainda imaturo, diferentemente do observado na cauda do epidídimo (Lin e Rodger, 1999;

Sivashanmugam e Rajalakshmi, 1997; Varesi et al., 2013; Angrimani et al., 2014a).

Os referidos processos de biotransformação correspondem à maturação espermática mediada por secreções do epitélio seminífero que irão compor o fluído epididimário (Schimming e Vicentini, 2001). Contudo, a composição exata do plasma epididimário dos cães, assim como as modificações específicas que ocorrem nos espermatozoides ainda não foram integralmente estabelecidos e elucidados, sendo necessários estudos específicos para a melhoria da

fertilidade e das biotecnologias reprodutivas na espécie (de Souza et al., 2007).

Neste contexto, a presente revisão tem como objetivo principal explanar os principais tópicos da maturação espermática em nível epididimário na espécie canina. Contudo, também foi possível abranger a maturação espermática nas demais espécies mamíferas, visando apresentar as particularidades do evento fisiológico.

Anatomia dos epidídimos

O epidídimo de mamíferos é dividido anatomicamente em: cabeça, corpo e cauda (Zhang et al., 2003). A cabeça do epidídimo encontra-se firmemente anexada ao testículo, local de confluência dos ductos eferentes ao ducto do epidídimo. Este último prossegue pelo corpo epididimário em posição medial- longitudinal ao testículo. A cauda do epidídimo é o local de estocagem das células até o momento da ejaculação, pois o ducto epididimal irá se unir ao ducto deferente (Chandler et al., 1981).

O comprimento do ducto epididimal pode variar de acordo com a espécie, sendo, nos cães, aproximadamente 5 a 8 metros (Schimming e Vicentini, 2001). Além de ser responsável pelo transporte dos espermatozoides, o ducto epididimal é imprescindível para a maturação espermática, pois é mediado por componentes do fluído epididimário (Belleannee et al., 2012b).

O fluído epididimário

O microambiente epididimal é isolado do sangue pela barreira hemato-epididimária, desta forma, sua regulação funcional ocorre localmente (Fouchecourt et al., 2000). O controlo das secreções do epitélio epididimal é mediado por hormônios esteroides, principalmente a dihidrotestosterona (Legare et al., 1999a). De maneira geral, o plasma epididimário é constituído por lipídeos e proteínas secretados e absorvidos pelos epidídimos, além da ação direta do espermatozoide sob as secreções do epitélio epididimal (Guyonnet et al., 2011).

Secreção e Absorção Epididimal

A atividade secretória dos epidídimos apresenta- se regionalizada em sítios anatômicos específicos (cabeça, corpo e cauda), caracterizados por atividade secretória exclusiva, conforme anteriormente descrito no homem (Belleannee et al., 2012a), rato (Carvelli et al., 2013), camundongo (Vernon et al., 1982), carneiro (Tajik et al., 2007b), bovino (Belleannee et al., 2011), suíno (Sukura et al., 2002) e felino (Axner, 2006). Para os cães, tal

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característica ainda não está completamente definida. Embora se acredite que a composição do fluido epididimário é semelhante entre as espécies, há diferenças espécie-específicas nas funções epididimárias, tais como a glicosilação, proteólise e preservação de proteínas (Belleannee et al., 2011).

Sabe-se que a concentração do líquido epididimal diminui gradativamente de acordo com o transito epididimário, havendo maior perda de líquidos na região da cabeça (Belleannee et al., 2011). Em relação à reabsorção iônica dos íons Na+ e Cl-, há menor concentração na região da cauda do epidídimo.

Por outro lado, a concentração de K+ aumenta no referido segmento (Crabo, 1965; Levine e Marsh, 1971). A redução dos níveis de Na+ e Cl- propicia maior estabilidade ao espermatozoide, já que tais íons, quando em níveis elevados, estimulariam a capacitação espermática e reação acrossomica (Fraser et al., 1993)

De forma semelhante ao controlo osmótico do lúmen epididimário, a concentração de proteínas depende de atividades opostas, tais como síntese e secreção de proteínas; e reabsorção e degradação proteica. Na região da cabeça do epidídimo, destaca-se a reabsorção e degradação, já que as proteínas provenientes do testículo (p.e.: albumina, transferrina e clusterina) deverão ser removidas do fluido epididimário (Dacheux et al., 2003; Dacheux et al., 2009). Não obstante, a cabeça do epidídimo também é considerada a região responsável pela maior secreção de proteínas (Belleannee et al., 2011; Brooks, 1987). Segundo Daucheux et al.

(2006), a reabsorção proteica pode variar segundo a espécie de estudo, pois em humanos, por exemplo, a albumina e transferrina estão presentes por todo o ducto epididimário.

Ação dos Epididimossomos

O epidídimo dispõe de diversas maneiras de secretar proteínas no ducto epididimário, a mais usual é liberar as proteínas por vesículas que se fusionam na membrana das células secretoras eliminando seu conteúdo por exocitose, a chamada secreção merócrina, comum nas células que compõe o epitélio epididimal (Cooper, 1998). Contudo, existe uma via não usual para que algumas proteínas e lipídeos (como o colesterol) se liguem aos espermatozoides, esta via se resume na ação de epididimossomos que se ancoram nas proteínas de superfície dos espermatozoides (Cooper, 1998; Kirchhoff e Hale, 1996). No ducto epididimal as vesículas conhecidas como epididimossomos, são secretados pelas células do epitélio epididimal em forma vesicular de maneira apócrina (Saez et al., 2003). O

mecanismo de transferência de conteúdo dos epididimossomos para os espermatozoides é desconhecido, porém teoriza-se que possa ocorrer fusão entre membranas e posterior aderência, já que os epididimossomos são ricos em colesterol, esfingomielina e cálcio facilitando assim a ligação na membrana espermática (Legare et al., 1999a).

A função específica dos epididimossomos ainda não está totalmente elucidada, acredita-se que eles são necessários para proteção das proteínas secretadas a fim de evitar a ação de proteases existentes no lúmen epididimário (Cornwall, 2009). Porém, é de conhecimento que os epididimossomos estão envolvidos no desenvolvimento da membrana plasmática, tendo papel fundamental na aquisição de proteínas específicas, como por exemplo, a P26h proteína de superfície dos espermatozoides abundante na região da cabeça do epidídimo (Legare et al., 1999a; Sullivan e Saez, 2013). Sendo esta envolvida na ligação do espermatozoide a zona pelúcida do oócito (Legare et al., 1999a; Sullivan e Saez, 2013).

Ação dos Espermatozoides

Em estudo com epidídimos de ratos, Garret et al. (1990) explanam que, além da ação direta das secreções do epidídimo no espermatozoide, a célula espermática regula diretamente as secreções provenientes do epitélio epididimal. O mesmo fenômeno foi encontrado por Reys- Moreno et al. (2008) em estudo in vitro com espermatozoides bovinos. Os autores observaram que os espermatozoides são capazes de estimular a secreção proteica das células do epitélio epididimário, indicando que o próprio espermatozoide exerce papel fundamental na composição do fluído epididimário.

Composição Lipídica

A composição lipídica do fluído epididimário é essencial para a maturação dos espermatozoides. Sabe-se que os lipídeos presentes no plasma epididimário contribuem para as modificações na membrana plasmática das células espermáticas durante a maturação, garantindo sua proteção durante as modificações estruturais (Poulos e White, 1973) e habilitando o espermatozoide à fecundação (Gulaya et al., 2001). Todavia, os mecanismos envolvidos nas mudanças dos fosfolipídeos de membrana dos espermatozoides continuam parcialmente elucidados. Acredita-se, porém, na transferência de fosfolipídeos e proteínas do fluído epididimário para as células espermáticas (Parks e Hammerstedt, 1985; Angrimani et al., 2017a).

Saez et al. (2007), em estudo com ratos knockout para receptores para oxisteróis

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(derivados do colesterol), observaram alterações no perfil lipídico da região da cabeça do epidídimo e diminuição na expressão de genes ligados ao metabolismo de ácidos graxos, demonstrando o papel fundamental dos lipídeos na regulação da função epididimal. Ainda, Angrimani et al., 2017a descreveu alterações no perfil dos ácidos graxos presentes no fluido epididimário e no espermatozoide canino durante a maturação epididimário, relacionando tais achados com uma possível incorporação dos lípidos presentes no ambiente epididimário aos espermatozoides nos estágios finais da maturação.

Composição Proteica

Como o espermatozoide sofre condensação do DNA por ação das protaminas, porém é incapaz de sintetizar proteínas pela sua maquinaria celular, sua maturação é mediada por proteínas secretadas pelo epitélio epididimal (Belleannee et al., 2011). Assim, durante o trânsito pelos epidídimos, os espermatozoides entram em contato com os distintos ambientes bioquímicos específicos, os quais alteram a funcionalidade e a morfologia das células espermáticas (Legare et al., 1999a). Dentre os diferentes componentes bioquímicos, destacam-se as proteínas pertencentes ao fluido epididimal, as quais se associam à superfície dos espermatozoides alterando sua funcionalidade ou morfologia (Fouchecourt et al., 2000). As alterações nas proteínas estruturais da membrana dos espermatozoides atuam como complexos de sinalização para as proteínas sintetizadas pelas células epiteliais dos epidídimos, que por sua vez, irão modificar o perfil proteico dos espermatozoides (Cornwall, 2009).

Foram observadas diversas proteínas no plasma epididimário de roedores como, por exemplo, a clusterina (Sylvester et al., 1991), SPAG 11 (Yenugu et al., 2006), P26h (Legare et al., 1999a) e SED 1, esta última relacionada com a ligação ao oócito, já que age diretamente no acrossomo (Ensslin e Shur, 2003). Em humanos, foram descritas proteínas (HEL 75) do fluído epididimal relativas à defesa antimicrobiana (Lin et al., 2008). Em cães, por outro lado, não há estudos específicos da ação de proteínas na maturação epididimária.

A concentração e local de síntese variam de acordo com cada proteína (Fouchecourt et al., 2000). Todavia, as secreções proteicas obedecem a um parâmetro de importância fisiológica. Portanto, as proteínas secretadas na cabeça e corpo do epidídimo são relacionadas à aquisição de motilidade espermática e potencial de ligação ao oócito, já na cauda do epidídimo, as proteínas sintetizadas atuam na manutenção dos espermatozoides, pois estes devem

permanecer aptos à fecundação mesmo após diversos dias de armazenamento (Belleannee et al., 2011; Legare et al., 1999b). Desta maneira, é imperativo o estudo diferencial das modificações do ambiente epididimário conforme sua região anatômica e sua possível influência funcional e morfológica nos espermatozoides.

Espermatozoides epididimários

Durante o transito pelas regiões da cabeça, corpo e cauda dos epidídimos, os espermatozoides sofrem importantes modificações morfofuncionais (Fouchecourt et al., 2000), as quais permitem adquirir motilidade progressiva, por alterações mitocondriais, migração da gota citoplasmática da região proximal para distal da peça intermediária e estabilização da membrana plasmática e acrossomal (Amann et al., 1993;

Jervis e Robaire, 2001).

Motilidade Espermática

Para habilitar a célula espermática à fecundação, o ganho de motilidade deve acontecer durante sua passagem pelo epidídimo (Belleannee et al., 2011). Logo, é observada imobilidade em espermatozoides provenientes do testículo e aquisição de motilidade progressiva, velocidade e linearidade de acordo com o transito epididimário (Devi e Shivaji, 1994; Martinez- Pastor et al., 2005).

De fato, Yeung et al. (1992), em estudo com espermatozoides epididimários de ratos, observaram, com o auxílio da Análise Computadorizada de Espermatozoides (CASA), que as células espermáticas provenientes da cabeça do epidídimo possuíam imobilidade, baixos índices de Velocidade Linear Progressiva (VSL), Velocidade Média da Trajetória (VAP) e Retilinearidade (STR). Por outro lado, os espermatozoides recuperados da cauda do epidídimo apresentaram superioridade de tais índices. Ainda, os referidos autores relatam que o ganho de motilidade espermática ocorreu no corpo do epidídimo, gradualmente até a cauda epididimária. Os mesmos resultados foram observados em estudo com espermatozoides epididimários de hamsters, ademais ao aumento gradual entre cabeça, corpo e cauda da Linearidade (LIN), Frequência de Batimento Flagelar Cruzado (BCF), Amplitude de Deslocamento Lateral de Cabeça (ALH) e motilidade progressiva (Devi e Shivaji, 1994).

Assim como Angrimani et al. (2016), em estudo utilizando espermatozoides epididimários caninos, constataram maiores valores de motilidade espermática, motilidade progressiva, espermatozoides rápidos, VSL, retilineridade e

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linearidade nos segmentos da cauda, comparadas com corpo e cabeça. E semelhante ao relatado nas demais espécies, relataram o ganho de motilidade espermática no corpo do epidídimo.

As bases químicas envolvidas nos processos de aquisição da motilidade espermática continuam pouco compreendidas. Acredita-se que as alterações em membrana plasmática e transporte iônico estejam relacionados a tal processo (Acott et al., 1983). Serres e Kann (1984), em estudo com espermatozoides da cabeça do epidídimo de hamsters, mostraram a atuação da proteína FMF (forward motility protein) na promoção da motilidade espermática.

Semelhante resultado foi observado em células espermáticas bovinas por Acott et al. (1983).

Migração da Gota Citoplasmática

Durante o processo de espermatogênese, a maior parte do citoplasma é fagocitado pelas células de Sertoli, e apenas um pequeno resíduo prolonga-se no espermatozoide, denominado gota citoplasmática. Durante o trânsito pelos epidídimos, a gota citoplasmática migra ao longo dos espermatozoides (Cooper, 2011).

Todavia, o segmento epididimário específico no qual a migração irá ocorrer pode variar segundo a espécie animal (Cooper e Yeung, 2003). Em felinos, a migração da gota citoplasmática ocorre na região distal do corpo epidídimário (Axner et al., 1999). Já em carneiros, suínos, coelhos e touros, a migração ocorre na região média do corpo do epidídimo (Amann et al., 1982; Briz et al., 1995; PerezSanchez et al., 1997; Tajik et al., 2007a). Segundo Varesi et al.

(2013) e Angrimani et al. (2014a), em cães, a maior porcentagem de gotas proximais localiza- se no segmento da cabeça do epidídimo e a migração para a região distal ocorre no corpo epididimário. Portanto, é frequente a incidência de gotas citoplasmáticas distais em espermatozoides oriundos da cauda do epidídimo. Porém, vale ressaltar que, na maioria das espécies, a gota é perdida após a ejaculação (Axner et al., 1998).

O mecanismo exato para a migração da gota citoplasmática permanece incerto. Entretanto, acredita-se que a migração ocorra por pressão exercida de forças mecânicas envolvidas no lúmen epididimário durante os movimentos peristálticos, aliados à alta concentração espermática do local (Cooper e Yeung, 2003).

Assim como o mecanismo de migração, a função da gota citoplasmática permanece não totalmente elucidada, atualmente acredita-se que substratos presentes neste resquício de citoplasma podem contribuir para o início da função mitocondrial (Angrimani et al., 2017b;Yuan et al., 2013).

Acrossomo

Dentre todas as modificações morfofuncionais que o espermatozoide atravessa durante o percurso pelo epidídimo, aquela que irá influenciar diretamente a fecundação oocitária é a alteração acrossomal (Lakoski et al., 1988). O acrossomo é uma organela situada na cabeça do espermatozoide, originalmente formado de vesículas produzidas no aparelho de Golgi. Sua estrutura formada por enzimas digestivas facilitam a penetração da célula espermática no oócito (Zhang e Lin, 2002).

Durante o transito epididimário, observa-se a remodelação da estrutura acrossomal, ocorrendo redução de seu tamanho (Hewitt et al., 2001).

Varesi et al. (2013), em estudo com espermatozoides epididimários caninos, observaram redução no número de alterações na membrana acrossomal entre a cabeça, corpo e a cauda do epidídimo, justificada pela remodelação dimensional do acrossomo. Este efeito foi novamente relatado, posteriormente por Angrimani et al. (2014a) também com espermatozoides epididimários caninos.

Contudo, tal processo foi observado inicialmente em estudo clássico de Bedford (1963), o qual avaliou espermatozoides epididimários de coelhos. Por outro lado, Axner et al. (1999) sugerem que a diminuição no número de acrossomos anormais na cauda do epidídimo em felinos ocorre por mecanismo de fagocitose de células anormais nesta região.

Portanto, as modificações acrosssomais no âmbito epididimário ainda precisam ser melhor estudadas para o estabelecimento da dinâmica fisiológica envolvida.

Defeitos Morfológicos dos Espermatozoides Epididimários

As alterações morfológicas do sêmen ejaculado classificadas como defeitos menores estão relacionados ao transporte e armazenamento dos espermatozoides no epidídimo. Durante o trajeto entre cabeça e cauda do epidídimo, fisiologicamente, ocorre decréscimo do número de espermatozoides anormais. Porém, a explicação fisiológica para este fenômeno é desconhecida, pois pode decorrer da própria maturação celular ou da remoção de células anormais (Varesi et al., 2013). Rao, Bande e Gustafsson (1980) apontam que a cauda do epidídimo é o local onde ocorre a reabsorção seletiva (por fagocitose) ou a dissolução de células com defeitos, sendo os espermatozoides mais suscetíveis à fagocitose aqueles que possuem os defeitos morfológicos de cabeça piriforme, estreitamento na base e cabeça subdesenvolvida.

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Em estudo sobre maturação epididimária de espermatozoides felinos, Axner (2006) relata o decréscimo do número de defeitos espermáticos ao longo do epidídimo e destaca que o fenômeno pode ser explicado pela reabsorção seletiva. O mesmo autor, ainda, observou que espermatozoides imaturos possuem altos teores de creatinina fosfoquinase (CPK), a qual pode servir como sinalizador para as células fagocíticas. Por outro lado, espermatozoides maduros possuem membrana plasmática rígida que evita sua eliminação em nível epididimário (Axner et al., 2002). Assim, a habilidade dos epidídimos em modificar a morfologia espermática é uma função interessante que deve ser levada em conta para avaliar o potencial reprodutivo masculino (Rao et al., 1980).

Mitocôndrias Espermáticas

Durante a espermatogênese e na maturação espermática ocorrem processos peculiares de diferenciação celular e reestruturações dos componentes celulares à medida que a célula imóvel é transformada em espermátide e, em seguida, em espermatozoide com motilidade (Yaffe, 1997). Dentre tais modificações, a mitocôndria tem papel fundamental.

As mitocôndrias são responsáveis por, aproximadamente, 90% da produção de energia celular, a qual ocorre por meio do processo de fosforilação oxidativa. Além disto, esta organela é responsável pela maior parte da produção endógena de espécies reativas ao oxigênio (EROs), sendo assim, considerada a reguladora de apoptose celular (Copeland, 2002). As mitocôndrias geram adenosina trifosfato (ATP) pela fosforilação oxidativa, por metabolismo anaeróbico ou aeróbico. Na célula espermática, as mitocôndrias localizam-se apenas na peça intermediária, formando a bainha mitocondrial e produzindo ATP através de respiração aeróbica (Cummins et al., 1994).

Para o espermatozoide iniciar a motilidade flagelar, é preciso grande quantidade de ATP, distribuído por todo o flagelo em curto espaço de tempo. Assim, pesquisas recentes na espécie ovina, suína, equina e canina teorizam que ocorra um mecanismo compensatório de geração de ATP, tais como a presença de estoques de glicogênio e a efetivação da gliconeogênese pela célula espermática (Palomo et al., 2003; Turner, 2003). As mitocôndrias também agem no processo de seleção espermática ao longo do trajeto pelos epidídimos, determinando a apoptose celular de espermatozoides indesejáveis ou danificados que serão reabsorvidos (Sakkas et al., 1995). A apoptose celular inicia-se com a redução do potencial de membrana mitocondrial decorrente da fragmentação do DNA nuclear, aumento na

produção de espécies reativas ao oxigênio e, por fim, ao aumento da permeabilidade da membrana plasmática (Kroemer et al., 1997).

Segundo Amann et al. (1993), as mitocôndrias, em conjunto com a membrana plasmática, passam por diversas modificações durante a maturação espermática de suma importância para a transdução eficiente de ATP e aquisição de motilidade espermática. Dentre tais modificações, destaca-se a fosforilação da tirosina, inicialmente na peça intermediária e, em seguida, na cauda do espermatozoide. Este seria o evento inicial para a fosforilação de diversas proteínas mitocondriais, gerando, assim, o potencial mitocondrial (PENA et al., 2009). Na região do corpo epididimário ocorrem as principais alterações de membrana plasmática, concomitantemente ao início do ganho de motilidade e também à maior produção de ATP pelas mitocôndrias espermáticas. As mitocôndrias permanecem em estágio silencioso na cabeça do epidídimo e em alta atividade na cauda, indicando o ganho de potencial mitocondrial no corpo epididimário (Aitken et al., 2007). Em cães, foi observada maior funcionalidade mitocondrial após a migração da gota citoplasmática da região proximal a distal, indicando um efeito modulador da mesma (Angrimani et al., 2017b).

Gallon et al. (2006), em estudo utilizando a citometria de fluxo em espermatozoides humanos, sugerem que o alto potencial mitocondrial está intimamente relacionado à capacidade de fertilização espermática.

Membrana Plasmática

As modificações na membrana plasmática são importantes transformações em nível epididimário, decorrentes da maturação da célula espermática (Lakoski et al., 1988). As remodelações da membrana plasmática ocorrem nas regiões da cabeça, corpo e cauda do epidídimo, mudanças extremamente necessárias para a integridade celular e fecundação (Parks e Hammerstedt, 1985; Petruszak et al., 1991).

Em função das alterações na membrana plasmática, os espermatozoides são capazes de adquirir a motilidade espermática (Acott et al., 1983) e o potencial mitocondrial (Amann et al., 1993). Além disto, as mudanças na composição lipídica da membrana plasmática em nível epididimário promovem estabilização da membrana para a estocagem e transporte dos espermatozoides no trato reprodutivo masculino, além da reorganização molecular necessária para capacitação no trato reprodutivo feminino (Parks e Hammerstedt, 1985).

Corroborando tais afirmações, Ammann et al.

(1993) relatam que, nas primeiras regiões epididimárias, a membrana plasmática é

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flexível, com o intuito de facilitar a remodelação necessária. De fato, em cães, foi observada maior permeabilidade da membrana plasmática nas regiões da cabeça e corpo do epidídimo em relação à cauda (Angrimani et al., 2014b; Angrimani et al., 2014a). Desta forma, o espermatozoide permanece estável e é capaz de suportar as injúrias do armazenamento na cauda do epidídimo ao final do processo de maturação espermática, além de estar apto à fecundação.

A composição da membrana lipídica ao final da maturação espermática pode variar de acordo com a espécie, mas, comumente, é constituída por 70% de fosfolipídios, 25% de lípidos neutros (como o colesterol) e 5% de glicolipídios (Flesch e Gadella, 2000). Contudo, o mecanismo exato de estruturação da membrana plasmática deve ser investigado, pois acredita-se que ocorram mudanças na composição dos ácidos graxos estruturais dos espermatozoides, devido às transferências de fosfolipideos e proteínas presentes no fluído epididimário para a célula espermática (Fouchecourt et al., 2000; Parks e Hammerstedt, 1985; Angrimani et al., 2017a).

Perspectivas decorrentes do estudo da maturação epididimária

Diante das distintas informações científicas arroladas nesta revisão de literatura, cabem algumas considerações com o intuito de reforçar o potencial científico para o estudo da maturação espermática nos epidídimos.

Os espermatozoides provenientes da cauda do epidídimo, em condições controladas de reprodução assistida, podem gerar resultados semelhantes ao sêmen ejaculado. Desta maneira, são interessantes alternativas para as biotecnologias da reprodução em cães (Yu e Leibo, 2002), tais como a inseminação artificial a fresco (Klinc et al., 2005) ou a criopreservação (Hori et al., 2004). O emprego deste material em tais biotecnologias apresenta grande importância na disseminação do material genético dos canídeos, pois a criopreservação possibilita o armazenamento do material genético post-mortem, utilizando-se a técnica de colheita de espermatozoides epididimários (Thomassen e Farstad, 2009).

Por tais motivos, as pesquisas que objetivam elucidar a fisiologia espermática e dos epidídimos em cães podem gerar protocolos e técnicas específicas para a recuperação, transporte e armazenamento de amostras epididimárias. Assim, são importantes para a criação de bancos de germoplasma de canídeos selvagens, contribuindo para a preservação destas espécies (Tittarelli et al., 2006). Ademais, os estudos em espermatozoides epididimários podem colaborar para o desenvolvimento de

biotecnologias tais como o estabelecimento de protocolos de maturação e fecundação in vitro e a injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (Travis et al., 2009).

Conclusão

A colheita de espermatozoides epididimários pode ser a última oportunidade para armazenar o material genético de animais superiores, ou mesmo em extinção. Assim, o conhecimento fisiológico das etapas envolvidas na maturação epididimária é fundamental para o possível emprego dos espermatozoides epididimários nas biotécnicas da reprodução.

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RPCV (2017) 112 (601-602) 12-22

12 Canine periodontal disease and its systemic implications - a review

Doença Periodontal canina e as suas implicações sistémicas – revisão bibliográfica

Eva Cunha¹, Tiago Trovão¹, Raquel Santos^1,2, Jos Diogo Santos¹, Jorge Moreira da Silva³, Berta São Braz¹, Ana Salom Veiga², Luís Tavares L¹, Manuela Oliveira¹

1

Centre for Interdisciplinary Research in Animal Health (CIISA) / Faculdade de Medicina Vetarinária da Universidade de Lisboa, Avenida da Universidade Técnica,

1300-477, Lisboa, Portugal

2

Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, Avenida Egas Moniz, 1629-028 Lisboa, Portugal

3

Virbac Portugal

Abstract: Periodontal disease (PD) is one of the most widespread diseases in dogs with a prevalence of 80%. PD is an inflammatory disorder caused by the formation of a dental plaque that affects the periodontium, promoting gingivitis and periodontitis. PD has a multifactorial aetiology, with the bacterial activity combined with the animal immune- inflammatory response being responsible for the onset of PD pathogenesis.

Control and removal of dental plaque are the standard procedures for therapeutics and prophylaxis. PD prevention is based on dental hygiene care, appropriate diet and regular evaluation by a veterinarian. For treatment, we can use surgical and non-surgical methods.

Besides PD local effects, systemic consequences can occur secondary to the dissemination of dental plaque bacteria via bloodstream, resulting in bacteraemia and in an exacerbated inflammatory response that can affect distant tissues and organs. Renal, hepatic, thromboembolic and cardiac diseases, cerebral and myocardial infarctions and atherosclerosis are some of the systemic diseases that have been related with PD in dogs. Additionally, several authors consider dogs as good models for human periodontal disease, also showing the importance of these studies for Human Medicine.

*Correspondência: [email protected]

Resumo: A doença periodontal (DP) é uma das doenças mais frequentes no cão, apresentando uma prevalência de 80%. É uma doença inflamatória causada pela formação de placa dentária que afeta o periodonto, causando gengivite e periodontite. A DP possui uma etiologia multifatorial, sendo desencadeada pela atividade bacteriana combinada com a resposta inflamatória do animal.

O tratamento e profilaxia da DP têm por base o controlo e remoção da placa dentária. A prevenção da PD baseia-se em cuidados de higiene dentária, alimentação adequada e avaliações médico-veterinárias regulares. No tratamento podem ser aplicados métodos cirúrgicos e não cirúrgicos.

Além das consequências locais a DP pode também originar complicações sistémicas, resultantes da disseminação de bactérias da placa dentária através da corrente sanguínea e da resposta inflamatória exagerada do animal, afetando diferentes tecidos e órgãos. Algumas das possíveis complicações sistémicas relacionadas com DP em cães incluem alterações renais, cerebrais e/ou hepáticas, bem como problemas tromboembólicos e cardiovasculares (enfartes do miocárdio e aterosclerose). Por outro lado, vários autores consideram o cão como um bom modelo para a DP em humanos, o que também demonstra a importância destes estudos para a Medicina Humana.

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2 Introduction

Periodontal disease (PD) is one of the most frequent and widespread diseases in dogs (Marshall et al., 2014). It is an inflammatory disorder caused by the formation of a dental plaque that affects the periodontium, which includes the gingiva, alveolar bone, periodontal ligament and cementum, causing gingiva inflammation (gingivitis) or periodontium inflammation (periodontitis) (see image 1) (Soukup, 2010, Albuquerque et al., 2012).

Despite the essential and primary role played by the dental plaque in PD development, it is the persistent host inflammatory response against bacterial aggression that causes a significant damage to the periodontium tissue (Pavlica et al., 2008; Albuquerque et al., 2015).

In fact, PD aetiology is multifactorial.

Several factors contribute to animal susceptibility, development and clinical expression of the disease, including microbiological, behavioural, environmental, systemical/metabolical, immunological, anatomical and genetical factors (Albuquerque et al., 2012). Specific examples include a poor or total absence of oral hygiene, malocclusion problems, lack of salivary production (xerostomia), radiation therapy, soft food exclusive diet and nutritional imbalances (Soukup, 2010; Albuquerque et al., 2012).

Additionally, gingival enlargement, with formation of gingival pseudo-pockets, also contributes to PD by promoting dental plaque development. These pseudo-pockets are a result of coronally migration of hyperplastic tissue leading to a sulcus depth greater than normal (Albuquerque et al., 2012). This enlargement

can be caused by certain drugs including cyclosporine, anticonvulsants and calcium channel blockers, or by neoplastic, systemic/nutritional (e.g. vitamin C deficiency) and inflammatory diseases, having idiopathic or hereditary aetiology in some breeds (Lewis and Reiter, 2005; Soukup, 2010).

In dogs, PD severity and incidence increase with age, being observed that small and brachycephalic breeds are more vulnerable (Pavlica et al., 2008; Rawlinson et al., 2011;

Marshall et al., 2014). Reports show that PD prevalence is high ranging from 44 to 63.6%

and rising to 84% in animals with 3 years or older (Marshall et al., 2014). In addition, PD prevalence of 100% is described in poodles with more than 4 years old (Marshall et al., 2014).

PD Pathogenesis

PD onset requires the adherence of oral bacteria to tooth surface and formation of dental plaque, which is a microbial biofilm constituted by a cooperating community of microorganisms protected by a matrix of salivary glycoproteins, extracellular polysaccharides and epithelial cells (Niemiec, 2008a; Whyte et al., 2014). In dental plaque development, first occurs the formation of a pellicle formed by a saliva-derived layer of glycoproteins that coats tooth surface, followed by microorganism’s adherence to the pellicle and finally community maturation and formation of complex bacterial interaction in the plaque. Regarding its location, dental plaque in teeth surface can be supragingival or subgingival if it extends to gingival sulcus and alveolar bone (Niemiec, 2008a). Due to mineralization of carbonate and phosphate calcium salts present in dog’s saliva, dental Image 1: Cross-section of the periodontium, original image.

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Cunha et al., RPCV (2017) 112 (601-602) 12-22

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plaque can turn into calculus or tartar (Niemiec, 2008a; Carreira et al., 2015).

Several aerobic and anaerobic microorganisms, present in dog’s oral microbiota, have been associated with PD, including gram positive bacteria from the genera Streptococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Bacillus, Lactobacillus, Peptoniphilus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Actinomyces and Propionibacterium, and gram negative bacteria from the genera Neisseria, Veillonella, Haemophilus, Proteus, Pseudomonas, Actinobacillus, Eikenella, Capnocytophaga, Escherichia, Porphyromonas, Prevotella and Fusobacterium (Ferreira et al., 2006; Polkowska et al., 2014; Oh et al., 2015; Wallis et al., 2015;

Oliveira et al., 2016; Pieri et al., 2016).

Spiroquetes and protozoa are also described by some authors as responsible for PD development in dogs (Wallis et al., 2015; Patel et al., 2016; Pieri et al., 2016).

Initially is formed by gram positive, aerobic facultative, non-motile, rods and cocci microorganisms. However, during PD development, microenvironment changes favor the growing of facultative anaerobe, promoting an increase in the number of gram negative, motile, anaerobic bacteria (Soukup, 2010).

These microorganisms infiltrate the subgingival plaque and produce several metabolites, such as ammonia and volatile sulfur compounds, cytotoxins, bacterial endotoxins and proteolytic enzymes, which lead to periodontium inflammation and activates the response from the animal’s immune system (Niemiec, 2008a).

Bacteria lipopolysaccharides and metabolic products activate monocytes, fibroblasts, endothelial and epithelial cells, which release pro-inflammatory cytokines that induce inflammatory responses and catabolic processes, such as bone resorption and collagen destruction, resulting in periodontium destruction (Pavlica et al., 2008; Albuquerque et al., 2012; Nemec et al., 2013). Additionally, they also stimulate neutrophils chemotactic attraction, vasodilatation and activation of immune pathways including complement, arachidonic acid and kinin cascades (Albuquerque et al., 2012). Mast cell degranulation, due to complement activation, along with the local action of leucocytes, fibroblasts, osteoclasts and osteoblasts, leads to proteinase, cytokine and prostaglandin release, which enhance the inflammation process (Soukup, 2010; Niemiec, 2008a). Therefore, PD progression and pathogenesis is strongly affected by bacteria activity combined with the animal immune-inflammatory response (Albuquerque et al., 2015).

PD is used to describe oral diseases that range from gingivitis to periodontitis. Gingivitis begins as an inflammatory response to supragingival plaque, and it is a reversible condition, while periodontitis is an inflammation of periodontal tissues beyond gingiva with irreversible character (Carreira et al., 2015; Shirai et al., 2015).

Clinical signs and staging

Identification and classification of the disease are essential points in evaluation and resolution of the clinical case. For that, it is important that the veterinarian is able to recognise a perfectly normal and healthy gingiva, without dental plaque or calculus, pink color, regular texture, thin and knife-like edges and a sulcus depth of 0 to 3 mm (Albuquerque et al., 2012, Carreira et al., 2015).

Halitosis is the most frequent sign described by owners in PD cases and should not be neglected (Soukup, 2010). A complete mouth evaluation must be performed in these cases to identify PD signs, with the help of complementary methods, i.e. oral X-ray films and periodontal probes, to allow PD staging (Albuquerque et al., 2012; Carreira et al., 2015).

As referred before, PD includes two distinct conditions, gingivitis and periodontitis. The first clinical sign of gingivitis is mucosa erythema, followed by edema, gingival bleeding, retraction, hyperplasia or swollen, and halitosis (Niemiec, 2008a; Albuquerque et al., 2012).

Periodontitis is characterized by attachment loss with formation of periodontal pockets due to apical migration of the junctional epithelium, gingival recession, loss or reabsorption of alveolar bone and furcation exposure (Carreira et al., 2015).

Attachment loss can be measured by probing the clinical attachment level (CAL) or by radiographic determination of the distance of the alveolar margin from the cemento-enamel junction relative to the length of the root (American Veterinary Dental College, 2016).

CAL is the main determination allowing to access PD evolution and severity and it can be defined as the distance from cemento-enamel- junction to the pocket bottom (Kortegaard et al., 2014). CAL can be combined with probing pocket depth (PPD), the determination of the distance between gingival margin to the pocket bottom, for screening and treatment planning (Kortegaard et al., 2014).

Furcation exposure occurs in teeth with attachment loss, being presenting 3 stages. This evaluation is performed using a periodontal probe placed under the crown of multirooted

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Cunha et al., RPCV (2017) 112 (601-602) 12-22

4

teeth (American Veterinary Dental College, 2016).

PD can be classified/staging in four stages based on clinical signs and lesions severity: PD 1 (gingivitis), PD 2 (early periodontitis), PD 3 (moderate periodontitis), and PD 4 (advanced periodontitis) (see image 2). In PD 1, gingivitis without attachment loss can be observed as well as normal periodontal probing and no bone loss on X-ray. In the next stage, less than 25% of attachment loss can be detected or, at most, a stage 1 furcation exposure. Early radiologic signs of periodontitis and periodontal probing with pockets 4mm deep can also be observed in PD 2. In stage 3, 25 to 50% of attachment loss or stage 2 furcation exposure can occur and a PPD between 4 to 6mm. In the last stage, more than 50% of attachment loss or stage 3 furcation exposure can occur, and also a PPD with at least 6mm deep (American Veterinary Dental College, 2016; Tavares, 2014; Carreira et al., 2015).

Other clinical signs and local lesions also observed in animals with PD include ptyalism, anorexia, behaviour alterations, tooth mobility, periodontal and periapical abscesses, nasal discharge, sneezing, osteomyelitis, contact ulcers and inflammation of the orbit, intranasal dental migration, and oronasal fistulas (Niemiec, 2008a; Albuquerque et al., 2012).

Pathologic fractures, usually in the mandible, can occur secondary to chronic periodontal loss, during dental extraction or resulting of mild

trauma. Moreover, oral cancer may also be linked to PD (Niemiec, 2008a).

Treatment

Bacterial dental plaque control is the aim and focus of PD therapeutics and prophylaxis (Albuquerque et al., 2012). PD treatment can be performed using non-surgical or surgical techniques, but general anaesthesia is always necessary (Soukup, 2010).

The first line of treatment is always non- surgical, aiming at the removal of factors that promote disease progression. Scaling and root planning are important procedures in initial treatment protocols. Scaling is the process of removing supragingival or subgingival dental plaque and calculus, whereas root planning is the removal of residual calculus from root surface. A combination of manual scaling using scalers and curettes, and mechanical scaling with ultrasonic instrumentation, polishing and sulcular lavage can be performed, providing a

higher reduction of periodontal microorganisms (Niemiec, 2008b). Additionally, antimicrobials can also be used, as the delivery of antimicrobials can promote the reduction of gingival inflammation and bleeding, pocket depths, subgingival bacteria and CAL in dogs (Soukup, 2010). A perioceutic gel composed of doxycycline is available for PD local treatment.

For instance, administration of systemic antimicrobials in PD are limited, and the ratio risk/benefit, PD severity and clinical status evaluation of the animal must be done before Image 2: Staging of Periodontal disease (PD) adapted from Tavares (2014).