Preparo,
Identificação e
Armazenamento
de amostras
Curso de Boas Práticas Laboratoriais
de amostras
biológicas
Silene Peres Keusseyan Maio/2011
Centrifugas
Poucos experimentos são realizados sem pelo menos uma
passagem pela centrífuga
Usadas para separar partículas de uma solução
Em laboratórios de pesquisa biológica: Em laboratórios de pesquisa biológica:
Sangue
Células
Separação de fases
Organelas
Isolamento de macromoléculas (DNA, RNA, vírus,
Centrifugação
Qual velocidade? rpm x rfc (g) ?
Qual o tipo de separação desejado?
Qual centrífuga usar?
Qual centrífuga usar?
Que temperatura?
Qual o tubo apropriado?
Qual o rotor?
Força centrífuga
A força centrífuga relativa (Rcf) cuja unidade é o g é gerada quando uma partícula ou conjunto de partículas é sujeito a um movimento
circular de aceleração
Rcf (g) = 1,12 x 10-5 x R x N2
R = raio em centímetros R = raio em centímetros
N = velocidade de centrifugação em rpm
Tipos de centrifugação
Centrifugação diferencial (separação de fases)
Amostras centrifugadas a certa velocidade resultam em sobrenadante e pélete (baseada no tamanho das partículas)
Tamanho maior sedimenta mais rápido
Ex: separação do sangue em elementos figurados e plasma / soro, Ex: separação do sangue em elementos figurados e plasma / soro,
Tipos de centrifugação
Centrifugação por gradiente de densidade
Centrifugação de escala zonal
Separação de partículas com diferentes densidades Ex: separação de mononucleares por Ficoll-Hypaque
Hemácias:1095 densidade, mononucleares 1065 e Ficoll 1077 Hemácias:1095 densidade, mononucleares 1065 e Ficoll 1077 Utiliza gradiente de meio viscoso
Sangue diluído Ficoll-Hypaque soro plaquetas Mononucleares “nuvem” eritrócitos granulócitos Ficoll-Hypaque
Centrífugas
Centrífuga de bancada
Centrífuga de bancada refrigerada
Centrífuga de alta velocidade
Ultracentrífuga
Microcentrífuga
Centrífuga de bancada
Múltiplos fins: peletizar células e bactérias, sedimentação de soro,
urina, células e sangue
Suporte oscilante: até 3.800g ou 6.000 rpm Capacidade:
normalmente 32 x 5mL ou 16 x 10mL
Com ou sem tacometro Controle de tempo
Sem freio
Fanem Excelsa Baby mod 206
Centrífuga de bancada
refrigerada
Múltiplos fins: peletizar células e bactérias, sedimentação de soro,
urina,células e sangue Ângulo fixo 2 tipos de rotores: 28 x 2 mL – máx 14500rpm – 17400rcf (g) 28 x 2 mL – máx 14500rpm – 17400rcf (g) 10 x 10 mL – máx 13500rpm – 16900rcf (g) Refrigeração : -8°C até +40°C Controle de aceleração/desaceleração
(alta para peletização, baixa para gradientes)
Memória para programas Sensor tampa fechada
Centrífuga de alta velocidade
refrigerada
Precipitações de grandes volumes
2 tipos de rotor (R24A e R12A3)
Ângulo fixo R24A: 8 x 50mL – máx 24000rpm – 68900rcf (g) R12A3: 6 x 300mL – máx 12000rpm – 23800rcf (g) Refrigeração: -20°C até +40°C Controle de aceleração/desaceleração Controle de tempo
Sensor tampa fechada
Ultracentrífuga
Sedimentação de macromoléculas, ribossomos, vírus...
Ângulo fixo ou suporte oscilante
Até 100.000rpm - 800000rcf (g)
Tubos tamanhos variáveis ,
Chão ou bancada
Programável
Sempre refrigerada
Câmara fechada à vácuo (atrito com ar eleva temperatura
e diminui velocidade)
Programável
Microcentrífuga
Volumes pequenos, precipitação de células (baixa
velocidade), retirada de “debris”, extrações com etanol e minifenol
Ângulo fixo: máx 14000rpm
Ângulo fixo: máx 14000rpm
Capacidade :tubos eppendorf 20 x 2mL
Sensor tampa
Sem refrigeração
Citocentrífuga
Produção de monocamada de células em área definida
Ex: lâminas para detecção de Anca
Cytofunnel saída única ou dupla
Programável
Capacidade até 12 câmaras
Suporte oscilante:200 a 2000rpm
Sensor tampa fechada + tampa de segurança
Tubos
Seleção do tubo adequado: De acordo com o tipo de rotor
Evitar vazamento ou perda da amostra (mecanismo de lacre) Assegura compatibilidade química (resistência)
Permite fácil recuperação da amostra (transparência) Permite fácil recuperação da amostra (transparência)
Como centrifugar
Conheça as limitações de velocidade da centrífuga e dos
rotores
Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas,
proteção e pinos
Se usar um tubo para equilibrar, encha-o com material
similar ao que vai centrifugar - água = contrabalancear fora do meio
Utilize tubos, tampas e suportes apropriados (filme
plástico)
Preencha os tubos até 1 ou 2 cm da borda
Como centrifugar
Suportes não utilizados podem desequilibrar a centrífuga
Materiais infecciosos SOMENTE EM TUBO FECHADO
Retire as amostras da centrífuga assim que terminar - Retire as amostras da centrífuga assim que terminar
-amostras paradas = pélete disperso
Centrífugas refrigeradas: feche a tampa no intervalo das
centrifugações (evitar queda de temperatura e
condensação) e deixe aberta quando terminar (secar)
Limpe com pano macio e hipoclorito/álcool 70% quando
Como equilibrar os tubos
Tubos frente a frente = mesmo peso
Microcentrífuga – ajuste por volume, não por peso
Alta velocidade ou ultra centrífuga – pesar tubos em duplas
com balança de pratos
Suportes de 4 tubos ou mais – equilibrar dois conjuntos em
balança de pratos e colocá-los frente a frente
Suportes não completos = equilibre na diagonal
Amostras estéreis – equilibre o volume dos pares “a olho”,
se necessário ajustar suportes use álcool 70% fora do tubo
Use o mesmo meio que sua amostra para ajustar tubos
Armazenamento de
amostras
Identificação
Canetas permanentes e durex sobre o escrito para tubos e caixas
NUNCA identifique amostras de pacientes pelas iniciais
Ex: MCO = Maria Cristina Oliveira – quantas ?
Todo material coletado pela disciplina, pertence à disciplina , não ao
pós-graduando pós-graduando
Material devidamente identificado pode ser utilizado no futuro
001 LESa SPK 03/05/11 Caixa 1 De 001 a xxx LESa ou protocolo YY NPS ano 2011
Banco de dados
data coleta Nº ENSAIO RG HSP Nome SEXO Idade Sledai ETNIA ACR FAN DNAifi DNA EIA CH100/C2
001 LESa SPK 20/07/2004
data coleta Nº ENSAIO RG HSP Nome SEXO Idade Sledai ETNIA ACR FAN DNAifi DNA EIA CH100/C2
20/07/2004 1 1058511 Bruna Suzuki Donoso F 14 6 NC 4 PF 1:320 NEG 101 182U/>100% 27/09/2004 2 1485459 Helen Micaela A Aguiar F 6 6 C 9 PF>1:320 NEG 94 161U/67 17/08/2004 3 10068367 Fernando de Souza M 16 8 C 5 NEG NEG 50 150 14/09/2004 4 10070001 Liliam Bruna O Magalhães F 17a 11m 8 C 6 PF 1:80 NEG 81 263/88% 28/09/2004 5 1061544 Juliane B de Oliveira F 18a 11m 12 C 7 PF 1:80 NEG 173 234/>100% 19/10/2004 6 10099595 Paula Ferreira F 16 13 C 6 PF1:640 NEG 74 <30/43%
15/07/2004 7 10052027 Thiago L de Oliveira M 14 16 C 9 PF 1:320 NEG 81 203/100 16/08/2004 8 1134111 Isabela C de Souza F 18 14 NC 6 HO >1:640 1/40 505 239/>100% 19/04/2005 9 10104632 Jaqueline R S Albuquerque F 11 8 C 5 PG >1:640 NEG 173 277/>100%
Conservação de amostras
Geladeira: material biológico temporariamente, reagentes e
soluções pelo prazo de validade dos mesmos
Sangue total: utilização imediata para ensaios
hemodinâmicos e dosagens bioquímicas, geladeira por 1 semana* ou -20ºC somente para futura extração de DNA semana* ou -20ºC somente para futura extração de DNA
Soro ou plasma: -20ºC por tempo indeterminado (selado)
Células sempre em solução de tamponamento para morte
celular
-70ºC por tempo limitado, nitrogênio líquido (-196°C ) por
tempo indeterminado
Conservação de amostras
Alíquotas
Por que fazer?
Prevenir decomposição por congelamentos e
Prevenir decomposição por congelamentos e
descongelamentos repetidos
Prevenir contaminação por múltiplos usos
Por conveniência física
Para economizar tempo no preparo de uma solução ou
Freezers -20º e -70ºC
Só abra a porta quando necessário e por pouco tempo
Se precisar manipular alguns tubos, retire a caixa do freezer
e coloque no gelo enquanto procura
Todas caixas ou recipientes colocados no freezer devem Todas caixas ou recipientes colocados no freezer devem
estar devidamente ROTULADOS e TAMPADOS
Periodicamente descarte material que não for mais utilizar
Mantenha um registro da localização de seus materiais
Respeite os espaços
Não altere localização de material alheio
UNIFESP
Disciplina de Reumatologia
“Na Bancada - Manual de iniciação científica em laboratório de pesquisas biomédicas”, Kathy Baker, Editora Artmed, 2002
“Boas Práticas de Laboratório” , Maria de Fátima da Costa Almeida, Editora Difusão, 2008
