UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
GIULIA DE ANDRADE MARINHO OLIVEIRA
Avaliação da importância funcional da triparedoxina peroxidase mitocondrial para o Trypanosoma cruzi
Campinas 2018
GIULIA DE ANDRADE MARINHO OLIVEIRA
Avaliação da importância funcional da triparedoxina peroxidase mitocondrial para o Trypanosoma cruzi
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Funcional e Molecular, na Área de Bioquímica.
ESTE ARQUIVO DIGITAL
CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA GIULIA DE ANDRADE MARINHO OLIVEIRA, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. FERNANDA RAMOS GADELHA.
Orientadora: Profa. Dra. Fernanda Ramos Gadelha
Coorientador: Prof. Dr. Eduardo de Figueiredo Peloso
CAMPINAS 2018
Campinas, 12 de janeiro de 2018
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Fernanda Ramos Gadelha
Prof. Dr. Danilo Ciccone Miguel Dra. Dayse Machado
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Á Deus,
Porque dele, por Ele e para Ele são todas as coisas.
Agradecimentos
Aos meus pais, que sempre foram meus maiores incentivadores e minha maior inspiração. Agradeço por terem desde sempre priorizado meus estudos e me apoiado em cada decisão, por vibrar minhas vitorias como se fossem suas, amo vocês incondicionalmente. Á minha irmã e melhor amiga, meu ponto de equilíbrio nesse mundo e também melhor revisora. Te amo.
Ao meu marido que sempre apoia minhas escolhas e pacientemente me dividiu por vários sábados, domingos e feriados com bactérias e protozoários sem nunca reclamar.
Á minha família que foi base para que sou hoje. Meus tios, primos e avós que sempre com bom humor alegram a minha vida, vocês são essenciais
Á professora Fernanda, que foi muito mais que orientadora! Foi inspiração demonstrando sua paixão e dedicação pelo que faz, amiga e conselheira ao longo desses anos. Obrigada por dividir sua paixão pela ciência e me permitir aprender com você.
Ao Eduardo pelas excelentes contribuições para o trabalho.
As meninas no laboratório: Isa, Tabata e Andressa. Obrigada por tornarem a jornada muito mais divertida, por torcerem a cada nova tentativa e me animarem sempre. Um Obrigada especial a Andressa, que foi essencial para diversos experimentos e por cuidar das minhas células como se fossem suas na minha ausência.
Aos meus amigos mais chegados que irmãos que torcem por mim sempre, em especial ao Lucas, Vivi, Marcelo e Fabi.
Aos queridos amigos do colégio Ágape, meus incentivadores, sempre preocupados e prontos a ouvir. Vocês são muito especiais e dividir minha rotina com vocês torna tudo mais divertido.
Aos meus alunos, a razão de eu buscar ser uma bióloga melhor é dar o melhor para vocês. A cada dia difícil os sorrisos e abraços nos corredores me davam forças. Muito mais que o título, espero ser lembrada como “mestre” por vocês.
As minhas parceiras desde o início da jornada biológica: Mari, Nath e Nay. Mesmo de longe sempre arrumam um tempo para se preocuparem comigo, com a tese... são os maiores presentes que o curso de Biologia me deu.
Ao professor Danilo que sempre foi solícito, participando da qualificação, defesa e cedendo os aparelhos para a obtenção das imagens deste trabalho, muito obrigada. Ao querido Ed, que foi muito além de professor e orientador, uma inspiração como biólogo e pessoa.
Aos membros da banca, que prontamente aceitaram o convite. Á UNICAMP pela oportunidade, apoio e estrutura.
Resumo
O Trypanossoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Atualmente o tratamento é restrito a um único medicamento que não é efetivo na fase crônica e leva a sérios efeitos colaterais. A busca por novos alvos é essencial para o desenvolvimento de um tratamento mais efetivo para a doença. Uma das formas de se avaliar a importância de uma proteína para a sobrevivência de uma célula é através da interrupção da sua expressão. A genética peculiar do T. cruzi não permite que métodos normalmente utilizados em outros tripanosomatídeos, como o RNA de interferência ou knockout, sejam empregados. A técnica do CRISPR-Cas9 descoberta em bactérias, foi adaptada recentemente, com êxito para a obtenção de gene knockout em T. cruzi. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da ausência da triparedoxina peroxidase mitocondrial (TcMPx) através do knockout realizado com a ferramenta CRISPR/Cas9 em
T. cruzi epimastigotas. Nesse sentido, três grupos de células foram eletroporadas: (1)
controle (Y); (2) com o vetor pTREX contendo Cas9 e (3) com o vetor pTREX contendo o
single guide RNA (sgRNA) e a Cas9 além de um doador de DNA para a recombinação
homóloga. As células eletroporadas foram selecionadas com antibióticos com exceção da Y, e após a seleção avaliou-se a bioenergética mitocondrial, taxa de proliferação e morfologia. As células selvagens (Y) e as que expressavam a Cas9 (Ys) apresentaram taxas de proliferação, de consumo de oxigênio semelhantes, indicando que a presença da Cas9 não é tóxica para as células. As células do grupo 3 não sobreviveram ao período de seleção e apresentaram diferenças morfológicas quando comparadas às Y e Ys. Esses resultados sugerem que ou a técnica que apesar de ter sido utilizada de forma satisfatória para outros genes não foi eficaz para o knockout da TcMPx ou essa proteína é essencial para a sobrevivência do parasita. Esses resultados dão suporte a relevante função da TcMPx para o parasita e abrem novos possíveis papéis desempenhados por essa proteína no T. cruzi.
Abstract
Trypanosoma cruzi is the ethiologic agent of Chagas disease. Nowadays, treatment is
restricted to only one drug, not effective on the chronic phase leading to serious side effects. The search for new targets is essential for the development of a more effective treatment. One approach to study the relevance of a protein is to interrupt its expression. T. cruzi peculiar genetics does not allow the use of methods currently employed with other trypanosomatids, like interference RNA or knockout. CRISPR-Cas9, discovered in bacteria, was recently adapted successfully to gene knockout in T. cruzi. The aim of the present work was to evaluate the effect of mitochondrial tryparedoxin peroxidase (TcMPx) absence through knockout using CRISPR/Cas9 in T. cruzi epimastigotes. TcMPx is part of the parasite antioxidant defenses and it is extremely vital to the detoxification of reactive oxygen species, generated mainly by the mitochondrial respiratory chain. In this sense, three groups of cells were electroporated: (1) control (Y); (2) with the pTREX vector containing Cas9 and (3) with the pTREX vector containing sgRNA and Cas9 plus a donor DNA for homologous recombination. Electroporated cells were selected with antibiotics, Y being an exception, and after selection mitochondrial bioenergetics, proliferation rates and morphology were evaluated. Wild type (Y) and cells expressing Cas9 (Ys) had similar proliferation and oxygen consumption rates showing that Cas9 expression was not toxic for the cells. Unfortunately, cells from group 3 did not survive through the selection process and showed morphological differences when compared to Y and Ys. These results suggest that or this technique although being used in a successful manner to other genes was not as effective to knockout the TcMPx gene or that this protein is essential to parasite survival. Taking all into consideration these results support the relevance of TcMPx for this parasite and open new possible roles for this protein in T. cruzi.
Sumário
Abstract ... 9
1. Introdução ... 12
1.1 Doença de Chagas ... 12
1.3. Estresse oxidativo e defesas antioxidantes ... 15
1.3.1 Triparedoxinas peroxidases ... 17
1.4. CRISPR/Cas9... 19
2. Objetivos ... 23
3. Material e Métodos ... 24
3.1. Construção do vetor através da técnica CRISPR/Cas9 ... 24
3.1.1. Obtenção das sequências de interesse ... 24
3.1.2. Clonagem do Vetor ... 24
3.2. Obtenção de Células competentes e transformação ... 25
3.2.2. Confirmação da obtenção dos clones. ... 25
3.3. Obtenção dos Knockouts... 26
3.3.1. Eletroporação e Cultura de Células ... 27
3.3.2. Obtenção das células para eletroporação ... 27
3.3.3. Eletroporação ... 27
3.4. Ensaios Bioquímicos ... 28
3.5. Microscopia ótica ... 28
3.6. Contagem dos parasitas em lâmina fixada ... 29
3.7. Análise estatística ... 29
4. Resultados ... 30
4.1. Obtenção do vetor pTREX ... 30
4.2 Obtenção dos plasmídeos para knockout e eletroporação ... 31
4.2. Seleção dos transfectantes ... 33
4.3. Curva de Proliferação ... 34
4.4. Ensaios bioquímicos ... 35
4.4.1. Consumo de Oxigênio das células não permeabilizadas ... 35
4.4.2. Consumo de Oxigênio das células permeabilizadas com digitonina ... 36
4.4.3. Avaliação do controle respiratório ... 36
4.4.4 Contagem das células em lâmina fixada. ... 37
5. Discussão ... 39
7. Referências bibliográficas ... 42 8. Anexos ... 49
1. Introdução
1.1 Doença de Chagas
A doença de Chagas (DC) apresenta como agente etológico o Trypanosoma cruzi sendo uma doença negligenciada e endêmica em 21 países da América Latina. Entretanto, nos últimos anos tornou-se um problema de saúde global devido ao grande fluxo migratório dessa região para a América do Norte, Europa, Canadá e Japão. Aproximadamente 70 milhões de pessoas vivem em áreas de risco, 6-8 milhões de pessoas estão infectadas e estima-se 12.000 mortes por ano decorrentes dessa infecção (ANTINORI, 2017; DNDI, 2017).
O principal mecanismo de transmissão é o vetorial através do principal inseto vetor, o Triatoma infestans, popularmente conhecido como barbeiro. A DC pode ainda ser transmitida por via oral através da ingestão de frutas e vegetais contaminados, transfusão de sangue, transplante de órgãos ou congênita, sendo a última mais rara (DIAS et al., 2016; BRASIL – MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
No Brasil, as vias de transmissão da DC por via vetorial e transfusional estão controladas (SILVEIRA e DIAS, 2011; DIAS et al, 2016). Entretanto, a transmissão por via oral ainda é um problema sério. Esse tipo de transmissão pode ocorrer pelo consumo de açaí, bacaba ou suco de cana-de-açúcar sem a correta higienização, permitindo a ingestão das fezes ou urina de triatomíneos ou ainda de triatomíneos infectados na possibilidade de serem processados juntos com os alimentos (DIAS et
al., 2016).
Surtos da doença pela ingestão de caldo de cana em Santa Catarina no ano de 2005 e açaí no Amazonas em 2007 mostram a necessidade de uma fiscalização efetiva realizada pela vigilância sanitária. Deve haver ainda um preparo dos médicos para diagnósticos oportunos e chances de cura na fase aguda, bem como a elaboração de um perfil epidemiológico mais consistente para a essa novo perfil epidemiológico da DC no Brasil (BRASIL - MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
Analisando-se os casos de DC aguda notificados num período de 13 anos observa-se que 68,9% ocorreu por via oral, o que indica uma mudança no perfil epidemiológico da doença (MARTINS-MELO et al., 2014; PEREIRA, 2009).
Figura 1 – Casos confirmados de doença de Chagas aguda segundo notificação e forma de transmissão. Brasil, 2000 a 2013. (Brasil - Ministério da saúde, 2015).
O tratamento da DC no Brasil é feito com o benznidazol, que só apresenta eficácia na fase aguda e leva sérios efeitos colaterais (FRAGATA et al., 1995; De OLIVEIRA FERREIRA, 1999).
Com relação a manifestação clínica, a DC apresenta duas fases no hospedeiro humano: a aguda e crônica. A fase aguda que ocorre logo após a infecção pelo parasita, dura de 2-4 semanas. Durante essa fase o parasita pode ser facilmente detectado no sangue e o paciente pode apresentar febre resultante da parasitemia e sintomas semelhantes ao de uma gripe (CARLIER et al., 2002; DIAS et al., 2016).
Na fase crônica onde o parasita é dificilmente detectado em exame de sangue fresco, o paciente pode apresentar diferentes formas clínicas como a cardíaca, digestiva, cardiodigestiva ou indeterminada. Na manifestação cardíaca o paciente desenvolve arritmias, ou insuficiência cardíaca que leva ao aumento do coração. Essa forma clínica é a mais comum e todos os anos cerca de 3% dos pacientes acabam desenvolvendo uma manifestação clínica da doença (BRASIL - MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015). Na forma digestiva o paciente tem um aumento progressivo do esôfago e do cólon causado pela inflamação crônica. Pacientes com a forma indeterminada podem permanecer por décadas ou até mesmo até o final de suas vidas assintomáticos (BRASIL - MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
Infelizmente, a maior parte dos casos é detectada na fase crônica em triagens em bancos de sangue ou suspeita médica, o que dificulta o tratamento (FRAGATA et al.,
1995). Nessa fase, o tratamento não é efetivo, restringindo o tratamento aos medicamentos comumente utilizados nas cardiopatias, no caso da manifestação cardíaca e com dieta específica, laxantes, lavagens intestinais ou cirurgias na manifestação digestiva (BRASIL - MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
Ainda não há uma explicação clara para as diferentes manifestações clinicas da DC. Entretanto, vários fatores parecem contribuir como a diversidade genética do parasita e/ou do hospedeiro, tanto o vertebrado como o invertebrado, e infecções cruzadas que podem ocorrer em áreas com grande incidência da doença (MACEDO
et al., 2002).
É importante ainda citar que a DC é uma antropozoonose, sendo o homem um hospedeiro acidental pelo deslocamento dos vetores para as áreas peri domiciliar pela invasão do homem em seu nicho ecológico e consumo de produtos naturais onde o inseto vetor possui ninhos. Sendo assim, o ser humano, por si só, não manteria o ciclo da doença uma vez que os principais reservatórios são os animais silvestres (FIOCRUZ, 2009).
1.2 Trypanossoma cruzi
O T. cruzi possui dois hospedeiros, um invertebrado e outro vertebrado. No invertebrado, o T. cruzi vive em seu lúmen intestinal na forma epimastigota, que por metaciclogênese se transforma em tripomastigotas metacíclicos, forma infectiva para o hospedeiro vertebrado (MURRAY et al., 2006) (Figura 2).
A infecção no hospedeiro vertebrado ocorre através da penetração dessas formas pela mucosa ou pela ferida causada pela picada do inseto que ocorre concomitantemente com a defecação. Os parasitas podem invadir tipos diferentes de células como macrófagos, células musculares e fibroblastos, onde se transformam na forma amastigota e se reproduzem assexuadamente por divisão binária. Essas formas por sua vez, diferenciam-se em tripomastigotas que podem ser novamente ingeridos pelo vetor no momento do repasto sanguíneo ou invadir outras células do hospedeiro vertebrado (Figura 2) (MURRAY et al., 2006).
Vale ressaltar que os indivíduos em áreas endêmicas podem ter sido infectados por diversos triatomíneos em contatos diferentes, o que leva a uma possível mistura de cepas do parasita. Sendo assim, é difícil desenvolver um estudo genético específico para a correlação da forma da doença com a genética do parasita (MOREL
et al., 1980; ARAÚJO et al., 1988).
A ativação de macrófagos com a concomitante geração de espécies oxidantes é um processo para o controle da infecção pelo T. cruzi. Dados indicam que os parasitas mais "preparados para lidar com a resposta oxidativa do hospedeiro são mais eficientes no estabelecimento da infecção (PIACENZA et al., 2009a).
1.3. Estresse oxidativo e defesas antioxidantes
Em geral, para lidar com o estresse oxidativo as células têm duas linhas principais de defesas. A primeira envolve moléculas diretamente envolvidas na prevenção do dano oxidativo, ou seja., enzimas antioxidantes e moléculas de baixo peso molecular, como a tripanotiona (T(SH)2), glutationa (GSH) e o ascorbato. A segunda linha de
defesa consiste nas enzimas de reparo, que removem e /ou reparam as macromoléculas danificadas oxidativamente (CRAWFORD e DAVIES,1994). De uma maneira geral, os mecanismos antioxidantes contribuem para a manutenção de um ambiente reduzido necessário para a adaptação e sobrevivência do parasita.
Em condições fisiológicas, o balanço entre a geração e a degradação das espécies reativas de oxigênio (EROs) deve estar finamente regulada. Interessantemente, essas EROs podem desempenhar diferentes papéis no parasita, assim como nas células em geral, de sinalização até citotoxicidade. O T. cruzi não só desenvolveu sistemas eficientes para lidar com o estresse oxidativo (revisado em PIACENZA et al., 2009a),
como também aprendeu a tirar vantagem dessas espécies onde aproximadamente 20 M H2O2 estimula a proliferação e adaptação ao estresse oxidativo em epimastigotas
(FINZI et al., 2004).
A maior parte do conteúdo da GSH, um tiol de baixo peso molecular, nos tripanosomatídeos, está na forma da tripanotiona, que desempenha papel central na detoxificação das EROs. A T(SH)2 consiste na união de duas glutationas com uma
espermidina (N1,N8-bis(glutationil)espermidina) (WILKINSON et al., 2003; CASTRO e
TOMÁS, 2008; KRAUTH-SIEGEL e COMINI, 2008).
Figura 3 – Funções desempenhados pela glutationa. Além da participação nos mecanismos de balanço redox, regeneração do ascorbato, conjugação com drogas, síntese e reparo de DNA, a glutationa é requerida para a biossíntese da tripanotiona. (WILKINSON et al., 2003).
O ânion superóxido (O2.-) produzido pela cadeia respiratória é dismutado em
peróxido de hidrogênio (H2O2) espontaneamente ou enzimáticamente pela superóxido
dismutase (SOD). Tanto o H2O2 como oO2-. podem passar através das membranas
pelas aquaporinas e chegar ao citosol (CASTRO et al., 2002; GIORGIO et al., 2007). Quando há um desbalanço na produção e detoxificação dessas EROs ocorre uma situação de estresse oxidativo levando a um dano celular. O H2O2 e o O2-. são
responsáveis por sinalizar vias celulares, como divisão e apoptose (FLOHÉ et al., 1999).
A cascata de detoxificação do hidroperóxidos no T. cruzi é centrada na tripanotiona. Para que funcione perfeitamente a tripanotiona redutase (TR) dependente de NADPH reduz a tripanotiona dissulfeto (TS2) a dihidrotripanotiona que
transfere os equivalentes reduzidos às peroxiredoxinas (MPX (ou TcMPx) e CPX (ou TcCPx)) que reduzem o H2O2 (Figura 4). Este sistema foi inicialmente demonstrado
em Crithidia fasciculata e depois para outros kinetoplastídeos como o T. cruzi e
Leishmania sp. mostrando ser uma característica do grupo. É importante ressaltar que
a diferença entre os componentes do sistema de detoxificação do parasita e do hospedeiro é fundamental para a identificação de alvos para o desenvolvimento de fármacos mais específicos e, portanto, menos tóxicos para o hospedeiro vertebrado (FLOHÉ et al., 1999; WILKINSON et al, 2000; WILKINSON et al., 2003; NOGOCEKE
et al., 1997).
Figura 4 – Sistema de detoxificação de hidroperóxidos em T. cruzi. A tripanotiona dissulfeto (TS2) é reduzida a
dihidrotripanotiona (T(SH)2) pela tripanotiona redutase (TR),
uma enzima dependente de NADPH. A T(SH)2 pode transferir
os equivalentes reduzidos para a triparedoxina (TPNI) no citosol ou para outra proteína, ainda não identificada, na mitocôndria onde as peroxiredoxinas (CPX ou MPX, repsectivamente) reduzem o hidroperóxido (ROOH) ao álcool correspondente (ROH). Adaptada de WILKINSON et al., 2003.
1.3.1 Triparedoxinas peroxidases
Como mencionado acima, em T. cruzi, os níveis de hidroperóxidos de cadeia curta e H2O2 são mantidos pelas triparedoxinas peroxidases mitocondrial e citosólica
(TcMPx ou MPX e TcCPx ou CPX, respectivamente) (WILKINSON et al., 2000), além da ascorbato peroxidase localizada no retículo endoplasmático(WILKINSON et al., 2003). A TcCPx e a TcMPx, não necessitam de cofator ou grupamentos prostéticos e como 2Cys peroxiredoxinas típicas, sua reatividade depende da reatividade de 2Cys
redox para catálise e a presença do grupo tiol facilita essa função. Ambas as enzimas são quase tão eficientes como as peroxidases de mamífero, catalase e glutationa peroxidase (PIÑEYRO et al., 2011).
Embora a TcMPx, assim como a TcCPx, seja capaz de ser reduzida pelo sistema TR/T(SH)2/TPNI in vitro (PIÑEYRO et al., 2011), não há dados na literatura
comprovando a ocorrência dessa via no parasita. Isso deve-se as seguintes razões: (1) A localização da TR não foi conclusivamente determinada. Estudos de imunolocalização sugeriram uma localização citosólica e mitocondrial (MEZIANE-CHERIF et al., 1994), mas experientos de fracionamento subcelular não deram suporte a essa conclusão por sugerirem a presença da TR em concentrações muito baixas na mitocôndria (WILKINSON et al., 2002); (2) Uma vez que a síntese da TS2
ocorre no citosol (MANTA et al., 2013), não está claro se a T(SH)2 poderia ser
importada para a mitocôndria, uma vez que um transportador de tiol na membrana mitocondrial desses parasitas até o momento não foi identificado; (3) O genoma de T.
cruzi apresenta apenas duas sequências codificando triparedoxinas: TPNI restrita ao
citosol (WILKINSON et al., 2002) e a TcTPNII que está presente na mitocôndria, retículo endoplasmático e glicossoma (ARIAS et al., 2013). Levando esses pontos em consideração, ainda não está claro como ocorre a regeneração da TcMPx.
Há ainda a especulação da presença de um sistema redox baseado na dihidrolipoamida desidrogenase e lipoamida como demonstrado em Leishmania
infantum (PIÑEYRO et al., 2011; WILKINSON et al., 2000; SILVA et al., 2011;
CASTRO et al., 2008). A interação da TcMPx com a lipoamida sugere que o sistema dihidrolipoamida/lipoamida poderia substituir a TR e TS2, regenerando assim a TcMPx
(PELOSO et al, 2016).
Peloso et al, 2016 demonstraram também que a TcMPx além da localização mitocondrial, está presente também no citosol. Interessantemente, parece haver uma cooperação entre o sistema de detoxificação envolvendo as peroxiredoxinas citosólica e mitocondrial, uma vez que há aumento da expressão de TcCPx nas células que superexpressam a TcMPx e vice-versa, levando a possibilidade do trabalho conjunto dos sistemas (PELOSO et al, 2016; DE FIGUEIREDO PELOSO et al., 2011). Epimastigotas de T. cruzi superexpressando a TcMPx apresentam ainda maiores taxas de produção de NADPH, doador inicial de elétrons para a cascata de detoxificação e proveniente da via das pentoses presentes no citosol reforçando
assim, a provável interação entre os sistemas (DE FIGUEIREDO PELOSO et al., 2011)
Em relação a sobrevivência do parasita no hospedeiro, a TcMPx e a TcCPx desempenham um papel importante, uma vez que os seus níveis são aumentados durante a metaciclogênese, juntamente com a tripanotiona sintetase e a superóxido dismutase mitocondrial (PIACENZA et al., 2009b); são expressas em maiores níveis nas formas metacíclicas infectivas de cepas virulentas quando comparadas as atenuadas (PIACENZA et al., 2009b) e a sua superexpressão aumenta a resistência ao estresse oxidativo em macrófagos e confere aos parasitas uma maior eficiência para sobreviver e replicar em células não fagocíticas (PIÑEYRO et al., 2008). Interessantemente, a TcCPx, mas não a TcMPx, é secretada de tripomastigotas de T.
cruzi submetidos a um estresse oxidativo induzido pelo H2O2, sugerindo que cada
peroxiredoxina tem um comportamento diferente frente ao estresse oxidativo para garantir a sobrevivência do parasita (GADELHA et al., 2013).
A TcMPx é transcrita a partir de um gene de cópia única localizado em dois cromossomos, mostrando assim a importância de sua conservação e integridade no genoma do parasita. A sua fase de leitura aberta (ORF) possui 682 pares de bases que codificam uma sequência amino terminal com 30 aminoácidos hidrofóbicos que indicam endereçamento mitocondrial e possuem uma sequência conservada da família das peroxiredoxinas (WILKINSON et al., 2000).
Para estudarmos completamente a relevância de uma proteína para o metabolismo celular é importante verificar os efeitos de sua ausência, porém com sua genética peculiar o T. cruzi é refratário a maioria das técnicas existentes para tal (PENG et al., 2015).
1.4. CRISPR/Cas9
A ferramenta descoberta no ano de 2012 é baseada em um sistema de bactérias que se assemelha ao sistema imune e baseia-se em repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (clustered regularly
interspaced short palindromic repeats - CRISPR) e proteínas associadas ao CRISPR
(Cas) (CONG et al., 2013).
O sistema CRISPR-Cas utiliza uma combinação entre pequenas sequências de RNA e proteínas que possuem direcionamento específico para a clivagem de sequências de DNA. Na bactéria essas sequências chamadas protospacers são
"coletadas” ao entrarem em contato com bacteriófagos e outros materiais genéticos exógenos e se incorporam no genoma bacteriano gerando uma espécie de banco de dados genético. Esse banco de dados serve de base para que as sequências de RNA sejam geradas quando houver um segundo contato com o DNA exógeno e possam clivar esse material genético, impedindo a infecção da célula (CONG et al., 2013; CHO
et al., 2013).
Figura 5 – Esquema de funcionamento da técnica CRISPR/Cas9 – após o contato com o DNA viral um
Protospacer desse material genético é inserido na sequência
CRISPR. O RNA é produzido e acoplado a uma proteína Cas9 que guiada pela maquinaria do CRISPR ronda a célula para
clivagem do DNA alvo (adaptado de
http://www.nanocell.org.br/crispr-a-tecnica-de-engenharia-genetica-que-pode-mudar-o-mundo/).
A proteína Cas9 guiada pelo sistema CRISPR para a clivagem de uma sequência de DNA especifica, foi descoberta em Streptococcus pyogenes. As sequencias de DNA viral incorporadas ao CRISPR são transcritas em pequenas moléculas de RNA (protospacers) com a adição de uma sequência 5’-NGG-3’ chamada de protospacer adjacent motif (PAM) porém o mecanismo pelo qual as sequências são escolhidas não foi elucidado. O que se sabe é que há uma maquinaria específica composta pelas proteínas Cas1, Cas2 e Csn2 que auxilia neste processo. A Cas9 é uma endonuclease com dois domínios funcionais (RuvC e HNH) e sofre uma
modificação conformacional quando ligada ao seu alvo e posiciona seus domínios para que ocorrA a quebra da ligação fosfodiéster do DNA alvo (HELER et al., 2015).
Essa ferramenta foi adaptada de forma eficiente para utilização em diversos organismos, desde mamíferos até protozoários como Toxoplasma gondii e
Plasmodium falciparum (SHEN et al., 2014; WAGNER et al., 2014). Em T. cruzi foi
adaptada por dois métodos diferentes, como descrito por PENG et al e Lander et al (PENG et al., 2015; LANDER et al., 2015).
PENG e colaboradores realizaram a eliminação de uma família de genes com 65 membros e demonstraram uma diminuição na expressão dos produtos enzimáticos. Não houve mutações fora do alvo, porém a expressão da proteína Cas apresentou certa toxicidade para as células (PENG et al., 2015).
LANDER et al., testou três diferentes estratégias para a utilização da ferramenta sem que a proteína Cas9 apresentasse toxicidade. Para tal as estratégias utilizadas foram a inserção na célula de um vetor (pTREX) contendo o RNA fita simples (single guide - sgRNA) que serviria como ferramenta de corte e a proteína Cas9 separadamente e depois em conjunto e ainda o vetor contendo o sgRNA, a proteína Cas9 e um doador de DNA para recombinação homóloga (LANDER et al.,
2015).
A implementação do sistema CRISPR/Cas9 para a análise funcional do genoma de T. cruzi é uma grande inovação em especial por ser um organismo de difícil manipulação genética. O método elaborado por LANDER et al., gerou a edição de um Loci de forma rápida e eficiente, além do knockout total de um gene endógeno através da recombinação homóloga (LANDER et al., 2015).
A técnica traz uma nova perspectiva para detecção da função de genes antes não caracterizados e ainda de como o parasita interage com os hospedeiros vertebrados e invertebrados através de suas proteínas de membrana (PENG et al., 2015).
A única técnica que até então havia sido eficiente para a modificação genética do tipo knockout em T. cruzi foi através da recombinação homóloga. Nesse protocolo utilizava-se uma fita de DNA com um marcador selecionável para drogas flanqueado pelas regiões não codificantes do gene alvo. Apesar de eficiente a técnica era bastante trabalhosa e demandava bastante tempo (CLAYTON, 1999).
A técnica de RNA interferência, utilizada em Trypanosoma brucei falhou em todas as tentativas de utilização em T. cruzi (Da ROCHA et al., 2004; BELLOFATTO
et al., 2008).
O desenvolvimento de uma técnica mais eficiente é, portanto, essencial para auxiliar no estudo do parasita e consequentemente novos alvos de desenvolvimento de drogas (PENG et al., 2015).
2. Objetivos
• Obtenção dos parasitas knockout para a TcMPx e,
• Comparação da bioenergética mitocondrial, taxas de proliferação e morfologia entre esses parasitas, os parasitas e o controle.
3. Material e Métodos
3.1. Construção do vetor através da técnica CRISPR/Cas9
3.1.1. Obtenção das sequências de interesse
A sequência de interesse para a proteína TcMPx foi encontrada na base de dados TriTrypDB, e um protoespacer contendo entre 20 e 25 pares de bases foi selecionado e acrescido da sequência PAM (protoespacer adjacent motif), que é reconhecida pela proteína Cas9 conforme descrito acima. Após essa seleção os
primers específicos para as sequências foram desenhados. O primer reverso utilizado
foi o descrito em (Lander et al., 2015) (Tabela 1).
Tabela 1 – Primers utilizados para obtenção dos clones
TcMPX_2 5’GATCGGATCCGCCAATATTCACACCTTGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC3’ Rv sgRNA 5’CAGTGGATCCAAAAAAGCACCGACTCGGTG3’
Para a amplificação das sequências utilizou-se 20 ng/µl do plasmídeo
pUC_single guide RNA com os primers reverso e específicos descritos na tabela 1 e
a enzima Platinum® Taq DNA e o respectivo tampão sob as seguintes condições: 1) 94°C x 2 min, 2) 94°C x 15 seg, 3) 52°C x 20 seg, 4) 68°C x 20 seg, 5) repetindo os passos 2-4 com um total de 35 ciclos, 6) 68°C x 5 min, 7) 10°C. A purificação foi feita com o kit comercial Pure Link Gel Extraction da Invitrogen®.
3.1.2. Clonagem do Vetor
Para a clonagem do single guide RNA no vetor cas9/pTREX-n 1 µg do produto de PCR e 1 µg do vetor foram digeridos separadamente com a enzima de restrição
BamHI por 2 horas a 37ºC. O produto da digestão do vetor foi defosforilado usando Antarctic Phosphatase (New England BioLabs®) seguindo orientações do fabricante
e utilizou-se 100 ng do vetor defosforilado e 22 ng do inserto para a reação de ligação realizada com LigaFast Rapid DNA Ligations System (Promega®) overnight a 3ºC.
3.2. Obtenção de Células competentes e transformação
A cultura de Escherichia coli DH5 foi crescida em caldo LB (5 g de peptona caseína, 2,5 g de extrato de levedura, 2,5 g de cloreto de sódio em 500 ml de água Mili-Q) e colocada para crescer sob agitação constante de 200 rpm à 37ºC overnight. No dia seguinte, 100 µl dessa cultura foi adicionada à 5ml de caldo LB e colocadas para crescer no shaker (37ºC e 200 rpm) por aproximadamente 1h40min (ou até atingir densidade ótica entre 0,4 e 0,6 em comprimento de onda 600 nm).
A cultura foi então dividida em microtubos contendo 1ml cada, e centrifugados a 2700 x g a 4ºC por 10 min. Após descartado o sobrenadante as células foram ressuspendidas em 600l de MgCl 80 mM + CaCl 20 mM gelado e centrifugadas novamente a 2700 x g a 4ºC por 10 min.
O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 40 µl de CaCl 0,1M gelado e todo conteúdo reunido em um único microtubo. Acrescentou-se 3 µl do produto de ligação e as células foram deixadas no gelo por 10 min e então colocadas no banho seco a 42ºC por 45 seg com exatidão e colocadas rapidamente no gelo por 5 min. Após esse tempo acrescentou-se 100l de caldo LB e colocou-se no shaker (37 oC e 200 rpm) por 1 hora e então foram plaqueadas em placa contendo ágar LB e
ampicilina 100g/ml e incubadas overnight a 37ºC.
3.2.2. Confirmação da obtenção dos clones.
A confirmação da obtenção dos clones se deu por meio de PCR (reação em cadeia polimerase) das colônias pré-selecionadas com o kit Quick Plasmid Miniprep
kit da Invitrogen®.
Utilizando o primer específico para a região de interesse e o primer reverso HX1 (5’TAATTTCGCTTTCGTGCGTG3’) com a enzima Platinum® Taq DNA e o respectivo tampão e 5 ml de água ultrapura onde as colônias selecionadas foram colocadas com auxílio de uma ponteira e amplificou-se sob as seguintes condições: 1) 94°C x 2 min, 2) 94°C x 15 seg, 3) 52°C x 20 seg, 4) 68°C x 20 seg, 5) repetindo os passos 2-4 com um total de 35 ciclos, 6) 68°C x 5 min, 7) 10°C.
Para confirmação da orientação do sg_RNA o produto de PCR foi sequenciado de acordo com o método sanger de eletroforese capilar no sequenciador 3730xL
(Applied Biosystems®.). Para tal 5 µl contendo 1 µg de amostra junto a 1 µl de primer HX1 em concentração de 3,2 pmol foram enviados para o Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida (LaCTAD), parte da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
As colônias obtidas foram também repicadas em 5ml de caldo LB na presença de ampicilina e crescidas no shaker (37ºC e 200 rpm) para manutenção da cultura.
3.3. Obtenção dos Knockouts
Ultrâmeros específicos foram desenhados para obtenção das células com marcador de seleção de blasticidina-S Deaminase (Bsd) para amplificar um template homólogo tento como base o vetor pTREX-b Para tal o PCR foi executado a partir dos ultrâmeros específicos (Tabela 2) para cada proteína com a enzima Dream® Taq DNA e o respectivo tampão sob as seguintes condições: 1) 95°C x 2 min, 2) 95°C x 20 seg, 3) 63°C x 20 seg, 4) 72°C x 1 min 40x, 6) 10°C e purificados com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, que foram adicionados em volume igual ao da amostra em microtubo e vortexado vigorosamente por 10 seg e em seguida centrifugado a 12.000 x g por 1 min a temperatura ambiente.
O sobrenadante foi removido com cautela com uma pipeta de 200µl e transferido para um novo tubo onde foram adicionados 1/10 do volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,2 e a mistura foi vortexada. Adicionou-se 2,5 vezes o volume de etanol 100% gelado e a amostra foi centrifugada por 30 min, a temperatura ambiente a 12000 x g. Após a centrifugação o sobrenadante foi cuidadosamente descartado e 1 ml de etanol 70% a temperatura ambiente foi adicionado, a amostra foi misturada por inversões várias vezes e centrifugada por 10 min a temperatura ambiente e 12000 x
g. O sobrenadante foi removido após a centrifugação e os tubos foram mantidos
Tabela 2 - Ultrâmeros utilizados para obtenção dos Knockouts
3.3.1. Eletroporação e Cultura de Células
3.3.2. Obtenção das células para eletroporação
Epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) foram crescidos à 28°C em meio LIT (Liver
Infusion Tryptose) com 20 µg/mL de hemina e 10% de soro fetal bovino inativado
(CASTELANI, 1967). Após a proliferação as células foram coletadas por centrifugação (2500 rpm, 5 min à 4°C) e lavadas com tampão fosfato salino (PBS), pH 7,3 e posteriormente com cytomix (25 mM de Hepes pH 7,6, 120 mM de KCl, 0,15 mM de K2HPO4, 2 mM de EDTA, 5 mM de MgCl2, 0,5% de glicose, 100 µg/ml de BSA e 1 mM
de hipoxantina). A contagem das células foi feita em câmara de Newbauer e 108
células/ml em 400 µl foram utilizadas para eletroporação.
3.3.3. Eletroporação
Aos 400 µl de células foram acrescidos 25 µg do plasmídeo
sgRNA/Cas9/pTREX e 25 µg do template contendo a blasticidina obtidos através dos
ultrâmeros nas cubetas para eletroporação de 0,4 cm acondicionadas no gelo. Um controle contendo apenas as células e 10 µl de água ultra-pura foi realizado, além de uma eletroporação contendo somente o plasmídeo com a proteína Cas9 (scramble) cedido gentilmente por Noelia Lander – FCM UNICAMP (LANDER et
al, 2015).
As células permaneceram no gelo por 10 min e então foram eletroporadas utilizando o eletroporador Bio-Rad gene pulser nas condições de 1,5 kV e 25 µF com três pulsos em cada cubeta com intervalo de 1 min no gelo e então foram deixadas por 15 min a temperatura ambiente e transferidas para 5ml de meio LIT suplementado com 20% de soro fetal bovino e mantidas a 28ºC. 24 horas depois os antibióticos para
Forward ultramer T. cruzi TcMCPx gene 5'AAAAAATAAAAACACACACACACACAAGAAAAGTTTTGTCCTGTTTCGTCGTTTGGCCGTG ACTTCGTTGCAGAAGGGTCTTTCACGCCGAGCTTTCTGCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAG 3' Reverse ultramer T. cruzi TcMCPx gene 5'TAGAAATTCATGCAAAAATGCTCCTTCACCATCTGAACTTATGCGTTTTTCTCAAAATATTCA TTTGCCTTCTCAGTTTTCATTGTCGGTTTGCCTGGCCTTTAGCCCTCCCACACATAACC 3'
seleção (blasticidina e geneticina - G418) foram adicionados na concentração de 10 µg/ml nos tubos específicos.
3.4. Ensaios Bioquímicos
Para a verificação do consumo de O2 as células selvagens (Cepa Y) e
eletroporadas com o scramble (Ys) (5,107 céls/ml) foram incubadas em meio IB (5 mM
KCl, 2 mM MgCl2, 80 mM NaCl, 16,2 mM Na2HPO4, 3,8 mM NaH2PO4, 50 mM glicose,
0,15% BSA, pH 7,4). na presença de 40 μM de digitonina e 5 mM de succinato e analizados em um Oxígrafo computadorizado com agitação contínua Hansatech® Systems Inc., Norfolk, Eng.) O controle respiratório (estado 3/estado 4) foi analizado pela adição de 400 μM de ATP (estado 3) e posteriormente 2 μg/ml de oligomicina (estado 4). O consumo máximo de oxigênio foi determinado na presença de 1 µM de CCCP (carbonyl-cyanide-m-chlorophenylhydrazone).
3.5. Microscopia ótica
Após as lâminas serem limpas com solução 1% HCl em 70% etanol, foi realizada uma marcação da região de aplicação da poli-lisina (1 mL de poli-lisina em 9 mL de água deionizada). Colocou-se aproximadamente 100 μL de poli-lisina diluída na região demarcada da lâmina e o excesso de líquido foi retirado e deixou-se ocorrer a secagem da lâmina à temperatura ambiente por 12 h.
Para a montagem das lâminas, utilizou-se uma alíquota das células e espalhou-se o mesmo sobre a superfície. Depois de espalhou-secar a temperatura ambiente, a lâmina foi submetida à coloração com uso do kit Panótico Rápido LB Labor Clin. Deixou-se a lâmina em contato com a solução n°1 por 1 min, e em seguida, em contato com a solução n° 2 por 40 seg e em contato com a solução n° 3 por 20 seg, e após isso, lavou-se a mesma com água corrente e o material secou à temperatura ambiente. E então adicionou-se uma lamínula à lâmina utilizando o reagente Entellan Merck. As imagens foram capturadas com câmera ICC50-HD acoplada ao microscópio Leica DM500 e processadas utilizando-se o software Leica Application Suite V. 4.2.0 (Leica
3.6. Contagem dos parasitas em lâmina fixada
As lâminas obtidas para a captura de imagens foram também utilizadas para levantamento quantitativo de alterações morfológicas e na divisão celular. Foi realizada a varredura completa da lamina e os parasitas forma contados e classificados em normais, com alterações e com parada na divisão celular em diferentes intervalos a partir da eletroporação, sendo 8, 11, 13, 14 e 18 dias para verificação das diferenças estatísticas.
3.7. Análise estatística
Analisou-se os resultados através da média e desvio padrão de três experimentos independentes realizados em duplicata pelo t-teste onde p< 0,05 foi considerado significativo.
4. Resultados
Tendo em vista a importância da investigação de novos alvos terapêuticos o estudo da importância da TcMPx para o T. cruzi é essencial, pois a mesma é a única proteína presente na mitocôndria, até o momento conhecida, responsável pela detoxificação de hidroperóxidos nesse parasita. Além disso, foi comprovado que o aumento de sua expressão aumenta a virulência do parasita. Sendo assim, o knockout desse gene nos permitirá o estudo aprofundado dos efeitos de sua ausência na célula, e nos permitirá reforçar a sua indicação como um possível alvo para desenvolvimento de fármacos mais efetivos para o tratamento da DC (PINEYRO et al.,2008; PENG et al., 2015).
4.1. Obtenção do vetor pTREX
A sequência da sgRNA TcMPx foi clonada no vetor Cas9/pTREX usando o sítio da BamHI e usado junto com o doador de DNA (ultrâmeros) para induzir o reparo de DNA por recombinação homológa. As sequências obtidas com o primer TcMCPx_2 e o vetor (pUC_single guide RNA) foram amplificadas com o tamanho esperado (195/200 pb) como mostrado na Figura 6.
Figura 6 - Obtenção do vetor - Gel de agarose 1,5% com as amostras de PCR obtidas utilizando sg_RNA como molde e os
primers específicos para proteína TcMPx
realizado em triplicata (1, 2 e 3). .
A digestão realizada com a enzima de restrição BamHI, uma vez que a mesma não possuía sequência de corte no inserto e seria o sítio onde o produto de PCR seria inserido no pTREX, se deu de forma satisfatória apresentando produtos de PCR com peso molecular esperado (Figura 7).
Figura 7 - Digestão com enzima de restrição para confirmação do inserto. Gel de agarose 1,5% com produto da digestão realizada com a enzima de restrição BamHI, 1µg do vetor (1) e 1µg do produto de PCR amplificados para a proteína TcMCPx (2).
Após a obtenção de quantidade suficiente do inserto obtido através de múltiplas reações de PCR a ligação foi feita para a obtenção de um plasmídeo com o vetor pTREX e a sequência de interesse e o mesmo foi inserido nas células competentes através do processo de transformação.
4.2 Obtenção dos plasmídeos para knockout e eletroporação
Após a seleção de seis colônias a verificação da presença do vetor se deu por meio de PCR de colônia que foi feito através da lise da colônia em água para liberação do material genético. Conforme pode ser observado na Figura 8, 5 colônias continham o inserto.
Após obtenção das culturas dessas colônias, e posterior isolamento do plasmídeo os mesmos foram enviados para sequenciamento. Somente a de número 5 possuía
o vetor com a sequência de interesse para o knockout do gene na orientação correta (Figura 9A).
Figura 8 - PCR de colônia - PCR em Gel de agarose 1,5% realizado a partir do plasmídeo das colônias selecionadas utilizando o primer reverso HX1. Cada colônia (1,2,3,4 e 5) com inserto para TcMCPx selecionada foi analisada para verificar a orientação do inserto.
Esta foi então a colônia utilizada para o prosseguimento dos experimentos. Obtivemos ainda o vetor scramble (Ys) (Figura 9B) a partir da extração do mesmo de bactérias cedidas pela Dra Noelia Lander.
A B
Figura 9 – Mapa dos vetores pTREX utilizados. (A) Plasmídeo obtido através da digestão com enzima de restrição BamHI para a inserção do fragmento de interesse para a proteína TcMCPx (sgRNA) com 200 pares de bases. (B) Vetor contendo apenas a proteína Cas9 para verificação da toxicidade da mesma para as células. Adaptado de (LANDER et al, 2015).
A verificação da sequência do inserto através de alinhamento através do software
Multiple Sequence Alignment - CLUSTALW demonstrou que a sequência de 25
nucleotídeos escolhidos para a realização da interrupção do gene se alinha perfeitamente com a sequência do gene da TcMPx da cepa CL Brener. A mesma foi utilizada pois apresenta sequenciamento completo no GenBank (Figura 10).
Figura 10 – Alinhamento realizado com ClustalW - Verificação da sequência do primer utilizado em comparação com o gene TcMCPx.
Tendo confirmado a orientação do inserto realizou-se a cultura das bactérias dessa colônia para a obtenção de material suficiente para a eletroporação. As células foram eletroporadas em três diferentes grupos: (1) contendo somente água ultra-pura para verificação de possíveis danos decorrentes da voltagem aplicada, as mesmas foram chamadas células Y (2) contendo somente o vetor pTREX que possui a proteína Cas9, as mesmas foram chamadas de Ys (scramble) (3) contendo o vetor pTREX que possui a proteína Cas9 e os ultrâmeros (doadores de DNA) para a recombinação homóloga e obtenção do knockout do gene.
4.2. Seleção dos transfectantes
Ao longo do processo de seleção, as células eram lavadas e o meio de cultura trocado a cada semana para reposição de nutrientes e antibióticos (G418 para as Ys e G418 e blasticidina para os knockouts). A cada manutenção na cultura uma alíquota de células era retirada para a obtenção de imagens para acompanhamento do
crescimento. Observou-se alterações morfológicas significativas nas células do grupo 3 ao longo das semanas (Figura 11 A-C) enquanto as células dos grupos 1 e 2 não apresentaram nenhum tipo de alteração (Figura 11 E-F) e apresentaram uma taxa de proliferação ótima quando comparadas as células do grupo 3.
As células com o plasmídeo contendo a sequência para interrupção do gene TcMPx não sobreviveram por muitos dias apesar de o meio ter sido enriquecido com 20% de soro fetal bovino. Foram feitas 8 eletroporações independentes, mas infelizmente em nenhuma delas foi possível obter os transfectantes. As células selvagens e scramble foram selecionadas por 4 semanas para prosseguimento dos experimentos.
Figura 11 – Microscopia ótica dos epimastigotas durante o processo de seleção. Imagens capturadas com aumento de 100x (A) Parasitas do grupo 3 apresentando parasitas com morfologia alterada; (B) parasita do grupo 3 onde evidencia-se parasitas que não completaram a divisão celular; (C) parasitas do grupo 2 e (D) Parasitas do grupo 1 (selvagem).
4.3. Curva de Proliferação
As curvas de proliferação das células selvagens e as células Ys não demonstraram diferenças significativas (Figura 12). Sendo assim, é possível concluir que a expressão da Cas9 não é tóxica para os epimastigotas.
A B
Figura 12 – Curva de proliferação das células selvagens e scramble. 5,2 x 106 céls/ml foram cultivadas em meio de
cultura e diariamente uma alíquota era retirada e a contagem de células realizada em Câmara de Newbauer. () Y e () Ys. Análise estatística: t-teste: p > 0,05 para os grupos analisados.
4.4. Ensaios bioquímicos
4.4.1. Consumo de Oxigênio das células não permeabilizadas
As taxas de consumo de oxigênio entre as células selvagens e as scramble não permeabilizadas foram semelhantes (Figura 13). Esses dados reforçam os resultados observados na curva de proliferação, onde a expressão da proteína Cas9 não gerou alterações na cadeia respiratória mitocondrial.
Figura 13 – Consumo de Oxigênio das células não permeabilizadas - Epimastigotas (5 x 107céls/ml) foram
adicionados ao meio IB. O consumo de oxigênio foi determinado em um Oxígrafo conforme descrito em material e métodos. Análise estatística: t-teste: p > 0,05 para os grupos analisados. 0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 6 Cél s 1 0 6/ m l Dias 0 2 4 6 8 10 12 Y Ys O2 co n su m p tion (n m o le s/10 7 ce lls/m in )
4.4.2. Consumo de Oxigênio das células permeabilizadas com digitonina
Nos experimentos utilizando-se succinato como substrato do complexo II da cadeia respiratória, e digitonina, observa-se que as células selvagens e as scramble demonstraram comportamentos semelhantes, sem variação significativa (Figura 14).
Figura 14– Consumo de Oxigênio das células permeabilizadas - Epimastigotas (5 x 107céls/ml)
foram adicionados ao meio IB contendo 40 M digitonina e 5 mM succinato. O consumo de oxigênio foi determinado em um Oxígrafo conforme descrito em material e métodos. Análise estatística: t-teste: p > 0,05 para os grupos analisados.
4.4.3. Avaliação do controle respiratório
Quando avaliado o controle respiratório através da razão entre o estado 3 (adição de ADP) e o estado 4 (adição de oligomicina) não se observou diferença significativa (Figura 15). 0 2 4 6 8 10 12 Y Ys O2 co n su m p tion (n m o le s/10 7 ce lls/m in )
Figura 15 – Determinação do controle respiratório. Epimastigotas (5 x 107 Céls/ml) foram adicionados ao meio
IB contendo 40 M digitonina e 5 mM succinato. O consumo de oxigênio foi determinado em um Oxígrafo conforme descrito em material e métodos, após adição de 400 M ADP (estado 3) e 1 g/ml oligomicina (estado 4). Análise estatística: t-teste: p > 0,05 para os grupos analisados.
O controle respiratório é um dado importante para se verificar o grau de acoplamento entre a fosforilação oxidativa e a cadeia respiratória mitocondrial. Esse acoplamento é essencial para a produção de ATP pela mitocôndria.
4.4.4 Contagem das células em lâmina fixada.
Durante o período de seleção foram feitas lâminas para avaliação da morfologia das células. Na Figura 16 está representado o levantamento quantitativo das alterações morfológicas e de divisão celular observadas durante esse período. Esse experimento foi feito até o 18º dia uma vez que após esse período não haviam mais parasitas vivos (Figura 16).
As lâminas com os parasitas scramble e selvagens no mesmo intervalo de tempo também foram avaliadas e nenhuma alteração morfológica foi observada por isso não adicionamos esses dados na Figura 16.
0 2 4 6 8 10 12 Y Ys Co n tr o le r e sp ir ató ri o (r e laç ão e stad o 3/e stad o 4)
Dias
Figura 16 – Avaliação da alteração morfologia e na divisão celular. Contagem de parasitas realizada nos dias especificados após a eletroporação. Os resultados são apresentados como a porcentagem de parasitas com alteração morfológica (traçado azul) e quantidade de parasitas com parada na divisão celular (traçado rosa).
5. Discussão
Para garantir a sua sobrevivência nas diferentes condições impostas pelo seu complexo ciclo de vida o T. cruzi tem que lidar com as espécies reativas de oxigênio e/ou espécies reativas de nitrogênio. Além da geração de EROs no hospedeiro invertebrado, como resultado da liberação de altas concentrações de heme durante a degradação de hemoglobina (GRAÇA-SOUZA et al. 2006), o parasita tem que lidar também com o estresse oxidativo no hospedeiro mamífero que envolve a geração de O2-., H2O2 e ONOO.- entre outras espécies (revisado em PIACENZA et al., 2009b) e,
também, com as espécies geradas pelo seu próprio metabolismo, tal como como sub produtos da cadeia respiratória mitocondrial (MRC) (SILVA et al., 2011). O Complexo II da MRC tem sido apontado como sendo o principal sítio de geração de H2O2 em
epimastigotas de T. cruzi (SILVA et al., 2011), assim como em Leishmania donovani (MEHTA E SHAHA, 2004).
Em condições fisiológicas, o balanço entre a geração e a degradação de EROs deve estar finamente regulado. Interessantemente, essas EROs podem desempenhar diferentes papéis nos parasitas, assim como nas células em geral, de sinalização até citotoxicidade. Nesse sentido, o T. cruzi não só desenvolveu sistemas eficientes para lidar com o estresse oxidativo (revisado em PIACENZA et al., 2009b), como também aprendeu a tirar vantagem dessas espécies onde, em epimastigotas, baixas concentrações de H2O2 estimulam a proliferação e adaptação ao estresse oxidativo
(FINZI et al., 2004).
Os níveis de H2O2 no T. cruzi são mantidos pelas triparedoxinas peroxidases
mitocondrial e citosólica (TcMPx e TcCPx, respectivamente) (WILKINSON et al, 2002), além da ascorbato peroxidase localizada no retículo endoplasmático (WILKINSON et
al., 2002).
O fato dos tripanossomatídeos possuírem uma única mitocôndria torna o sistema de defesa antioxidante desta essencial. A mitocôndria é o principal sítio gerador de energia em forma de ATP e também um dos principais sítios de produção de EROs, necessitando assim de um sistema de defesa antioxidante extremamente eficiente para a proteção da mesma (PIACENZA et al., 2008).
A ausência de proteínas fundamentais para o funcionamento do sistema de defesa antioxidante pode gerar uma falha na cascata de detoxificação levando a geração de uma alta concentração de EROs. Um desequilíbrio na produção e degradação de
EROs gera um ambiente hostil para a célula podendo assim levar a morte celular (WILKINSON et al., 2002). A obtenção de células knockout para a TcMPx seria interessante para a avaliação da real influência da mesma sobre o metabolismo de EROs e viabilidade celular.
A técnica CRISPR/Cas9 foi utilizada com sucesso para a obtenção de células onde o gene que codifica a proteína GP72, componente chave para a integridade do flagelo do parasita e sua motilidade, provando assim que a ferramenta é eficiente em T. cruzi (LANDER et al., 2015). Essa ferramenta foi ainda utilizada para obtenção do knockout de outros alvos, diminuindo a expressão de um gene enzimático de uma família de 65 proteínas de forma satisfatória e sem nenhuma mutação fora do alvo escolhido (PENG
et al., 2015).
No presente trabalho não foi possível obter as células knockouts para a TcMPx, mesmo com oito diferentes tentativas independentes. Esse resultado sugere a possibilidade de possíveis falhas na técnica para o silenciamento do gene alvo ou a demonstração da essencialidade da TcMPx para a sobrevivência da célula.
As modificações morfológicas observadas ao longo do processo de seleção dos parasitas, sugerem que a ausência da TcMPx pode de alguma forma levar à parada no ciclo celular. Entretanto, infelizmente não há dados na literatura com outros tripanosomatídeos ou mesmo com outras células que suportem esses dados.
Na quantificação dos parasitas portadores dessas alterações observou-se que as maiores taxas de alterações morfológias e também as paradas na divisão celular ocorrem entre o 13º e 14º dia com uma média de 46% de alterações morfológicas e 3,9% de alterações na divisão celular. Após o 14º dia há uma queda acentuada no número de parasitas até a total extinção no 18º dia.
Os resultados mostrados no gráfico da Figura 12 descartam a possibilidade de toxicidade da proteína Cas9 ter gerado os danos celulares e consequente morte como ocorrido em PENG et al., 2015.
As taxas do metabolismo de oxigênio das células contendo a Cas9 também se mostram muito próximas das observadas nas células selvagens como demonstrado nas Figuras 12-14, reforçando os dados obtidos onde a presença da Cas9 não é tóxica para as células.
6. Conclusão
Levando em consideração que não foi possível obter as células knockout para o gene da TcMPx e que a expressão da Cas9 não era tóxica para as células, a TcMPx parece ser essencial para a sobrevivência do parasita. Entretanto, não é possível se descartar também algum problema na técnica utilizada que impossibilitou a geração do knockout do gene.
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