UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
RAQUEL FRENEDOSO DA SILVA
AÇÃO ANTIANGIOGÊNICA DO NINTEDANIBE EM
CÉLULAS TUMORAIS PROSTÁTICAS E NA PRÓSTATA
DE CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS PARA O
ADENOCARCINOMA (TRAMP) EM DIFERENTES
ESTÁGIOS DE DESENVOLVIMENTO DO TUMOR
ANTIANGIOGENIC ACTION OF NINTEDANIB IN
PROSTATIC TUMOR CELLS AND IN THE PROSTATE
OF TRANSGENIC ADENOCARCINOMA OF THE MOUSE
PROSTATE (TRAMP) IN DIFFERENT STAGES OF
TUMOR DEVELOPMENT
Campinas 2018
AÇÃO ANTIANGIOGÊNICA DO NINTEDANIBE EM CÉLULAS
TUMORAIS PROSTÁTICAS E NA PRÓSTATA DE
CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS PARA O
ADENOCARCINOMA (TRAMP) EM DIFERENTES ESTÁGIOS DE
DESENVOLVIMENTO DO TUMOR
ANTIANGIOGENIC ACTION OF NINTEDANIB IN PROSTATIC
TUMOR CELLS AND IN THE PROSTATE OF TRANSGENIC
ADENOCARCINOMA OF THE MOUSE PROSTATE (TRAMP) IN
DIFFERENT STAGES OF TUMOR DEVELOPMENT
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Celular e Estrutural, na área de Biologia Celular.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Ph.D. in Cellular and Structural Biology, Cellular Biology area.
ORIENTADOR: DRA. VALÉRIA HELENA ALVES CAGNON QUITETE
Campinas 2018
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA RAQUEL FRENEDOSO DA SILVA E ORIENTADA PELA DRA. VALÉRIA HELENA ALVES CAGNON QUITETE
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Adriana Fogagnolo Maurício Prof. Dr. Murilo Vieira Geraldo
Prof. Dr. Odair Aguiar Junior Profa. Dra. Rejane Maira Góes
Profa. Dra. Valéria Helena Alves Cagnon Quitete (Presidente da comissão julgadora)
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedicatória
Não só esse trabalho, mas todo o sucesso da minha vida, eu dedico e devo à minha mãe Maria. Ela acreditou em mim quando ninguém mais o fez. Ela me entendeu, mesmo quando não entendeu nada; me apoiou mesmo quando não concordou em nada; e me deixou ir, mesmo quando sua vontade era fazer ficar. Obrigada mãe, sempre foi e sempre vai ser por você!
“Tudo aquilo que sou, ou pretendo ser, devo a um anjo: minha mãe.”
Abraham Lincoln
Agradecimentos
A Deus, que permitiu a realização de todos os meus sonhos, e que continua olhando pormim a cada passo dado.
E acontecerá que, antes que eles clamem, eu os ouvirei; estando eles ainda a falar,
eu os atenderei.
Isaías, 65:24
A minha orientadora Valéria Helena Alves Cagnon Quitete, que sempre acreditou, apoiou e confiou no meu trabalho, e me deu a liberdade para realizá-lo da melhor forma.
"Se enxerguei mais longe, foi porque estava sobre os ombros de gigantes."
Isaac Newton.
Aos membros do laboratório de Biologia da Reprodução, aos atuais e aos já formados, que tanto contribuíram para a realização desse trabalho, seja direta ou indiretamente. Ao Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho e a doutoranda Thais Petrochelli Banzato, que permitiram o ensaio in vitro da atividade antiproliferativa do Nintedanibe, realizada no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) – Unicamp. À Thais, que esteve ao meu lado tantas vezes não só profissionalmente, mas pessoalmente. Você é mais do que uma amiga. A Profa. Dra. Sarah Arana, que tanto nos auxiliou em parte das avaliações histológicas apresentadas nesse trabalho e a Dra. Mary Anne Heidi Dolder, que nos permitiu realizar avaliações espermáticas em seu laboratório. Ao Dr. Rajesh Agarwal, meu supervisor no exterior, que me deu todo o apoio intelectual e financeiro para realização de parte deste trabalho. A Dra. Komal Raina e MSc. Deepanshi Dhar, que tanto me ajudaram durante o meu tempo com elas. A Liliam Panagio, que sempre esteve disposta em ajudar. Muito obrigada por seu apoio.
Aos membros titulares e suplentes da banca de defesa, Dra. Rejane Maira Góes, Dra. Adriana Fogagnolo Mauricio, Dr. Odair Aguiar Junior, Dr. Murilo Vieira Geraldo, Dra. Maria Julia Marques, Dra. Carla Collares Buzato e Dr. Francisco Eduardo Martinez. Obrigada por aceitarem o convite!
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro na forma de Bolsa de Doutorado Regular e de Estágio de Pesquisa no Exterior, processos nº 2013/26677-7 e 2016/13913-2. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelas bolsas concedidas durante o início do doutorado. E um agradecimento especial aos animais de laboratório utilizados nesse trabalho
"Jamais creia que os animais sofrem menos do que os humanos. A dor é a mesma para eles e
para nós. Talvez pior, pois eles não podem ajudar a si mesmos."
Epígrafe
“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis”
Resumo
O câncer de próstata tem sido amplamente estudado devido ao grande número de indivíduos afetados por esse tipo de injúria, em adição à complexidade do desenvolvimento do órgão considerando a importante interação epitélio-estromal como fator principal pelas alterações prostáticas. Especial atenção tem sido dada ao estudo de inibidores das vias de FGF e VEGF como o Nintedanibe, um composto capaz de reduzir a angiogênese, prevenir a proliferação celular e diminuir o volume tumoral, usado na prevenção, intervenção e regressão do câncer de próstata. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação antiproliferativa do Nintedanibe em nove linhagens tumorais derivadas de diferentes tecidos, além de avaliação de proliferação e ciclo celular, motilidade, invasividade e capacidade clonogênica, bem como análise de perfil proteico e expressão gênica de células tumorais prostáticas humanas submetidas à droga. A ação antiproliferativa da droga foi avaliada também em modelo xenográfico para câncer de próstata, utilizando-se inoculação de células PC3 em camundongos nude; posteriormente, os tumores foram submetidos à análise imuno-histoquímica e de perfil proteico. Além disso, camundongos transgênicos para o adenocarcinoma de próstata (TRAMP) foram tratados com Nintedanibe (10mg/Kg/dia) em diferentes estágios do desenvolvimento tumoral, isto é, lesões malignas em estágios inicial (8 semanas), intermediário (12 semanas) e avançado (22 semanas). Após o final de tratamento, o lobo ventral da próstata foi coletado para análise do perfil estrutural e expressão de proteínas relacionadas ao desenvolvimento e progressão do câncer como receptores hormonais AR e ERα, FGF-2, FGF-7, FGFR-3, VEGF, VEGFR-1, HIF-1α, MMP-9 e vimentina, densidade de microvasos (marcação para CD31), além da avaliação da proliferação e morte celular através da marcação do PCNA e ensaio TUNEL, respectivamente. Ainda, possíveis efeitos tóxicos da droga no fígado, testículos e epidídimos foram avaliados, além de procura de focos metastáticos e ação da droga sobre os mesmos. A exposição de células tumorais prostáticas ao Nintedanibe levou à redução da viabilidade e clonogenicidade celular e do potencial móvel e invasivo, bem como afetou a expressão de moléculas cruciais para a progressão do ciclo celular, levando a uma saída do ciclo em fase G1. Além disso, a droga diminuiu o volume tumoral por interferir na proliferação celular e densidade de microvasos em tumor xenográfico, além de reduzir os níveis de moléculas pró-angiogênicas. Os resultados mostraram ainda, que a administração de Nintedanibe em camundongos TRAMP em período inicial e intermediário do desenvolvimento do carcinomade moléculas cruciais para a tumorigênese. Assim, no presente estudo pré-clínico, concluímos que a terapia antiangiogênica com Nintedanibe foi capaz de atrasar a transformação neoplásica no microambiente prostático, reduzindo a vascularização necessária à tumorigênese, impedindo que o desenvolvimento tumoral avançasse para estágios mais agressivos da doença. A terapia com Nintedanibe é promissora no tratamento do câncer de próstata, visto que no período pelo qual foi administrado não apresentou toxicidade hepática e reprodutiva.
Abstract
Prostate cancer has been widely studied due to the large number of individuals affected by this type of injury, in addition to the complexity of the organ development, considering the important epithelial-stromal interaction as the main factor for prostatic changes. Special attention has been given to the study of FGF- and VEGF-inhibitors such as Nintedanib, a compound capable of reduce angiogenesis, prevent cell proliferation and decrease tumor volume, used in the prevention, intervention and regression of prostate cancer. The objective herein was to evaluate the antiproliferative action of Nintedanibe in nine tumor cell lines from different tissues, besides evaluation of proliferation and cell cycle assays, motility, invasiveness and clonogenic capacity, as well as analysis of protein profile and gene expression of human prostate tumor cells submitted to the drug. The antiproliferative action of the drug was also evaluated in xenograft mouse model for prostate cancer by inoculating PC3 cells in nude mice; subsequently, tumors were submitted to immunohistochemistry and protein profile assays. In addition, Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate (TRAMP) were treated with Nintedanibe (10 mg/kg/day) at different stages of tumor development, i.e., malignant lesions in the initial (8 weeks), intermediate (12 weeks) and advanced (22 weeks) stages. At the end of treatment, the ventral prostate was collected for structural profile analysis and expression of proteins related to cancer development and progression such as hormonal receptors AR and ERα, FGF-2, FGF-7, FGFR-3, VEGF, VEGFR-1, HIF-1α, MMP-9 and vimentin, microvessel density (labeling for CD31), and evaluation of proliferation and apoptosis through PCNA labeling and TUNEL assay, respectively. Also, possible toxic effects of the drug in the liver, testes and epididymis were evaluated, as well as the search for metastatic foci and drug action on them. Exposure of prostatic tumor cells to Nintedanibe led to reduced cell viability and clonogenicity as well as mobile and invasive potential, besides affecting the expression of crucial molecules to the cell cycle progression, leading to a G1 phase cycling arrest. In addition, the drug decreased tumor volume by interfering with cell proliferation and microvessel density in xenograft tumor, as well as reducing levels of pro-angiogenic molecules. The results also showed that the administration of Nintedanib in TRAMP mouse at the initial and intermediate stages of the prostatic carcinoma development exerted a protective effect on cancer progression, since it delayed the neoplastic transformation in the prostatic microenvironment, reducing tumor vascularization besides immunolocalization and the levels of crucial molecules formicroenvironment, reducing the necessary vascularization for tumorigenesis, preventing the tumor development to advance to more aggressive stages of the disease. Nintedanibe therapy is promising for the treatment of prostate cancer, since in it did not show liver and reproductive toxicity.
Lista de abreviaturas
AR – Receptor de Andrógeno CD31 – Cluster de Diferenciação 31 DAB – Diaminobenzidina DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole DMSO – Dimetilsulfóxido ERα – Receptor de Estrógeno αFGF – Fator de Crescimento de Fibroblasto
FGFR – Receptor de Fator de Crescimento de Fibroblasto
HRP – Horseradish Peroxidase
MMP – Metaloproteinase
PCNA – Antígeno Nuclear de Proliferação Celular
PDE – Produção diária espermática
SFB – Soro fetal bovino
TCA – Acido Tricloroacético
TGI – Inibição Total do Crescimento
TRAMP – Camundongos Transgênicos para Adenocarcinoma de Próstata
TUNEL – Marcação de "nicks" por dUTP e Deoxinucleotidil Terminal Transferase
VEGF – Fator de Crescimento Vascular-Endotelial
Sumário
Introdução ...15
Morfologia da próstata...15
Câncer de próstata ...17
Fatores de crescimento fibroblásticos (FGFs) na próstata e uso de inibidores no tratamento do câncer ...21
FGFs nas células germinativas masculinas ...24
Modelo transgênico para o adenocarcinoma de próstata (TRAMP) ...25
Justificativa ...27 Objetivo ...28 Manuscrito I ...30 Manuscrito II ...70 Manuscrito III ...100 Resultados complementares ...137 Discussão e conclusão ...146 Conclusão geral ...149 Referências ...150 Anexos ...160
Introdução
Morfofisiologia da próstata
A próstata é uma glândula sexual acessória do sistema reprodutor masculino, situada ao redor da uretra prostática, na base da bexiga urinária. Essa glândula apresenta importante papel na fisiologia reprodutiva, uma vez que sua principal função é produzir uma secreção de natureza alcalina que compõe o fluído seminal. Essa secreção é essencial para a motilidade e fertilidade dos espermatozoides (Marker et al., 2003; Risbridger, 2006). Em humanos, é dividida anatomicamente em zonas central, de transição e periférica, sendo a zona periférica a região mais afetada por carcinomas (Yu-Ching Peng et al., 2015). Já em roedores apresenta aspecto multilobulado, dividida em quatro lobos, classificados como ventral, dorsal e lateral, de acordo com a distribuição ao redor da uretra prostática, além do lobo anterior ou glândula de coagulação, situado na parte côncava da vesícula seminal (Figura 1), os quais apresentam características histológicas, morfológicas, de expressão proteica e de síntese de DNA diferenciadas (Cunha et al., 2004).
Figura 1. Divisão dos lobos prostáticos de acordo com sua localização ao redor da uretra.
Adaptado de Marker et al. (2003).
A próstata é dividida em dois compartimentos extremamente diferenciados entre si: epitelial glandular e estroma fibromuscular. O compartimento epitelial é composto por epitélio cubóide a colunar secretor, com células neuroendócrinas e basais, organizadas em ácinos
glandulares que secretam para o espaço interluminal (Barron & Rowley, 2012). Já o compartimento estromal possui células estromais, vasos sanguíneos, nervos e células do sistema imune como macrófagos e linfócitos. Há ainda a presença de fibroblastos, principal tipo celular presente, responsável por sintetizar a matriz extracelular, uma rede de proteínas fibrilares, glicoproteínas e proteoglicanos (Kreis, 1999), e moléculas regulatórias, como fatores de crescimento, e enzimas que agem coordenadamente, regulando a fisiologia celular e mantendo a homeostase (Figura 2) (Tuxhorn et al., 2001).
Figura 2. Composição dos compartimentos epitelial (A) e estromal (B) e corte
histológico de próstata (C). Adaptado de Marker et al. (2003), Tuxhorn et al. (2001) e Silva et
al. (2017).
A interação epitélio-estroma tem papel primordial na manutenção da estrutura e funcionamento da próstata (Ekman, 2000). Baseando-se em aspectos morfológicos, funcionais e embriológicos, esta interação pode ser considerada como única unidade funcional (Aumuller & Seitz, 1990; Hayward & Cunha, 2000). A membrana basal é o ponto de união dessa interação oferecendo suporte mecânico e fisiológico ao epitélio secretor (Hayward & Cunha, 2000). O desequilíbrio da interação epitélio-estroma na próstata favorece a formação do carcinoma prostático (Cunha et al., 2002). As células estromais associadas às células tumorais respondem aos andrógenos e fatores de crescimento, levando a interrupção da homeostase epitélio-estroma,
o que desencadeia processos de crescimento, migração, angiogênese, apoptose e metástases tumorais (Cunha et al., 2003; Cornell et al., 2003).
O desenvolvimento e a manutenção da morfofisiologia da próstata são altamente influenciados pelo ambiente hormonal, sendo regulados principalmente por andrógenos, os quais expressam seus efeitos biológicos através da interação com o receptor androgênico (AR) (Cunha et al., 2002; Pytlowanciv, 2016). Os principais andrógenos que induzem a diferenciação prostática são a testosterona e a di-hidrotestosterona, resultado da conversão da testosterona por ação da enzima 5α-redutase tipo II (Thomas et al., 2008). Apesar da próstata ser um órgão andrógeno-dependente, regulado principalmente por esses dois hormônios, os estrógenos também têm importante papel tanto na regulação das funções normais desse órgão quanto nas alterações que podem levar ao prejuízo funcional e estrutural. A presença de estrógenos tem se mostrado importante na manutenção do tecido prostático devido ao sinergismo com andrógenos (Cunha et al., 2002; Weihua et al., 2002).
A biossíntese de estrógeno ocorre a partir de um substrato androgênico, através da aromatização desse hormônio pela enzima aromatase (citocromo P450 aromatase), expressa pelo gene Cyp19 (Fishman & Goto, 1981; O'Donnell et al., 2001; Risbridger et al., 2003). Esta enzima é reguladora crítica entre o balanço de andrógeno e estrógeno, a qual contribui para o nível circulante e tecidual desses hormônios (Risbridger et al., 2003). A evidência da síntese local de estrógenos na próstata foi demonstrada através da detecção local da enzima aromatase (Ellem et al., 2004). Os efeitos estrogênicos na próstata são resultados da ligação desse hormônio em receptores estrogênicos específicos e (ER, ER), os quais são predominantemente expressos no estroma e no epitélio, respectivamente (Risbridger et al., 2001; Cunha et al., 2002). A identificação desses dois subtipos de receptores estrogênicos no tecido prostático confirma a sinalização do caminho de estrógenos neste órgão (Cunha et al., 2002).
Câncer de próstata
O câncer de próstata é o tipo de câncer mais comum em homens, sendo a maior causa de mortalidade, particularmente acima dos 50 anos de idade. Pesquisas apontam que 68.220 novos casos serão diagnosticados no Brasil apenas no biênio 2018-2019, sendo o câncer de próstata o mais incidente no país (INCA, 2018). Segundo Siegel (2018), mais de 164 mil novos casos são estimados apenas para os Estados Unidos no ano de 2018, fazendo com que a doença se torne a segunda maior causa de mortes de homens (Siegel et al., 2018). A lesão está
histologicamente presente em 80% dos indivíduos, mas se manifesta em apenas 10%. Mudanças genéticas capazes de desregular a homeostase entre o compartimento epitelial e estromal da próstata são a principal causa dessa doença (Valta et al., 2009). No carcinoma prostático, a proliferação de células tumorais ocorre além da membrana basal invadindo o estroma, o que leva à desregulação na homeostase do tecido, contribuindo para a ocorrência de um novo microambiente denominado estroma reativo. Esse termo é utilizado para descrever a formação de um novo ambiente em resposta ao carcinoma que acompanha a progressão tumoral (Tuxhorn
et al., 2001). A caracterização do estroma reativo envolve uma série de fatores como
remodelamento da matriz extracelular, aumento na atividade de proteases e na expressão de vimentina, angiogênese aumentada, influxo de células inflamatórias, aparecimento de miofibroblastos e aumento da biodisponibilidade de fatores de crescimento (Figura 3).
Figura 3. Desregulação da homeostase tecidual que leva à formação do estroma
reativo. Adaptado de Barron & Rowley (2012).
Remodelamento da matriz extracelular: Envolve as mudanças que ocorrem na
matriz extracelular incluindo irregularidade espacial entre as fibras, aumento na síntese de fibras colágenas, além de aumento na expressão da glicoproteína denominada fibronectina, que regula
adesão e migração celular (Pujuguet et al., 1996). Estudos indicaram que essas modificações na matriz são induzidas pelas células do carcinoma (Iozzo, 1995; Brown et al., 1999). Além disso, o remodelamento da matriz extracelular pode modular a expressão de algumas moléculas importantes como as metaloproteinases (MMPs) 2 e 9, além de inibidores teciduais de MMPs, as TIMPS, no processo de metástase (Neschadim et al.,2015).
Aumento na atividade de proteases: As proteases estão envolvidas na manutenção
da homeostase da matriz extracelular. As MMPs, uma família de 20 enzimas caracterizadas inicialmente como proteolíticas, apresentam intensa atividade de degradação de componentes da matriz extracelular como colágeno, laminina e fibronectina. Atualmente, sabe-se que elas apresentam também funções no remodelamento tecidual envolvido em processos como morfogênese, angiogênese e principalmente na carcinogênese, uma vez que contribui para os fenótipos invasivos e metastáticos em células do câncer de próstata (Moroz et al., 2013; Gong
et al., 2014). Além disso, sabe-se que no câncer há um aumento na expressão e atividade de
MMP-9, demonstrando que o estroma reativo contribui para o crescimento, progressão, invasão e metástase do tumor pela superprodução de proteases (Wood et al., 1997; Lynch & Matrisian, 2002). Recentemente, um estudo do nosso grupo mostrou que o nível proteico da MMP-9 é significativamente maior em camundongos transgênicos para o adenocarcinoma de próstata (TRAMP) com 18 semanas de idade, caracterizando o envolvimento dessa molécula na progressão tumoral da próstata (Montico et al., 2014).
Angiogênese aumentada: A angiogênese é o processo de recrutamento de novos
vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes, e ocorre em resposta à demanda de nutrientes e oxigênio pelas células tumorais, sendo um fator importante para o surgimento de metástases (McMahon, 2000). As células endoteliais provenientes de microvasos presentes no estroma são induzidas a migrar para a região do tumor, formando novos vasos através de sua proliferação. Esse processo é regulado por fatores ativadores e inibidores (pró e anti- angiogênicos), que podem ser mobilizados a partir da matriz extracelular (Tuxhorn et al., 2001). No câncer de próstata, a angiogênese requerida para o crescimento tumoral é induzida principalmente por um fator ativador, o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), que tem sua expressão aumentada nas células endoteliais, estromais e do próprio tumor (Jackson et al., 1997; Mavrou
et al., 2015), exercendo seus efeitos através da ligação ao seu principal receptor, o VEGFR-2,
presente nas células do endotélio (Ferrara et al., 2003).
Montico e colaboradores (2015) verificaram a expressão de VEGF significativamente aumentada na próstata de camundongos TRAMP, caracterizando o aumento da angiogênese bem como seu envolvimento na progressão tumoral prostática nesses animais.
Ainda, os mesmos autores verificaram que o uso drogas anti-angiogênicas em camundongos em processo de envelhecimento foi capaz de inibir a expressão de VEGF, mostrando que a terapia anti-angiogênica pode ser promissora tanto na prevenção quanto no tratamento do câncer de próstata, visto a diminuição do processo de neovascularização (Montico et al., 2015).Assim, a neovascularização ou angiogênese é considerada um dos principais marcadores de câncer, tornando-se um potencial alvo em terapias (Griffioen & Thijssen, 2014).
Influxo de células inflamatórias: Processos inflamatórios prostáticos estão
associados ao aumento na proliferação, migração e invasão de células tumorais, sendo responsáveis por 20% do desenvolvimento de câncer em humanos, sendo que suas causas ainda são desconhecidas (Sfanos & De Marzo, 2012; Debelec-Butuner et al., 2014). Sabe-se que a resposta inflamatória que ocorre na próstata modifica o microambiente epitelial, o que resulta em remodelação do estroma, ativação de fibroblastos, infiltração de células imunes (mastócitos, macrófagos, linfócitos T e B), além da deposição de colágeno. O recrutamento dessas células imunes resulta em liberação de citocinas pró-inflamatórias, que contribui para instabilidade e proliferação das células epiteliais (Mimeault & Batra, 2013). Os tecidos prostáticos que possuem células malignas apresentam aumento na densidade de macrófagos, e sua presença pode inibir ou estimular a progressão tumoral (Shimura et al., 2000). O macrófago libera substâncias tóxicas e antígenos que marcam a célula tumoral para eliminação por outras células do sistema imune, mas também pode aumentar a secreção de fatores de crescimento que contribuem para a angiogênese, causando o crescimento do tumor (Sunderkotter et al., 1994; Elgert et al., 1998).
Aparecimento de miofibroblastos: O microambiente tumoral apresenta células
estromais derivadas de fibroblastos, os chamados miofibroblastos, que aparecem em locais onde ocorre remodelamento tecidual em situação patológica (Sappino et al., 1990). Este tipo celular desempenha importante papel no desenvolvimento e progressão do câncer, influenciando e modulando a progressão neoplástica através da secreção de matriz extracelular, fatores de crescimento pró-angiogênicos, citocinas, além da superexpressão de MMPs. Através desses mediadores, os miofibroblastos levam ao aumento do crescimento e da sobrevivência tumoral pela promoção de angiogênese e ocorrência de processos metastáticos, além de aumentar a produção de mediadores inflamatórios, que irão recrutar células imunes ativas ao microambiente tumoral (Ammirante et al., 2014). Além disso, o miofibroblasto é um dos principais componentes do estroma reativo em tumores epiteliais, incluindo o câncer de próstata. Assim, a presença desse tipo celular é a principal característica fenotípica do estroma reativo (Domenech et al., 2012).
Aumento da biodisponibilidade de fatores de crescimento: Uma vez que fatores de
crescimento, como os fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), vascular endotelial (VEGFs) e de hepatócitos (HGFs) regulam o estroma normal, o aumento em sua expressão pelo estroma reativo pode regular as células do carcinoma direta ou indiretamente, causando a proliferação do tumor.
Fatores de crescimento fibroblásticos (FGFs) na próstata e uso de
inibidores no tratamento do câncer
A família de FGFs consiste em 23 genes codificantes dos fatores FGF-1 a FGF-23, que estão envolvidos em vários processos celulares como proliferação, apoptose, quimiotaxia, adesão celular, motilidade e diferenciação, sendo secretados por um tipo celular e se ligando a seus receptores (FGFRs) em um diferente tipo celular, caracterizando uma sinalização parácrina (Schwertfeger, 2009). Após serem secretados, os FGFs se encontram na matriz extracelular e sua liberação se dá através da ação de enzimas proteolíticas como as proteases (Powers et al., 2000). A ligação ao receptor, uma tirosina quinase transmembrana, é responsável pela ativação de cascatas sinalizadoras dentro da célula, e só é eficiente quando na presença de heparina ou heparan sulfato, que facilitam a ligação, formando um complexo ternário que estabiliza a ligação FGF-FGFR (Ornitz, 2000; Harmer, 2006). Na próstata, a formação desse complexo irá regular o desenvolvimento embrionário, além de manter a homeostase tecidual através da sinalização direcional e interação entre os compartimentos epitelial e estromal. Esses fatores de crescimento participam tanto de processos normais, como desenvolvimento de lesões e reparo tecidual, quanto da transformação neoplásica, diferenciação celular, angiogênese e inibição da morte celular programada, visto que a expressão aberrante de FGFs e seus receptores levam à ativação de vias envolvidas na progressão do câncer de próstata (Corn et al., 2013). Eles estão envolvidos ainda na motilidade e invasividade de vários tipos celulares, apresentando atividades biológicas com papel importante na tumorigênese (Kwabi-Addo et al., 2004).
Atualmente, a inibição da angiogênese tumoral tem se mostrado uma ferramenta para o tratamento do câncer, uma vez que drogas inibidoras de VEGF e seus receptores (VEGFRs) foram introduzidas com sucesso na prática clínica. Entretanto, as células do câncer podem apresentar um mecanismo de troca de sinalização para a via FGF, o que leva ao crescimento do tumor mesmo sob inibição do VEGF. A sinalização de FGFs e seus receptores está intimamente envolvida com a angiogênese, podendo apresentar um mecanismo de resistência às terapias anti-angiogênicas, além de ter papel importante no desenvolvimento de
metástases em 80% dos pacientes com câncer de próstata em estágio avançado (Corn et al., 2013). Assim, existe a necessidade do desenvolvimento de drogas que sejam mais efetivas no tratamento do câncer, capazes de inibir tanto receptores pró-angiogênicos como a atividade de quinases como os FGFs (Casanovas et al., 2005).
Um inibidor de angioquinases chamado Nintedanibe (Figura 4), está em fase III nos testes clínicos de segurança e eficácia para o tratamento de câncer de próstata, principalmente aqueles resistentes à castração (Molife et al., 2014; Droz et al., 2014). O Nintedanibe tem mostrado a habilidade de inibir múltiplos receptores tirosina quinase, inibindo as vias pró-angiogênicas mediadas não só pelo VEGF, mas também pelo FGF e PDGF, prevenindo o crescimento tumoral por suprimir a angiogênese (McCormack, 2015)
Figura 4. Estrutura química do Nintedanibe. Adaptado de Hilberg et al. (2008).
O Nintedanibe tem se mostrado eficiente na diminuição da proliferação de tipos celulares que os expressam na membrana celular, como células epiteliais e endoteliais (Corn et
al. 2013). A droga se liga e bloqueia o sítio de ligação ao ATP desses receptores, resultando em
bloqueio de sua auto-fosforilação e consequente ativação, provocando mudanças na cascata de sinalização de processos importantes como angiogênese, proliferação, migração, invasão e permeabilidade (Figura 5) (Awasthi & Schwarz 2015).
Figura 5. Ação do Nintedanibe na inibição de receptores de FGF, VEGF e PDGF. Adaptado
de Awasthi & Schwarz (2015).
Resultados interessantes têm sido obtidos no tratamento de câncer de pulmão (Hanna et al., 2016), glândula salivaria (Kim et al., 2017), ovário (Monk et al., 2016) e carcinoma hepatocelular (Okusaka et al., 2016) com Nintedanibe, demonstrando uma boa taxa de controle e estabilização da doença em pacientes, com um perfil de segurança aceitável. Durante o encontro bienal da European Society of Gynecologic Oncology, foram apresentados resultados demonstrando que o Nintedanibe está associado à melhora significativa na sobrevivência de pacientes tratados com essa droga, além de não apresentar interações quando administrado junto com outras drogas quimioterápicas (Du Bois, 2013).
Estudos em animais mostraram que o Nintedanibe, administrado por 2 semanas nas doses de 50 a 100mg/Kg/dia, é capaz de inibir o crescimento tumoral em camundongos nude inoculados com células de hepatocarcinoma (Kudo et al., 2010). Quando camundongos foram inoculados com células do carcinoma de cabeça e pescoço e rim, Nintedanibe foi capaz de diminuir o volume tumoral nas doses de 100, 50 e 10mg/Kg/dia (Hilberg et al., 2008).Assim, o Nintedanibe está sendo avaliado como importante inibidor simultâneo de FGFR e VEGFR, indicando uma opção no tratamento para a doença, uma vez que atrasa o desenvolvimento do câncer (Capdevila, 2014).
O cálculo da dose escolhida para o presente estudo levou em consideração a correspondência entre as doses apropriadas para humanos e àquela usada em estudo com animais, proposta por Reagan-Shaw et al. (2007), baseada na normalização com base na área de superfície corporal (ASC), segundo a fórmula a seguir:
Dose equivalente = Dose animal X Km camundongo1
em humano (mg/kg) (mg/kg) Km humano2
onde Km é uma constante (peso corpóreo/ASC) para cada espécie animal 1Km=3; 2K
m=37.
Considerando-se que um adulto recebe duas doses diárias de 150 mg do Nintedanibe durante o tratamento quimioterápico (Awasthi & Schwarz, 2015), e que um adulto apresenta, em média, 70 kg de peso corporal, tem-se que a dose equivalente em camundongos é de 50 mg/kg/dia. Assim, a dose utilizada nesse estudo, com a qual obtivemos excelentes resultados na inibição do crescimento tumoral (10 mg/kg/dia) é equivalente à 1/5 da dose recomendada em humanos.
FGFs nas células germinativas masculinas
Os testículos são os órgãos do sistema genital masculino responsáveis pela produção de células germinativas, gametas e hormônios essenciais à reprodução. O processo de formação do espermatozoide, denominado espermatogênese, é suportado pela célula de Sertoli, fonte de estradiol para o testículo imaturo (Faham et al., 1998). O interstício testicular apresenta células de Leydig, responsável pela biossíntese de testosterona, um hormônio crucial para a espermatogênese (Hedger & de Kretser, 2000).
A cascata sinalizadora de FGFs é conhecida por seu papel chave na regulação do crescimento e desenvolvimento de vários órgãos reprodutivos, incluindo os testículos (Jiang et
al., 2013). A presença de FGF e FGFR em vários tipos celulares do sistema genital, como
células germinativas, de Sertoli e Leydig, implica que esses fatores apresentam importante papel na regulação do desenvolvimento testicular fetal, maturação espermática, indução da capacidade de produção de gametas funcionais, além de afetar diretamente a fertilidade (Li et
al., 2014). O fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2) está expresso especialmente nas
em espermatócitos e na cauda de espermátides alongadas, mostrando papel modulador no seu desenvolvimento e função (Cotton et al., 2006).
Cotton et al. (2006) demonstraram que o comprometimento da sinalização FGF-FGFR durante o processo de espermatogênese pode resultar em diminuição da produção diária de espermatozoides, e que os espermatozoides produzidos podem ser deficientes em termos de habilidade de capacitação (Cotton et al., 2006).
Modelo transgênico para o adenocarcinoma de próstata (TRAMP)
O camundongo transgênico para o adenocarcinoma de próstata foi desenvolvido em 1995 por Greenberg e colaboradores, e atualmente tem sido amplamente adotado como modelo de estudo para o câncer de próstata. O desenvolvimento do carcinoma prostático espontâneo no TRAMP é induzido pelo antígeno tumoral (Tag) SV40, que age como uma oncoproteína, interagindo com retinoblastoma e p53, importantes produtos de genes supressores de tumor (Greenberg et al., 1995). É devido à inativação dessas proteínas que o Tag SV40 está envolvido no desenvolvimento e progressão do câncer de próstata, sendo capaz de induzir transformações
in vivo (Brinster et al., 1984). O Tag SV40 tem sua expressão regulada pelo promotor da
proteína prostática probasin, um elemento andrógeno-regulado e próstata-específico (Greenberg et al., 1994), fazendo com que o camundongo TRAMP apresente neoplasia restrita à próstata.
Essa linhagem permite um estudo detalhado da progressão de lesões epiteliais e neoplasias intra-epiteliais na próstata, desde adenocarcinomas bem diferenciados, moderadamente diferenciados e fracamente diferenciados com metástase e grandes alterações em marcadores moleculares (Kaplan-Lefko et al., 2003). Como a transformação da transgene ocorre especificamente na próstata de um camundongo TRAMP, o desenvolvimento da neoplasia é especialmente identificado nos lobos ventral e dorsolateral. A transgene é expressa em níveis mais elevados na próstata ventral (Greenberg et al., 1995) e por isso, esse lobo apresenta alteração na expressão de 36 proteínas durante a carcinogênese (Zhang et al., 2011). Esse modelo apresenta a vantagem de desenvolver seu microambiente apropriado, facilitando o estudo da biologia tecidual dessa glândula frente às alterações geradas pelo câncer (Gingrich
et al., 1996).
O modelo TRAMP tem sido amplamente utilizado no estudo de importantes eventos da progressão do câncer de próstata, visto que o animal desenvolve tumores prostáticos com muitas características comuns ao câncer humano (Chiaverotti et al., 2008). Esse animal desenvolve formas progressivas do câncer durante seu tempo de vida, sendo que a neoplasia
intra-prostática pode apresentar-se entre 6 e 12 semanas de idade e todos os animais exibem tumores primários e metastáticos entre 18 e 24 semanas (Gingrich et al., 1999). A partir de 30 semanas, apresentam metástases para nódulos linfáticos e/ou pulmões bem como invasão para vesículas seminais, sendo que sua sobrevida varia de 50 a 54 semanas de idade (Greenberg et
al., 1995; Chiaverotti et al., 2008). O modelo TRAMP foi originalmente produzido e
caracterizado a partir da linhagem de camundongos C57BL/6 (B6). Contudo foi demonstrado posteriormente que os tumores surgiam mais rapidamente e apresentavam-se mais vascularizados em camundongos [C57BL/6 X FVB] F1, sugerindo ativação precoce da
angiogênese nesses animais (Gingrich et al., 1999).
Outra característica do camundongo transgênico é que a maior parte dos animais, quando castrados com aproximadamente 12 semanas de idade, desenvolve o câncer andrógeno-independente (Gingrich et al., 1997), caracterizando o surgimento da doença hormônio-refratária. Isso pode ser devido ao fato de que o TRAMP desenvolve uma mutação espontânea no receptor de andrógeno na próstata (Han et al., 2001). Esses estudos mostram que a progressão do câncer de próstata nessa linhagem é capaz de mimetizar o câncer de próstata clínico com relação a sua progressão, independência androgênica e bioquímica. Assim, o camundongo TRAMP é altamente indicado no estudo de tratamentos para prevenção, intervenção e regressão do câncer de próstata.
Justificativa
Grande atenção tem sido dada ao estudo de novas terapias para prevenção, intervenção e regressão do câncer de próstata, uma vez que há um grande número de indivíduos afetados pela doença. Deve-se levar em conta a complexidade de funcionamento e desenvolvimento desse órgão, considerando-se a importante interação epitélio-estroma como fator primordial para a alteração prostática na caracterização das alterações morfofuncionais geradas pelo tumor. Além disso, ainda não está estabelecida a cura direta por meio de agentes químicos para o câncer de próstata em estágio avançado, bem como a utilização de diferentes drogas agindo sobre os diversos mecanismos de funcionamento desse órgão. Além disso, não se conseguiu estabelecer estratégias terapêuticas totalmente seguras e eficazes no tratamento dessa doença. Assim, estudos com novas drogas são extremamente importantes, especialmente utilizando-se de modelos animais que simulem essa doença no homem e agreguem conhecimento a essa importante lesão glandular, além de sinalizarem estratégias efetivas na prevenção e terapia dessa doença. Especial atenção tem sido dada ao estudo dos inibidores das vias de FGFs e VEGF como o Nintedanibe, composto capaz de reduzir a angiogênese e a proliferação celular, diminuindo o volume tumoral. Nesse sentido, se fez necessário uma investigação mais detalhada e abrangente sobre a eficácia, mecanismos de ação e toxicidade desse composto no tratamento do câncer de próstata em camundongos TRAMP.Ainda, se considerando o importante papel da cascata sinalizadora de FGFs no desenvolvimento e maturação de espermatozoides, e sabendo-se que o comprometimento da sinalização FGF-FGFR durante o processo de espermatogênese pode resultar em diminuição da eficiência da produção espermática, se fez procedente a avaliação complementar do testículo e epidídimo desses animais no presente estudo.
Objetivo
O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos e mecanismos de ação do agente anti-angiogênico, Nintedanibe no lobo ventral da próstata de camundongos transgênicos para adenocarcinoma (TRAMP), que receberam a droga em diferentes estágios de desenvolvimento do tumor, bem como em células tumorais prostáticas e modelo xenográfico para câncer de próstata. Além disso, avaliou-se a toxicidade da droga e efeitos em outros órgãos do sistema genital masculino.
Objetivos específicos
• Manuscrito I: O manuscrito teve como objetivo avaliar a viabilidade de células tumorais humanas PC3 e LNCaP após exposição ao Nintedanibe, bem como os níveis de VEGFR-1 e VEGFR-2 nas mesmas. Avaliou-se ainda os efeitos do Nintedanibe sobre a progressão tumoral no lobo ventral da próstata em diferentes graus de lesões nos camundongos TRAMP através de análise morfológica e de proliferação por imuno-histoquímica para PCNA. Também, a resposta hormonal (AR e ERα) e angiogênica (VEGF, VEGFR-1 e FGFR-3) foram avaliadas, bem como da neovascularização (CD31) no lobo ventral da próstata após tratamento com a droga, além de sua possível toxicidade no fígado desses animais.
• Manuscrito II: Objetivou decifrar os mecanismos moleculares pelos quais a terapia com Nintedanibe é eficaz na terapia do câncer de próstata através de avaliação de viabilidade, invasividade, motilidade e potencial clonogênico de células tumorais prostáticas humanas expostas à droga, bem como sua ação na transição epitélio-mesenquimal (avaliação de vimentina e E-caderina). Além disso, foram avaliadas a expressão gênica, através de PCR, e níveis proteicos de moléculas relacionada ao ciclo celular, tais como ciclinas, cdks e p21, entre outras. Ainda, experimentos em modelo xenográfico para câncer de próstata foram realizados a fim de avaliar os efeitos do tratamento no volume tumoral, via angiogênica, indução de apoptose, e proliferação de células tumorais por meio de imuno-histoquímica e quantificações proteicas
• Manuscrito III: Neste estudo, os efeitos do Nintedanibe em moléculas relacionadas à via angiogênica como fatores de crescimento (FGF-2 e FGF-7) e receptores (FGFR-3 e VEGFR-1) foram avaliados, bem como sua ação na transição epitélio-mesenquimal (vimentina) e estroma reativo (MMP-9). Além disso, avaliou-se a influência do tratamento na indução de apoptose e na hipóxia tecidual (HIF1α).
• Análise complementar (futuro manuscrito IV): Avaliar a ação citotóxica/citocida do Nintedanibe em um painel com 11 diferentes linhagens celulares tumorais e não tumorais, bem como scanning de focos metastáticos da doença em fígado, osso e pulmão de camundongos TRAMP, além de possíveis efeitos adversos exercidos pela droga sobre testículo e epidídimo.
Manuscrito I
O manuscrito apresentado a seguir foi publicado em maio de 2017 no periódico Journal
of Biomedical Science.
Nintedanib antiangiogenic inhibitor effectiveness in delaying adenocarcinoma progression in Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate (TRAMP)
Raquel Frenedoso da Silva1, Ellen Nogueira-Pangrazi1, Larissa Akemi Kido1, Fabio Montico1, Sarah Arana2, Dileep Kumar3, Komal Raina3, Rajesh Agarwal3, Valéria Helena Alves Cagnon1*
1 Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, University of Campinas
(UNICAMP), São Paulo, Brazil
2 Department of Biochemistry and Tissue Biology, Institute of Biology, University of Campinas
(UNICAMP), São Paulo, Brazil
3 Department of Pharmaceutical Sciences, Skaggs School of Pharmacy, University of Colorado
Anschutz Medical Campus, Aurora, Colorado, USA
*Correspondence to: Valeria H. A. Cagnon PhD, Department of Structural and Functional
Biology, Institute of Biology, State University of Campinas (UNICAMP), P.O. Box 6109, 13083-865, Campinas, São Paulo, Brazil. E-mail: quitete@unicamp.br
ABSTRACT
Background: In recent times, anti-cancer treatments have focused on Fibroblast Growth Factor
(FGF) and Vascular-Endothelial Growth Factor (VEGF) pathway inhibitors so as to target tumor angiogenesis and cellular proliferation. One such drug is Nintedanib; the present study evaluated the effectiveness of Nintedanib treatment against in vitro proliferation of human prostate cancer (PCa) cell lines, and growth and progression of different grades of PCa lesions in pre-clinical PCa transgenic adenocarcinoma for the mouse prostate (TRAMP) model.
Methods: Both androgen- dependent (LNCaP) and androgen-independent (PC3) PCa cell lines
were treated with a range of Nintedanib doses for 72 h, and effect on cell growth and expression of angiogenesis associated VEGF receptors was analyzed. In pre-clinical efficacy evaluation, male TRAMP mice starting at 8 and 12 weeks of age were orally-fed with vehicle control (10% Tween 20) or Nintedanib (10mg/Kg/day in vehicle control) for 4 weeks and sacrificed immediately after 4 weeks of drug treatment or sacrificed 6-10 weeks after stopping drug treatments. At the end of treatment schedule, mice were sacrificed, and ventral lobe of prostate was excised along with essential metabolic organ liver and subjected to histopathological and extensive molecular evaluations. Results: The total cell number decreased by 56-80% in LNCaP and 45-93% in PC3 cells after 72 h of Nintedanib treatment at 2.5 - 25 µM concentrations. In pre-clinical TRAMP studies, Nintedanib led to a delay in tumor progression in all treatment groups; the effect was more pronounced when treatment was given at the beginning of the glandular lesion development and continued till study end. A decreased microvessel density and VEGF immunolocalization was observed, besides decreased expression of Androgen receptor (AR), VEGFR-1 and FGFR-3 in some of the treated groups. No changes were observed in the histological liver analysis. Conclusions: Nintedanib treatment was able to significantly decrease the growth of PCa cell lines and also delay growth and progression of PCa lesions to higher grades of malignancy (without inducing any hepatotoxic effects) in TRAMP mice. Furthermore, it was observed that Nintedanib intervention is more effective when administered during the early stages of neoplastic development, although the drug is capable of reducing cell proliferation even after treatment interruption.
KEYWORDS: Nintedanib, angiogenesis inhibitor, hormone receptors, VEGF, prostate cancer,
BACKGROUND
Prostate cancer (PCa) is the most common type of cancer in men and the second leading cause of cancer-associated deaths, particularly in men over 50 years of age [1]. According to Siegel (2015), more than 1.6 million new cases of PCa were diagnosed in 2015 in the United States alone [2]. Genetic aberrations, capable of disrupting homeostasis between the epithelial and the stromal prostate compartments, are considered as one of the leading causes of this disease; prostatic stroma is responsible for the quick response in case of tissue injury/damage to the prostatic epithelium [3, 4].
Different animal models have been used in anti-PCa efficacy studies, including the transgenic adenocarcinoma for the mouse prostate (TRAMP) model, which mimics the spontaneous growth and progression of PCa as it occurs in humans. According to Wikstrom et
al. (2005), lesions found in the prostate of the TRAMP mice can be classified into different
grades histopathologically, [5]: low and high grade prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) lesions which advance to different stages of adenocarcinoma, such as well-differentiated, and poorly differentiated adenocarcinoma; in addition, there are extensive changes in the expression of molecular markers [6]. The PIN stage is characterized by a stratification pattern and epithelial cell projection into the acinar lumen, showing atypical cells and cell polarity loss, nuclear increase, and chromatin condensation. Well-differentiated adenocarcinoma is characterized by the invasion of epithelial cells in the prostatic stroma and basement membrane disruption. This latter grade lesion can develop into poorly differentiated adenocarcinoma, where the tumor is made up of a cluster of indistinct cells [7].
Though the transgene is significantly expressed in dorsolateral prostate of TRAMP mice, it is also expressed at higher levels in the prostate ventral lobe [8]; a recent study has shown changes in the expression of 36 proteins during carcinogenesis in the ventral lobe of prostate [9]. Furthermore, a 2016 study showed a significant delay in tumor progression in the prostate ventral lobe of TRAMP mice after anti-inflammatory therapy [10].
Angiogenesis is known for its importance in the development and maintenance of the tumor and is responsible for the recruitment of new blood vessels from pre-existing vessels, occurring in response to the demand of nutrients and oxygen by tumor cells [11]. Currently, inhibition of tumor angiogenesis has been shown to be a promising therapeutic strategy in cancer treatment, and Vascular-Endothelial Growth Factor (VEGF) inhibitory drugs have been used successfully in clinical practice [12]. However, cancer cells may show a signaling exchange mechanism with the Fibroblast Growth Factor (FGF) pathway, leading to tumor growth even under VEGF inhibition. FGF signaling and receptors are responsible for regulating
mechanisms such as differentiation, survival, motility and invasiveness, as well as being intimately involved in angiogenesis [13].
Currently Nintedanib (BIBF 1120), a selective FGF and VEGF receptor inhibitor, is being evaluated in clinical trials for its safety and efficacy against PCa treatment [13]. Studies have shown that Nintedanib is related to a significantly improved survival rate in patients [14]. Other studies have shown that Nintedanib administered at doses of 50 to 100mg/kg/day for 2 weeks could inhibit hepatocellular tumor growth in nude mice [15]. Furthermore, Nintedanib has been also shown to decrease tumor volume in mice injected with head, neck, and renal carcinoma cells [16]. Thus, the objective in the present study was to evaluate the efficacy of Nintedanib treatment against in vitro proliferation of human PCa cell lines, and the growth and progression of different grades of PCa lesions in TRAMP model. Besides investigating the effect on aberrant signaling pathways associated with PCa, the therapy effectiveness would also be analyzed on the structural and hormonal responses as well as the neovascularization of the prostate ventral lobe of TRAMP mice at different stages of the disease.
METHODS
Reagents and cell culture
Human prostate carcinoma LNCaP and PC-3 cells were obtained from American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cells were cultured in RPMI 1640 with 10% fetal bovine serum (Hyclone, Logan, UT) under standard culture conditions (37°C, 95% humidified air and 5% CO2). Cells were plated at a density of 5 × 103 cells/cm2 plates under standard culture
conditions. After 24 h, cells were treated with either DMSO alone (control), or different doses of Nintedanib dissolved in DMSO (concentration did not exceed 0.1% in any treatment (v/v)). At the end of treatment time (72 hours), cells were collected after brief trypsinization, washed with PBS, and then stained with Trypan blue. The total cell number (colorless and blue stained) and dead cells (blue stained) were counted under light microscope using hemocytometer.
Western Blotting for cell lysates
Approximately 80 μg of protein lysate from whole-cell extracts per sample was denatured in 5× sample buffer and subjected to sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) on 8% Tris–glycine gel. The separated proteins were transferred on to nitrocellulose membrane followed by blocking with 5% non-fat milk powder (w/v) in Tris-buffered saline (10 mM Tris–HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) for 1 h at room temperature. Membranes were probed for VEGFR-1 Vascular-Endothelial Growth Factor Receptor 1 - VEGFR-1 (sc-316) (Santa Cruz Biotechnology, USA) and VEGFR-2 (sc-6251)
(Santa Cruz Biotechnology, USA) followed by the appropriate peroxidase-conjugated secondary antibody and visualized by ECL detection system. Membranes were also stripped and re-probed again with the loading control β-actin (A2228 Sigma-Aldrich). In each case, blots were subjected to multiple exposures on the film to make sure that the band density is in the linear range. The autoradiograms/bands were scanned with Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems, San Jose, CA).
Animals and Experimental Procedure
A total of 72 transgenic male mice - TRAMP (C57BL/6-Tg (TRAMP) 824Ng/JX FVB/JUnib) were provided by the Multidisciplinary Center for Biological Investigation in Laboratory Animal Science at the State University of Campinas (UNICAMP). The animals received water and solid food ad libitum (Nuvilab, Colombo, PR, Brazil). Procedures were approved by the Committee of Ethics in Animal Research (protocol nº 3285-1) and carried out in agreement with the Ethical Principles for Animal Research established by the Brazilian College for Animal Experimentation (COBEA). The mice were weighed and divided into 9 experimental groups (n=9 per group), as follows (Figure 1A), receiving either the vehicle (10% Tween 20,10mL/kg/day) or Nintedanib (10mg/kg/day in control vehicle) orally [16]: T8 group: untreated 8-week-old TRAMP mice; TC12 and TN12 groups: TRAMP mice treated with vehicle or Nintedanib, respectively, from 8-12 weeks of age and sacrificed thereafter; TC16
and TN16 groups: TRAMP mice treated with vehicle or Nintedanib, respectively, from 12-16
weeks of age and sacrificed thereafter; TC22 (8-12) and TN22 (8-12) groups: TRAMP mice treated with vehicle or Nintedanib, respectively, from 8-12 weeks of age and sacrificed 10 weeks later (22 weeks of mice age); TC22 (12-16) and TN22 (12-16) groups: TRAMP mice treated with vehicle or Nintedanib, respectively, from 12-16 weeks of age and sacrificed 6 weeks later (22 weeks of mice age). At the end of treatment, the mice were weighed on a Denver
P-214 scale (Denver Instrument Company, Arvada, CO, EUA) anesthetized with 2% xylazine
hydrochloride (5 mg/kg; Konig, São Paulo, Brazil) and 10% ketamine hydrochloride (60 mg/kg; Fort Dodge, IA) and euthanized. Samples from the prostate ventral lobe were collected and submitted to histopathological, immunohistochemical and western blotting analyses. The body weight gain during the treatment (n=3) were recorder for each experimental group.
Histopathological analysis. Five prostate ventral lobe samples per experimental group were fixed in Bouin solution, washed in 70% ethanol, dehydrated in increasing concentration of ethanol, diaphanized in xylene and embedded in Paraplast (Paraplast Plus, St. Louis). Five µm thick sections were obtained using a microtome (Zeiss Hyrax M60) and the sections were deparaffinized in xylene, hydrated in a decreasing ethanol series, rinsed under
distilled water and staining with hematoxylin–eosin. Photomicrographs were captured by a digital camera coupled to a Nikon Eclipse E-400 light microscope (Nikon, Tokyo, Japan). Morphological evaluation was performed (blind assay) in 15 randomly captured areas per animal (under 400x magnification), resulting in 75 areas per group. Each area was divided into 4 quadrants and histopathologically classified as per modified recommendations of Berman-Booty (2012) [7]: Normal, (without lesion), Low/High Grade Prostatic Intraepithelial Neoplasia (PIN) and Well-differentiated adenocarcinoma. Liver samples from TC12, TN12, TC22 (8-12) and TN22 (8-12) groups were also collected and subjected to same histopathological protocol as above.
Immunohistochemistry. Tissue samples of prostate ventral lobe as were used in the histopathological analyses were also used for CD31, Androgen Receptor (AR), Estrogen Receptor α (ERα), Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) immunohistochemical analysis using standard protocol. Briefly, antigens were retrieved by boiling the sections in 10mM citrate buffer (pH 6.0). After that, the sections were incubated in H2O2 to block endogenous peroxidase. Nonspecific binding was blocked by
incubating the sections in a blocking solution (BSA in TBS-T buffer) for 1 h at room temperature. AR, ERα, PCNA, CD31 and VEGF antigens were detected using polyclonal rabbit anti-AR (sc-816) (Santa Cruz Biotechnology, USA), polyclonal rabbit anti-ERα (sc-542) (Santa Cruz Biotechnology, CA), PCNA [PC10] (ab29) Abcam for PCNA, polyclonal rabbit anti-CD31 1506-R) (Santa Cruz Biotechnology, CA) and polyclonal mouse anti-VEGF (sc-53462) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), respectively, diluted in 1% BSA and applied to the sections overnight at 4 °C. The sections were then washed with TBS-T and subsequently incubated in HRP-conjugated secondary antibody from the Envision Kit (DAKO) for 60 minutes for CD31, goat anti-rabbit IgG (W4018) (Promega Corporation, Madison, WI) for AR and ERα and goat anti-mouse IgG (W4021) for VEGF detection. After washing in TBS-T, peroxidase activity was detected using a diaminobenzidine (DAB) chromogenic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for 5 min, which indicated the immunoreactivity of antibodies. Sections were lightly counterstained with Harris Hematoxylin, dehydrated in an increasing ethanol series and xylene, mounted in Entellan (Merck, Darmstadt, Germany) and photographed using the Nikon Eclipse E-400 microscope. The prostatic sections were analyzed using a multipoint system with 160 intersections [17]. Thus, 10 fields per mice, totaling 50 fields per group, were randomly captured (under 400x magnification). Values were determined by immunoreactivity count coinciding with the grid intersection divided by the total number of points. The result was
expressed as a relative frequency of positive staining for the molecule in all experimental groups. Samples that were not incubated with primary antibody were used as negative controls. Microvessel density. Microvessel density determination was performed by counting the number of CD31 positive blood vessels in the prostatic stroma in ten random and non-overlapping fields per animal, following the criteria proposed by Weidner (1993) [18]. Microvessel density was expressed as the mean value obtained from the ten fields in each animal and also as the maximum density in a particular field (modified from Hochberg, 2002) [19].
Western Blotting for tissue lysates. Prostate ventral lobe samples from five animals per group were collected and frozen in liquid nitrogen. The samples were weighed and homogenized in a Polytron homogenizer (Kinematica Inc., Lucerne, Switzerland) in a 40 mL/mg protein extraction buffer. The tissue homogenates were centrifuged at 18,659 rcf for 20min at 4°C and a sample of each extract was used for protein quantification with Bradford reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). The supernatants were mixed (1:1) with 3X Laemmli buffer and transferred to a dry bath at 100°C for 5min. Aliquots containing 50 or 75 mg of protein were separated by electrophoresis in SDS-PAGE gels under reducing conditions. After electrophoresis, proteins were transferred to Hybond-ECL nitrocellulose membranes (Amersham, Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL) at 120V for 90 minutes. The membranes were blocked with BSA in TBS-T for 60 min and incubated at 4 °C overnight with the primary antibodies for AR, ERα and VEGF (described under the immunohistochemistry section) and Fibroblast Growth Factor Receptor 3 – FGFR-3 (sc-123) (Santa Cruz Biotechnology, USA) and Vascular-Endothelial Growth Factor Receptor 1 – VEGFR-1 (sc-9029) (Santa Cruz Biotechnology, USA). Membranes were then incubated for 2 h with the same HRP-conjugated secondary antibodies used for immunostaining diluted in a 1:5,000–1:10,000 range. After washing in TBS-T, peroxidase activity was detected through the incubation of the membranes in the chemiluminescent solution (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) for 5 min, followed by fluorescence capture using the Gene Gnome equipment and the Gene Sys image acquisition software (Syngene Bio Imaging, Cambridge, UK). Mouse monoclonal anti-β-actin (sc-81178) (Santa Cruz Biotechnology, CA) antibody was used as an endogen control for comparison among groups. The intensity of antigen bands in each experimental group was determined by densitometry using the Image J (Image Analysis and Processing in Java) software for image analyses and was expressed as the mean percentage + standard deviation in relation to β-actin band intensity.
Statistical Analysis. Data are presented as average percentage or mean ± Standard Error of Mean (SEM). Parametric variables were compared by ANOVA followed by the test of Bonferroni or by two-tailed t-test (for morphology and Western Blotting analysis). Differences were considered significant when 𝑝<0.05. The statistical analyses were performed by the software GraphPad Prism (version 5.0).
RESULTS
Inhibitory effects of Nintedanib on growth of androgen–dependent and – independent human PCa cells. In order to evaluate the anticancer efficacy of Nintedanib
against both androgen-dependent and –independent human PCa cells, we studied the in vitro effect of Nintedanib treatment on the cellular growth/viability of both cell types (under 10% serum conditions) using Trypan blue dye exclusion method. Both androgen-dependent LNCaP and androgen–independent PC3 PCa cells treated with Nintedanib at the concentrations of 0, 2.5, 5, 10 and 25 µM for 72 h showed a concentration dependent decrease in growth of these cells. The total cell number decreased by 56-80% (P<0.001) in LNCaP and 45-93% (P<0.001) in PC3 cells after 72 h of Nintedanib treatment at 2.5- 25 µM concentrations, respectively (Figure 1B and 1C). These in vitro observations confirmed that Nintedanib had inhibitory effect against the growth of both androgen-dependent and –independent human PCa Cells.
TRAMP mice as an appropriate model for prostate ventral lobe adenocarcinoma evaluation. Though most of the TRAMP studies have focused on efficacy
evaluation in dorsolateral prostate, the transgene is also expressed in ventral prostate of TRAMP mice. In this study, we focused on neoplastic changes as observed in ventral prostate; this lobe also showed progressive development of PCa with increase in age in the TRAMP mice. The lesions were characterized as acinar epithelium proliferative lesions with different grades of severity. In 8- and 12-week-old mice (T8 and TC12 groups) there was a predisposition of low grade PIN (43.86% and 43.16%, respectively), characterized by cellular proliferation without occupying the lumen acinar known as the micro-papillary form (Figures 1D, 2B, 2F and 2G), at the beginning of the prostatic lesion development. In these lesions, cellular atypia, such as the increase of nuclear size and cytoplasm reduction were verified in the epithelium (Figure 2E). Also, the occurrence of inflammatory cells and hyperplasia of the smooth muscle cells were verified in the prostatic stroma. The smooth muscle cells were placed around the stroma, in addition to collagen fiber thickening, particularly around glandular regions showing epithelial cell proliferation (Figures 2O, 2P and 2Q). On the other hand, the predisposition of high grade PIN was verified in 16-week-old mice (TC16 group), representing 46.61%, showing
higher frequency of epithelial stratification (Figures 2C and 2E). The proliferative foci of prostatic epithelium in this group occupied the greater part of the acinar lumen, characterizing the acini with a cribriform feature (Figure 1E). Finally, the 22-week-old mice TC22 (8-12) and TC22 (12-16) presented prostatic adenocarcinoma in advanced grades of development, characterized by the frequent occurrence of high grade PIN and representing 55.28% of the glandular total in the TC22 (8-12) group and 57.08% in the TC22 (12-16) group (Figures 2C, 2K, and 2M). Also, there was well-differentiated adenocarcinoma characterized by epithelial cell proliferation invading the stroma, characterizing basal membrane discontinuity (Figure 1F). In addition, undifferentiated adenocarcinoma was seen, characterized by acinar structure loss, in which the epithelial cells occupied the organ entirely (Figure 1G). The prostatic stroma of these two groups also presented collagen fiber thickening, with the disorganization of stromal elements (Figures 2U and 2X).
Nintedanib delayed adenocarcinoma progression in the prostate ventral lobe, particularly when it was administered at the beginning of glandular lesion development.
The mice from TN12 and TN16 groups showed late prostatic adenocarcinoma progression, characterized by a significant increase of healthy acinar frequency and decrease of high grade PIN foci in all Nintedanib treated groups vs. their control groups (Figures 2A, 2C, 2H and 2J). On the other hand, the reduction of prostatic epithelial cell proliferation was higher in the TN12 group where Nintedanib treatment was given from 8-12 weeks of age and mice were sacrificed immediately after treatment end (Figure 2H).
The mice from the TN12 group also showed a significant increase in a no-lesion acini frequency (34%), in addition to epithelial atrophy in comparison to the control group (TC12). Also, Nintedanib treatment reduced the well-differentiated adenocarcinoma incidence to 1.07%. There was also a reduction of low grade PIN (37.21%) and high grade PIN (27.71%) in relation to the TC12 control group (Figures 2B and 2H). The prostatic stroma from the Nintedanib treated mice showed a slight decrease of fibromuscular layer thickening. However, hypertrophied smooth muscle cells, and regions with inflammatory cells were still observed (Figure 2R). The TC12 group showed a predominance of low grade PIN (43.16%), while only 19.62% of the total glandular area showed acini without structural changes (Figures 2B and 2G). High grade PIN foci (35.31%) and well–differentiated adenocarcinoma (1.68%) were verified in the TC12 group. The prostatic stroma in the mice from the TC12 group showed a slight fibrillar element increase, characterized by smooth muscle cell hypertrophy and collagen fiber layer thickening. In addition, inflammatory cells occurrence was identified, which was
