Doença multifatorial. Fatores Genéticos. Fatores Ambientais Também chamadas doenças complexas. Muitos genes

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(2) Doença multifatorial  Fatores Genéticos  Muitos genes  Fatores Ambientais  Também chamadas doenças complexas.

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(4) Limiar  Vários fatores que contribuem  quando passa do. limiar = DOENÇA.

(5) Limiar.  Vários fatores que contribuem quando a. pessoa passa do limiar = DOENÇA.

(6) Limiar Vários fatores que contribuem quando a pessoa passa do limiar = DOENÇA.

(7) Genes associados  São vários genes  Cada gene segue padrão de herança mendeliano  Nem todo mundo tem os mesmos alelos nos mesmos locos.

(8) Exemplo fictício  Doença associada com 10 genes (A –J) e 1 fator ambiental (cigarro)  Todos os genes tem efeito igual sobre a susceptibilidade (sempre o. recessivo )  Limiar é quando tem alelo de susceptibilidade em pelo menos 7 genes (+fator ambiental).

(9) Exemplo fictício  1: AA BB CC DD EE FF GG HH II jj –fuma  2: AA BB CC DD ee FF gg HH II jj –não fuma  3: aa BB cc dd ee FF gg hh ii JJ –fuma.  4: AA BB CC dd ee ff gg hh ii jj –fuma  5: aa bb cc dd ee ff gg hh ii jj –não fuma.

(10) Genes associados  Não tem um gene causador da doença e sim muitos genes ASSOCIADOS.  Genes associados – alelos conferem diferentes graus de. SUSCEPTIBILIDADE.

(11) Risco de recorrência  Menor que para características monogênicas.  Não é simples de ser calculado – estimativa  Depende da prevalência da doença na população em questão.

(12) Como saber se tem fator genético  Estudos de gêmeos e filhos adotivos  Agregação familial – parentes consanguíneos x parentes. não consanguíneos  Estudos de genes associados.

(13) Como saber quais genes  Estudos de associação POPULAÇÃO. vs  Estudos de ligação  FAMÍLIAS.

(14) Estudos de associação  Baseados em análises populacionais  Também chamados de estudos caso-controle.  Comparação entre grupo de pacientes com grupo de. indivíduos não afetados.

(15) Estudos de associação  Princípio:  compara os alelos de um gene em pacientes e em. controles  se houver diferença entre o grupo de pacientes e o grupo controle o gene está associado.

(16) Exemplo fictício  Gene A –alelos A1 e A2.

(17) Exemplo fictício.  Teste estatístico para ver se a diferença é significativa  Se for:.  Cálculo da OR (odds ratio) ~ risco relativo.

(18) Exemplo fictício.  Nem todo mundo que tem A1 tem a doença  Nem todo mundo que tem a doença tem A1.

(19) Análise estatística Método de Woolf (1955)  Razão de proporções (odds ratio)  É a incidência relativa da característica em pessoas com. marcador α comparada a pessoas com o marcador β.

(20) Incidência relativa marcador α. pacientes a. controles b. β. c. d. • Razão entre os marcadores α e β em pacientes dividida pela razão respectiva em controles • Odds ratio = (a/c)/(b/d) = a.d/c.b.

(21) Estudos de associação  IMPORTANTE: grupos de pacientes e controles devem ser pareados para.   . . outros fatores!!!! Idade Sexo Exposição ao fator ambiental Origem étnica.

(22) Estudo de associação  Consequências do mal-pareamento entre pacientes e controles:  ASSOCIAÇÕES ESPÚRIAS  ausência de associação  IDADE ≠ se controles forem mais novos podem ainda não ter desenvolvido. a doença  Sexo ≠ se a doença afetar mais homens do que mulheres e nos controles tiverem mais mulheres.

(23) Origem étnica ≠.  Se todos os pacientes forem do continente X e os. controles do continente Y  Se forem de um continente Z, mas com origem ≠.

(24) Exposição ao fator ambiental  Nem sempre se conhece, tentar parear por:  Área geográfica  Ocupação  Classe social  Hábitos de vida/alimentação (tabagismo, consumo de álcool, uso de anticonceptivos, etc...).

(25) Polimorfismos  Como estudar o gene?.  Marcadores genéticos  SNP  STR/VNTR  Indel.

(26) Polimorfismos  Técnicas utilizadas:  PCR-RFLP (restriction fragment lenght polymorphism)  PCR-SSP (sequence specific primer)  PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide)  PCR-SSCA (single strand conformation polymorphism)  Sequenciamento  Microarranjo.

(27) Polimorfismos associados  Polimorfismo associado pode:  Alterar aa na proteína (alteração de função) –polimorfismo não sinônimo na região codificadora  Alterar a quantidade da proteína –polimorfismo na região. do promotor ou região reguladora  Alterar processamento do mRNA (alteração sítio de. splicing) –polimorfismo em íntrons.

(28) Polimorfismos  Polimorfismo estudado pode ser variante causal ou não (marcador. genético)  Polimorfismo pode aparecer associado porque está em Desequilíbrio de. Ligação com polimorfismo “causal”.

(29) Haplótipos  Gene A: alelos A1 e A2  Gene B: alelos B1 e B2  Tipagem: indivíduo A1/A2 e B1/B2  Possíveis haplótipos:.

(30) Desequilíbrio de Ligação  Na população:  Frequências alélicas:  A1 –20%; A2 –80%  B1 –50%; B2 –50%.

(31) Desequilíbrio de Ligação.  Desequilíbrio de ligação é quando as frequências. haplotípicas observadas diferem das esperadas!.

(32) Desequilíbrio de Ligação  Implicações para estudos de associação:  Associações observadas podem estar acontecendo apenas por causa do Desequilíbrio de Ligação  No exemplo: B2 só ocorre com A2 (não ocorre com A1)  então, se A2 estiver associado, num estudo do gene B provavelmente B2 vai estar associado, mas a associação de B2 pode não ter significado biológico e apenas refletir a associação “real” de A2.

(33) Desequilíbrio de Ligação  Permite usar um ou poucos marcadores (SNPs) para avaliar vários outros.  “varredura” de um gene inteiro ou uma região genômica  TagSNP: SNP que funciona como “etiqueta” para um haplótipo inteiro.

(34) TagSNP -Exemplo  Haplótipos existentes (4 genes):  1) A1B1C1D1.  2) A1B2C2D1  3) A2B1C2D2  Se genotipar só gene A  se for A2: já sabe que é B1, C2 e D2  Se for A1: sabe que é D1, mas não sabe B e C  Se genotipar mais B ou C –dá pra deduzir todo o haplótipo.

(35) Estudos de associação  Abordagem do gene candidato.  Estudos de regiões candidatas  Estudos de varredura –GWAS (genome wide association studies).

(36) Gene candidato  Escolhe um gene para o estudo:  Função do gene  Estudos anteriores encontraram associação  Estudos anteriores apontam região como candidata  Genotipagem:  Um ou vários polimorfismos do gene em questão.

(37) Gene HSD11B1  associação com HDL. Tureck et al. (2014).

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(39) Estudos genômicos  Estudo sem hipótese à priori livre de hipótese  Permitem encontrar associações que não eram esperadas/previstas.  Precisam de amostras muito grandes (geralmente mais de 1.000 pacientes. e 1.000 controles).

(40) Estudos genômicos  Estudos de milhares de SNPs (geralmente 100.000 ou mais).  Apontam regiões de interesse –SNPs associados em DL com SNP “causal”  Precisam de estudos posteriores refinados destas regiões encontradas para. validação.

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(42)  1161 pacientes e 1174 controles –>315.000 SNPs  Compararam com resultados de 2 estudos.  Genotiparam 80 SNPs em mais 1215 pacientes e 1258 controles  Locos associados identificados com segurança para susceptibilidade a T2D. –pelo menos 10.

(43) Diabetes  Dividida em dois tipos:  Tipo 1: autoimune  Tipo 2: metabólica  Diabetes tipo 1 –associação bem definida com genes HLA de classe II  Genes HLA contribuem com 30-50% do risco para diabetes tipo 1, muitos. outros genes também contribuem Clin Chem.2011 Feb;57(2):176-85..

(44) Resumindo  Doença Multifatorial  Interação de fatores genéticos e ambientais  Estudos de associação  Estudos populacionais  Comparação de grupo de pacientes com grupo de indivíduos controle.

(45) Resumindo  Abordagens  Genes candidatos –escolhe por importância e conhecimento a priori  GWA –muitos SNPs (precisa amostra grande)  Polimorfismos  Regiões reguladoras ou regiões codificadoras  TagSNP (desequilíbrio de ligação).

(46) Resumindo  Diferentes alelos conferem diferentes SUSCEPTIBILIDADES aos. portadores  Nenhum gene sozinho é suficiente para desenvolver doença  Alelo associado:  Nem todo mundo que tem a doença tem o alelo e vice-versa.

(47) Estudos de Ligação • Ligação entre dois locos. • Famílias nas quais mais de um membro tem. a doença..

(48) Estudos de Ligação Dois loci (M e D) são ligados: probabilidade de que sejam herdados juntos, como um haplótipo, depende da probabilidade de recombinação durante a meiose:.

(49) Estudos de Ligação  Para locos não ligados (segregação independente) a fração de recombinação  = 0,5..  Para locos completamente ligados,  = 0..

(50)  Se D é um gene de doença desconhecido e M é um alelo de um. loco de um marcador, e se M e D estão ligados, M irá segregar de modo semelhante à doença..

(51) Alelo A está cosegregando com a doença: ligação entre alelo A do marcador e doença..

(52) Diferentes alelos de marcadores irão co-segregar com a doença em diferentes famílias..

(53) Alelo B está cosegregando com a doença: ligação entre alelo B do marcador e doença. Recombinação gera haplótipo diferente: alelo C e doença..

(54) Importante  Nenhum alelo do marcador está necessariamente ASSOCIADO à. doença!!!! São locos LIGADOS!!!  O loco do marcador é localizado próximo ao loco (gene) da doença:. ocorre menos recombinação entre eles do que seria esperado se apresentassem segregação independente..

(55) Marcadores e Mapeamento  Para serem úteis no mapeamento de genes de doenças,. os loci de marcadores moleculares devem:.  Ser altamente polimórficos, de modo que. sua segregação em famílias possa ser atribuída precisamente;  Ter sua localização conhecida..

(56) Microssatélites (STR).

(57) Estudos de Ligação - Características mendelianas  Somente um ou dois locos estão envolvidos e os variantes causais são. altamente penetrantes.  Grandes heredogramas com múltiplos casos da doença.  Métodos paramétricos (Lod score) são eficientes e o padrão de segregação é claro, permitindo a escolha de modelos plausíveis..

(58) Análise em famílias: Método do LOD Score  Mais utilizado para doenças monogênicas.  Distâncias genéticas entre marcadores são conhecidas.  Somente a localização do gene da doença e portanto a. sua fração de recombinação com os marcadores, é desconhecida..

(59) Método do LOD Score   fração de recombinação : varia de 0 a 0,5..  Frequência esperada na progênie para cada valor de : de. 0,01 a 0,5.  Probabilidade (likelihood; L) de que os dados da família. resultem de um determinado valor de .  Maximum likelihood é a melhor estimativa de ..

(60) Método do LOD Score  Odds ratio (OR): L para cada valor de  / L para  = 0,5.  LOD score (Z): Log (base 10) de OR.  Somar o LOD score de diferentes famílias para obter o valor. máximo de LOD score (MLS)..

(61) Análises paramétricas – Método do LOD Score  Evidência de ligação:. Lod score (Z) > 3  Rejeitar ligação: Lod score (Z) < -2  Incerteza: -2< Lod score (Z) <3.

(62) Genetic analysis of cystic fibrosis using linked DNA markers. L C Tsui, K Buetow, and M Buchwald Am J Hum Genet. 1986 December; 39(6): 720–728..

(63) Mapeamento Gênico por análise de ligação e caminhada cromossômica: gene da fibrose cística • Dois marcadores em desequilibrio de ligação com a fibrose cística: MET e D7S8..

(64) Mapeamento Gênico por análise de ligação e caminhada cromossômica: gene da fibrose cística.

(65) Mapeamento Gênico por análise de ligação e caminhada cromossômica: gene da fibrose cística.

(66) Estudos de Ligação - Características Complexas  Suscetibilidade depende de muitos locos.  Alelos comuns com efeitos pequenos e/ou alelos raros com efeitos. um pouco maiores.  Não se observam grandes famílias com múltiplos afetados.  O risco de recorrência nas famílias é baixo.  Métodos paramétricos podem levar a resultados enganosos..

(67) Análises em pares de parentes  Mais comuns para doenças multifatoriais.  Pares de parentes afetados compartilham marcadores mais do. que o esperado de acordo com sua relação de parentesco..

(68) Método dos pares de irmãos  Pares de irmãos afetados pela doença: maior. disponibilidade; mesmos fatores ambientais.  Quando possível, pais são coletados e genotipados também..

(69) Análises não-paramétricas: pares de irmãos. Compartilhamento de Alelos Idênticos por Descendência (IBD sharing): indício de ligação.

(70) Características Multifatoriais  Análises em muitos pares de irmãos afetados: estimativa de MLS. (maximum LOD score).  Utilizando muitos marcadores: identificação de regiões no genoma que sugerem ligação com a doença.  Varreduras genômicas: 400 marcadores, abrangendo entre 10 e 20 milhões de pares de bases..

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(72) Referências  Turek, Luciane Viater, Leite, Neiva, Souza, Ricardo Lehtonen Rodrigues, Lima, Jovana Karoline,.  .   . Milano, Gerusa Eisfeld, Timossi, Luciana Da Silva, . . . Alle, Lupe Furtado. (2014). Genderdependent association of HSD11B1 single nucleotide polymorphisms with glucose and HDL-C levels. Genetics and Molecular Biology, 37(3), 490-495. Araujo Munhoz, F., Baroneza, J., Godoy‐Santos, A., Fernandes, T., Branco, F., Alle, L., . . . Santos, M. (2016). Posterior tibial tendinopathy associated with matrix metalloproteinase 13 promoter genotype and haplotype. Journal of Gene Medicine, 18(11-12), 325-330. Scott, Laura J., Mohlke, Karen L., ...Boehnke, Michael. (2007). A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants. Science, 316(5829), 1341-1345. Steck, A., & Rewers, M. (2011). Genetics of Type 1 Diabetes. Clinical Chemistry, 57(2), 176-185. Tsui, L., Buetow, K., & Buchwald, M. (1986). Genetic analysis of cystic fibrosis using linked DNA markers. American Journal of Human Genetics,39(6), 720-8. Machado do Nascimento, L., Silva de Castro, C., Medeiros Fava, V., Iani Werneck, R., & Távora Mira, M. (2015). Genetic and biochemical evidence implicates the butyrylcholinesterase gene BCHE in vitiligo pathogenesis. Experimental Dermatology, 24(12), 976-978..

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