Secretaria de Estado da Saúde Coordenadoria de Controle de Doenças
Instituto Adolfo Lutz
Curso de Especialização
Vigilância Laboratorial em Saúde Pública
Bruno Martins de Carvalho
DETERMINAÇÃO DE CLOREXIDINA POR ESPECTROFOTOMETRIA NA REGIÃO DO UV, EM PRODUTOS
COSMÉTICOS E ANTISSÉPTICOS
São Paulo 2019
Trabalho de conclusão de curso de especialização apresentado ao Instituto Adolfo Lutz- Unidade do Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP-Doutor Antônio Guilherme de Souza como requisito parcial para obtenção do titulo de Especialista em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública
Orientador: Prof. Esp. Maria Cristina Santa Barbara
DETERMINAÇÃO DE CLOREXIDINA POR ESPECTROFOTOMETRIA NA REGIÃO DO UV, EM PRODUTOS
COSMÉTICOS E ANTISSÉPTICOS
São Paulo 2019
Carvalho, Bruno Martins
Determinação de clorexidina por espectrofotometria na região do UV, em produtos cosméticos e antissépticos / Bruno Martins Carvalho – São Paulo, 2020.
30 f. il
Trabalho de Conclusão de Curso (Especialização-Vigilância Laboratorial em Saúde Pública)-Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, CEFOR/SUS-SP, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, 2020.
Área de concentração: Segurança Biológica e Química em Medicamentos, Análise Físico-química em Cosméticos e Saneantes
Orientação: Profa. Especialista. Maria Cristina Santa Barbara 1 Clorexidina; 2 Espectrofotometria; 3 Validação de método
SES/CEFOR/IAL-94/2020
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES-SP
"Saber muito não lhe torna inteligente. A inteligência se traduz na forma que você recolhe, julga, maneja e, sobretudo, onde e como aplica esta informação."
RESUMO
A clorexidina é uma substância química que possui uma eficiente ação antimicrobiana antisséptica de largo espectro contra bactérias Gram-positivas e negativas. Por ser um composto químico biguanídico com propriedades catiônicas, pode apresentar-se na forma de diversos sais, quando ingerida é excretada pelas vias normais, e a porcentagem retida no organismo não é tóxica. O seu uso é amplo e têm sido empregados na limpeza de superfícies, equipamentos, roupas hospitalares, consultórios odontológicos e para antissepsia da pele e mãos. Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) a clorexidina é uma solução antisséptica tópica, classificada como um medicamento de baixo risco e como produto cosmético, dependendo da sua utilização e concentração. O laboratório de saúde pública tem como função contribuir para o estudo e a solução de todos os problemas importantes de saúde, fornecendo uma informação precisa e fidedigna. O monitoramento de métodos analíticos validados para a detecção do teor de clorexidina assegura a confiabilidade dos resultados laboratoriais dos produtos disponíveis no mercado, auxiliando na fiscalização sanitária destes produtos. O objetivo deste trabalho foi aperfeiçoar uma metodologia para determinação do teor de clorexidina utilizando o método espectrofotométrico, em produtos antissépticos de uso tópico. Foram realizados testes de avaliação do desempenho incluindo linearidade, seletividade, exatidão, repetitividade, limites de detecção e quantificação, bem como foi efetuada uma comparação entre dois métodos, ao se comparar os resultados obtidos entre as duas metodologias, na qual foi alterado o reagente, concluiu-se que não houve diferença significativa entre os valores p valor maior que 0,05. Sendo assim a metodologia validada é de fácil execução, rápida e de baixo custo podendo ser implantada na rotina do laboratório. Constatou-se que o método validado utilizou pequenas quantidades de solventes e mostrou-se simples e eficaz, uma vez que os resultados encontrados foram satisfatórios. No entanto, para que seja aplicado à rotina laboratorial, ainda são necessários outros testes especialmente na utilização de produtos com corantes, a fim de evitar a interferência melhorando a eficiência do método.
ABSTRACT
Chlorhexidine is a chemical that has an efficient broad spectrum antiseptic antimicrobial action against Gram-positive and negative bacteria. Because it is a biguanide chemical compound with cationic properties, it can be in the form of several salts, when ingested it is excreted by normal pathways, and percentage retained in the body is not toxic. They are widely used and they have been used for cleaning surfaces, equipment, hospital clothing, dental offices and for antisepsis of the skin and hands. According to the National Health Surveillance Agency chlorhexidine it is a topical antiseptic solution, classified as a low-risk drug and as a cosmetic product, depending on its use and concentration. The purpose of the public health laboratory is to contribute to study and solution of all important health problems by providing accurate and reliable information. The monitoring of validated analytical methods for the detection of chlorhexidine content ensures the reliability of laboratory results of products available in the market, assisting in the sanitary inspection of these products. The objective of this work was to improve a methodology for chlorhexidine content determination using the spectrophotometric method in topical antiseptic products. Performance evaluation tests were performed including linearity, selectivity, accuracy, repeatability, detection limits and quantification. In addition, the performance evaluation tests were also compared by comparing the results obtained between two methodologies. When the reagent was changed, it was concluded that there was no significant difference between p values greater than 0.05. Thus the validated methodology is easy to perform, fast and low cost and can be implemented in the laboratory routine. It was found that the validated method used small amounts of solvents and was simple and effective, since the results were satisfactory. However, in order to be applied to the laboratory routine, further testing is still needed especially in the use of dye products to avoid interference by improving the efficiency of the method.
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ... 9
1.1. Clorexidina e antissepsia ... 9
1.2. Regulação de produtos contendo clorexidina na composição ... 11
1.3. Metodologia analítica ... 12
1.4. Espectrofotometria no ultravioleta, visível e infravermelho. ... 14
1.5. Justificativa ... 14 2. OBJETIVOS ... 14 2.1. Objetivo geral ... 14 2.2. Objetivos específicos ... 15 3. MATERIAL ... 15 3.1. Amostras ... 15
3.2. Padrões, reagente e solventes ... 15
3.3. Equipamentos e vidrarias ... 15
4. MÉTODOS ... 16
4.1. Preparo da solução química padrão secundário ... 16
4.2. Preparo da amostra ... 16
4.3. Ensaio de recuperação ... 16
4.4. Ensaio ... 17
4.5. Parâmetros de desempenho analisados para a validação do método ... 19
4.5.1. Seletividade ... 19 4.5.2. Linearidade ... 20 4.5.3. Limite de quantificação (LQ) ... 20 4.5.4. Limite de detecção (LD) ... 20 4.5.5. Recuperação ... 20 4.5.6. Precisão ... 22 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 23
5.1. Critérios de aceitação para recuperação ... 23
5.2. Avaliação do desempenho do método analítico ... 24
6. CONCLUSÃO ... 26
LISTA DE TABELAS Tabela 1. ... 21 Tabela 2. ... 22 Tabela 3. ... 23 Tabela 4. ... 24 Tabela 5. ... 25 LISTA DE FIGURAS Figura 1. ... 10 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1... 18 Gráfico 2... 18
9
1. INTRODUÇÃO
1.1. Clorexidina e antissepsia
A antissepsia é um conjunto de medidas para eliminar ou inibir o crescimento microbiano em um ambiente, pele ou em outros tecidos vivos, podendo ou não destruí-los e os produtos usados com essa finalidade são os antissépticos. (DE OLIVEIRA; SARMENTO GAMA, 2018; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2017).
Os antissépticos referem-se às substâncias químicas utilizadas como bactericidas ou bacteriostáticas em tecidos vivos, sendo designadas de desinfetantes quando usadas em objetos inanimados (BRASIL, 2009). Compreendem uma grande variedade de estruturas químicas e, consequentemente, possuem distintos mecanismos de ação (AMORAS; ZAIA, 2013; FIORENTINO, 2009). Quando aplicados sobre a pele, reduzem a microbiota transitória e residente, uma vez que a ação degermante é apenas temporária e após alguns minutos ou horas há a multiplicação dos microrganismos que permaneceram (REIS et al., 2011).
Na seleção dos antissépticos deve-se levar em consideração o cumprimento de alguns critérios: redução significativa de microrganismos na pele intacta, não irritante, amplo espectro de atividade, ação rápida e persistente. (MORIYA; MÓDENA, 2008).
A clorexidina é uma substância química descoberta no final de 1940, e pela sua eficiente ação antimicrobiana, passou a ser usada na antissepsia da pele e introduzida há muitos anos como antisséptico de largo espectro contra bactérias Gram-positivas e negativas. Por ser um composto químico biguanídico com propriedades catiônicas, pode apresentar-se na forma de diversos sais como acetato, cloridrato, gluconato, digluconato, sendo o digluconato o que apresenta maior solubilidade em água (AMORAS; ZAIA, 2013; BARBIN, 2008; FIORENTINO, 2009).
A designação International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) do digluconato de clorexidina é: “2 - [6 - [[ amino - [[ amino - (4 - chloroanilino) methylidene]amino] methylidene] amino ] hexyl ] – 1 - [amino - (4 - chloroanilino) methylidene ] guanidine; (2R,3S,4R,5R) -2,3,4,5,6- pentahydroxyhexanoic acid” com
10
massa molar de 897,8 g/mol e fórmula molecular “C28H42Cl2N10O7” (PUBCHEM,
2019).
A solução de digluconato de clorexidina é uma solução aquosa, que contém no mínimo 19% (190 g/L) e no máximo 21% (210 g/L) de digluconato de clorexidina. É um líquido amarelo–pálido límpido, quase inodoro, miscível em água e ácido acético glacial, solúvel em álcool e em acetona. Em solução aquosa a 5% (v/v) tem pH compreendido entre 5,5 a 7,0. Sua densidade relativa a 20 ºC é de 1,06 a 1,07 g/mL; deve ser armazenada protegida da luz e em temperatura máxima de 25 ºC. (USP, 2019)
Figura - 1. Estrutura química do digluconato de clorexidina
Fonte: CHEMSPIDER, 2019
A clorexidina é uma molécula estável e quando ingerida é excretada pelas vias normais, e a porcentagem retida no organismo não é tóxica. Quando em baixas concentrações, provoca lixiviação de substâncias de pequeno peso molecular, como o potássio e o fósforo, exercendo efeito bacteriostático e bactericida em altas concentrações (SILVA, 2002). A clorexidina age nas bactérias rompendo a
11
integridade de suas membranas citoplasmáticas resultando na perda de constituintes celulares vitais como o ácido nucleico e potássio (A et al., 2008; BARBIN, 2008; KLUK; REINHOLD; PEREIRA, 2016).
De acordo com a literatura, o uso da clorexidina é bastante amplo e tem sido empregada para a limpeza de superfícies, equipamentos e roupas hospitalares, consultórios odontológicos e outras unidades de saúde para antissepsia da pele, mãos e membranas mucosas bem como para o tratamento de feridas e queimaduras. (ABDUL MAJID et al., 2015; MORIYA; MÓDENA, 2008). Combinada a um detergente ou álcool, é usada para escovação cirúrgica das mãos e preparo pré-operatório da pele em pacientes (TORTORA et al., 2006).
Formulações contendo clorexidina são utilizadas como desinfetantes de uso tópicos desde meados de 1970. Além disso, a clorexidina pode ser incorporada em produtos cosméticos, com função de biocida cosmético. No início da década de 1990, a produção de três tipos de dispositivos médicos que introduziram a clorexidina na sua composição foi iniciada. São eles: os cateteres intravenosos, os curativos tópicos cutâneos antimicrobianos e as malhas cirúrgicas antimicrobianas (AMORAS; ZAIA, 2013).
1.2. Regulação de produtos contendo clorexidina na composição
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) a clorexidina é uma solução antisséptica tópica e está regulamentada pela RDC (Resolução de Diretoria Colegiada) n° 107, de 05 de setembro de 2016. De acordo com essa RDC a clorexidina é um medicamento de baixo risco e os fabricantes, devidamente autorizados, podem comercializar o medicamento obedecendo alguns critérios: solução aquosa ou alcoólica com concentrações de 0,5 a 1,0% (p/p); soluções com tensoativos até 4% (p/p) de clorexidina, com a advertência para não ser utilizado em pessoas com sensibilidade a clorexidina. As soluções tópicas antissépticas contendo clorexidina que estão regularizadas como produtos cosméticos, não podem ultrapassar 0,3% deste ativo (ANVISA, 2015).
12
O uso de clorexidina para a higienização das mãos é seguro e a absorção pela pele é baixa. Porém, de acordo com a frequência de utilização bem como da concentração do ativo na formulação, pode haver irritação na pele, com probabilidade maior para produtos que contêm 4% de clorexidina (ANVISA, 2009).
A Food and Drug Administration (FDA) dos EUA alerta que reações alérgicas raras, porém graves, foram relatadas após o uso de produtos antissépticos tópicos que contêm gluconato de clorexidina. Embora raros, observou-se um aumento nos últimos anos do número de notificações de reações alérgicas graves a esses produtos. (U.S FOOD AND ADMINISTRATION DRUG, 2017).
A toxicidade sistêmica após a ingestão da solução de gluconato de clorexidina foi descrita através de um relato de caso, onde se observou que após a ingestão acidental de solução de clorexidina a 20% (que é equivalente a 100 disparos de bochechos a 0,2%) os seguintes efeitos adversos: cefaleia, euforia, tontura, visão turva por 12 horas, dor de estômago e perda completa de sensação do sabor por 8 horas, alguns desses sintomas perduraram pelas 48 horas seguintes a ingestão. (AMORAS; ZAIA, 2013).
O laboratório de saúde pública, como órgão integrante do serviço nacional ou estadual de saúde, tem como função primordial contribuir para o estudo e a solução de todos os problemas importantes de saúde apresentados, fornecendo uma informação precisa e fidedigna para que o pessoal da assistência médico-sanitária possa adotar medidas adequadas. O emprego de métodos analíticos validados para a detecção do teor de clorexidina assegura a confiabilidade dos resultados laboratoriais dos produtos disponíveis no mercado, auxiliando na fiscalização sanitária destes produtos.
1.3. Metodologia analítica
A escolha de uma metodologia analítica adequada é de fundamental importância para se proceder ao controle de qualidade de uma formulação. A disponibilidade econômica, de equipamentos e reagentes, também deve ser considerada.
13
(BATISTELA; LAPORTA, 2013) A espectrofotometria na região do ultravioleta (200 a 400 nm) representa um dos métodos instrumentais mais empregados, em razão da maioria das substâncias químicas apresentarem absorção nessa região (GIL, 2007). A cromatografia a líquida de alta eficiência é atualmente, um dos métodos preferenciais das indústrias, devido a sua alta sensibilidade e especificidade, já que se trata de uma técnica de separação acoplada a sistema de detecção, além da vantagem da automação. Esse método apresenta algumas desvantagens como o alto custo da instrumentação e operação, a falta de um detector universal e a necessidade de treinamento para sua execução (BATISTELA; LAPORTA, 2013).
Na literatura, infelizmente o material sobre métodos espectrofotométricos para análise do teor de clorexidina é escasso, isso devido a utilização dos métodos cromatográficos, que como já citados possuem vantagens e desvantagens, porém por questões de baixo custo, facilidade de realização e uma menor geração de resíduos o método espectrofotométrico é uma técnica valida e atual.
A validação, verificação ou normalização de um método analítico, envolvem processos de avaliação para verificar sua eficiência na rotina do laboratório. Segundo a NBR ISO/IEC 17025 da Associação Brasileira De Normas Técnicas (ABNT), “Validação de métodos é a confirmação por exame e fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado uso pretendido são atendidos”. (INMETRO, 2018a)
A validação demonstra que o método analítico é adequado para o seu propósito. A validação deve ser considerada quando se desenvolve ou efetua adaptações em metodologias já validadas (BRITO et al., 2003).
Então a validação é importante para garantir que os métodos sejam adequados aos objetivos a que se destinam, possibilitando a obtenção de resultados confiáveis, além de permitir conhecer as limitações e a confiabilidade nas medidas realizadas.
De acordo com o propósito do método, devem ser determinados os parâmetros analíticos que necessitam ser avaliados. A exatidão e a precisão do método constituem parâmetros obrigatórios, independente do seu propósito, exceto para métodos com objetivo apenas qualitativo. Deve-se ressaltar que o método pode ser considerado validado, mesmo que alguns parâmetros não se enquadrem nos limites
14
estabelecidos na literatura, mas que sejam criteriosamente conhecidos e, portanto, adequados aos objetivos do estudo a ser realizado.
1.4. Espectrofotometria no ultravioleta, visível e infravermelho.
As técnicas espectrofotométricas são fundamentadas na absorção da energia eletromagnética por moléculas, o que depende tanto da concentração quanto de suas estruturas químicas. De acordo com o intervalo de frequência da energia eletromagnética aplicada, a espectrofotometria de absorção pode ser dividida em ultravioleta, visível e infravermelho, podendo ser utilizada como técnica de identificação e quantificação de substâncias. (FARMACOPEIA, 2019).
1.5. Justificativa
A proposta do estudo é fazer um levantamento das metodologias existentes para determinação do teor de clorexidina e atividade antimicrobiana em formulações cosméticas e antissépticas, para fornecer subsídios a pesquisas futuras quanto à implantação de novas metodologias na rotina dos núcleos envolvidos, permitindo desenvolver pesquisa técnico-cientifica para a melhoria da qualidade, diagnostico e a análise de produtos de interesse na saúde publica.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Aperfeiçoar metodologia analítica para avaliação da determinação do teor de digluconato de clorexidina.
15
2.2. Objetivos específicos
Comparar metodologias, para a substituição de diluente.
Avaliar o desempenho da metodologia analítica, através dos parâmetros de linearidade, seletividade, exatidão, repetitividade, limites de detecção e quantificação.
3. MATERIAL
3.1. Amostras
Foi utilizada uma amostra de solução aquosa de digluconato de clorexidina antisséptico uso tópico adquirido no comércio de São Paulo com concentração de 1% (p/p), e uma de enxaguatório bucal com concentração rotulada de 0,12% (p/p).
3.2. Padrões, reagentes e solventes
O padrão utilizado foi uma solução aquosa de digluconato de clorexidina padrão secundário Neobrax®, Brasil, com teor rotulado de 20% (p/v) e lote número 201902013. Os solventes utilizados foram Álcool Etílico P.A e água ultrapura, que foi utilizada por ser a disponível com mais facilidade no laboratório, podendo ser substituída por água purificada.
3.3. Equipamentos e vidrarias
Foram utilizados os equipamentos: Balança analítica Modelo AL 204 (Metller Toledo®, EUA), Espectrofotômetro modelo Genesys TL 22303 Thermo Fisher Scientific, EUA), Pipetador 1000 a 5000 µL modelo Brand®,
16
As vidrarias utilizadas, com calibração realizada por laboratórios pertencentes à Rede Brasileira de Calibração (RBC) do Inmetro, foram: pipetas volumétricas (2,0mL, 4,0mL, 5,0mL, 7,0mL, 9,0mL, 15,0mL e 20,0mL) e balões volumétricos de 100mL e 250mL.
4. MÉTODOS
4.1. Preparo da solução química padrão secundário
A partir da solução padrão secundário de digluconato de clorexidina 20%, foi preparada uma solução a 0,1% (p/v). Foi pesado 0,125g do padrão secundário e diluído em um balão volumétrico de 250mL, utilizando-se água ultrapura para obter a solução a 0,1% (solução A).
4.2. Preparo da amostra
A amostra utilizada foi uma amostra comercial padrão de um antisséptico de uso tópico, com concentração de 0,1% (p/p) de digluconato de clorexidina, foi pesado 1g da amostra e diluído com água ultrapura em um balão volumétrico de 100mL, desse balão foi retirada uma alíquota de 2,5mL e diluída em 6 balões de 100ml, resultando em uma solução com concentração teórica de 2,5 ppm (solução B).
4.3. Ensaio de recuperação
Foi fortificada a amostra de antisséptico de uso tópico em três concentrações 4ppm, 7ppm e 15ppm. Pipetou-se 2,5mL da solução B, adicionando 4mL, 7mL e 15mL, da solução A em três balões volumétricos, como a análise foi realizada em triplicata utilizou-se um total de nove balões; três para cada solução.
17
4.4. Ensaio
O objetivo do presente estudo é validar uma metodologia para determinação do cloridrato de clorexidina em produtos antissépticos para uso tópico e em enxaguatórios bucais.
A metodologia utilizada atualmente no Núcleo de ensaios físicos e químicos em cosméticos e saneantes do Centro de Medicamentos do Instituto Adolfo Lutz baseia-se no método do fabricante.
Na literatura foram encontrados poucos métodos de ensaio espectrofotométrico na região de ultravioleta para análise quantitativa de digluconato de clorexidina. Um método encontrado utilizou o etanol como diluente, pois além de apresentar picos bem definidos, possui facilidade de aquisição, baixo custo e baixa geração de resíduos químicos (FIORENTINO, 2009).
Em contrapartida o método proposto neste trabalho para determinação do digluconato de clorexidina foi realizado com base no método utilizado para determinação de biguanida, utilizando água em comparação com o etanol como diluente. O método validado utilizado no laboratório atualmente utiliza etanol. A partir da solução A alíquotas de 2 mL, 4 mL, 5 mL, 7 mL, 9 mL, 15 mL, e 20 mL, foram transferidas para balões volumétricos, com o auxílio de pipetas volumétricas, e avolumadas para 100 mL utilizando água ultrapura para obtenção de soluções de 2 ppm, 4 ppm, 5 ppm, 7 ppm, 9 ppm, 15 ppm e 20 ppm. A partir dessas leituras obteve-se a curva analítica, por método espectrofotométrico a 232 nm, como demonstrado no gráfico 1.
Para efeito de comparação das metodologias foi realizado o mesmo procedimento nas mesmas condições e concentrações utilizando o álcool como diluente, cuja curva analítica obtida está representada pelo gráfico 2.
O espectro de absorção na região de ultravioleta foi obtido utilizando-se o equipamento especificado na lista de equipamentos e cubeta de quartzo de 1cm de caminho óticos. A leitura foi realizada entre 200 e 400 nm. Verificou-se que a faixa de absorção máxima da solução de digluconato de clorexidina padrão secundário,
18
foi na faixa de 232 nm, utilizando a concentração de 7 ppm para a verificação, pois é concentração que se encontra ponto médio da curva.
Gráfico - 1. Representação gráfica da curva analítica da solução de digluconato de clorexidina pelo método espectrofotométrico na região de ultraviolenta a 232 nm, utilizando água como diluente.
Fonte: elaborada pelo autor
Gráfico - 2. Representação gráfica da curva analítica da solução de digluconato de clorexidina pelo método espectrofotométrico na região de ultraviolenta a 232 nm, utilizando etanol como diluente.
Fonte: elaborada pelo autor
A absortividade molar (ε) foi calculada pela equação:
ε = A/(c.b) Em que:
A= absorbância
19
b= caminho óptico da cubeta (cm)
4.5. Parâmetros de desempenho analisados para a validação do método:
Os parâmetros analisados seguiram a norma ABNT NBR ISO/IEC 17025:2017, para verificar se o método era apropriado ao uso pretendido.
As características de desempenho da metodologia foram verificadas com base no Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO, 2018b, 2018c), a validação deve ser abrangente para atender a uma determinada aplicação, e os parâmetros devem incluir, quando aplicável:
Seletividade Linearidade Limite de detecção (LD) Limite de quantificação (LQ) Exatidão Precisão 4.5.1. Seletividade
É o grau em que um método pode quantificar o analito na presença de interferentes, matrizes ou outros analitos (INMETRO, 2018b).
Para avaliação da seletividade foi preparada solução da amostra de antisséptico na concentração de 7 ppm, utilizando como diluente água ultrapura. Na concentração da solução preparada, o espectro de varredura foi obtido na faixa de 200 a 400 nm, utilizando o diluente como solução de compensação. O solvente utilizado como branco foi a mesma água utilizado como diluente.
20
4.5.2. Linearidade
É o parâmetro que mede a obtenção dos resultados diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra (INMETRO, 2018b). Como visto nos gráficos 1 e 2, a linearidade do método com água foi melhor nesse caso que o método utilizando o etanol.
4.5.3. Limite de quantificação (LQ)
É a menor quantidade do analito na amostra que pode ser quantificado, o que corresponde normalmente ao padrão de calibração de menor concentração, que no caso desse ensaio foi de 2 ppm.
4.5.4. Limite de detecção (LD)
Limite de detecção de um procedimento analítico é a menor quantidade de analito na amostra que pode ser detectada, mas não significa que pode ser quantificada para as condições do ensaio.
Para o cálculo do LD foi utilizado o método descrito no DOQ-CGCRE-008 (INMETRO, 2018b).
LD= LQ/3,3
4.5.5. Recuperação
Os processos normalmente utilizados para avaliar esse parâmetro são segundo o (INMETRO, 2018), realizados através do “uso de matérias de referência certificados (MRC), de participação em comparações interlaboratorial, comparação
21
com método de referência (ou método validade) e realização de ensaio de recuperação”.
A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de amostras fortificadas com quantidades conhecidas do mesmo, segundo o (INMETRO, 2018b), as amostras podem ser fortificadas com o analito em pelo menos três diferentes concentrações (baixa, média e alta).
Para o presente estudo a exatidão foi avaliada a partir da adição e recuperação de quantidades conhecidas de clorexidina nas concentrações finais de 4 ppm, 7 ppm e 15 ppm, sendo a concentração da amostra constante de mg/mL. O procedimento foi realizado em triplicata. O critério utilizado para considerar satisfatória a recuperação foi de 80 a 110%.
A recuperação foi calculada segundo a equação:
C1 : concentração do analito na amostra fortificada. C2 : concentração do analito na amostra não fortificada. C3 : concentração do analito adicionado à amostra fortificada.
A taxa de recuperação pode ser vista na tabela 1 seguindo respectivamente as concentrações acima.
Tabela - 1. Resultados de análise por espectrofotometria com solução de clorexidina nas concentrações (4ppm, 7ppm e 15ppm).
Concentração do analito adicionado (%) (mg/mL) ppm Recuperação (%) Concentração do analito amostra fortificada (ppm) Concentração do analito na amostra (ppm) DP* DPR** Variância Clorexidina (água) 3,7ppm 109,1 6,640 2,62 0,04475 0,7 0,002003 Clorexidina (água) 6,6ppm 105,8 9,686 2,62 0,06045 0,6 0,003654 Clorexidina (água) 15ppm 103,5 18,144 2,62 0,06938 0,4 0,004814 Clorexidina 108 6,684 2,51 0,08893 1,3 0,007908
22 (etanol) 4ppm Clorexidina (etanol) 7ppm 102 9,778 2,51 0,04290 0,4 0,001841 Clorexidina (etanol) 15,1ppm 103 17,977 2,51 0,05896 0,3 0,003477
Fonte: elaborada pelo autor *Desvio padrão
**Desvio padrão relativo
4.5.6. Precisão
A precisão do método analítico determina o grau de concordância entre resultados independentes em torno de um valor central, efetuada várias vezes com seis determinações em uma amostra homogênea. A precisão intermediária foi obtida por analistas diferentes (A e B), em dias diferentes. Os valores experimentais obtidos para as determinações da precisão intermediária da clorexidina estão descritos na Tabela 2
Tabela - 2. Precisão intermediária para diferentes analistas, métodos e dias.
N Etanol A Água A Água B 1 1,01 1,03 1,01 2 1,00 1,02 1,02 3 1,00 1,00 1,02 4 1,00 1,01 1,02 5 1,00 1,00 1,01 6 1,02 1,00 1,02 Média 1,01 1,01 1,02 DP 0,008 0,013 0,005 DPR (%) 0,79 1,28 0,49
Fonte: elaborada pelo autor
Os resultados obtidos na determinação da precisão intermediária e da repetibilidade foram avaliados estatisticamente por ANOVA para um intervalo de confiança de 95%, a fim de determinar se houve diferença significativa entre as respostas encontradas entre métodos e analistas. A análise estatística para os resultados apresentados na tabela 2 apresentou Fcalculado igual a (2,40) menor que F crítico (3,68)
23
e p-valor superior a 0,05 (0,12), indicando que não há diferença significativa entre os resultados encontrados, conforme tabela 3.
Tabela - 3. Resultados estatísticos obtidos por ANOVA RESUMO
Grupo Contagem Soma Média Variância
Etanol A 6 6,03 1,005 7x10-5
Água A 6 6,06 1,01 0,00016
Água B 6 6,1 1,01666667 2,67x10-5
ANOVA
Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 0,000411111 2 0,00020556 2,402597 0,124406 3,68232 Dentro dos grupos 0,001283333 15 8,5556x10-5
Total 0,001694444 17
Fonte: elaborada pelo autor
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Previamente, foi realizado um levantamento em artigos científicos publicados recentemente sobre métodos espectrofotométricos para análise de clorexidina, mas infelizmente quase não existe material disponível, hoje a tendência da indústria vem sendo a cromatografia, um dos poucos trabalhos de análise por método espectrofotométrico, utilizou o etanol como diluente, a partir desse trabalho então foi adaptado o método com água utilizado em análise de biguanida, e então chegou-se no resultado apresentado.
5.1. Critérios de aceitação para recuperação
Os laboratórios devem estabelecer critérios para aceitação para recuperação, e quando possível, seguir orientações normativas da legislação aplicável (INMETRO, 2018b). Na Tabela 4 temos os critérios sugeridos pela AOAC, que foram os adotados pelo ensaio 80% a 110%
24
Tabela - 4. Critério de aceitação para recuperação
Analito, % Razão do analito Unidade Recuperação média, %
100 1 100% 98 – 102 10 10-1 10% 98 – 102 1 10-2 1% 97 – 103 0,1 10-3 0,1% 95 – 105 0,01 10-4 100 ppm (mg/kg) 90 – 107 0,001 10-5 10 ppm (mg/kg) 80 – 110 0,0001 10-6 1 ppm (mg/kg) 80 – 110 0,00001 10-7 100 ppb (µg/kg) 80 – 110 0,000001 10-8 10 ppb (µg/kg) 60 – 115 0,0000001 10-9 1 ppb (µg/kg) 40 – 120 Fonte: AOAC, 2016
5.2. Avaliação do desempenho do método analítico
A seletividade nos diz se há interferência de matriz na metodologia, o que necessita da comparação entre as curvas, nos mesmos níveis, da matriz fortificada e das soluções-padrão. A seletividade foi avaliada pela fortificação da amostra em três diferentes níveis, 4ppm, 7ppm e 15ppm. Conforme tabela 2 não foram verificados valores discrepantes, indicando que para este analito não houve interferência de matriz, entretanto outra amostra foi analisada, um enxaguatório bucal adquirido no comercio contendo corante, os resultados foram inconclusivos para esta amostra, pois não foi possível comprovar que o teor declarado de clorexidina, correspondia realmente ao teor encontrado, concluímos que para amostras contendo corante serão necessário novos estudos visto que estas substâncias podem interferir nos valores de Absorbância através da técnica utilizada.
O critério de aceitação no parâmetro seletividade, para o antisséptico de uso tópicos, utilizando água ultrapura como diluente, foi uma leitura da absorbância máxima entre 200nm a 400nm, o resultado encontrado foi de 232nm.
A linearidade é a capacidade de respostas analíticas serem diretamente proporcionais à concentração do analito. Como não foi detectada a interferência de matriz para o antisséptico tópico, foram utilizados para o cálculo da linearidade os
25
resultados obtidos com os padrões preparados, a partir de triplicatas, nos sete níveis de concentração: 2ppm, 4ppm, 5ppm, 7ppm, 9ppm, 15ppm e 20ppm. Assim, verificou-se a ausência de valores discrepantes, e constatado que as variâncias foram homogêneas ao longo das curvas de calibração. As curvas obtidas foram analisadas pela regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados, na forma y = ax + b, onde y são as áreas correspondentes às concentrações x, e pelo coeficiente de correlação quadrado, r2, o qual estima a qualidade da curva, sendo requeridos
valores próximos de 0,995 para ser considerado linear (GUIMARÃES et al., 2010). Os resultados estão apresentados na Tabela 5. Com isso, no intervalo de concentração estudado, é possível dizer que há linearidade.
O limite de detecção é a menor quantidade do analito que pode ser detectado, mas não quantificada, e o limite de quantificação é a menor concentração que pode ser quantificada com precisão e exatidão aceitáveis.
Verificou-se que o LQ obtido foi 2 ppm, pois após testes com amostras verificou-se que abaixo dessa concentração existe muita variação. A partir do LQ (2 ppm) utilizou-se o método descrito no DOQ-CGCRE-008 (INMETRO, 2018b) publicado pelo INMETRO.
LD= LQ/3,3
LD = 2/3,3
LD = 0,61 ppm
A tabela 5 apresenta os critérios de aceitação adotados e os resultados. Em todos os casos o critério de aceitação estabelecidos no presente trabalho foi de 80% a 110%, seguindo a tabela da AOAC (tabela 4), o critério foi atendido.
Tabela - 5. Critérios de aceitação
Parâmetro Critério de aceitação Resultado
Avaliação (conforme/não
conforme)
Seletividade Leitura da absorbância máxima
entre 230nm a 233nm 232nm -
26
Precisão DPR < 2,0% *1 Conforme
Reprodutibilidade Dias e analistas diferentes *2 Conforme
Limite de detecção
(LD) 0,61ppm 0,61ppm Conforme
Limite de quantificação
(LQ) 2ppm 2ppm Conforme
Recuperação 80% - 110% 106% Conforme
*1 e *2 - resultados conforme tabela 2. Fonte: elaborada pelo autor
6. CONCLUSÃO
A otimização e validação da metodologia de determinação de digluconato de clorexidina por espectrofotometria UV/VIS utilizando água como diluente, demonstrou ser adequado para sua função. Por meio de testes estatísticos, foram constatados que os parâmetros de linearidade, seletividade, repetitividade, exatidão, limites de detecção e quantificação, e os critérios como recuperação e coeficiente de variação foram considerados adequados e estavam dentro dos limites aceitáveis dos estabelecidos por instituições reconhecidas garantindo um método robusto e confiável. A utilização da água proporcionou o uso de um solvente menos agressivo ao meio ambiente e ao analista em comparação com os métodos utilizados usualmente na indústria, onde se utiliza a cromatografia, e a água é um solvente mais estável que o etanol, que o utilizado atualmente, pois as variações de temperatura não afetam o ensaio, além da segurança do analista na inalação de gases voláteis e a geração de um resíduo mais amigável ao meio ambiente. Apesar disso, há necessidade de aperfeiçoamento da metodologia, melhorando a etapa de limpeza, pois para amostras contendo corantes, no caso dos enxaguatórios bucais, ainda não foi possível efetuar uma análise por conta da interferência dos mesmos. Recomenda-se testar outros métodos para retirada do corante, além de conseguir amostras com confirmação de teor para certificar os resultados. Em relação a amostra utilizada, por se tratar de um antisséptico incolor, os resultados foram
27
satisfatórios e poderá ser implantado no Núcleo Físico Químico de Cosméticos e Saneantes do Instituto Adolfo Lutz, a fim de melhorar o controle dos produtos disponíveis à população.
28
REFERÊNCIAS
A, E. D. A. C. et al. Armazenadas Em Diferentes Temperaturas Sobre Alguns Microrganismos - Estudo in Vitro. v. 18, 2008.
ABDUL MAJID, J. et al. APLICAÇÕES DA CLOREXIDINA NA SAÚDE MÉDICA, ODONTOLÓGICA E VETERINÁRIA– REVISÃO DE LITERATURA. Acta
Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis, v. 16, n. 2, p. 39–55, 2015.
AMORAS, L. DA S.; ZAIA, A. A. Uso Da Clorexidina Na Medicina: Revisão De Literatura. p. 33, 2013.
ANVISA. Segurança do Paciente em Serviços de Saúde - Higienização das Mãos. Segurança do Paciente em Serviços de Saúde - Higienização das Mãos, p. 109, 2009.
ANVISA. Ministério da Saúde - MS Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. Resolução da Ciretoria Colegiada - RDC no 7, de 10 de fevereiro de
2015, v. 7, p. 1–24, 2015.
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS.NBR ISO/IEC 17025:
Requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaios e calibração. Rio de Janeiro, 2017
BARBIN, E. L. Análise química da clorexidina misturada ou não ao hidróxido de cálcio. 2008.
BATISTELA, C. G.; LAPORTA, L. V. Quantitative Determination of Gliclazide in Tablets By Uv. p. 47–59, 2013.
BRITO, N. M. et al. Validação De Métodos Analíticos: Estratégia E Discussão.
Pesticidas: Revista de Ecotoxicologia e Meio Ambiente, v. 13, p. 129–146, 2003.
CHEMSPIDER.
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4514538.html?rid=43b88e74-330e-4826-be55-4810c6cd37dd
DE OLIVEIRA, A. C.; SARMENTO GAMA, C. O que usar no preparo cirúrgico da pele: povidona-iodo ou clorexidina? Revista SOBECC, v. 23, n. 3, p. 155–159, 2018.
29
FARMACOPEIA. Farmacopeia brasileira, Sexta Edição. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, v. 1, n. 6, p. 873, 2019.
FIORENTINO, F. Desenvolvimento e controle de qualidade de formulação cosmética contendo digluconato de clorexidina. Aleph, 2009.
GIL, E. S. Controle físico-químico de controle de qualidade de medicamentos. 2 ed. São Paulo: Pharmabooks, 2007.
GUIMARÃES, E. F. et al. Validação de metodologia analítica para a determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Produto & Produção, Porto Alegre, v. 11, n. 1, p.113-123, 2010.
INMETRO. Orientações gerais sobre os requisitos da ABNT NBR IS/IEC 17025:2017. v. 087, p. 66, 2018a.
INMETRO. Doq-Cgcre-008 - Orientação Sobre Validação De Métodos Analíticos. Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia, p. 31, 2018b.
INMETRO. Guia para tratamento estatístico de validação. Guia No 10/2017 - Versão
1, p. 19, 2018c.
KLUK, E.; REINHOLD, F. C. B. C.; PEREIRA, N. Uma Abordagem Sobre a
Clorexidina: Ação Antimicrobiana E Modos De Aplicação. Revista Gestão & Saúde, v. 14, n.1, n. ISSN 1984-815, p. 7–13, 2016.
MORIYA, T.; MÓDENA, J. L. P. Assepsia E antissepsia: Técnicas de esterilização. Medicina, v. 41, n. 3, p. 261–269, 2008.
PUBCHEM. National Center for Biotechnology Information. Database.
CID=29089, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/29089 (accessed on Nov. 26, 2019)
REIS, L. M. DOS et al. Avaliação da atividade antimicrobiana de antissépticos e desinfetantes utilizados em um serviço público de saúde. Revista Brasileira de Enfermagem, v. 64, n. 5, p. 870–875, 2011.
SILVA, C.R.G.; JORGE, A.O.C. Avaliação de desinfetantes de superfícies utilizados em odontologia. Pesq. Odontol. Bras., v. 16, n. 2, p. 107-114, 2002.
30
THE UNITED SATES PHARMACOPEIA. 42.ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 2019.
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2006, p. 183-200; 459-460; 590-592.
U.S FOOD AND ADMINISTRATION DRUG. Drug Safety Communication: FDA warns about rare but serious allergic reactions with the skin antiseptic chlorhexidine gluconate. p. 2-2–2017, 2017.
WORLD HEALTH ORGANIZATION, (WHO). on Hand Hygiene in Health Care First Global Patient Safety Challenge Clean Care is Safer Care. World Health
