R evista da Socied a d e B rasileira de M ed icin a Tropical
18(4): 231-236, O ut-D ez, 1985
THE USE OF DIFFERENT CONCENTRATIONS OF LEISHMANIAL ANTIGEN
IN SKIN TESTING TO EVALUATE DELAYED HYPERSENSITIVITY IN
AMERICAN CUTANEOUS LEISHMANIASIS
C és ar A. C u b a C u b a 1, P h ilip D. M a rs d e n 1, A ir C . B a rre tto 1,
T h o m a s C. J o n e s
2
and F ran k R ic h a rd s
2
Three concentrations o f
L e i s h m a n i a m e x i c a n a a m a z o n e n s i ssonicated whole
prom a stig o te antigen (30, 9.6 and 3 ug N in 0.1 m l) w ereprepared and 0.1 ml o f each
inoculated intra d erm a lly in to p a tie n ts who live in one endem ic leishm aniasis region in
B razil. P atients were d ivid ed into groups with active cutaneous leish m aniasis (A C L ),
h ealed cutaneous leish m a n ia sis (H C L ), m uco sa l leish m a n ia sis (M L ), a n d Controls (C).
S k in reactions were recorded by m easuring induration 48 hours after inoculation.
S k in tests using 9.6 u g N / 0 .1 m ly ie ld e d th e b e s td ia g n o s tic r e s u lts s in c e 9 7 % o f3 0
p a tien ts with active lesions (cutaneous or m ucosal) a n d 8 3 % with H C L show ed
reactions o f 5 m m o rg re a ter as com pared with 4 % Controls. Tests using 3 0ug N/O. 1 m l
c a u sed a n unacceptable levei o fs k in reactions with necrosis (1 0 % o fA C L p a tie n ts tested
a n d 1 7 % o f H C L , respectively). Tests using 3 ug N/O. 1 m l were less sensitive since only
8 7 % o f p a tie n ts with active lesions a n d 6 8 % with H C L h a d reactions o f5 m m orgreater.
The 3 ug N/O. 1 m l dose was u tilize d to a sk the questions whether skin delayed
hypersensitivity decreased with tim e after the in itia l lesion a n d whether m ucosal
involvem ent is associated with enhaced hypersensitivity to leish m a n ia l antigen.
D ecreased d ela yed hypersensitivity was noted only in th o se p a tie n ts who h a d an initial
lesion m ore th a n 3 0 yea rs ago. The m ean induration o f the reaction in 10 p a tien ts with
M L was 11.3 m m
± 7 .15, in 41 p a tie n ts with H C L , 9 .2 7 m m
±6 .7 8 a n d in 2 0 patients
with A C L 10. 7 m m
±6.10 mm. The percent o f patients with
5m m orgreater induration was
M L 80% , H C L 71%, A C L 90% . Thus, we could not confirm an association between
enhanced d ela yed h ypersensitivity a n d m u co sa l involvem ent in leishm aniasis.
K e y W o r d s : S k i n t e s t c o m p a r i s o n . A n t i g e n c o n c e n t r a t i o n s . C l i n i c a i f o r m s . A m e r i c a n m u c o c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s .
A d e l a y e d h y p e r s e n s i t i v i t y c u t a n e o u s r e a c t i o n t o l e i s h m a n i n is p r e s e n t in m o s t f o r m s o f c u t a n e o u s a n d m u c o c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s w i t h t h e e x c e p t i o n o f d i f f u s e c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s a n d s o m e c a s e s o f p o s t k a l a - a z a r d e r m a l l e i s h m a n i a s i s ^ . T h e s k i n t e s t w a s
f i r s t p r o p o s e d b y W a g e n e r in 1 9 2 3 2 8 , a n d w a s i n t r o d u c e d a s a d i a g n o s t i c a i d in A m e r i c a n c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s i n m a n b y M o n t e n e g r o in 1 9 2 6 * 8 . i t js
t h e m o s t w i d e l y u s e d s k i n t e s t i n p a r a s i t i c d i s e a s e a n d is a v a l u a b l e a n c i l l a r y i n v e s t i g a t i o n e s p e c i a l l y in m u c o s a l d i s e a s e w h e r e p a r a s i t e s a r e o f t e n d i f f i c u l t t o
f in d .
S h a w a n d L a i n s o n 1 9 7 5 2 7 o b s e r v e d t h a t p a t i e n t s w i t h m u c o s a l l e i s h m a n i a s i s t e n d e d t o h a v e l a r g e r d e l a y e d h y p e r s e n s i t i v i t y r e a c t i o n s t h a n t h o s e w i t h o n l y c u t a n e o u s l e s i o n s . T h i s s u g g e s t e d t h a t
* T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y N I H G r a n t A I 1 6 2 8 2 a n d b y t h e C o n s e l h o N a c i o n a l d e P e s q u i s a s ( C N P q , P I D E V 4 0 3 6 8 2 / 8 2 ) , t h e B r a z i l i a n M i n i s t r y o f H e a l t h ( S U C A M ) a n d U N D P / W O R L D B A N K / W H O S p e c i a l p r o g r a m m e f o r r e s e a r c h a n d T r a i n i n g i n T r o p i c a l D i s e a s e ( T D R ) . 1. F a c u l d a d e d e C i ê n c i a s d a S a ú d e . N ú c l e o d e M e d i c i n a
T r o p i c a l . U n i v e r s i d a d e d e B r a s í l i a . B r a s í l i a , B r a z i l . 2 . C o m e l l U n i v e r s i t y M e d i c a i C o l l e g e , N e w Y o r k , U S A . R e c e b i d o p a r a p u b l i c a ç ã o e m 2 6 / 9 / 8 4 .
m u c o s a l d i s e a s e c o u l d b e a s s o c i a t e d w i t h e n h a c e d h y p e r s e n s i t i v i t y r e s p o n s e t o l e i s h m a n i a l a n t i g e n s .
T h i s s t u d y w a s d e s i g n e d t o c o m p a r e a ) t h r e e c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i g e n in t h r e e f o r m s o f A m e r i c a n c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s a n d b ) t o e x a m i n e th e h y p o t h e s i s t h a t m u c o s a l d i s e a s e is a s s o c i a t e d w it h m o r e m a r k e d c u t a n e o u s h y p e r s e n s i t i v i t y t h a n c u t a n e o u s l e s i o n s .
M A T E R I A L S A N D M E T H O D S
1 )
P atient p o p u la tio n -
N i n e t y - n i n e p a t i e n t s w e r e s t u d i e d l i v i n g in t h e a r e a o f T r ê s B r a ç o s , B a h i a , B r a z i l , w e r e m u c o c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s is e n d e m i c ^ .T h e f o l l o w i n g g r o u p s w e r e e s t a b l i s h e d : a ) 2 0 p a t i e n t s w i t h a c t i v e c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s
( A C L ) p r e s e n t i n g a s a s k i n u l c e r .
b ) 1 0 p a t i e n t s w i t h m u c o s a l l e s i o n s ( M L ) o f t h e n o s e o r o r o p h a r y n x a s w e l l a s a s k in s c a r o r a c t i v e u l c e r .
c ) 4 1 p a t i e n t s w i t h t h e o l d s c a r s o f c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s ( H C L ) w h i c h a r e v e r y t y p i c a l in a p p e a r a n c e ( F i g u r e 2 )
d ) 2 8 p a t i e n t s l i v i n g i n t h e s a m e a r e a w i t h o u t s i g n s o r a h i s t o r y o f l e i s h m a n i a s i s .
-Cuba CAC, M arsden PD, B arretto A C , Jo n es TC, R ic h a rd s F. The use o f different concentrations o f leish m a n ia l antigen
in skin testing to evaluate delayed hypersensitivity in A m erica n cutaneous leishm aniasis. R ev ista da Sociedade B rasileira de
M edicina Tropical 18: 231-236, O ut-D ez, 1985
t i t u e d a c o n t r o l g r o u p w i t h o u t a n y h i s t o r y o f l e i s h m a n i a s i s a n d l i v i n g in a n o n e n d e m i c a r e a .
O f t h e t h i r t y p a t i e n t s w i t h a c t i v e c u t a n e o u s o r m u c o s a l l e s i o n s 2 3 ( 7 6 . 6 % ) h a d p o s i t i v e i n d i r e c t f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t i t e r s ( p r o m a s t i g o t e a n t i g e n ) a n d in 2 0 p a t i e n t s , p a r a s i t e s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e l e s i o n s ( T a b l e 1 ) . E i g h t s t o c k s f r o m t h e s e p a t i e n t s w e r e i d e n - t i f i e d a s
L eish m a n ia braziliensis braziliensis
b y i s o e n z y m e a n a l y s i s 7 .2 )
A ntig en s -
A s t o c kL eish m a n ia m exicana
am azonensis
( J o s e f a ) i s o l a t e d f r o m a p a t i e n t in B r a s í l i a w a s u s e d t o p r e p a r e t h e a n t i g e n s f o r s k in t e s t i n g . T h i s o r g a n i s m w a s m a i n t a i n e d b y s e r i a l p a s s a g e in h a m s t e r s . I t g a v e a r i c h g r o w t h o f p r o m a s-t i g o -t e s i n L I T m e d i u m ( L i v e r I n f u s i o n T r y p -t o s e ) a n d w a s h a r v e s t e d f o r t h e s e s t u d i e s a f t e r e i g h t d a y s .
T h e o r g a n i s m s w e r e w a s h e d t w i c e i n p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( p H 7 . 2 ) , c e n t r i f u g e d , r e s u s p e n d e d in d i s t i l l e d w a t e r a n d s o n i c a t e d ( f i v e p e r i o d s o f o n e m i n u t e e a c h a t 2 0 k h a t 4 o C ) . S p e c i m e n s o f t h e m i x e d s u s p e n s i o n w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t o t a l n i t r o g e n c o n c e n t r a t i o n b y t h e m i c r o - K j e l d a h l m e t h o d ' 0 . T h e s o l u t i o n w a s a d j u s t e d t o t h r e e c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i g e n n a m e l y 3 0 0 ]_lg N i t r o g e n p e r m l , 9 6 y g N / m l a n d 3 0 u g N / m l u s i n g 0 . 5 % p h e n o l in s a l i n e . T h e s e a n t i g e n s w e r e k e p t a t - 2 0 ° C u n t i l u s e . T h e a n t i g e n s w e r e t e s t e d t o c o n f i r m t h e i r a c t i v i t y i n h o s p i t a l i s e d p a t i e n t s w i t h k n o w n l e i s h m a n i n s k i n r e a c t i o n s b e f o r e u s e in t h i s f i e l d t r i a l .
T a b l e 1 -
C linicai a n d parasito lo g ica l Jindings in 3 0 active cases o f L eish m a n ia sis (cutaneous a n d m ucosal
diseases) su b m itted to skin test.
P atient n.° C linicai Form
T im e o f
E volution
N.° o f L esio n s A ge
Serology
(IF A T )
Parasites
Id entification
( I = Iso en zym es)
1
C*
2 m * * * 2 5 5 1 :4 0 + L . b . b . ( I )2
C
1 2 y / 1 4 0 - +3
C
5 m 1 4 2 1 : 8 0-4
C
2 , 5 m 6 0 1 : 4 0 + L . b . b . ( I )5
C
8 m 1 1 6 - + L . b . b . ( I )6
C
l m 1 1 9 1 :4 0 + L . b . b . ( I )7
C
2 m 1 1 5 1 : 1 6 0-8
C
3 m 8 1 : 1 6 0 +9
C
4 m 1 1 8 1 : 1 6 0 + L . b . b . ( I )1 0
C
5 m 4 1 : 8 0 +11
C
6 m 1 3 --1 2
c
1 . 5 m 1 1 8 1 :4 0 +1 3
c
2 m 1 5 3 1 : 4 0 + L . b . b . ( I )1 4
c
1 . 5 m 1 4 5 1 : 4 0 +1 5
c
3 m 1 5 0 1 : 8 0 +1 6
c
5 m 1 4 8 1 : 4 0 + L . b . b . ( I )1 7
c
l y 6 6 1 : 4 0 +1 8
c
2 . 5 m 1 6 5 1 :2 0-1 9
c
2 m 1 2 8 - +2 0
c
3 m 1 3 0 - +2 1 M * * 2 y 1 3 5 1 : 4 0
-2 -2 M 3 y 5 9 1 : 2 0
-2 3 M 3 y 1 2 3 1 :8 0
-2 4 M 5 . 5 y 1 3 5 1 : 4 0
-2 5 M 4 y 1 4 9 1 : 6 4 0 +
2 6 M 1 . 5 y 1 1 0 - N . D
2 7 M 2 y 1 2 4 1 : 1 6 0 + L . b . b . ( I )
2 8 M 9 y 1 3 7 1 : 2 5 6 0 +
2 9 M 2 y 1 9 1 : 1 6 0 N . D
3 0 M 2 y 1 3 4 - +
*
C : C u t a n e o u s d i s e a s e * * M : M u c o s a l d i s e a s e * * * m : m o n t h sy : y e a r s
C uba C AC , M a rsd en PD, B arretto A C , Jo n es TC, R ic h a rd s F. The use o f different concentrations o f leish m a n ia l antigen
in sk in testing to evaluate d e la y ed h ypersensitivity in A m erican cutaneous leishm aniasis. R evista da Sociedade B rasileira de
M e d ic in a Tropical 18: 231-236, O ut-D ez, 1985
3 )
The cutaneous t e s t -
T h e a n t i g e n s u s p e n s i o n s w e r e a l w a y s m i x e d t h o r o u g h l y b e f o r e u s e . E a c h c o n c e n t r a t i o n w a s i n o c u l a t e d i n t r a d e r m a l l y i n t o t h e v e n t r a l s u r f a c e o f t h e f o r e a r m i n a d o s e o f 0 . 1 m l ( F i g . 1 ) . A c o n t r o l s o l u t i o n o f t h e s a m e v o l u m e o f 0 . 5 % p h e n o l i n s a l i n e w a s a l s o i n o c u l a t e d a t t h e s a m e t i m e . A t 4 8 h o u r s t h e s i z e o f i n d u r a t i o n a t e a c h i n o c u l a t i o n s i t e w a s m e a s u r e d w i t h a m i l l i m e t e r c a l l i p e r . A ni n d u r a t i o n o f 5 o r m o r e m i l l i m e t e r s w a s r e g a r d e d a s a p o s i t i v e r e a c t i o n b u t d e t a i l e d m e a s u r e m e n t s w e r e t a k e n . F i g u r e 2 s h o w s p a t i e n t s w i t h t h e t y p i c a l m u c o s a l l e s i o n a n d a c u t a n e o u s s c a r . T h e r e s u l t s o f s k in t e s t i n g w e r e a n a l y s e d c a l c u l a t i n g t h e m e a n i n d u r a t i o n in m i l l i m e t e r s a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n f o r
e a c h g r o u p .
Figure 1. R esu lts o f d e la y ed hypersensitivity sk in testing
using three doses o f antigen a n d control read a t 48
hours. T he g ra d e d d ose response is seen.
R E S U L T S
T a b l e 2 s h o w s t h e r e s u l t s o f t h e s k i n t e s t u s i n g t h e t h r e e a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n s in p a t i e n t s w i t h a c t i v e c u t a n e o u s l e s i o n s ( A C L ) a n d m u c o s a l l e s i o n s ( M L ) ,
s c a r s , a n d
Controls
f r o m t h e e n d e m i c a r e a . T h e f r e q u e n c y o f p o s i t i v e r e a c t i o n s in t h e C o n tr o l s f r o m t h eF igure2. A 7y e a r o ld b o y w ith to ta la b se n c e o fn a sa lse p tu m
fr o m m u c o sa l leish m a n isa sis a n d a 13 y e a r old
g irl with p o sitiv e g raded sk in tests on the left
fo re a rm a n d a characteristic scar on the right
forearm .
Su ch scars resem ble burns being
slig h tlv depressed, hypopigm ented a n d fibrotic.
e n d e m i c r e g i o n is v e r y lo w a n d p r e s e n t o n l y a t h ig h a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n s ( 4 % u s i n g a d o s e o f 9 . 6 p g N ) . I n p a t i e n t s w i t h a c t i v e d i s e a s e o r a s c a r , s k in r e a c t i v i t y i n c r e a s e d w i t h t h e a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n . T h e r e w a s n o d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e t w o g r o u p s in t h e n u m b e r o f p o s i t i v e s k i n r e a c t i o n s a t t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n . T h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n ( 3 0 y g / 0 . 1 m l ) h o w e v e r w a s u n a c e p t a b l e s i n c e i t o c c a s i o n a l l y c a u s e d n e c r o s i s a t
T a b l e 2
- D e la y e d hypersensitivity responses to three concentrations o f leism anin in three p a tie n t groups:
N u m b e r o f P atients with R eaction o f
>5m m Using
P atient G roups
N u m b e r o f P atients S tu d ie d
the C oncentrations o f A ntigen ( fJg N/O. 1 m l) Given
B e low.
3 9 . 6 3 0
a - b A c t i v e L e s i o n s 3 0 2 6 ( 8 7 % ) 2 9 ( 9 7 % ) 3 0 * ( 1 0 0 % )
( A C L a n d M L )
c S c a r s 4 1 2 7 ( 6 8 % ) 3 4 ( 8 3 % ) 4 0 * * ( 9 8 % )
d C o n t r o l 2 8 0 1 ( 4 % ) 2 ( 7 % )
Cuba CAC, M arsden PD, B arretto A C , Jo n es TC, R ic h a rd s F. The use o f different concentrations o f leish m a n ia l anrigen
in skin testing to evaluate d elayed hypersensitivity in A m erica n cutaneous leishm aniasis. R evista da Socied a d e B rasileira de
M edicina Tropical 18: 231-236, O ut-D ez, 1985
t h e i n o c u l a t i o n s i t e a n d a x i l l a r y l y m p h a d e n o p a t h y ( 1 0 % a n d 1 7 % o f p a t i e n t s w i t h a c t i v e o r h e a l e d d i s e a s e , r e s p e c t i v e l y ) . 9 . 6 y g / 0 . 1 m l w a s t h e m o s t s a t i s f a c t o r y d o s e f o r r o u t i n e d i a g n o s t i c w o r k s i n c e it w a s v e r y s e n s i t i v e b u t i n d u c e d a d e g r e e o f s k i n r e a c t i o n w h i c h w a s o n l y o f t e m p o r a r y i n c o n v e n i e n c e . T h e 1 0 v o l u n t e e r s f r o m t h e U n i v e r s i t y o f B r a s í l i a w e r e n e g a - ti v e t o a l i t h r e e a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n s .
R e a c t i o n s i z e in r e l a t i o n t o a n t i g e n d o s e is e x p r e s s e d d i a g r a m a t i c a l l y i n F i g u r e 3 f o r p a t i e n t s w i t h a c t i v e l e s i o n s . T h i s c l e a r l y s h o w s t h e m a r k e d d i f f e r e n c e t h a t c o n c e n t r a t i o n o f a n t i g e n m a k e s in s k i n
t e s t r e a c t i v i t y in t h i s d i s e a s e . 3 U g / 0 . 1 m l y i e l d e d a s c a t t e r o f s k in r e a c t i o n i n p a t i e n t s w i t h a c t i v e d i s e a s e , w h e r e a s 3 0 U g a l w a y s y i e l d e d r e a c t i o n g r e a t e r t h a n 1 0 m m . I n T a b l e 3 , t h e t h r e e a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n s a r e r e l a t e d t o l e s i o n s d u r a t i o n i n e i g h t r e c e n t l y a c q u i r e d c a s e s o f
L .b .b ra zilen sis
i n f e c t i o n s . P o s i t i v e r e a c t i o n s t o a l i t h r e e a n t i g e n s w e r e o b t a i n e d in o n e m o n t h a f t e r o n s e t o f t h e a c t i v e l e s i o n s . T h e m e a n s k i n t e s t r e a c t i v i t y t o 3 lJ g c o m p a r e d t o t i m e a f t e r i n i t i a l l e s i o n w a s 1 0 m m f o r l e s s t h a n 5 y e a r s , 9 m m f o r 6 t o 1 0 y e a r s , 1 4 m m f o r 1 1 t o 2 0 y e a r s i n b o t h g r o u p s w i t hh e a l e d s c a r s a n d m u c o s a l d i s e a s e . T h e i n t e n s i t y o f t h e s k in t e s t c o u l d n o t b e r e l a t e d t o t h e a g e o f t h e s c a r i n t h e in a c t i v e g r o u p e x c e p t t h a t t h r e e p a t i e n t s w i t h s c a r s
m o r e t h a n 3 0 y e a r s in t h e p a s t y i e l d e d r e a c t i o n s t o 3 U g N o f 5 , 4 a n d 0 m m i n d u r a t i o n c o n s i s t e n t w i t h a s l i g h t a g e r e l a t e d d e c r e a s e in M o n t e n e g r o s k i n t e s t r e a c t i v i t y .
T a b l e 3 -
R esults o f the three doses o f sk in test antigen in eight p a tien ts with proven active
L . b r a z i l i e n s i s b r a z i l i e n s i sinfection o f less than 5 m o n th s in duration.
P aiient N u m b er
D u ration o f
D isease (m onths)
M a g n itu d e o f the R eaction in M illim eters
*3 U g N / 0 . 1 m l 9 . 6 i-ig N / 0 . 1 m l 3 0 y g N / 0 . 1 m l
1 1 7 . 5 1 1 . 6 1 5 . 9
2 2 5 . 0 1 3 . 2 1 4 . 2
3 2 5 . 5 8 . 0 1 3 . 0
4 2 . 5 1 3 .1 1 8 . 7 2 1 . 0
5 2 7 . 0 1 2 . 0 1 9 . 0
6 3 2 0 . 5 1 8 .3 2 1 . 7
7 4 1 5 . 0 1 4 . 0 2 3 . 8
8 5 7 . 5 1 0 . 8 1 0 . 0
( * ) M e a n i n d u r a t i o n s i z e f o r t h e t h r e e g r o u p s a r e 1 0 , 1 3 . 3 a n d 1 7 . 3 m m r e s p e c t i v e l y . S t a n d a r d d e v i a t i o n . ( S x ) 5 . 5 0 ; 3 . 6 6 ; 4 . 8 0 .
T a b l e 4
- S k i n testing in the various fo rm s o f L eishm aniasis. M ean diam eter o f induration using the 3 Ug N /0 .1 m l
C linicai fo r m o f
L eish m a n ia sis
N u m b e r o f P atients S tu d ie d
M ea n In duration in M illim eters
±1 S D
A c t i v e c u t a n e o u s 2 0 1 0 .7
±
6 . 1 0 *M u c o s a l 1 0 1 1 . 3 ± 7 . 1 5 *
S c a r 4 1 9 . 3 ± 6 . 7 8
( * ) N o t s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) c o m p a r e d t o s c a r s o n l y
10 0
8 0
6 0
-4 0
20 r
ffl
ü
:
< j m m 5 m m > 5 - l 0 m m > 1 0 i T i m > 1 0 m m p lu s n ecr o sis
F i g u r e 3 .
C om parison o f the m agnitude o f the s k in test
reaction to three concentrations o f leish m a n ia l
antigen in 3 0 p a tie n ts with active lesions.
C uba C AC , M a rsd en PD, B arretto A C , Jo n es TC, R ic h a rd s F. The use o f different concentrations o f leish m a n ia l antigen
in sk in testing to evaluate delayed hypersensitivity in A m erica n cutaneous leishm aniasis. R evista da Sociedade Brasileira de
M edicina Tropical 18: 231-236, O ut-D ez, 1985
d i a m e t e r in t h r e e g r o u p s o f p a t i e n t s . N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n m u c o s a l a n d c u t a n e o u s l e s i o n s in s i z e o f t h e d e l a y e d h y p e r s e n s i t i v i t y r e a c t i o n w a s n o t e d . B y c o m p a r i n g t h e p e r c e n t o f p a t i e n t s w i t h r e a c t i o n s a t 5 m m o r g r e a t e r , n o d i f f e r e n c e s w e r e d e t e c t e d ( M L 8 0 % , H C L 7 1 % , A C L 9 0 % ) .
D I S C U S S I O N
O u r s t u d y c o n f i r m s t h a t t h e M o n t e n e g r o s k in t e s t is a u s e f u l i n d i c a t o r o f a c t i v e o r p r e v i o u s c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s , b u t t h a t t h e d o s e o f a n t i g e n u s e d d e t e r m i n e s t h e s e n s i t i v i t y o f t h e t e s t . 9 . 6 U g N p e r d o s e w a s f o u n d t o b e t h e m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n w h i c h i d e n t i f i e d m o s t p a t i e n t s . W e c o n f i r m e d t h a t t h e s k in t e s t w a s a l w a y s p o s i t i v e b y o n e m o n t h a f t e r o n s e t o f a n a c t i v e l e s i o n , a n d p e r s i s t e d w i t h t h e s a m e d e g r e e o f r e a c t i v i t y f o r a t l e a s t 2 0 y e a r s . T h e r e a f t e r , a s l i g h t d e c r e a s e i n s k i n t e s t r e a c t i v i t y w a s n o t e d . W e f o u n d n o
c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e o c c u r r e n c e o f m u c o s a l d i s e a s e d u e t o l e i s h m a n i a s i s a n d e n h a n c e d s k i n t e s t r e a c t i v i t y .
S k in t e s t i n g w i t h l e i s h m a n i a a n t i g e n t o d o c u m e n t th e p r e v a l e n c e o f c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s h a s b e e n u s e d f o r m a n y y e a r s . I t h a s b e e n c o n s i d e r e d a t e s t w i t h g o o d s p e c i f i c i t y19 a n o b s e r v a t i o n c o n f i r m e d in o u r B r a z i l i a n c o n t r o l g r o u p , b u t f e w c a r e f u l s t u d i e s h a v e b e e n d o n e * 3. F u r t a d o * h a s s u m m a r i s e d w h a t i s k n o w n in B r a z i l r e g a r d i n g c r o s s r e a c t i o n s w i t h o t h e r d i s e a s e s . P a t i e n t s w i t h l e p r o s y a n d p r e v i o u s v i s c e r a l l e i s h m a n i a s i s m a y r e a c t t o l e i s h m a n i n . B o t h t h e s e
i n f e c t i o n s a r e v e r y r a r e in o u r s t u d y a r e a .
W h e n t e s t s h a v e b e e n d o n e in r e g i o n s e n d e m i c f o r c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s w i d e v a r i a t i o n s in s k i n t e s t r e a c t i v i t y in p a t i e n t s w i t h o u t a h i s t o r y o f d i s e a s e o r a s c a r h a v e b e e n r e p o r t e d . I n o u r a r e a w e h a v e f o u n d , in o t h e r s t u d i e s ^ , t h a t 6 % o f s u c h p a t i e n t s y i e l d a p o s i t i v e
t e s t . I n t h e s t a t e o f S ã o P a u l o 2 5 . 6 % o f p e o p l e w i t h p o s i t i v e s k i n r e a c t i o n s h a d n o v i s i b l e s ig n o f l e i s h m a n i a s i s ^ ^ ín M i n a s G e r a i s 1 3 . 4 % 12 jn t h e
X i n g u N a t i o n a l P a r k f o r I n d i a n s in M a t o G r o s s o 6 2 . 5 % ^ i n A m a z ô n i a 3 2 . 9 % 8 a n d in R i o d e J a n e i r o
s t a t e f i g u r e s v a r y f r o m 3 . 7 - 2 4 % d e p e n d i n g o n t h e c o m m u n i t y s t u d i e d 1 7 2 6 W h i l e d i f f e r e n t c o n d i t i o n s o f
t h e t e s t m a y a c c o u n t f o r s o m e o f t h i s v a r i a t i o n i t is li k e l y t h a t s u b c l i n i c a l i n f e c t i o n s o c c u r w i t h o u t l e a v i n g a r e c o n g n i s a b l e s c a r .
I n c r e a s e d s e n s i t i v i t y o f t h e t e s t b y u s e o f h ig h a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n w a s f i r s t r e p o r t e d b y R o t b e r g ^ 4
w h o s h o w e d t h a t w i t h a c o n c e n t r a t i o n o f 1 x 1 0 7 p r o m a s t i g o t e s p e r m i l l i l i t e r 9 2 % o f p a t i e n t s w i t h c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s h a d p o s i t i v e r e a c t i o n s . M e l o e t a l , ( \ u t i l i z i n g a c o n c e n t r a t i o n o f 4 0 )J g o f p r o t e i n n i t r o g e n p e r m i l l i l i t e r h a d a 9 6 % p o s i t i v i t y r a t e a n d s u g g e s t e d t h a t a n a n t i g e n o f t h i s s t r e n g h t w a s d e s i r a b l e . O u r r e s u l t s s u p p o r t t h e i r f i n d i n g s b u t h ig h s t r e n g t h a n t i g e n s d o p r o d u c e u n d e s i r a b l e s k i n r e a c t i o n . O n t h e o t h e r h a n d , w e f o u n d t h a t w h e n t h e w e a k e s t a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n w a s u s e d 3 2 % o f t h e 4 1 p a t i e n t s w i t h s c a r s w e r e n o n r e a c t o r s . T h i s is i m p o r t a n t s i n c e l e i s h m a n i n s k i n t e s t s u r v e y s a r e f r e q u e n t l y u s e d t o
a s s e s s t h e i n c i d e n c e a n d p r e v a l e n c e o f c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s u s i n g s i m i l a r a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n s .
O u r s t u d i e s a l s o c o n f i r m t h a t a n t i g e n s p r e p a r e d f r o m a d i f f e r e n t o r g a n i s m ,
L . m. am azonensis,
in d u c e s a t i s f a c t o r y s k i n r e a c t i o n s in p a t i e n t s w i t h p r o v e n le s i o n s d u e t oL. braziliensis braziliensis.
T h i s is n o t s u r p r i s i n g s i n c e h e t e r o l o g o u s a n t i g e n s o u t s i d e th e l e i s h m a n i a g e n u s , s u c h a sT. c r u z fl
1 2 2 a n c jL
epto-m o nas p e s s o a fl
y i e l d p o s i t i v e r e a c t i o n s in c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s .T h e t i m e o f o n s e t o f s k i n t e s t r e a c t i v i t y a n d its d u r a t i o n a f t e r t h e i n i t i a l l e s i o n h a s b e e n o f i n t e r e s t . W e h a v e n o t e d , a s h a v e o t h e r s ^ 21_ t h a t t h e t e s t m a y b e n e g a t i v e e a r l y in i n f e c t i o n b u t , b y o n e m o n t h , n e a r l y a li a r e p o s i t i v e .
R e c e n t l y t h r e e g r o u p s o f w o r k e r s h a v e s t u d i e d l e i s h m a n i n r e a c t i v i t y s o m e y e a r s a f t e r a n i n i t i a l t e s t a n d r e p o r t e d a d e c l i n e in i n c i d e n c e o f p o s i t i v e r e a c t o r s 14 15 2 0 . T h i s is a v a r i a n c e w i t h t h e v ie w t h a t , o n c e e s t a b l i s h e d , s k i n h y p e r s e n s i t i v i t y p e r s i s t s in d e - f i n i t e l y . A n a l y s i s o f o u r d a t a d o e s n o t s u g g e s t t h a t t h e t i m e e l a p s e d b e t w e e n t h e h e a l i n g a n d t h e s k in t e s t i n g i n f l u e n c e s t h e i n t e n s i t y o f t h e r e a c t i o n e x c e p t w h e n l e s i o n s h a v e b e e n h e a l e d f o r m o r e t h a n 2 0 y e a r s * 9 .
T h e d e s t r u c t i v e e f f e c t s o f e s p u n d i a h a v e b e e n a t t r i b u t e d t o a h y p e r s e n s i t i v i t y p h e n o m e n o r P o r a u t o i m m u n e r e a c t i o n 1 1 . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t th e b a s i c m e c h a n i s m s o f c u t a n e o u s a n d m u c o s a l d i s e a s e d e p e n d o n t h e t o x i c i t y a n d i m m u n o g e n i c i t y o f t h e p a r a s i t e s 2 5 . T o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t m u c o s a l d i s e a s e is a s s o c i a t e d w i t h a g r e a t e r d e g r e e o f s k in h y p e r s e n s i t i v i t y t o l e i s h m a n i n i t w a s n e c e s s a r y to
s e l e c t t h e r e s u l t s u s i n g t h e l o w e s t c o n c e n t r a t i o n o f a n t i g e n i n v i e w o f o u r d a t a i n T a b l e 2 . W e d e t e c t e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e in s k i n t e s t r e a c t i v i t y b e t w e e n m u c o s a l a n d a c t i v e c u t a n e o u s c a s e s o r m u c o s a l a n d h e a l e d c u t a n e o u s c a s e s . T h i s is a t v a r i a n c e w i t h t h e o b s e r v a t i o n s m a d e b y S h a w a n d L a i n s o n 1 9 7 5 2 7 , in a d i f f e r e n t r e g i o n o f B r a z i l .
O u r d a t a c o n f i r m t h e n e c e s s i t y t o s t a n d a r d i s e t h e p r o c e d u r e o f t h e M o n t e n e g r o b o t h in t h e a n t i g e n u s e d a n d t h e m e t h o d o l o g y o f t h e t e s t r e a d i n g . I d e a l l y , o n e c a r e f u l l y s t a n d a r d i z e d a n t i g e n s h o u l d b e d i s t r i - b u t e d b y a n i n t e r n a t i o n a l a g e n c y . T h i s s t a n d a r d i z a t i o n s h o u l d i n c l u d e c a r e f u l t a x o n o m y o f t h e s t r a i n u s e d f o r a n t i g e n p r o d u c t i o n , c o n c e n t r a t i o n o f p r o m a s t i g o t e s p e r m i l l i l i t e r , p r e p a r a t i o n m e t h o d f o r p r e s e r v i n g th e a n t i g e n s a n d t o t a l n i t r o g e n d e t e r m i n a t i o n . E a c h l o t is b e s t s t a n d a r d i z e d b i o l o g i c a l l y in i n f e c t e d m a n a g a i n s t a s t o c k o f a n t i g e n o f k n o w n a c t i v i t y . A n e x o a n t i g e n h a s b e e n r e p o r t e d t o y i e l d a n i m m e d i a t e h y p e r s e n s i t i v i t y r e a c t i o n in 7 4 . 4 % o f 4 1 p a t i e n t s 2 7 . T h i s o b s e r v a t i o n is o f p r a c t i c a l i m p o r t a n c e a n d s h o u l d b e f u r t h e r in v e s - t i g a t e d s i n c e r e t u r n a f t e r t w o d a y s t o r e a d t h e r e a c t i o n is o f t e n d i f f i c u l t u n d e r f ie l d c o n d i t i o n s .
A D D E N D U M
R e c e n t l y C a s t e s M , A g n e l l i A , V e r d e O &
Cuba CAC, M a rsd en PD, B arretto A C , Jo n es TC, R ic h a rd s F. T he use o f different concentrations o f leish m a n ia l antigen
in sk in testing to evaluate delayed hypersensitivity in A m e rica n cutaneous leishm aniasis. R evista da Sociedade B rasileira de
M edicina Tropical 18: 231-236, O ut-D ez, 1985
I m m u n o l o g y a n d I m m u n o p a t h o l o g y 2 7 : 1 7 6 - 1 8 6 , 1 9 8 3 ) , h a v e s h o w n t h a t t h e s k i n t e s t r e s p o n s e
( a s m e a n i n d u r a t i o n i n m m . ) w a s s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r in m u c o c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s ( M C L , 1 1 p a t i e n t s ) t h a n i n 3 2 p a t i e n t s w i t h l o c a l i z e d c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s ( L C L ) .
T h i s d i f f e r e n c e f r o m o u r r e s u l t s m i g h t b e e x - p l a i n e d b y t h e s m a l l g r o u p s e x a m i n e d in b o t h s e r i e s a n d t h e f a c t t h a t s o m e o f o u r p a t i e n t s w i t h m u c o s a l d i s e a s e h a d s e c o n d a r y m a l n u t r i t i o n w h i c h w o u l d d e p r e s s s k in r e s p o n s e s .
A C K N O W L E D G E M E N T S
W e w i s h t o t h a n k D r . J o h n D a v i d f o r t h e i n i t i a l s u g g e s t i o n s l e a d i n g t o t h i s s t u d y . L u i z C . B a r r e t o a n d M a r i o A b r e u g a v e v a l u a b l e p r a c t i c a l a s s i s t a n c e i n t h e f i e l d .
R E F E R E N C E S
1 . A s h t o n D L , T h o r l e y A P . L e i s h m a n i a s i s in C e n t r a l B r a z i l . R e s u l t s o f a M o n t e n e g r o s k i n t e s t s u r v e y a m o n g A m e r i n d i a n s in t h e X i n g u N a t i o n a l P a r k . T r a n s a c t i o n s o f t h e R o y a l S o c i e t y o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 6 4 : 6 7 1 , 1 9 7 0 .
2 . A z u l a y R D , S a l g a d o U . S u r t o e p i d ê m i c o d a l e i s h m a - n i o s e t e g u m e n t a r e m p á r a - q u e d i s t a s d o E x é r c i t o n o A m a z o n a s . M e d i c i n a C u t â n e a 1: 3 4 7 , 1 9 6 6 .
3 . B a r b o s a W . S o u z a M C M , R a s s i D M , O l i v e i r a R L , M o t a L . I n v e s t i g a ç ã o s o b r e i m u n o l o g i a d a l e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r a m e r i c a n a . 1. I n t r a d e r m o r r e a ç ã o c o n c o m i t a n t e c o m a n t í g e n o s d e
L e p to m o n a s p e sso a i
eL. braziliensis.
R e v i s t a d e P a t o l o g i a T r o p i c a l 1: 3 7 7 - 3 8 3 , 1 9 7 2 . 4 . B a r r e t t o A C , C u b a C A C , M a r s d e n P D , V e x e n a t J A , D eB e l d e r M . C a r a c t e r í s t i c a s e p i d e m i o l ó g i c a s d e l e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r a m e r i c a n a e m u m a r e g i ã o e n d ê m i c a d o E s t a d o d a B a h i a , B r a s i l . I . L e i s h m a n i o s e h u m a n a . B o l e t i m O f i c i n a S a n i t a r i a P a n - a m e r i c a n a 9 0 : 4 1 5 - 4 2 4 1 9 8 1 .
5 . B i t t e n c o u r t A L , A n d r a d e Z A . A s p e c t o s i m m u n o p a t o - l ó g i c o s n a l e i s h m a n i o s e c u t a n e o m u c o s a . H o s p i t a l 7 1 : 9 7 5 - 9 8 4 , 1 9 6 7 .
6 . B r a y R S . L e i s h m a n i a s i s . I n : H o u b a V ( e d ) I m m u n o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n o f T r o p i c a l p a r a s i t i c d i s e a s e s . C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e , N e w Y o r k . p . 6 6 - 7 4 , 1 9 8 0 .
7 . C u b a C A . L e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r e m a r e a e n d ê m i c a d o E s t a d o d a B a h i a . C a r a c t e r i z a ç ã o e c l a s s i f i c a ç ã o d e
L e ish m a n ia .
n o h o m e m e c ã o d o m é s t i c o e a s p e c t o s c o m p o r t a m e n t a i s d e L .braziliensis braziliensis.
T e s e d e D o u t o r a m e n t o . U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d e M i n a s G e r a i s . B e lo H o r i z o n t e - M G . B r a s i l . 1 9 8 3 .8 . F o n s e c a J M , L a c a z C S , M a c h a d o P A . I n q u é r i t o i m u n o - a l é r g i c o n a A m a z ô n i a . R e s u l t a d o s p r e l i m i n a r e s . R e v i s t a d o I n s t i t u t o d e M e d i c i n a T r o p i c a l d e S ã o P a u l o 1 5 : 4 0 9 - 4 1 6 , 1 9 7 3 .
9 . F u r t a d o T A . C r i t é r i o s p a r a o d i a g n ó s t i c o d a L e i s h m a n i o s e T e g u m e n t a r A m e r i c a n a . A n a i s B r a s i l e i r o s d e D e r m a t o l o g i a 5 5 : 8 1 - 8 6 , 1 9 8 0 .
1 0 . G o a A . A m i c r o b i u r e t m e t h o d f o r p r o t e i n d e t e r m i n a t i o n o f t o t a l p r o t e i n in c e r e b r o s p i n a l í lu i d . S c a n d i n a v i a n J o u r n a l o f C l i n i c a i I n v e s t i g a t i o n 5 : 2 1 8 - 2 2 3 . 1 9 5 3 . 1 1 . H e y n e m a n D . I m m u n o l o g y o f L e i s h m a n i a s i s . B u l l e t i n o f
t h e W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n 4 4 : 4 9 9 - 5 1 4 . 1 9 7 1 . 1 2 . M a r t i n s A V . B a r r e t o M P , B r e n e r Z , P e l l e g r i n o J . O b s e r
v a ç õ e s p r e l i m i n a r e s s o b r e u m f o c o d e l e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r a m e r i c a n a e m M i n a s G e r a i s . R e v i s t a B r a s i l e i r a d e M a l a r i o l o g i a e D o e n ç a s T r o p i c a i s 8 : 5 7 7 - 5 8 1 ,
1 9 5 6 .
1 3 . M a r s d e n P D , N o n a t a R R . M u c o c u t a n e o u s L e i s h m a n i a s i s . A r e v i e w o f c l i n i c a i a s p e c t s . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 6 : 3 0 9 - 3 2 6 , 1 9 7 5 . 1 4 . M a r z o c h i M C A , C o u t i n h o S G , S a b r o z a P C , S o u z a
W I . R e a ç ã o d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a e i n t r a d e r m o r r e a ç ã o p a r a l e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r a m e r i c a n a e m m o r a d o r e s n a á r e a d e J a c a r e p a g u á , R i o d e J a n e i r o . E s t u d o c o m p a r a t i v o d o s r e s u l t a d o s e m 1 9 7 4 e 1 9 7 8 . R e v i s t a d o I n s t i t u t o d e M e d i c i n a T r o p i c a l d e S ã o P a u l o 2 2 : 1 4 9 - 1 5 5 , 1 9 8 0 .
1 5 . M a y r i n k W , M e l o M N , D a C o s t a C A , M a g a l h ã e s S A , D i a s P A , C o e l h o M , A r a ú j o M V , W i l l i a m s F G , F i g u e i r e d o U P , B a t i s t a S M . I n t r a d e r m o r r e a ç ã o d e M o n t e n e g r o n a l e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r a m e r i c a n a a p ó s t e r a p e u t i c a a n t i m o n i a l . R e v i s t a d o I n s t i t u t o d e M e d i c i n a T r o p i c a l d e S ã o P a u l o 1 8 : 1 8 2 - 1 8 5 , 1 9 7 6 .
1 6 . M e l o M N , M a y r i n k W , D a C o s t a C A , M a g a l h ã e s P A , D i a s M , W i l l i a m s P , A r a ú j o F G , C o e l h o M V , B a t i s t a S M . P a d r o n i z a ç ã o d o a n t í g e n o d e M o n t e n e g r o . R ç v i s t a d o I n s t i t u t o d e M e d i c i n a T r o p i c a l d e S ã o P a u l o 1 9 :
1 6 1 - 1 6 4 , 1 9 7 7 .
1 7 . M e n e z e s J A . L e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r n o E s t a d o d o R i o d e J a n e i r o , T e s e d e M e s t r a d o , U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d o R i o d e J a n e i r o , R i o d e J a n e i r o , 1 9 7 6 .
1 8 . M o n t e n e g r o J . C u t a n e o u s r e a c t i o n s in l e i s h m a n i a s i s . A r c h i v e s o f D e r m a t o l o g y a n d S y p h i l is 1 3 : 1 8 7 - 1 9 4 , 1 9 2 6 . 1 9 . P a m p a g l i o n e S , M a n s o n B a h r P E C , L a P l a c a M , B o r -
g a t t i M A , M i c h e l o n i F . S t u d i e s o n M e d i t e r r a n e a n L e i s h m a n i a s i s . I V . T h e L e i s h m a n i n s k i n t e s t in c u t a n e o u s L e i s h m a n i a s i s . T r a n s a c t i o n s o f t h e R n y a l S o c i e t y o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 7 0 : 6 2 - 6 5 , 1 9 7 6 . 2 0 . P e l l e g r i n o J , P e r e i r a L H , F u r t a d o T A . M u c o c u t a n e o u s
l e i s h m a n i a s i s i n t r a d e r m a l t e s t w i t h a p r o m a s t i g o t e s u s p e n s i o n a n d a c r u d e e x t r a c t f r o m
L e ish m a n ia
braziliensis.
R e v i s t a d o I n s t i t u t o d e M e d i c i n a T r o p i c a l d e S ã o P a u l o 1 9 : 3 9 3 - 3 9 6 , 1 9 7 7 .2 1 . P e s s o a S B , P e s t a n a B R . A i n t r a d e r m o r r e a ç ã o d e M o n t e n e g r o n a s c a m p a n h a s s a n i t á r i a s c o n t r a a l e i s h m a n i o s e . S ã o P a u l o M é d i c o . 1 5 : 1 3 3 - 1 5 1 , 1 9 4 0 .
2 2 . P e s s o a S B , C a r d o s o F A . N o t a s o b r e a i m u n i d a d e c r u z a d a n a l e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r e n a m o l é s t i a d e C h a g a s . O H o s p i t a l 2 1 : 1 8 7 - 1 9 3 , 1 9 4 2 .
2 3 . P e s s o a S B , B a r r e t o M P . L e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r a m e r i c a n a . I m p r e n s a N a c i o n a l , R i o , 1 9 4 8 .
2 4 . R o t b e r g A . C o n t r i b u i ç ã o p a r a o e s t u d o d a a l e r g i a n a l e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r a m e r i c a n a . T e s e , U n i v e r s i d a d e d e S ã o P a u l o , S ã o P a u l o , 1 9 5 1 .
2 5 . R i d l e y D S . A h i s t o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s a n d i t s g e o g r a p h i c a l e x p r e s s i o n . T r a n s a c t i o n s o f t h e R o y a l S o c i e t y o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 7 4 : 5 1 5 - 5 2 1 , 1 9 8 0 .
2 6 . S a b r o z a P C , W a g n e r M S , S o b r e r o N . I n q u é r i t o e p i - d e m i o l ó g i c o d e l e i s h m a n i o s e t e g u m e n t a r a m e r i c a n a e m J a c a r e p a g u á , R i o d e J a n e i r o . I n : R e s u m o d o X I C o n g r e s s o d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l , R i o d e J a n e i r o , 1 9 7 5 .
2 7 . S h a w J J , L a i n s o n R . L e i s h m a n i a s i s i n B r a z i l . X . S o m e O b s e r v a t i o n s o n i n t r a d e r m a l r e a c t i o n s t o d i f f e r e n t t r y p a n o s o m a t i d a n t i g e n s o f p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o m c u t a n e o u s a n d m u c o c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s . T r a n s a c t i o n s o f t h e R o y a l S o c i e t y o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 6 9 : 3 2 3 - 3 3 5 , 1 9 7 5 .
