UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
VALDEVANE ROCHA ARAÚJO
ESTUDO DOS FATORES QUE AFETAM A EFICIÊNCIA DO
CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS
E BOVINOS: EFEITO DO REGIME DE TROCA, MEIOS DE
CULTIVO DE BASE E SUPLEMENTOS
FORTALEZA-CE
2013
VALDEVANE ROCHA ARAÚJO
ESTUDO DOS FATORES QUE AFETAM A EFICIÊNCIA DO
CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS E
BOVINOS: EFEITO DO REGIME DE TROCA, MEIOS DE CULTIVO
DE BASE E SUPLEMENTOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de pequenos ruminantes.
Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.
FORTALEZA-CE
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecário(a) Responsável – Thelma Marylanda Silva de Melo- CRB-3 / 623
A658e Araújo, Valdevane Rocha
Estudo dos fatores que afetam a eficiência do cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos e bovinos: efeito do regime de troca, meios de cultivo de base e suplementos / Valdevane Rocha Araújo. — 2013
CD-ROM. 290f.: il. (algumas color); 4 ¾ pol.
―CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm)‖.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2013.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes.
Orientação: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo. Co-orientação: Prof. Dr. Eduardo Leite Gastal.
1. Bovino. 2. Caprino. 3. Competência oocitária. 4. Estradiol. 5. Folículos pré-antrais. I. Título.
Dedico esta tese em memória aos meus avós queridos, Belchior Damião de Araújo e Daldete Rocha Araújo, e José Muniz Rocha. Que Deus permita confortar nossos corações da saudade eterna.
Dedico também em memória do grande amigo da família e meu segundo pai, Sr. Arnoldo Almeida Catter. Alguém que dedicou sua vida a ajudar e educar pessoas e que acreditou em mim.
AGRADECIMENTOS
Deus e Nossa Senhora sabem o quão difícil foi toda essa jornada e por isso, a Eles, agradeço.
À Universidade Estadual do Ceará, ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias e a todos os seus funcionários (especialmente à Adriana Albuquerque), coordenadores, ex-coordenadores e professores, agradeço.
A CAPES e ao CNPq pelos auxílios em forma de bolsa de estudos tanto no Brasil quanto no exterior (Estados Unidos), agradeço.
Aos meus pais, Edite Araújo Rocha e Valdeci Rocha Araújo que são tudo para mim. Em todos esses anos e em todos os momentos sempre estiveram ao meu lado. Pessoas cujo apoio tive incondicional e que carregaram comigo todo o peso da ausência de um ano. Moletas que me sustentaram durante a subida de cada degrau na escada da vida. E que no topo da escada, receberam-me de braços abertos. A quem devo tudo o que tenho e tudo o que sou. A quem amo muito e com todas as minhas forças, agradeço.
Aos meus irmãos, Aurineide Rocha Araújo, Auricélio Rocha Araújo, Lázaro Rocha Araújo, Jacób Rocha Araújo e Belchior José Rocha Araújo, que de uma maneira ou de outra também me ajudaram, e continuam me ajudando. Aqueles que me apoiaram na difícil tarefa de amar as diferenças e as semelhanças, os defeitos e as qualidades. As minhas lindas irmãs que nem mesmo o prazer de conhecê-las tive, mas que sei que elas estão olhando por nós junto a Deus, nosso pai. A toda minha família, meus sobrinhos e afilhados, agradeço.
Ao Sr. Arnoldo, meu segundo pai, a quem dedico esta tese e a quem Deus chamou para continuar sua missão junto ao Senhor dos senhores, agradeço.
A todos os amigos, especialmente minha amiga Maria Noeme da Silva, e professores de graduação, especialmente aos Professores Lúcia de Fátima Lopes dos Santos e Ricardo Toniolli, que tanto me apoiaram e acreditaram em mim, agradeço.
A todos os amigos que fizeram do LAMOFOPA uma casa e me fizeram sentir em família: Deborah Magalhães-Padilha, Anderson Almeida, Jamily Bruno, Juliana Celestino, Viviane Saraiva, Ana Beatriz Duarte, Gerlane Modesto, Roberta Chaves, Helena Matos, Isabel Lima-Verde, Rochele Falcão, Michelle Brasil, Valesca Luz, Anelise Alves, Rebeca Rocha, Laritza Lima, Raphael Gonçalves, Fabrício Martins, Ticiana Franco, Ana Kelen Lima, Edmara Costa, Franciele Lunardi, Mirlla Baracho, Patrícia Andrade, Sra. Alzenira Andrade, Lindemara Rodrigues, Débora Sales, Priscilla Campos, Marcelo Ricardo, Lidinane Sales, Francisco Léo Aguiar, Hudson Correia, Denise Guerreiro, Andréa Moreira, Sr. Antônio Cézar Camelo, agradeço.
A duas amigas, que são como mães científicas que tenho, Jamily Bruno e Juliana Celestino. Pessoas que mesmo nos momentos mais difíceis, estavam lá para me ajudar e me confortar, especialmente nessa última etapa, agradeço.
A duas amigas que Deus colocou em meu caminho com o intuito de serem meus anjos da guarda e que me fizeram acreditar que poderia ter minhas irmãs de volta, Deborah Magalhães-Padilha e Ticiana Franco, agradeço.
A dois amigos que muito devo, Anderson Almeida e Cláudio Lopes, e a quem a Deus peço toda a proteção e cuidado, agradeço.
As minhas duas filhotas científicas, Gerlane Modesto e Mirlla Baracho, que me deram muitas alegrias e dividiram muitos ensinamentos, agradeço.
To my new Family, the American one, during my time out from Brazil. People as Mike Isom, Casie and Jeremiah Bass, Christiane and Mike Bass, Cherie Watson, Anja Meksem, Cindy McDaniel, Patrícia Krejcik, Joy Carter, Garcia and Brandon, Ricot Saint-Aimé, Deb Sarvela, Douglas Gimeniz and Maíra Aranha, Walquiria and David Adams, Shereen Hammad, Dra. Ana Migone, Áurea Wischral and Manoel Adrião, Eduardo and Melba Gastal, Keith Haag, Gabriela Fonseca, Saulo Silva, thank you very much.
Mike Isom, you were the best American dad that I could have in my life. You gave me Casie Bass as my sister and all that I needed in that time. For this and for everything that you guys did to me, I really thank you.
A Walquíria e David Adams que foram meus amigos, pais e conselheiros. Deram-me o apoio no momento em que mais precisei e foram um refúgio para mim, agradeço. “Walquíria and David Adams were more than friends; they were my friends, my parents and my advisors. They gave to me support when I needed it most and have been my refuge, thank you.”
Ao Prof. Dr. Cláudio Cabral, à Profa. Dra. Liliam Tavares, à Profa. Dra. Melba Gastal, à Profa. Dra. Áurea Wischral e ao Prof. Dr. Manuel Adrião pela amizade, carinho e pelas tantas lições de vida que levarei comigo para sempre, agradeço.
Ao meu orientador, Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo, que me recebeu no LAMOFOPA de braços abertos e que me deu votos de confiança desde o primeiro momento. Alguém que demonstrou acreditar no meu trabalho e na minha capacidade. A alguém que além de tudo, proferiu muitas palavras de conforto e aconcelhamento fazendo-me acreditar cada vez mais na minha própria capacidade, agradeço.
À minha co-orientadora, Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, que foi orientadora de mestrado e amiga, acima de tudo; e que nestes últimos momentos tem me apoiado muito, adradeço.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Eduardo Leite Gastal, que me deu a oportunidade de testar meus conhecimentos e minha capacidade, agradeço.
Aos membros da banca examinadora, Prof. Dr. Cláudio Cabral Campello, Prof. Dr. José Roberto Viana Silva, Profa. Dra. Áurea Wischral e Profa. Dra. Roberta Nogueira Chaves, que tanto contribuíram com a melhora desse trabalho, agradeço.
Finalmente, obrigada, papai e mamãe do céu, por mais uma etapa ultrapassada com sucesso em minha vida.
RESUMO
Os objetivos do presente trabalho foram: 1) verificar o efeito do regime de troca de meio (caprinos e bovinos) e do tipo de meio de cultivo de base (bovinos) sobre o crescimento/viabilidade in vitro de folículos secundários isolados; 2) avaliar a influência da proteína morfogenética óssea-6 (BMP-6) na ausência ou presença do hormônio folículo estimulante (FSH) sobre o crescimento/viabilidade de folículos pré-antrais caprinos cultivados in situ ou isolado; e quantificar os níveis de RNAm para BMPR-1A/R-2 e Smads 1/4/5/6/7/8 antes e após o cultivo de folículos secundários caprinos isolados; 3) investigar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) sobre o desenvolvimento de folículos secundários caprinos isolados; 4) verificar a influência da adição de VEGF, fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) e/ou hormônio do crescimento (GH) ao meio de cultivo in vitro de folículos secundários bovinos isolados utilizando sistemas de cultivo bi (2D) e tridimensional (3D). Para o cultivo in situ, fragmentos de córtex ovariano foram cultivados por um ou sete dias em MEM+ adicionado de BMP-6 (0, 1, 10, 50 ou 100 ng/mL). Folículos secundários foram isolados por microdissecção e cultivados por 18 (caprino) ou 32 (bovino) dias em αMEM+
(caprino e bovino) ou TCM-199+ (bovino) na presença ou ausência de FSH. O meio foi ainda suplementado com BMP-6 (caprino: 1 ou 10 ng/mL), VEGF (caprino: 10 ou 100 ng/mL; bovino: 100 ng/mL), IGF-1 (bovino: 50 ng/mL), GH (bovino: 50 ng/mL) ou VEGF+IGF-1+GH (bovino). Os resultados demonstraram que a adição periódica de meio aumentou significativamente as percentagens de oócitos (≥ 100 µm) caprinos destinados à maturação in vitro. O diâmetro, a taxa de crescimento, formação de antro e as concentrações de estradiol de folículos secundários bovinos isolados foram maiores (P<0,05) na adição periódica de meio utilizando α-MEM (MEM-S) quando comparada ao controle (MEM-C). A BMP-6 aumentou significativamente o percentual de folículos atrésicos e promoveu alterações ultraestruturais nos folículos primordiais caprinos após cultivo in situ. Em caprinos, a BMP-6 (1 ng/mL) promoveu maiores taxas de folículos antrais e completos níveis de expressão de RNAm da via de sinalização das BMPs; e o VEGF (10 ou 100 ng/mL) aumentou o diâmetro, a taxa de crescimento folicular e de recuperação oocitária, apresentando maiores percentagens de oócitos em metáfase II (P<0,05). Em bovinos, o VEGF melhorou as taxas de crescimento e formação de antro e o GH aumentou os níveis de estradiol após cultivo 2D e 3D, respectivamente (P<0,05). Diante do exposto, pode-se concluir que: 1) a adição periódica de meio melhorou o
cultivo de folículos secundários caprinos e bovinos isolados; 2) a BMP-6 induziu a atresia em folículos primordiais caprinos, porém promoveu o desenvolvimento in vitro de folículos secundários isolados; 3) a adição de VEGF melhorou as taxas de maturação de oócitos oriundos de folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro e finalmente; 4) a adição de VEGF (sistema 2D) e GH (sistema 3D) melhoraram, respectivamente, o desenvolvimento folicular (formação de antro e taxa de crescimento) e a produção de estradiol em folículos secundários bovinos isolados cultivados in vitro.
Palavras-chave: Bovino. Caprino. Competência oocitária. Estradiol. Folículos
ABSTRACT
The aims of this study were to: 1) verify the effect of medium replacement methods (caprine and bovine) and the type of culture media (bovine) in the in vitro growth/viability of isolated secondary follicles; 2) evaluate the effect of bone morphogenetic protein-6 (BMP-6) alone or associated with follicle-stimulating hormone (FSH) in the in vitro growth/viability of caprine preantral follicles cultured in situ or isolated; and to quantify the mRNA expression levels for BMPR-1A/R-2 and Smads 1/4/5/6/7/8 before and after in vitro culture of isolated caprine secondary follicles; 3) verify the influence of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the in vitro development of isolated caprine secondary follicles; 4) investigate the effect of VEGF, insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and growth hormone (GH) alone or in combination in the in vitro culture of isolated bovine secondary follicles using two- (2D) or three-dimensional (3D) culture systems. To the in situ culture, fragments of ovarian cortex were cultured in vitro for one or seven days in MEM+ supplemented with BMP-6 (0, 1, 10, 50 or 100 ng/mL). Secondary follicles were isolated by microdissection and cultured for 18 (caprine) or 32 (bovine) days in α-MEM+
(caprine and bovine) or TCM-199+ (bovine) with or without FSH. The culture medium was supplemented also with BMP-6 (caprine: 1 or 10 ng/mL), VEGF (caprine: 10 ou 100 ng/mL; bovine: 100 ng/mL), IGF-1 (bovine: 50 ng/mL) or GH (bovine: 50 ng/mL) or the combination of VEGF+IGF-1+GH (bovine). The results demonstrated that the periodic addition of culture medium increased (P<0.05) the percentage of caprine oocytes (≥ 100 µm) destined to in vitro maturation. Follicular diameter, growth rate, antrum formation, and estradiol production of isolated bovine secondary follicles were higher (P<0.05) using periodic addition method and α-MEM culture medium (MEM-S) than the control (MEM-C). BMP-6 increased (P<0.05) the percentage of atretic follicles and promoted ultrastructual alterations in caprine primordial follicles after in situ culture. In caprine, BMP-6 (1 ng/mL) improved the antrum formation rate (P<0.05) and allowed the complete mRNA expression levels for BMP receptor and Smads; and VEGF (10 and 100 ng/mL) increased (P<0.05) the follicular diameter and growth rate presenting higher percentage of metaphase II oocytes. In bovine, VEGF improved the follicular growth and antrum formation rate and GH increased the estradiol levels after 2D and 3D culture systems, respectively (P<0.05). Thus, the main conclusions from this study are as follows: 1) periodic addition of culture medium improved the follicular development of caprine and
bovine isolated secondary follicles; 2) BMP-6 induced the atresia in caprine primordial follicles, while improved the development of isolated secondary follicles; 3) the addition of VEGF improved the in vitro maturation rate of oocytes from secondary caprine follicles grown in vitro; and finally 4) the addition of VEGF (2D culture system) and GH (3D culture system), respectively, improved the follicular development (antral formation and growth rate) and increased the estradiol production in isolated bovine secondary follicles cultured in vitro.
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figure 1. Schematic sequence of complete follicular development. Preantral phase: Formation and beginning of growth and activation of primordial follicles and growth of primary and secondary follicles. Antral phase: Formation of tertiary follicle (antral-filled follicular fluid cavity). Follicle growth continues through the phases of recruitment, emergency, selection, dominance, and preovulatory stage of follicular waves. Oogonia is a cell that arises from a primordial germ cell and differentiates into an oocyte in the ovary. Primordial follicle has a single layer of flattened granulosa cells. Primary follicle has a single layer of cuboidal granulosa cells. Secondary follicle has two or more layers of cuboidal granulosa cells and a small number of theca cells. All the preantral follicles have a primary oocyte. Tertiary follicle has several granulosa cell layers, theca cells and primary oocyte and is characterized by an antral cavity which containing follicular fluid. Preovulatory or also called as Graafian follicle is the last stage of follicle development; these follicles are larger, have more antral fluid and a secondary oocyte. Follicular fluid is a plasma
exudate conditioned by secretory products from the granulosa cells and oocyte.…….. 65
Figure 2. Isolated follicles (A) by tissue chopper and microdissection, and (B) in situ follicles stained with PAS-hematoxilin. o: oocyte; n: oocyte nucleus; fgc: flattened granulosa cells; cgc: cuboidal granulosa cells; tc: theca cells; zp: zona pellucida. *Antral follicle grown in vitro...……….. 69
Figure 3. Schematic representation of the (A) two- and (B) three-dimensional culture
systems utilized for bovine preantral follicles..……… 72
CAPÍTULO 2
Figure 1. VEGF isoforms generated by alternative splicing. VEGF-A comprises monomers designated according to the number of amino acids in the polypeptide
VEGF165b, VEGF183, VEGF189 and VEGF206)………...
Figure 2. Binding complex VEGF-heparin-receptor involved in biological responses to VEGF in various cells and tissues. VEGF-A binds both to 1 and VEGFR-2, whilst PIGF and VEGF-B interact only with VEGFR-1. VEGF-C and VEGF-D
bind to receptors VEGFR-2 and VEGFR-3, and VEGF-E binds only to VEGFR-2….. 106
Figure 3. Biological activities of VEGF in the mammalian ovarian follicle. The expansion of the vascular network during follicle development enhances oxygenation and diffusion of several substances important for follicle cells, and leads to the
discussed biological responses……… 108
CAPÍTULO 3
Figure 1. Normal caprine preantral follicle before culture (A); antral follicle after 18 days of culture in T2 (periodic addition of medium). Note the chromatin configuration of the oocytes in germinal vesicle (C) and telophase I (D - from T2
treatment)………. 128
Figure 2. Percentage of isolated morphologically normal preantral follicles after 18 days of culture. (a,b)Differs significantly among culture periods within the same treatment (P<0.05). (A,B)Differs significantly among treatments within the same
culture period (P<0.05).………... 131
Figure 3. Follicular diameter after 18 days of culture with different protocols of medium replacement. (a,b)Differs significantly among culture periods within the same treatment (P<0.05). (A,B)Differs significantly among treatments within the same
culture period (P<0.05).………... 132
Figure 4. Percentage of antral cavity formation in follicles cultured with different protocols of medium replacement after 18 days. (a,b)Differs significantly among culture periods within the same treatment (P<0.05). (A,B)Differs significantly among
CAPÍTULO 4
Figure 1. Morphologically normal (a) and degenerated (b) bovine follicles before and
after 32 days of in vitro culture, respectively. Bars = 20 µm (a) and 50 µm (b)………. 146
Figure 2. Viable and non-viable bovine follicles after 32 days of in vitro culture. (a, b, i, j) Conventional and (c, d, k, l) Small supplementation methods using α-MEM+
. (e, f, m, n) Conventional and (g, h, o, p) Small supplementation methods using TCM-199+. Note that viable follicles (a-h) had shiny granulosa cells arranged in several layers, intact basal membrane, and antrum cavity. However, non-viable follicles (i-p) had very dark granulosa cells, irregularities in the basal membrane, and no antral
cavity. Bars = 100 µm (a-p)………. 150
Figure 3. Relative mRNA expression (mean±SEM) for FSHR, IGF1, VEGF, and
P450AROM at days 0 and 32 of in vitro culture. A,BRelative mRNA expression differed (P<0.05) among groups. No expression of VEGF was detected in fresh, MEM-S, and TCM-S groups. No difference (P>0.05) was observed for P450AROM
among all groups.……… 154
CAPÍTULO 5
Figure 1. Percentages (means±S.E.M) of atretic preantral follicles in uncultured tissue (fresh control) and tissue cultured for 1 and 7 days in MEM+ and MEM+ supplemented with 1, 10, 50, and 100 ng/mL BMP-6. For each treatment, 30 follicles were evaluated in each of five replicates. *P<0.05, significantly different from uncultured ovarian cortex tissue (control/D0). (A, B)Different letters denote significant
differences between culture periods within the same medium (P<0.05)….……… 172
Figure 2. Histological section of (A) normal follicles from uncultured tissue and, (B) atretic follicles after culture in the presence of BMP-6 O: oocyte; NU: oocyte
nucleus; GC: granulosa cells. Staining with periodic acid Schiff-hematoxylin, 400x… 172
Figure 3. Electron micrograph of caprine preantral follicle from (A) an uncultured
6 cultured (8000x) for 7 days. Homogeneous cytoplasm with numerous rounded mitochondria is characteristic of non-cultured follicles and cultures with only MEM+ (3A and 3B, respectively). Extreme vacuolization and great holes are present in the cytoplasm, indicative of degeneration (3C and 3D; solid arrow). Note the empty space in degenerated granulosa cells after in vitro culture with BMP-6 (3C and 3D; open arrow). NU: oocyte nucleus, GC: granulosa cells, m: mitochondria, ser: smooth endoplasmic reticulum, v: vesicle ………..
CAPÍTULO 6
Figure 1. (A) Morphologically normal preantral (day 0) and (B) antral follicles (day
6) using BMP-6 at 1 ng/mL withou rFSH®... 192
Figure 2. Antrum formation rate (%) in follicles cultured for 18 days in αMEM+
or medium supplemented with BMP-6 (1 or 10 ng/mL) in the absence or presence of rFSH®. A,BDifferent letters denote significant differences among treatments in the
same period (P<0.05).……….. 194
Figure 3. The oocytes from follicles grown in vitro in αMEM+ medium (A-C) or under treatment with BMP-6 at 1 ng/mL without FSH® (D-F). Note the presence of the intact germinal vesicle (GV) in the MEM treatment and the metaphase II (MII)
stage indicated in blue after Hoechst 33342 staining in BMP-6 treatment………. 196
Figure 4. Relative expression of mRNA (means±SD) of (A) bmpr2; (B) smad1; (C)
smad5; (D) smad8; (E) smad6; and (F) smad7 in the non-cultured control (D0) and
after 18 days of culture in αMEM+
medium or BMP-6 at 1 ng/mL without rFSH® (BMP1). A,BDifferent letters denote significant differences among treatments
(P<0.05)………... 197
CAPÍTULO 7
Figure 1. Oocytes from goat follicles, grown in vitro, at the end of the culture period (after 18 days) with various treatments: control (a, d, g, j), with 10 ng/ml VEGF (b, e,
AM in d-f and in red by ethidium homodimer in j-l for all treatments. Bars 50 μm…...
Figure 2. Percentages of goat preantral follicles with normal morphology (healthy follicles) cultured for 18 days (D0, D6, D12, D18) in αMEM+
(Control) and αMEM+ supplemented with 10 ng/ml VEGF (VEGF10) or 100 ng/ml VEGF (VEGF100). Different lowercase letters denote significant differences among culture periods
within the same medium (P<0.05)………... 216
Figure 3. Diameter of goat follicles cultured for 18 days (D0, D6, D12, D18) in αMEM+
(Control) and αMEM+ supplemented with 10 ng/ml VEGF (VEGF10) or 100 ng/ml VEGF (VEGF100). Different lowercase letters denote significant differences among culture periods within the same medium (P<0.05). Different uppercase letters
denote significant differences among treatments in the same period (P<0.05)………... 217
Figure 4. Antrum formation in goat follicles cultured for 18 days (D0, D6, D12, D18) in αMEM+
(Control) and αMEM+ supplemented with 10 ng/ml VEGF (VEGF10) or 100 ng/ml VEGF (VEGF100). Different lowercase letters denote significant differences among culture periods within the same medium (P<0.05). Different uppercase letters denote significant differences among treatments in the same period
(P<0.05)………... 218
Figure 5. Oocytes from goat follicles grown in vivo (a-c) and in vitro under control conditions (d-f) and after treatment with 10 ng/ml VEGF (g-i) or 100 ng/ml VEGF (j-l). b, e, h, k Viable oocytes marked in green by Calcein-AM for all the treatments. Note the presence of the germinal vesicle in the controls (f) and metaphase II in oocytes in vivo (c) and after treatment with 10 ng/ml VEGF (i) or 100 ng/ml VEGF
(l), marked in blue by Hoechst 33342. Bars 50 μm………. 220
CAPÍTULO 8
Figure 1. Bovine follicles before (A; day 0) and after in vitro culture (B-D; day 32) in medium containing only α-MEM+
(B), or α-MEM+ plus VEGF (C), or α-MEM+ plus GH (D). Normal in vitro grown preantral (A) and antral follicles D) using 2D
cells; a: antral cavity formation. Scale bars = 50 µm. Images were captured at 32X
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Table 1. Chronological advances in in situ culture system of early bovine preantral
follicles.*……….………... 74
Table 2. Chronological advances in two and three dimensional (2D and 3D) in vitro
culture systems for isolated bovine preantral follicles.*……… 76
CAPÍTULO 3
Table 1. Meiotic stages of goat oocytes from preantral follicles cultured for 18 days
with three different protocols for medium exchange.………. 134
CAPÍTULO 4
Table 1. Oligonucleotide primers used for real-time polymerase chain reaction
analysis of bovine follicles before and after in vitro culture.……….. 148
Table 2. Morphological normal follicles (%), follicular viability (%), follicular diameter (µm) and growth rate (µm/day), antrum formation (%), and estradiol concentration (ng/ml) of bovine follicles after 32 days of in vitro culture in α-MEM+ and TCM-199+ using two medium replacement methods (Conventional-C or Small
Supplementation-S)………... 151
Table 3. Frequency of slow (<1 µm/day), medium (1 to 4.9 µm/day), and fast (≥5 µm/day) growth rates of bovine follicles after 32 days of in vitro culture in two media (α-MEM+
or TCM-199+) using two medium replacement methods (Conventional-C
or Small Supplementation-S)……….. 152
Table 4. Mean (±SEM) estradiol concentrations (ng/ml) produced by bovine follicles in α-MEM+
or TCM-199+ using two medium replacement methods (Conventional-C
of in vitro culture……….
Table 5. Mean (±SEM) estradiol concentrations (ng/ml) produced by antral versus no antral bovine follicles in α-MEM+
or TCM-199+ using two medium replacement methods (Conventional-C or Small Supplementation-S) after 32 days of in vitro
culture……….. 153
CAPÍTULO 5
Table 1. Percentages (mean±S.E.M.) of primordial and growing follicles (primary and secondary) in uncultured tissues and tissues cultured for 1 or 7 days in MEM+
(control medium) and MEM+ supplemented with various concentrations of BMP-6…. 170
Table 2. Follicle and oocyte diameters (mean±S.E.M.) in uncultured tissues and tissues cultured for 1 or 7 days in MEM+ (control medium) and MEM+ supplemented with various concentrations of BMP-6. For each treatment, 20 follicles were
evaluated……….. 171
CAPÍTULO 6
Table 1. Oligonucleotide primers used for the real-time polymerase chain reaction
analysis of caprine follicles before (Day 0) and after in vitro culture (Day 18)………. 191
Table 2. Percentage of morphological normal follicles, means±SEM of follicular diameter (µm) and overall growth rate (µm/day) of caprine follicles after long-term culture (18 days) in αMEM+
or medium supplemented with BMP-6 at 1 or 10 ng/mL
in the absence or presence of rFSH®………... 193
Table 3. Oocyte viability (%) and diameter (µm), recovery rate of oocytes cultured in
vitro (%), and meiotic stages (%) of caprine oocytes from preantral follicles after
long-term culture (18 days) in αMEM+ or medium supplemented with BMP-6 (1 or
CAPÍTULO 7
Table 1. Recovery rate of oocytes (≥110 μm) grown in vitro and meiotic stages of goat oocytes from preantral follicles cultured for 18 days in αMEM+
(Control) and αMEM+
supplemented with 10 ng/ml VEGF (VEGF10) or 100 ng/ml VEGF (VEGF100). Significant differences between treatments in the same column are
indicated by uppercase letters (P<0.05)………... 219
CAPÍTULO 8
Table 1. Morphologically normal follicles (%), antrum formation (%), growth rate (µm/day), and estradiol concentration (ng/ml) of bovine follicles after 32 days of in vitro culture in two- (2D: Experiment 1) and three-dimensional (3D using alginate: Experiment 2) culture systems in the absence (Control group: only α-MEM+) or
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
18S: 18 unidades Svedberg de parte do RNA ribossomal 2D: Two-dimensional culture system (Sistema de cultivo
bidimensional)
3D: Three-dimensional culture system (Sistema de cultivo tridimensional)
A1: B-cell leukemia/lymphoma 2 related protein A1
ActR-I/Alk2 Activin type I receptor/activin receptor-like kinase-2/ (Receptor tipo 1 da ativina/ Receptor de ativina semelhante à quinase-2) ActR-IIA Activin type IIA receptor (Receptor tipo 2A da ativina) ActR-IIB Activin type IIB receptor (Receptor tipo 2B da ativina) ANOVA: Analysis of variance (Análise de variância)
Bcl-2: B-cell leukemia/lymphoma protein 2
BMP: Bone Morphogenetic Proteins (Proteínas morfogenética óssea) BMP-2/4/6/7/8/15: Bone Morphogenetic Protein (Proteína morfogenética
óssea)-2/4/6/7/8/15
BMPR-IA/Alk-3: Bone Morphogenetic Protein type IA receptor/ activin receptor-like kinase-3 (Receptor tipo 1A das proteínas morfogenéticas ósseas/ Receptor de ativina semelhante à quinase-3)
BMPR-IB/Alk-6: Bone Morphogenetic Protein type IB receptor/ activin receptor-like kinase-6 (Receptor tipo 1B das proteínas morfogenéticas ósseas/ Receptor de ativina semelhante à quinase-6)
BMPR-II: Bone Morphogenetic Protein type II receptor (Receptor tipo 2 das proteínas morfogenéticas ósseas)
BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridine
BSA: Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) -C: Conventional method for medium replacement CaCl2: Cloreto de cálcio
Calceína-AM: Calceína acetoximetil
CAPES: Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid (Ácido
desoxirribonucleico completar)
CGP: Células germinativas primordiais
CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CO2: Dióxido de carbono
COC: Cumulus oocyte complexes (Complexos cúmulos oócito) Co-Smad: Common-mediator Smad (Smad mediadora comum)-Smad4 Ct: Cycle threshold (Ciclo de threshold)
CXCL12: Chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (Quimiocina CXCL12) CYC-A: Cyclophilin-A (Ciclofilina-A)
D: Dia
D0: Day zero/fresh control/non-cultured control (Dia 0/ controle não cultivado)
e.g.: For example (por exemplo)
E2: Estradiol
EGF: Epidermal Gorwth Factor (Fator de crescimento epidermal) ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Ensaio de
imunoadsorção enzimática) FAVET: Faculdade de Veterinária
fgc: Flattened granulosa cells (Células da granulosa pavimentosas); FGFb: Fibroblast Growth Factor (Fator de Crescimento Fibroblástico) b
Fig. Figure (Figura)
FSH: Follicle Stimulating Hormone (Hormônio folículo estimnulante) FSHR: Receptor do hormônio folículo estimulante
FUNCAP: Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
G: Gauge (calibre)
GADPH: Glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (Gliceraldeído trifosfato desidrogenase)
GC: Granulosa cells (Células da granulosa)
GDF-9: Growth and differentiation factor (Fator de crescimento e diferenciação)-9
GH: Gowth hormone (Hormônio do crescimento)
GHR: Growth hormone receptor (Receptor de hormônio do crescimento)
h: Hora
hCG: Human chorionic gonadotrophin (Gonadotrofina coriônica humana)
HE: Hematoxylin-eosin (Hematoxilina-eosina)
HEPES: 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (4-(2-hidroxietil)-1-piperazina ethanesulfonic de ácido)
i.e.: This is (Isto é)
IAA: Indole-3-acetic acid (Ácido 3-indol Acético) IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IGF-1/2: Insulin like growth factor (Fator de crescimento semelhante à insulina)-2
IGFBP: Insulin-like growth factor-binding proteins (Proteínas ligantes transportadoras de fator de crescimento semelhante à insulina) ISABR: International Symposium on Animal Biology of Reproduction I-Smad: Inhibitory or antagonistic Smads (Smads inibitórias ou
antagonistas) -Smad6, Smad7
ITS: Insulin, transferrin and selenium (Insulina, transferrina e selênio) IVC: In vitro culture (Cultivo in vitro)
JAK2: Janus kinase 2
kb: Kilo base
KCl: Cloreto de potássio
kD: Kilo Dalton
KL: Kit ligand
LAMOFOPA: Laboratório de manipulação de oócitos e folículos pré-antrais LH: Luteinizing hormone (Hormônio luteinizante)
m: Mitochondria (mitocôndria)
M: Molar
MAP: Mitogen-activated protein kinases (Proteínas quinases ativadas por mitógeno)
MEM/HEPES: Meio essencial mínimo adicionado de tampão HEPES MEM: Minimum essential medium (Meio essencial mínimo) MEM+: Minimum essential medium supplemented (Meio essencial
mínimo suplementado) MII: Metaphase (Metáfase)- II
ml/mL: Mililitro
mm: Milímetro
mM: Milimolar
mm3: Milímetro cúbico
MMP-9: Matrix metalloproteinases-9 (Metalopreinase da matriz-9) MOIFOPA: Manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos
pré-antrais
NaCl: Cloreto de sódio
ng: Nanograma
nm: Namômetro
NU/n: Oocyte nucleus (Núcleo do oócito) Nubis: Núcleo de Biotecnologia de Sobral
O/o: Oocyte (Oócito)
Oct4/POU5F1: Octamer-binding transcription factor 4 (Fator de transcrição de ligação ao octâmero 4)
OPU: Ovum pick-up (colheita de oócitos) P < 0.05: Probabilidade de erro menor do que 5% P > 0.05: Probabilidade de erro maior do que 5%
P4: Progesterona
P450AROM: P450aromatase
PAS: Periodic acid Shiff (Ácido periódico de Shiff) PBS: Phosphate buffered saline (Tampão fosfato salina)
PCNA: Proliferation marker proliferating cell nuclear antigen (Antígeno nuclear de proliferação celular)
PDGF: Platelet-derived growth factor (Fator de crescimento derivado de placenta)
PI3K/AKT: Phosphatidylinositide 3-kinases (Fosfatidil inositol 3-quinase) PIGF: Placental growth factor (fator de crescimento placentário) PIV: Produção in vitro de embriões
PPGCV: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias qPCR: Quantitative polimerase chain reaction (Reação em cadeia
polimerase quantitativa)
rFSH: Recombinant follicle stimulating hormone (hormônio folículo estimulante recombinante)
RNAm/mRNA: Ribonucleic acid messenger (Ácido ribonucléico mensageiro) R-Smad: Receptor-regulated Smads (Smads
reguladoras-receptoras)-Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 e Smad8
RT-qPCR: Real time reverse transcription quantitative polimerase chain reaction (Transcrição reversa da reação em cadeia polimerase quantitativa em tempo real)
S.E.M./SEM: Standard error of means (Erro padrão da média) s/sec: Seconds (Segundos)
-S: Small Supplementation for medium replacement (Pequena suplementação para troca de meio)
SAS: Statistical Analysis System (Sistema de análise estatística) SCF: Stem cell factor (Fator de células-tronco)
SEM: Standard error of the mean (Erro padrão da média)
ser: Smooth endoplasmic reticulum (retículo endoplasmático liso) SIU: Southern Illinois University (Universidade do Sul de Illinois) Smads: small-mothers against dpp gene Drosophila
SNK test: Student-Newman-Keels test
SSR: Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction (Reunião annual da Sociedade para o estudo da reprodução) STAT-1/3/5: Signal transducters and activators of transcription (Transdutores
de sinal e ativação de transcrição)-1/3/5
T: Treatment (Tratamento)
TC/tc: Theca cells (Células da teca)
TCM-199: Tissue medium culture (Meio de cultivo de tecido)-199
TE: Transferência de embriões
TEM/MET: Transmission eletron microscopy (Microscopia eletrônica de transmissão)
TGF-β: Transforming growth factor (Fator de crescimento transformante) -β
TI: Telophase (Telófase)-1
TMB: Tetramethylbenzidine (Tetrametilbenzidina)
UECE: Universidade Estadual do Ceará UFC: Universidade Federal do Ceará UnB: Universidade de Brasília
v/v: Volume/volume
v: Vesicle (vesícula)
VEGF: Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento do endotélio vascular)
VEGF10: VEGF treatment at 10 ng/mL (Tratamento com VEGF na concentração de 10 ng/mL)
VEGF100: VEGF treatment at 100 ng/mL (Tratamento com VEGF na concentração de 100 ng/mL)
VEGF110-206: Monômeros de VEGF de acordo com o número de aminoácidos
(110, 111, 121, 145, 148, 162, 165, 165b, 183, 189, 206) da cadeia polipeptídica
VEGF-A-E: Isoformas de VEGF dos tipos A, B, C, D, e E
VEGFR-1/Flt-1: Fms-like tyrosine kinase-1 (Tirosina quinase 1 semelhante a Fms) VEGFR-2/KDR: kinase domain receptor (Receptor de domínio quinase)
VEGFR-3/Flt-4: Fms-like tyrosine kinase-4 (Tirosina quinase 4 semelhante a Fms) VPF: Vascular permeability factor (Fator de permeabilidade vascular)
w/v: Massa/volume
x: Eixo das abicissas
y: Eixo das ordenadas
ZP/zp: Zona pelúcida (Zona pelúcida)
α-MEM: Minimum essential medium alpha (Meio essencial mínimo alfa) α-MEM+
: Supplemented minimum essential medium alpha (Meio essencial mínimo alfa suplementado)
α-MEM-HEPES: Meio essencial mínimo alfa tamponado com HEPES
%: Percentagem
≥: Maior ou igual a
°C: Graus Celsius
µg: Micrograma
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 30
2 REVISÃO DE LITERATURA……… 32
2.1 FOLICULOGÊNESE OVARIANA E CARACTERIZAÇÃO FOLICULAR
(ASPECTOS BÁSICOS DA FOLICULOGÊNESE OVARIANA)... 32
2.1.1 Formação e início do crescimento de folículos primordiais... 32 2.1.2 Crescimento de folículos primários e secundários... 33 2.2 POPULAÇÃO E ATRESIA FOLICULAR... 34 2.3 NEOFOLICULOGÊNESE... 35 2.4 BIOTÉCNICA DE MOIFOPA (Ovário Artificial)... 37 2.5 ESTADO ATUAL DO CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS
PRÉ-ANTRAIS... 37 2.6 SISTEMAS DE CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS... 38 2.7 IMPORTÂNCIA DA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTIVO DE BASE 39 2.8 HORMÔNIO FOLÍCULO ESTIMULANTE (FSH)... 40 2.9 FATOR DE CRESCIMENTO DO ENDOTÉLIO VASCULAR (VEGF)... 41 2.10 PROTEÍNA MORFOGENÉTICA ÓSSEA-6 (BMP-6)... 42 2.11 FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA-1 (IGF-1)... 45 2.12 HORMÔNIO DO CRESCIMENTO (GH)... 46 2.13 TÉCNICAS PARA AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO CULTIVO IN
VITRO... 47 2.13.1 Histologia clássica... 47 2.13.2 Microscopia eletrônica de transmissão... 48 2.13.3. Microscopia de fluorescência e microscopia confocal... 48 2.13.4. Análise de esteroides... 49 2.13.5. Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real).... 50
3 JUSTIFICATIVA... 52
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS... 54
5 OBJETIVOS... 55 5.1 OBJETIVOS GERAIS... 55 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 55
6 CAPÍTULO 1
Cultivo in vitro de folículos pré-antrais bovinos: Uma revisão... 57 7 CAPÍTULO 2
Importância do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) na fisiologia
ovariana de mamíferos... 98 8 CAPÍTULO 3
Efeito do protocolo de troca de meio sobre o desenvolvimento in vitro de
folículos pré-antrais caprinos isolados... 122 9 CAPÍTULO 4
Crescimento in vitro, produção de estradiol e expressão gênica de folículos
pré-antrais bovinos isolados: Efeito do meio de base e método de troca de meio... 139 10 CAPÍTULO 5
Proteína morfogenética óssea-6 (BMP-6) induz atresia em folículos primordiais
caprinos cultivados in vitro... 162 11 CAPÍTULO 6
Efeito da proteína morfogenética óssea-6 (BMP-6) e do hormônio folículo estimulante (FSH) durante o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais ovarianos caprinos, e expressão relativa de RNAm para os receptores de BMP e
Smads em folículos cultivados... 181 12 CAPÍTULO 7
Fator de crescimento do endotélio vascular-A165 (VEGF-A165) estimula o
desenvolvimento in vitro e a competência oocitaria de folículos pré-antrais
caprinos... 205 13 CAPÍTULO 8
Desenvolvimento in vitro de folículos secundários bovinos em sistemas bi e tridimensional utilizando fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) e hormônio do
crescimento (GH)... 226
CONCLUSÕES... 245
PERSPECTIVAS... 246
1 INTRODUÇÃO
As pesquisas realizadas nos últimos anos em reprodução assistida têm possibilitado oportunidades extraordinárias para a reprodução animal (TROUNSON et al., 1998), visto que visam aumentar o potencial reprodutivo e a produtividade dos rebanhos, proporcionando uma grande revolução na multiplicação de animais de elevado potencial econômico. Considerando a expressividade dos rebanhos caprino (9 milhões de cabeças) e bovino (209,5 milhões de cabeças) para o Brasil (IBGE, 2010), diversas biotécnicas reprodutivas, tais como a inseminação artificial, sincronização de estro, produção in vitro (PIV) e transferência de embriões (TE), têm sido utilizadas. Outra biotécnica bastante estudada é a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA), também denominada ovário artificial (FIGUEIREDO et al., 2008). A biotécnica de MOIFOPA compreende as etapas de isolamento e cultivo in vitro, bem como a criopreservação dos oócitos inclusos em folículos pré-antrais. Em associação a outras tecnologias reprodutivas, como a fecundação in vitro e a transferência de embriões, a MOIFOPA poderá, no futuro, não somente otimizar, como também conservar o material genético de animais valiosos e de espécies em vias de extinção.
Tendo em vista que o ovário dos mamíferos contém milhares de folículos pré-antrais, e que a sua grande maioria se tornará atrésica naturalmente durante seu desenvolvimento (CARROLL et al., 1990), deve-se buscar técnicas que visem otimizar o potencial reprodutivo das fêmeas prevenindo a ocorrência da atresia folicular. Desta forma, o desenvolvimento de técnicas para recuperação e crescimento in vitro de folículos pré-antrais seria uma alternativa aos métodos já disponíveis para reprodução animal, uma vez que forneceria uma população grande e uniforme de oócitos de animais geneticamente superiores (BETTERIDGE et al., 1989). Neste sentido, a identificação de fatores produzidos localmente em folículos ovarianos caprinos e bovinos, bem como a avaliação do efeito destes fatores sobre o crescimento e maturação oocitária poderão contribuir para uma melhor compreensão da foliculogênese, otimizando a produção de embriões a partir de oócitos inclusos em folículos pré-antrais crescidos in vitro.
Diversos grupos de fatores de crescimento produzidos localmente no ovário já foram identificados em animais de laboratório, primatas e ruminantes. Além disso, tem sido demonstrado que fatores como a proteína morfogenética óssea-6 (BMP-6 – OTSUKA et al., 2001a), o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF – YANG;
FORTUNE, 2007; BRUNO et al., 2009) e o fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1: THOMAS et al., 2007) podem exercer importantes funções no controle do crescimento folicular e posterior maturação oocitária. No tocante à utilização de hormônios, os hormônios folículo estimulante (FSH; MATOS et al., 2007a; MAGALHÃES et al., 2009) e hormônio do crescimento (GH; LANGHOUT et al., 1991) têm sido considerados importantes na regulação do crescimento e desenvolvimento folicular. Contudo, ainda são poucos os estudos sobre os fatores de crescimento que controlam o desenvolvimento folicular inicial e a maturação oocitária, sendo uma prioridade a análise do efeito destes fatores sobre a foliculogênese pré-antral de mamíferos, visando o desenvolvimento de meios de cultivo in vitro.
Para um maior esclarecimento da importância deste projeto, a revisão de literatura a seguir abordará aspectos relacionados à foliculogênese ovariana e caracterização folicular, população e atresia folicular, neofoliculogênse, biotécnica de MOIFOPA (ovário artificial), estado atual do cultivo in vitro, sistemas de cutlivo in
vitro de folículos pré-antrais, importância da composição do meio de cultivo de base e
substâncias relacionadas à foliculogênese com ênfase para o FSH, BMP-6, VEGF, IGF-1 e GH, bem como para as técnicas de avaliação da eficiência do cultivo in vitro de folículos pré-antrais.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 FOLICULOGÊNESE OVARIANA E CARACTERIZAÇÃO FOLICULAR (ASPECTOS BÁSICOS DA FOLICULOGÊNESE OVARIANA)
A foliculogênese pode ser definida como o processo de formação e desenvolvimento (crescimento e maturação) dos folículos. É um evento iniciado ainda na vida pré-natal, na maioria das espécies, com a formação do folículo primordial e culminando com a formação do folículo de De Graaf ou pré-ovulatório (van den HURK; ZHAO, 2005). Ocorre simultaneamente à oogênese na maioria das espécies quando o oócito está entre as fases de prófase I e metáfase II. A foliculogênese pode ser dividida em duas fases, considerando o grau de evolução dos folículos: 1) fase pré-antral, composta pelos folículos não cavitários em que ocorre a ativação dos folículos primordiais e crescimento dos folículos primários e secundários; e 2) fase antral, na qual ocorre o crescimento inicial e terminal dos folículos terciários dando origem aos folículos pré-ovulatórios.
2.1.1 Formação e início do crescimento de folículos primordiais
Na espécie caprina, os folículos primordiais são formados por volta do 62° dia de vida fetal. Estes folículos apresentam um oócito circundado por uma camada de células somáticas planas, conhecidas como células da pré-granulosa, originárias do epitélio celômico (BEZERRA et al., 1998). Os folículos primordiais representam cerca de 95% do total de folículos pré-antrais presentes no ovário (ERICKSON, 1986). Estes folículos possuem diâmetro médio de 35, 22 e 20 µm em bovinos (HULSHOF et al., 1994), ovinos (AMORIM et al., 2000) e caprinos (LUCCI et al., 1999), respectivamente. Após a formação dos folículos primordiais, as células da pré-granulosa param de se multiplicar e entram num período de quiescência.
Com a evolução folicular e após a ativação, os folículos pré-antrais iniciam uma série de mudanças morfofisiológicas que envolvem o crescimento e a diferenciação do oócito, bem como a proliferação e a diferenciação das células da granulosa, além do desenvolvimento das células da teca (SUH et al., 2002). No início do crescimento folicular, fase conhecida como ativação, os folículos primordiais passam do pool de reserva ou folículos quiescentes para o pool de folículos em crescimento (primário,
secundário, terciário e/ou pré-ovulatório; RÜSSE, 1983). Os sinais de ativação dos folículos primordiais incluem a retomada da proliferação das células da granulosa (van den HURK; BEVERS; BECKERS, 1997) e a mudança na morfologia dessas células de pavimentosas para cúbicas. No entanto, os fatores e mecanismos responsáveis pela ativação de folículos primordiais, bem como os mecanismos envolvidos no início do crescimento folicular, são ainda enigmáticos e representam uma das maiores questões relacionadas com a biologia ovariana.
Vários fatores de crescimento produzidos pelas células foliculares podem estar relacionados com a ativação dos folículos primordiais. O kit ligand (KL), também conhecido como fator de células-tronco (Stem cell factor – SCF), e o fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF), por exemplo, foram relatados como fatores necessários à ativação de folículos primordiais caprinos (bFGF: MATOS et al., 2007b; KL: CELESTINO et al., 2010a) e bovinos (bFGF: TANG et al., 2012). Além disso, gonadotrofinas, como o hormônio folículo estimulante (FSH), promovem a ativação de folículos primordiais, bem como o crescimento dos folículos ativados, uma vez que o FSH parece estar envolvido na proliferação e diferenciação das células da granulosa in
vitro (MATOS et al., 2007a; MAGALHÃES et al., 2009; TANG et al., 2012).
2.1.2 Crescimento de folículos primários e secundários
Após a ativação, os folículos primordiais gradualmente adquirem células da granulosa de formato cúbico, tornando-se folículos de transição. Em seguida, quando todas as células que circundam o oócito tornam-se cúbicas, aumentando em número e volume, os folículos são chamados folículos primários (van den HURK; BEVERS; BECKERS, 1997). Em caprinos, o aparecimento de folículos primários e secundários ocorre aos 71 e 80 dias de gestação, respectivamente (BEZERRA et al., 1998). Os folículos primários possuem diâmetro médio de 34,7 µm e apresentam-se com uma camada completa de células da granulosa. Com a multiplicação destas células, ocorre a formação de várias camadas de células ao redor do oócito formando os folículos secundários, cujo diâmetro médio é de 58,94 µm (LUCCI et al., 1999). Nestas categorias foliculares (folículos primários e secundários), a zona pelúcida (ZP) começa a ser formada circundando o oócito (RANKIN et al., 2001). No entanto, na espécie humana (GOOK et al., 2008) e ovina (MATOS et al., 2004), foram verificadas a presença de proteínas, bem como de pequenas quantidades visíveis de material de ZP
em folículos desde o estágio primordial. Tais resultados sugerem que estas proteínas estão presentes desde o início da foliculogênese.
O crescimento folicular após o estágio de folículo primário é, também caracterizado pelo aparecimento das células da teca recrutadas de seus precursores presentes no tecido circundante do estroma (PARROTT; SKINNER, 2000) além de ser dependente de fatores de crescimento como o fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9). Martins et al. (2008) verificaram que a adição de GDF-9 ao meio de cultivo de folículos pré-antrais caprinos permitiu o desenvolvimento folicular in vitro com aumento no número de folículos secundários. Além disso, outros fatores também são considerados como estimuladores do desenvolvimento folicular como o KL (CELESTINO et al., 2010a) e o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF – YANG; FORTUNE, 2007; BRUNO et al., 2009).
À medida que ocorre o crescimento dos folículos secundários e a organização das células da granulosa em várias camadas, inicia-se a formação do antro folicular, definido como sendo uma cavidade repleta de líquido folicular entre as células da granulosa. A partir deste estágio, os folículos passam a ser denominados terciários ou antrais, os quais aparecem na fase fetal aos 110 dias de gestação (RÜSSE, 1983). Em bovinos, a formação do antro inicia-se em folículos com diâmetro em torno de 130 µm (LUSSIER et al., 1987). Em caprinos, o menor diâmetro observado no folículo terciário de fetos foi de 130 µm (BEZERRA et al., 1998). Contudo, já foram observados diâmetros superiores a 200 µm em folículos secundários em várias espécies, tais como: caprinos (SARAIVA et al., 2010, 2011; CELESTINO et al., 2011; MAGALHÃES et al., 2011; 2012), ovinos (ARUNAKUMARI; SHANMUGASUNDARAM; RAO, 2010; LUZ et al., 2012), bovinos (McLAUGHLIN et al., 2010; McLAUGHLIN; TELFER, 2010; ROSSETTO et al., 2012, 2013) e caninos (SERAFIM et al., 2010, 2012).
2.2 POPULAÇÃO E ATRESIA FOLICULAR
A população folicular preantral já foi estimada em diferentes espécies, sendo de 285.000 em bovinos (SILVA-SANTOS et al., 2011), 33.000 em ovinos (AMORIM et al., 2000), 45.000 em caprinos (LUCCI et al., 1999) e 599.000 em suínos (ALVES et al., 2012) por ovário. Além da variação individual, vários fatores podem afetar o número de folículos presentes no ovário, tais como: a raça (CAHILL; MARIANA; MAULÉON, 1979), a idade (ERICKSON, 1966a; RÜSSE, 1983), os níveis hormonais
(PETERS, 1976), a genética (ERICKSON, 1966b), bem como o status reprodutivo (ERICKSON; REYNOLDS; MURPHREE, 1976) e nutricional do animal (SCARAMUZZI et al., 1993).
Apesar do grande pool de reserva ovariana, é sabido que aproximadamente 99,9% dos folículos são eliminados pelo processo fisiológico conhecido como atresia folicular, tornando o ovário um órgão de baixíssima produtividade. A atresia ocorre por um processo de morte celular programada conhecido por apoptose (TSAFIRI; BRAW, 1984). Em folículos pré-antrais, as primeiras alterações indicativas de atresia ocorrem no oócito, como por exemplo, retração da cromatina nuclear e fragmentação oocitária (MORITA; TILLY, 1999). As alterações nas células da granulosa são raras, uma vez que essas células são mais resistentes à degeneração que os oócitos (SILVA et al., 2002).
Ao longo do desenvolvimento folicular, o folículo adquire a cavidade antral. Neste momento, o oócito torna-se altamente resistente e as primeiras alterações indicativas de atresia são observadas nas células da granulosa pela sensibilidade adquirida ao longo de seu desenvolvimento (SILVA et al., 2002). O destino final dos folículos ovarianos, (i) ovulação ou (ii) atresia, é dependente de um balanço entre diferentes fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos que promovem a sobrevivência e aqueles que induzem a apoptose (HSU; HSUEH, 2000).
Diante disso, pesquisas têm desenvolvido vários modelos in vitro que possibilitam o estudo dos fatores que controlam a atresia e favorecem o desenvolvimento folicular (CELESTINO et al., 2010; MATOS et al., 2007a,b), evitando assim as perdas foliculares que ocorrem naturalmente in vivo.
2.3 NEOFOLICULOGÊNESE
A continuidade da oogênese e foliculogênese no período pós-natal, pela atuação de células-tronco, caracteriza e define o processo de neofoliculogênese (JOHNSON et al., 2004, 2005). Desde a apresentação desse conceito, a neofoliculogênese tem sido, portanto, motivo de muitas discussões na comunidade científica, uma vez que os estudos ainda são escassos e imprecisos.
Até pouco tempo atrás, se acreditava no paradigma de que mulheres e as demais fêmeas (exceto as murinas) perdiam sua capacidade de produzir células germinativas primordiais (CGP) durante o desenvolvimento da vida fetal e nasciam com um número
finito de oócitos inclusos em folículos, dos quais apenas um pequeno número iria ovular após a puberdade (WOODRUFF, 2008). Esse conceito foi considerado uma premissa básica da fisiologia da reprodução por mais de 150 anos (BYSKOV et al., 2005). Entretanto, estudos recentes, da equipe do Dr. Jonathan Tilly da Universidade de Harvard nos Estados Unidos, apresentaram evidências de que uma fêmea teria a capacidade de produzir novos folículos durante a vida adulta a partir de células-tronco de linhagem germinativa extra e intraovariana (JOHNSON et al., 2004, 2005). A equipe do Dr. Tilly então postulou que, pelo menos em camundongos, a morte folicular ocorre rapidamente e que a fertilidade normal de um indivíduo adulto não poderia ser mantida se dependesse exclusivamente do pool de folículos presentes no ovário ao nascimento. Resultados semelhantes foram observados em humanos quando células do epitélio germinativo ovariano foram cultivadas e permitiram o desenvolvimento de células da granulosa e oócitos (BUKOVSKY; SVETLIKOVA; CAUDLE, 2005). Recentes achados ainda propuseram que na medula óssea, há células semelhantes às células-tronco embrionárias originárias do epiblasto, as quais podem persistir também durante a vida adulta para regenerar tecidos e órgãos (SHIN et al., 2010).
Tendo em vista que a definição clássica das células-tronco é a de que estas células perpetuadamente se renovam e geram progênies diferenciadas, sua presença no ovário levaria a formação de novos oócitos. Sendo assim, se a população folicular está sendo reestabelecida continuamente durante a vida adulta, como sugerido anteriormente, as células-tronco germinativas deveriam progressivamente perder sua habilidade de se multiplicar para permitir o declínio da fertilidade (BYSKOV et al., 2005). Neste contexto, outros estudos foram realizados e, de fato, não encontraram evidências de que células progenitoras de origem extragonadal poderiam renovar as células foliculares no ovário adulto (KERR et al., 2006; BEGUM; PAPAIOANNOU; GOSDEN, 2008).
Na tentativa de entender o comportamento das CGP no ovário, algumas citocinas e fatores de crescimento pleiotrópicos tais como as BMPs (LAWSON et al., 1999; YING et al., 2000), o Chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12), o KL (MOLYNEAUX; WYLIE, 2004; KUNWAR; SIEKHAUS; LEHMANN, 2006) e o Oct4 ou POU5F1 (PANGAS; RAJKOVIC, 2006) têm sido estudados. Tais moléculas foram, portanto, consideradas como importantes para controlar o processo de formação dos folículos primordiais durante a colonização da gônada pelas CGP. A ausência das BMP-4 (LAWSON et al., 1999) e BMP-8 (YING et al., 2000), em embriões de
camundongas, por exemplo, promoveu falha no desenvolvimento das CGP sugerindo que as BMPs podem de alguma maneira estar envolvidas na formação e no desenvolvimento dos folículos primordiais. Além disso, a ausência de Oct4 em CGP provocou apoptose prematura dessas células antes da colonização da gônada (KEHLER et al., 2004). Neste contexto, o estudo da foliculogênese pré-antral abre oportunidadades de esclarecer os mecanismos envolvidos na formação dos folículos primordiais.
2.4 BIOTÉCNICA DE MOIFOPA (Ovário Artificial)
A biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) também conhecida como ―ovário artificial‖, é uma biotécnica da reprodução que vem sendo aprimorada nos últimos anos e consiste numa das principais ferramentas utilizadas atualmente para a elucidação da foliculogênese inicial. Tal biotécnica possibilita a padronização de populações de oócitos para utilização em outras biotécnicas como a produção in vitro de embriões (PIV), a transgênese e a clonagem. A MOIFOPA tem como principal objetivo resgatar oócitos oriundos de folículos pré-antrais, a partir do ambiente ovariano, e posteriormente cultivá-los in vitro até sua completa maturação, prevenindo-os da atresia. Para alcançar esse objetivo, diversos estudos têm sido realizados com o intuito de desenvolver um sistema de cultivo in vitro ideal para cada etapa do desenvolvimento folicular (FIGUEIREDO et al., 2008).
2.5 ESTADO ATUAL DO CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
Notável progresso tem sido observado no cultivo in vitro de folículos pré-antrais em diferentes espécies animais. Nas espécies bovina (GUTIERREZ et al., 2000; McLAUGHLIN; TELFER 2010; ROSSETTO et al., 2012, 2013) e humana (ROY; TREACY, 1993; TELFER et al., 2008), folículos pré-antrais isolados foram cultivados
in vitro e se desenvolveram até o estágio antral. Em suínos (WU et al., 2001), bubalinos
(GUPTA et al., 2008) e mais recentemente em caprinos (SARAIVA et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2011), ovinos (ARUNAKUMARI et al., 2010; LUZ et al., 2012) e primatas não-humanos (XU et al., 2011), folículos secundários crescidos in vitro tiveram seus oócitos fecundados in vitro, com posterior desenvolvimento embrionário. Contudo, os resultados mais satisfatórios até o presente momento foram observados em
animais de laboratório. Eppig; Schroeder (1989) obtiveram o primeiro nascimento a partir de folículos primordiais crescidos, maturados e fecundados in vitro. Anos mais tarde, essa mesma equipe, utilizando um protocolo revisado e melhorado, conseguiu aumentar o número de crias nascidas vivas (O’BRIEN et al., 2003). Carroll et al. (1990) também obtiveram o nascimento de camundongos após congelação e descongelação, crescimento, maturação e fecundação in vitro de oócitos oriundos de folículos primários. Apesar desses resultados, o rendimento referente à produção de oócitos maturos a partir de folículos pré-antrais ainda é extremamente baixo e variável devido à inadequação dos meios de cultivo disponíveis.
Diversos fatores podem afetar a eficiência do cultivo in vitro de folículos pré-antrais. Dentre eles pode-se destacar a espécie animal, pH, temperatura, tensão de oxigênio, tipo de sistema de cultivo (bi ou tridimensional) e composição do meio, sendo esses dois últimos, objetos de estudo da presente tese.
2.6 SISTEMAS DE CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
Basicamente, o cultivo de folículos pré-antrais pode ser realizado utilizando fragmentos do córtex ovariano (in situ) ou estruturas foliculares na forma isolada. O cultivo in situ tem como vantagens proporcionar a manutenção da integridade tridimensional dos folículos e os mantém interagindo com as células do estroma, assemelhando-se às condições in vivo. Melhor perfusão do meio e ainda, o monitoramento individual dos folículos são as principais vantagens do cultivo de folículos isolados, o qual é atualmente o mais utilizado (FIGUEIREDO et al., 2008).
O cultivo de folículos isolados permite o crescimento e desenvolvimento de oócitos imaturos e favorece a elucidação dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento oocitário, na diferenciação das células da granulosa e na regulação dos fatores autócrinos/parácrinos que controlam a foliculogênese (THOMAS et al., 2003). Esses folículos podem ser cultivados de maneira bidimensional (2D) ou tridimensional (3D). No sistema 2D, os folículos são cultivados diretamente sobre uma superfície plástica ou mesmo sobre uma matriz extracelular. Vários estudos tem utilizado esse sistema com grande sucesso, inclusive com a obtenção de embriões produzidos a partir de folículos pré-antrais crescidos in vitro (GUPTA et al., 2008; ARUNAKUMARI; SHANMUGASUNDARAM; RAO, 2010; SARAIVA et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2011; LUZ et al., 2012). Já no sistema 3D, os folículos são cultivados
completamente inclusos em uma matriz extracelular (XU et al., 2010, 2011), ou mesmo na ausência de matriz (WYCHERLEY et al., 2004; NATION; SELWOOD, 2009; WANG et al, 2012). O princípio do cultivo 3D é o de que os folículos são cultivados de maneira que não haja contato e, consequentemente, aderência da estrutura folicular a superfície de cultivo. Esse sistema, portanto, permite a manutenção da estrutura folicular sem deformações durante o cultivo in vitro. Maiores detalhes serão abordados na revisão de literatura apresentada no Capítulo 1, a qual descreverá mais especificamente sobre os sistemas de cultivo de folículos pré-antrais.
2.7 IMPORTÂNCIA DA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTIVO DE BASE
Diversos meios de cultivo vêm sendo utilizados para o cultivo de células ovarianas. Dentre esses meios podemos destacar o meio essencial mínimo (MEM) e suas modificações (α-MEM, MEM Glutamax, etc.), o meio de cultivo de tecido (TCM-199), além de outros meios como o McCoy’s, Waymouth, Leibowitz e Menezo B2. Cada meio de cultivo difere em sua composição de sais, vitaminas, minerais e principalmente, nas concentrações de aminoácidos, ribonucleosídeos e desoxiribonucleosídeos. De uma maneira geral, os meios de cultivo são utilizados de acordo com as espécies estudadas ou mesmo, de acordo com a equipe de pesquisadores. Contudo, o principal objetivo desses meios é o de manter a sobrevivência das células em cultivo, bem como promover e/ou melhorar o desenvolvimento celular. O meio MEM, por exemplo, tem sido utilizado com sucesso para as espécies caprina (MATOS et al., 2007a,b; BRUNO et al., 2009; ARAÚJO et al., 2010a; SARAIVA et al., 2010, 2011; MAGALHÃES et al., 2011, 2012), bovina (FIGUEIREDO et al., 1994a; ROSSETTO et al., 2012, 2013), canina (SERAFIM et al., 2010, 2012), murina (JIN et al., 2010; JEE et al., 2012), bem como em primatas não-humanos (XU et al., 2010, 2011). Outro meio amplamente utilizado tem sido o TCM-199, que além do cultivo de folículos ovarianos (KATSKA; RYNSKA, 1998; ITOH; HOSHI, 2000; SAHA et al., 2000, 2002; ROSSETTO et al., 2012), tem sido utilizado para estudos de maturação e fertilização em diferentes espécies (ARLOTTO et al., 1996; ALM et al., 2006; ABEDELAHI et al., 2010; ANTOSIK et al., 2010). Além dos meios de cultivo de base, outras substâncias como fatores de crescimento e/ou hormônios vêm sendo testados no cultivo folicular in vitro. Tendo em vista a necessidade da definição de um meio padrão para a espécie bovina, por exemplo, dois meios de cultivo de base (αMEM e TCM-199)
