PROTEÍNA MORFOGENÉTICA ÓSSEA-6 (BMP-6)

As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são membros da superfamília do fator de crescimento transformante-β (TGF-β). Originalmente as BMPs foram associadas a suas habilidade de formar tecido ósseos e cartilagens. Dentre as várias BMPs descritas até o momento, as BMP-2 (ZHU et al., 2013), BMP-4 (LAWSON et al., 1999; GLISTER; KEMP; KNIGHT, 2004; JUENGEL et al., 2006; ZHU et al., 2013), BMP-6 (OTSUKA et al., 2001a; GLISTER; KEMP; KNIGHT, 2004; JUENGEL et al., 2006; ZHU et al., 2013), BMP-7 (GLISTER; KEMP; KNIGHT, 2004; JUENGEL et al., 2006; ARAÚJO et al., 2010a; ZHU et al., 2013), BMP-8 (YING et al., 2000) e BMP-15 (OTSUKA et al., 2001b) têm sido relacionadas com funções na foliculogênese e ovulação. Como objeto dessa tese, mais detalhes serão abordados em relação à BMP-6. O RNAm que codifica a BMP-6 foi identificado em ovários de várias espécies mamíferas (SHIMASAKI et al., 1999; SHIMIZU et al., 2004). Foram detectadas proteínas e/ou RNAm da BMP-6 em ovários de ratas (OTSUKA et al., 2001a; ERICKSON; SHIMASAKI, 2003) e porcas (SHIMIZU et al., 2004; BRANKIN et al.; 2005a). A BMP-6 é uma proteína expressa no oócito (ovelha: JUENGEL et al., 2006; camundongo: ELVIN et al. 2000; rata: OTSUKA et al., 2001a; vaca: GLISTER; KEMP; KNIGHT, 2004; porca: BRANKIN et al., 2005a), células da granulosa (rata: ERICKSON; SHIMASAKI, 2003; vaca: GLISTER; KEMP; KNIGHT, 2004 e porca: BRANKIN et al., 2005a) e células da teca (ovelha: CAMPBELL et al., 2004; vaca: GLISTER; KEMP; KNIGHT, 2004) de folículos em diferentes estágios de desenvolvimento. A expressão da proteína da BMP-6 foi demonstrada no líquido

folicular de grandes folículos suínos (BRANKIN et al., 2005a). Recentemente, o RNAm para a BMP-6 foi verificado em folículos secundários avançados e antrais iniciais caprinos antes e após o cultivo in vitro (FROTA et al., 2011; COSTA et al., 2012). Além disso, a imunomarcação da BMP-6 foi observada em oócitos caprinos de todas as categorias foliculares (primordial, primário, secundário, pequenos e grandes folículos antrais), enquanto que em células da granulosa a marcação foi observada apenas a partir do estágio primário (FROTA et al., 2011).

As BMPs interagem com duas classes de receptores transmembranários do tipo serina-treonina quinase, receptores de BMP tipo I e tipo II. Nos mamíferos, três receptores tipo I (BMPR-IA/Alk3, BMPR-IB/Alk6 e ActR-I/Alk2) e três receptores do tipo II (BMPR-II, ActR-IIA, e ActR-IIB) foram identificados (KNIGHT; GLISTER, 2003). Estudos verificaram que o RNAm para os receptores da BMP-6 (BMPR-IA, -IB e II) são expressos nos oócitos e nas células da granulosa de folículos caprinos (SILVA et al., 2004; COSTA et al., 2012) e de várias outras espécies mamíferas: camundongo (ELVIN et al., 2000), rata (SHIMASAKI et al., 1999; ERICKSON; SHIMASAKI, 2003), ovelha (SOUZA et al., 2002) e vaca (GLISTER; KNIGHT, 2002). Na superfície do epitélio ovariano de ovelhas (WILSON et al., 2001; SOUZA et al., 2002), a expressão da proteína para estes receptores é observada apenas nas células da granulosa. Além disso, em vacas foi detectada a expressão de RNAm do BMPR-IA, BMPR-IB, ActR-I, ActR-IIB e BMPR-II em todos os compartimentos de folículos antrais, enquanto que a proteína BMPR-II foi encontrada somente nos oócitos destes folículos (FATEHI et al., 2005). A expressão da proteína dos receptores de BMP (BMPR-IA, BMPR-IB e BMPR-II) foi demonstrada em células da granulosa, células da teca e oócitos suínos (QUINN et al., 2004), indicando possíveis efeitos autócrinos e/ou parácrinos.

Para a atuação das BMPs, os receptores de BMP fosforilam proteínas sinalizadoras intracelulares chamadas Smads, as quais convertem o sinal para o núcleo modificando a expressão gênica. As Smads constituem três subfamílias: Smads receptoras (R-Smads: Smad-1, Smad-5 e Smad-8); Smad mediadora comum (Co-Smad:

Smad4); e Smads inibidoras (I-Smads: Smad-6 e Smad-7). A via Smad é regulada pelo

co-mediador Smad-4 e pelas Smads inibidoras (Smad-6 e Smad-7; ten DIJKE; HILL, 2004), sendo as BMPs ativadoras das Smad-1, Smad-5 e Smad-8 (MIYAZAWA et al., 2002). As R-Smads são fosforiladas pelo BMPR-I, enquanto que as I-Smads exercem um feedback negativo, uma vez que competem com as R-Smads pelas interações com os

receptores levando-os à degradação (MOUSTAKAS et al., 2001). As R-Smads que forem fosforiladas interagem com a Smad-4 e são translocados ao núcleo para ativar a maquinaria transcricional e modular a transcrição dos genes de BMP (WANG et al. 2010). Desta forma, a formação do complexo BMP, receptores e Smads regulará vários processos biológicos (COSTELLO et al. 2009), determinando os possíveis efeitos autócrinos e parácrinos da BMP-6 durante o crescimento folicular. Recentemente, Costa et al. (2012) verificaram a expressão do RNAm para as Smad-1, Smad-5 e Smad-8 em folículos pré-antrais e antrais caprinos. Em vacas, a expressão da proteína para Smad-1 foi verificada em folículos antrais e sua expressão foi ativada pela BMP-6 em células da granulosa cultivadas in vitro (GLISTER; KEMP; KNIGHT, 2004). Além disso, a BMP- 6 induziu a fosforilação das Smad-1 e Smad-5, mas não da Smad-8 em osteoblastos (EBISAWA et al. 1999; AOKI et al. 2001).

Modelos knockout, têm sido utilizados para investigar os efeitos in vivo e in vitro das BMPs e Smads no ovário. A ausência da Smad-4 no ovário impediu o desenvolvimento de folículos antrais (PANGAS et al., 2006), aumentou a apoptose folicular (PANGAS et al., 2006) e celular (WANG et al., 2010), além de ter inibido a proliferação e a esteroidogênese das células da granulosa (WANG et al., 2010). Ratas

knockout para o gene da BMP-6 parecem normais no que diz respeito à fertilidade e

tamanho da ninhada, sugerindo que esta proteína pode não ser essencial para a fertilidade de murinos (SOLLOWAY et al., 1998). Ao contrário da BMP-15, a BMP-6 não estimula a proliferação de células da granulosa (ratas: OTSUKA et al., 2001a,b; ovelhas: JUENGEL et al., 2006), além de inibir sua diferenciação (ovelhas: JUENGEL et al., 2006). Entretanto, em bovinos, GLISTER; KEMP; KNIGHT (2004) verificaram um pequeno, porém significativo, aumento no número de células da granulosa viáveis após cultivo in vitro em meio adicionado de BMP-6. Além disso, esta proteína foi demonstrada também ser importante na proliferação de células da granulosa (BRANKIN et al., 2005a) e células da teca em suínos (BRANKIN et al., 2005b). Em caprinos, o cultivo de folículos secundários por seis dias com adição de BMP-6, promoveu aumento no diâmetro folicular e no percentual de folículos antrais após cultivo in vitro (FROTA et al., 2011). Neste contexto, as diferentes respostas celulares às BMPs podem ser devido a múltiplos fatores, incluindo o estágio de maturação ou número de células da granulosa dos folículos, às diferenças nas composições dos meios e os períodos de cultivo, ou ainda a adição de outros hormônios e/ou fatores de crescimento. Tendo em vista essas difereças entre as categorias foliculares, dois dos

capítulos da presente tese objetivaram verificar os efeitos da BMP-6 sobre o cultivo de duas categorias foliculares diferentes, folículos primordiais (Capítulo 5) e folículos secundários avançados (Capítulo 6).