TÉCNICAS PARA AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO CULTIVO IN VITRO

O monitoramento da eficiência do cultivo in vitro de folículos ovarianos pré- antrais pode ser realizado através da avaliação da ativação folicular, mudanças morfológicas no oócito e nas células somáticas foliculares durante o crescimento in

vitro, surgimento da cavidade antral, além da produção de hormônios e esteroides pelos

folículos durante o cultivo in vitro. Cada um desses parâmetros necessita de uma técnica específica para sua avaliação. Dentre as principais técnicas utilizadas para avaliar os sistemas de cultivo in vitro destacam-se: a análise histológica e ultraestrutural (MATOS et al., 2006; 2007a,b; MAGALHÃES et al., 2009; ARAÚJO et al., 2010a), expressão gênica através dos níveis de RNAm (HAYASHI et al., 1999; CELESTINO et al., 2010, 2011) e a dosagem hormonal para mensuração, por exemplo, dos níveis de estradiol (KOBAYASHI et al., 2000; SILVA et al., 2013).

2.13.1 Histologia clássica

A microscopia de luz tem sido utilizada para avaliar o crescimento folicular e a qualidade das células em diferentes espécies (caprino: MATOS et al., 2007a,b; MAGALHÃES et al., 2009; ARAÚJO et al., 2010a; bovino: AERTS; OSTE; BOLS, 2005; AERTS et al., 2008; CELESTINO et al., 2008; equino: HAAG et al., 2013a,b,c; humano: ABIR et al., 2010). Os processos de ativação folicular e as mudanças

morfológicas nos oócitos e nas células da granulosa e da teca durante o crescimento folicular podem ser avaliadas usando técnicas histológicas. Além disso, as alterações pelo processo de degeneração do folículo, como retração citoplasmática do oócito, presença ou ausência de corpos picnóticos nucleares, desorganização das células da granulosa e baixa densidade celular também podem ser avaliadas sob microscopia de luz.

2.13.2 Microscopia eletrônica de transmissão

De maneira geral, as análises utilizando microscopia eletrônica de transmissão são realizadas após avaliação sob microscopia de luz. A microscopia eletrônica é utilizada de maneira qualitativa, observando detalhes como o formato e as dimensões do núcleo, a dispersão da cromatina nuclear, presença de citoplasma intacto, qualidade das organelas, vacuolização citoplasmática, preservação do contato entre as células da granulosa e o oócito, bem como a aparência das células do estroma (OSKAM et al., 2010).

Folículos pré-antrais de várias espécies têm sido avaliados com sucesso utilizando o microscópio eletrônico de transmissão, sendo observados tanto folículos apresentando ultraestrutura normal (FAIR et al., 1997; van den HURK et al., 1998; MATOS et al., 2007a; CELESTINO et al., 2008; ARAÚJO et al., 2010a), como aqueles com ultraestrutura alterada (SILVA et al., 2002; MATOS et al., 2006). Folículos pré- antrais normais apresentam um oócito com núcleo bem delimitado, mitocôndrias arredondadas com cristas irregulares, membrana mitocrondrial contínua e mitocôndrias alongadas com cristas paralelas (CELESTINO et al., 2008), bem como gotas lipídicas e ambos retículo endoplasmático liso e rugoso e material de ZP (FAIR et al., 1997).

2.13.3. Microscopia de fluorescência e microscopia confocal

Em geral, a viabilidade celular é avaliada pelas diferentes marcações de células viáveis e não-viáveis, e a determinação dos percentuais de viabilidade celular pela microscopia de fluorescência, a qual é mais sensível que a microscopia de luz. Folículos de diferentes espécies vêm sendo avaliados com sucesso utilizando esta técnica (THOMAS et al., 2001; AERTS et al., 2008; BRUNO et al., 2009). Para a marcação, células viáveis necessitam apresentar membrana intacta, enquanto que células não-

viáveis apresentam integridade da membrana comprometida. Dentre os vários marcadores disponíveis para avaliação da viabilidade celular, a Calceína-AM e o Etídeo homodímero-1 são os mais comumente utilizados. Além dos marcadores fluorescentes, utilizando o microscópio confocal a laser, a detecção de outros aspectos do desenvolvimento folicular in vitro também podem ser avaliados, tais como: a produção das proteínas da ZP, a dinâmica das junções gap, a atividade mitocondrial, a detecção do núcleo das células da granulosa em proliferação (SCHOTANUS et al., 1997), bem como a distribuição de filamentos de actina e da proteína conexina (McLAUGHLIN et al., 2010).

2.13.4. Análise de esteroides

Os folículos ovarianos são responsáveis principalmente por permitir a liberação de oócitos e a produção de esteroides e hormônios proteicos (CORTVRINDT; SMITZ, 2002). Cada estágio do desenvolvimento folicular exibe um padrão único de sensibilidade às gonadotrofinas, produção de esteroides e vias de feedback hormonal (RICHARDS, 2001). Além disso, cada categoria folicular passa por mudanças estruturais, nas quais diferentes células foliculares adquirem a maquinaria intracelular requerida para sintetizar e secretar esteroides e hormônios proteicos, e expressar receptores estágio-específicos para responder a estímulos endócrinos (CORTVRINDT; SMITZ, 2002).

Quando os folículos crescem in vitro, alguns indicadores da saúde folicular são requeridos. Portanto, o meio de cultivo pode ser monitorado e quaisquer fatores secretados que possa indicar a saúde do folículo e do oócito podem ser facilmente mensurados (TELFER et al., 2000). Hormônios esteróides, tais como a progesterona, androstenediona e o estradiol podem ser mensurados em meio de descarte, ou seja, meios retirados durante as trocas, podendo então, serem avaliados utilizando radioimunoensaio ou ensaio imunoenzimático (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA). Entretanto, dependendo do estágio folicular, os níveis de esteroides podem não ser detectados, ou mesmo serem alterados (WANDJI et al., 1996a). A ausência de uma camada de células da teca completamente definida em folículos pré-antrais durante o cultivo in vitro, contribui para a inabilidade (bovinos: WANDJI et al., 1996a) ou pouca habilidade (murinos: KOBAYASHI et al., 2000) de se detectar níveis mensuráveis de androstenediona. Além disso, a inibina e o estradiol foram significativamente reduzidos

quando folículos pré-antrais murinos foram cultivados sem células da teca (KOBAYASHI et al., 2000). A habilidade de folículos pré-antrais aumentarem os níveis de estradiol e progesterona indicam o desenvolvimento folicular e a diferenciação das células da granulosa. A conversão de testosterona exógena à estradiol sob estímulo do FSH induziu a atividade da enzima P450aromatese em folículos pré-antrais cultivados

in vitro (WANDJI et al., 1996a).

2.13.5. Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real)

A localização de proteínas, RNAm e seus receptores auxilia a compreensão do papel de cada hormônio e fator de crescimento em cada fase do desenvolvimento folicular, uma vez que além da localização, esta técnica possibilita quantificar cada uma das substâncias produzidas no ovário. Muitas atuações das células foliculares ovarianas relacionadas à sobrevivência, ao crescimento e à diferenciação, são refletidas na alteração dos padrões da expressão gênica. Desta forma, a capacidade de quantificar os níveis de transcrição de genes específicos é fundamental para qualquer investigação das funções foliculares (ZAMORANO et al. 1996). Após a extração do RNAm, a partir de folículos ovarianos, e da sua conversão em um DNA complementar (DNAc), a PCR realiza a síntese de milhões de cópias deste DNAc na presença da enzima DNA polimerase, caracterizando o princípio fundamental da técnica que é a amplificação do DNA. A reação de PCR em tempo real, uma variante da PCR convencional, permite uma análise precisa da quantificação da expressão gênica em determinado tecido ou amostra biológica. Esse método utiliza um sistema fluorescente em plataforma, capaz de detectar a luz oriunda da reação de amplificação de um determinado gene no momento real da amplificação (BUSTIN, 2002).

Vários estudos demonstraram que a PCR é uma ferramenta adequada para o estudo mais detalhado do complexo e misterioso processo da foliculogênese. Os RNAm para receptores e ligantes para várias substâncias já foram observados em folículos pré- antrais de várias espécies como caprinos, bovinos, ovinos, suínos, murinos e humanos. Alguns hormônios e fatores de crescimento já tiveram o RNAm para o ligante e seus receptores detectados em folículos pré-antrais, tais como: BMP-6 (caprino: FROTA et al 2011; COSTA et al., 2012) e BMPRs (caprino: SILVA et al., 2004; COSTA et al., 2012), FSHR (caprino: SARAIVA et al., 2011; FROTA et al., 2011; BRITO et al., 2012; humano; OKTAY; BRIGGS; GOSDEN, 1997), VEGF e VEGFRs (bovino:

YANG; FORTUNE, 2007; humano: ABIR et al., 2010); e IGF-1 e IGFR-1 (caprino: BRITO et al., 2012; MAGALHÃES et al., 2012).

3 JUSTIFICATIVA

Como visto anteriormente, os folículos pré-antrais representam a quase totalidade da população folicular ovariana, cerca de 90%, entretanto, a grande maioria (99,9%) dos folículos não chegam à fase ovulatória, sendo eliminados por atresia. Neste contexto, a biotécnica de MOIFOPA visa resgatá-los do ovário antes que se tornem atrésicos e cultivá-los in vitro até sua completa maturação. Os oócitos oriundos destes folículos crescidos in vitro representam uma população homogênea de um mesmo animal e poderiam ser utilizados em programas de produção in vitro e transferência de embriões e/ou criopreservação. Além disso, o desenvolvimento de um sistema de cultivo eficiente poderá fornecer subsídios para uma melhor compreensão sobre os fatores que regulam o crescimento e a maturação folicular.

No que se refere a espécie caprina, a maturação de oócitos oriundos de folículos pré-antrais crescidos in vitro ainda é considerada um fator limitante para o sucesso da biotécnica de MOIFOPA. Além disso, na espécie bovina, os resultados ainda são inconsistentes em relação aos meios de base utilizados, limitado apenas à produção de folículos antrais após cultivo in vitro. Portanto, o desafio atual dos pesquisadores em todo mundo, e que justifica a elaboração da presente tese, tem sido a definição de um meio de cultivo de base e do regime de troca de meio mais eficientes, bem como o desenvolvimento de um sistema de cultivo que permita a manutenção da viabilidade, a ativação, o crescimento e a completa maturação folicular, otimizando o aproveitamento do potencial oocitário dos animais e incrementando a eficiência da reprodução animal.

Desta forma, além da determinação de um meio de cultivo de base para a manutenção da viabilidade e promoção do crescimento de folículos secundários bovinos isolados, outro aspecto considerado importante foi o conhecimento acerca dos efeitos dos fatores de crescimento (exemplos: VEGF, BMP-6 e IGF-1) e/ou hormônios (exemplos: FSH e GH) sobre o cultivo in vitro dos folículos pré-antrais bovinos e/ou caprinos. Esses estudos foram extremamente necessários para que estratégias de cultivo pudessem ser desenvolvidas e buscassem otimizar o crescimento e a maturação folicular

in vitro. No tocante as substâncias adicionadas aos meios de cultivo, tornou-se

necessária a determinação das melhores concentrações da BMP-6 em um cultivo in situ de curta duração, para posteriormente utilizá-las em um cultivo de longa duração de folículos secundários caprinos isolados. Adicionalmente, o VEGF foi utilizado com o objetivo principal de melhorar as taxas de maturação dos oócitos oriundos de folículos

pré-antrais caprinos crescidos in vitro. Tendo em vista os resultados limitados apresentados anteriormente para a espécie bovina, e na tentativa de melhorá-los, os fatores de crescimento VEGF e IGF-1, bem como o hormônio GH, foram utilizados baseados nos melhores resultados presentes na literatura para a espécie caprina.

Para melhor avaliar a eficiência dos sistemas de cultivo empregados no presente estudo, além da histologia clássica, foi utilizada a microscopia eletrônica de transmissão e/ou de fluorescência, bem como a análise dos níveis de estradiol (ELISA) para determinar a qualidade de folículos pré-antrais caprinos e/ou bovinos cultivados in

vitro. Na tentativa de melhor desvendar a foliculogênese caprina e bovina, foi ainda

realizado um estudo de quantificação da expressão gênica do RNAm para os BMPR- 1A, BMPR-2, Smad-1, Smad-3, Smad-4, Smad-5, Smad-6, Smad-7, Smad-8 sob a influência de BMP-6 em folículos secundários caprinos, bem como o RNAm para o VEGF, IGF-1, P450aromatase, FSHR sob a influência de diferentes meios de cultivo de base e protocolos para troca de meio em folículos secundários bovinos por meio da técnica de transcrição reversa da PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR).