UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação
VANESSA PEREIRA GOMES
FABRICAÇÃO DE MATRIZES DE MICROELETRODOS SEMITRANSPARENTES ATRAVÉS DE ESCRITA DIRETA A LASER
CAMPINAS 2019
VANESSA PEREIRA GOMES
FABRICAÇÃO DE MATRIZES DE MICROELETRODOS SEMITRANSPARENTES ATRAVÉS DE ESCRITA DIRETA A LASER
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia Elé-trica e de Computação da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Engenharia Elé-trica, na área de ELETRÔNICA, MICROELETRÔ-NICA E OPTOELETRÔMICROELETRÔ-NICA.
Supervisor/Orientador: PROF. DR. JACOBUS WILLIBRORDUS SWART Co-supervisor/Coorientador: PROF. DR. ROBERTO RICARDO PANEPUCCI Este trabalho corresponde à versão final da tese
de-fendida pelo aluno Vanessa Pereira Gomes, orientada pelo(a) Prof(a). Dr. Jacobus Willibrordus Swart e coo-rientada pelo Prof. Dr Roberto Ricardo Panepucci.
Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2019
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura
Luciana Pietrosanto Milla - CRB 8/8129
Gomes, Vanessa Pereira, 1989-
G585f Fabricação de matrizes de microeletrodos semitransparentes através de escrita direta a laser/ Vanessa Pereira Gomes. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
Orientador: Jacobus Willibrordus Swart. Coorientador: Roberto Ricardo Panepucci.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação.
1. Microeletrodos. 2. Grafeno. 3. Neurônios. I. Stwart, Jacobus
Willibrordus, 1950-. II. Panepucci, Roberto Ricardo. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação. IV. Título. Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Fabrication of semitransparent microelectrode arrays through laser direct writing
Palavras-chave em inglês: Microelectrodes
Graphene Neurons
Área de concentração: Eletrônica, Microeletrônica e Optoeletrônica Titulação: Doutora em Engenharia Elétrica
Banca examinadora:
Jacobus Willibrordus Swart [Orientador] José Alexandre Diniz
André Schwambach Vieira Alcimar Barbosa Soares
Eduardo Lázaro Martins Naves Data de defesa: 11-10-2019
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Elétrica
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-9389-1575 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/1155717212022374
COMISSÃO JULGADORA – TESE DE DOUTORADO
Candidato(a): Vanessa Pereira Gomes RA: 151550 Data da defesa: 11 de Outubrode 2019
Título da Tese: “Fabricação de matrizes de microeletrodos semitransparentes através de escrita direta a laser”
Profa. Dr. Jacobus Willibrordus Swart(Presidente) Profa. Dr. José Alexandre Diniz
Profa. Dr. André Schwambach Vieira Profa. Dr. Alcimar Barbosa Soares
Profa. Dr Eduardo Lázaro Martins Naves
A Ata de Defesa, com as respectivas assinaturas dos membros da Comissão Julgadora, encontra-se no SIGA (Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese) e na Secretaria de Pós-Graduação da Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação.
Dedico estre trabalho à minha mãe Josiane, ao meu pai Gilberto, e à minha irmã Marcella, pelo estímulo, carinho e confiança, e minha querida avó Delma, pelo amor e por ser uma inspiração sempre.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer à:
minha família, pela paciência e compreensão;
meus amigos, pela amizade e paciência durante a realização deste projeto;
meu orientador, prof. Dr. Jacobus Willibrordus Swart, pela confiança no meu trabalho, ensina-mentos e orientação;
meu co-orientador Dr. Roberto Ricardo Panepucci, pela paciência e disposição em sanar minhas muitas dúvidas;
Dr. Angelica Denardi de Barros, por me auxiliar desde o mestrado e por toda a paciência desde o início;
prof. Dr. João Batista Destro Filho, da Universidade Federal de Uberlândia, por sempre ter confi-ado no meu trabalho, pelo auxílio e dedicação desde a época que comecei a participar do grupo de neurociências, na iniciação científica;
prof. Dr. José Alexandre Diniz pelo suporte durante todo o desenvolvimento do projeto;
funcionários do laboratório do CCS, na Unicamp, que contribuíram direta ou indiretamente para que fosse possível atingir os objetivos propostos. Especial, Frederico Cioldin por colaborar na fa-bricação das matrizes, depositando filmes de nitreto de titânio, e Luana C. J. Espindola, pelo au-xílio em todo o processo de fabricação;
Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação (FEEC/UNICAMP), Departamento de Semicon-dutores, Instrumentos e Fotônica (DSIF/UNICAMP), Centro de Componentes Semicondutores (CCS/UNICAMP) por possibilitar a realização deste trabalho;
Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer, por todo o suporte.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
RESUMO
Este projeto de doutorado visa a produção de uma nova versão de Matrizes de Microeletrodos (MEAs) de alto desempenho, produzidas de forma customizada e empregadas para estudos de redes neurais in vitro. Tais dispositivos são compostos por eletrodos de grafeno (crescido por Deposição em Fase Vapor sobre folha de cobre e transferido ao substrato), e isolação de dióxido de silício, sobre substrato de vidro, geradas sem a utilização de máscaras, através da técnica de escrita direta a laser. Como resultado, duas gerações de MEAs foram fabricadas e caracterizadas, exibindo especificações elétricas e biológicas apropriadas para sua aplicação. Verificou-se que a resposta referente às MEAs discutidas nesta tese apresentou significativas melhorias quando comparada com àquelas presentes em estudos encontrados na literatura, principalmente com relação à carga que nossos microeletrodos são capazes de armazenar e aplicar na cultura celular durante pulsos estimulatórios. O nível de ruído foi inferior à 10 µV em ambos os dispositivos, enquanto a Capacidade de Injeção de Carga, que é calculada a partir da curva de Voltametria Cíclica, foi muito superior tanto quando comparada com MEAs comerciais (0,054 mC/cm²) como com MEAs com microeletrodos padrões de nitreto de titânio (TiN) produzidas durante o projeto de mestrado (0,63 mC/cm²). Para os nossos dispositivos, os valores médios foram de 0,67 ± 0,009 mC/cm² e 19,7 ± 0,025 mC/cm². Adicionalmente, o segundo dispositivo produzido também é significativamente superior também quando confrontado com os dados divulgados na literatura, cujo melhor resultado foi 3,1 mC/cm². Com relação à Espectroscopia de impedância, a resposta verificada para as nossas MEAs de grafeno também foi superior. O valor médio da impe-dância para a frequência de 1 kHz foi de 28,65 ± 3,98 kΩ e 73,95 ± 3,84 kΩ, para as versões 1 e 2, respectivamente, que são valores compatíveis com os apresentados por MEAs comerciais padrão da MultiChannel Systems (30-400 kΩ), além de ser melhor que aquele obtido para MEAs produ-zidas durante o projeto de mestrado, cujo valor foi 141,60 ± 5,27 kΩ. Por fim, o teste de biocom-patibilidade mostrou que a MEA produzida é adequada para realizar medidas de potenciais celu-lares, não induzindo efeitos tóxicos sobre as células. Consequentemente, nós conseguiumos fa-bricar um novo modelo de MEA com microeletrodos transparentes, com grande CIC e baixa im-pedância e ruído de grafeno com resposta altamente superior àquela encontrada para as MEAs
comerciais e divulgadas na literatura. Com isso, trata-se de um dispositivo adequado para atuar como interface bioeletrônica no estudo de redes neurais tanto para estimulação quanto para me-dição dos potenciais elétricos (espontâneos ou induzidos) das mesmas.
ABSTRACT
This PhD project aims to produce a new version of high performance, custom made Microelectrode Arrays (MEAs), applied for in vitro neural network studies. Such devices are composed of graphene electrodes (grown by Chemical Vapor Deposition on copper foil and transferred to the substrate), and silicon dioxide passivation on glass substrate, generated without the use of masks, through laser direct writing technique. As a result, two generations of MEAs have been manufactured and characterized, exhibiting appropriate electrical and biological specifications for their application. It was found that the response of the MEAs discussed in this thesis improved when compared to those shown in studies in the literature, especially the charge that our microelectrodes are capable of storing and applying to cell culture during stimulatory pulses. Noise level was <10 µV for both devices, while Charge Injection Capacity, which is calculated from the Cyclic Voltammetry curve, was much higher if compared to commercial MEAs (0.054 mC/cm²) and MEA with standard tita-nium nitride microelectrodes (TiN) produced during the master’s project (0.63 mC/cm²). For our devices, the mean values were 0.67 ± 0.009 mC/cm² and 19.7 ± 0.025 mC/cm². Additionally, the second device produced is also significantly better also when compared to data published in the literature, whose best result was 3.1 mC/cm². Regarding impedance spectroscopy, the response verified for our graphene MEAs was also superior. The average impedance value at 1 kHz was 28,65 ± 3,98 kΩ and 73,95 ± 3,84 kΩ for the first and second versions, respectively, which are compatible with those viewed for standard commercial MEA (30-400 kΩ), and are better than those obtained for MEAs produced during the master’s project, whose value was 141.60 ± 5,27 kΩ. Finally, biocompatibility test showed that our de-vice is adequate to measure cellular potentials, not inducing toxic effects on cells. Consequently, we were able to produce a new model of MEA with transparent microelectrodes, with high CIC and low impedance and graphene noise levels with highly superior response to that found for commercial MEAs published in the literature. Thus, it is a suitable device to act as a bioelectronic interface in the study of neural networks for both stimulation and measurement of their electrical potentials (spontaneous or induced).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Diagrama esquemático de uma Matriz de Microeletrodos tradicional. É composta pelo substrato, condutor (eletrodos, trilhas e pads de contato), isolação e um anel (que delimita a região onde o meio biológico deve permanecer durante os experimentos)... 28 Figura 2 – Esquema de medida por Fixação de tensão. (A) O potencial de membrana é captado através do amplificador ligado a um eletrodo interno e um externo; (B) O valor do potencial “fixado” pelo experimentador é alimentado no terminal positivo do amplificador com retroalimentação. Este, por sua vez, (C) subtrai o potencial de membrana do potencial “fixado” e amplifica a diferença entre esses dois valores. A saída de tensão do amplificador é conectada ao eletrodo interno de corrente (que percorre todo o axônio); (D) A retroalimentação negativa assegura que a tensão resultante no amplificador direcione uma corrente que modifique a tensão de membrana de forma a reduzir a variação entre ela e o potencial “fixado”. Para que a medida seja precisa, o potencial de membrana precisa ser uniforme ao longo de toda a superfície do axônio e isto ocorre pois o eletrodo de corrente interna é altamente condutor. Provoca um curto-circuito na resistência axoplasmática e, assim, zera a resistência do axônio, aniquilando qualquer variação nesta tensão ao longo do axônio. Modificado de Kandel et. al. (2014). ... 35 Figura 3 – Ilustração da técnica de Fixação de Membrana. Adaptado de Lent (2010)... 38 Figura 4 – Diagrama equivalente elétrico para registros extracelulares através de eletrodos planares da MEA. Após a detecção da atividade elétrica pelos eletrodos (região central do dispositivo), este sinal é transmitido para os pads de contato via trilhas. Na sequência, ele é captado pelo amplificador (à direita na imagem) que, por sua vez, envia este dado ao sistema de medidas para seu posterior processamento pelo experimentador. Adaptado de TAKETANI; BAUDRY (2006). ... 43 Figura 5 – Diagrama esquemático do sistema de medida da atividade elétrica de fatias de tecidos com a MEA. Seus eletrodos podem atuar como meios de registro dos sinais ou como estimuladores. Adaptado de TAKETANI; BAUDRY (2006). ... 44
Figura 6 – Sinais registrados por Gross et. al. através de três eletrodos muito distantes (até 1 mm) em toda a monocamada de cultura cortical, durante quatro semanas in vitro (GROSS et. al., 1982). ... 48 Figura 7 – MEA construída no laboratório de Pine. À esquerda, verifica-se a estrutura dos eletrodos, enquanto na direita é exibida uma fotografia deste dispositivo. Consiste em uma matriz de platina negra em formato hexagonal, com espaçamento intereletrodo de 70 μm, com trilhas de óxido de índio estanho (para não interferir na observação óptica) e isolação de poliimida, sobre substrato fino de vidro (MEISTER et. al., 1994; REGEHR et. al., 1989). ... 49 Figura 8 – Ilustração do aparato experimental para medidas realizadas por Thiébaud et al. (1997). ... 51 Figura 9 – (a) Fotografia de uma MEA padrão, com o (b) padrão de distribuição dos eletrodos (MULTICHANNEL SYSTEMS, 2018). ... 58 Figura 10 – (a) Fotografia da MEA fina, com o (b) padrão de distribuição dos eletrodos (MULTICHANNEL SYSTEMS, 2018). ... 59 Figura 11 – (a) Fotografia da MEA 2 x 30, com o (b) padrão de distribuição dos eletrodos (MULTICHANNEL SYSTEMS, 2018). ... 60 Figura 12 – Fotografia de uma MEA flexível. À esquerda há destaque para o local onde residem os microeletrodos. À direita estão os pads de contato (MULTICHANNEL SYSTEMS, 2018). ... 61 Figura 13 – MEA de alta densidade. Ela é ligada a um soquete de circuito impresso através de um fio wire-bonded. (b) disposição dos eletrodos (MULTICHANNEL SYSTEMS, 2018; TAKETANI; BAUDRY, 2006). ... 62 Figura 14 – Imagens da MEA perfurada. Note as aberturas presentes no substrato (com diâmetro de 20 μm, e de 5 μm na parte central), assim como os microeletrodos na área ativa deste dispositivo (TAKETANI; BAUDRY, 2006). ... 63 Figura 15 – Fotografia da Eco MEA com substrato de (a) PCB, e (b) vidro (MULTICHANNEL SYSTEMS, 2018). ... 64 Figura 16 – (a) Fotografia da área ativa da MEA 3D, e (b) especificações dos eletrodos. Adaptado de MultiChannel Systems (2018). ... 66
Figura 17 – MEA Utah: (a) Imagem do dispositivo, que é formado por 100 microagulhas de 1,5 mm de altura sobre um substrato de silício dopado (4 x 4 mm² e espessura de 0,2 mm). Cada microagulha é isolada eletricamente das demais por um “fosso” de vidro que fica ao redor de cada eletrodo, com pads de contato na parte traseira de cada um (para conexão dos mesmos aos fios condutores, os quais se conectam ao conector externo); (b) Ampliação da região do eletrodo de óxido de irídio (ponta), destacando sua ponta arredondada e fina (NORMAN; FERNANDEZ, 2016). ... 68 Figura 18 – MEA flexível produzida por Biswas e colaboradores: (a) Micrografia da região dos microeletrodos de ouro (200 μm de diâmetro); (b) Fotografia da MEA com conexões dos pads de contato aos fios conectores, de tal forma que liga a MEA aos instrumentos periféricos; e (c) Imagem ampliada de (a), mostrando que não há craqueamento da superfície de ouro (BISWAS et. al. 2017). ... 70 Figura 19 – Visualização de neurônios através da técnica desenvolvidas por Nissl. Neurônios, glias e células endoteliais do córtex cerebral de macaco corado pela técnica Nissl. Os grandes neurônios (identificados por setas pretas) podem ser identificados facilmente, uma vez que possuem citoplasma abundante e grande núcleo (sem grânulos de heterocromatina e com nucléolo distinto). Já os neurônios menores (setas laranjas), destacam-se por possuírem uma borda de citoplasma ao redor do seu núcleo, enquanto a eucromatina surge (região azul clara) e mostra diversos grânulos de heterocromatina, alguns dos quais constroem grupos espessos do redor do nucléolo. Além disso, nota-se que alguns astrócitos (cabeça de seta verde) são satélites para neurônios, como pode ser visualizado na Camada 2. Observa-se, também, que os oligodendrócitos (cabeça de seta branca) têm pequenas dimensões e são redondos, enquanto a microglia (cabeça de seta preta) exibe núcleo com forma irregular (veja Camada 3) e as células endoteliais (cabeça de seta laranja) se moldam para adquirir o formato das paredes dos capilares. Adaptados de GARCÍA-CABEZAS et. al. (2016). ... 79 Figura 20 – Visualização de neurônios cerebrais de rato adulto através do procedimento de Golgi. A imagem destaca um neurônio e célula glial no hilo do giro dentado. Adaptado de Kang et. al. (2017). ... 80
Figura 21 – Ilustração da estrutura neuronal. Para neurônios típicos encontrados no sistema nervoso de vertebrados, é possível notar quatro regiões distintas principais: (1) soma, que contém o núcleo, onde concentram-se os genes da célula; (2) axônios, os transmissores dos sinais elétricos para demais células; (3) dendritos, atuando como uma “antena” para o neurônio; e (4) terminais pré – sinápticos, os quais, juntamente com os terminais pós – sinápticos, formam a sinapse. Um único neurônio, através do seu axônio, pode formar sinapses com até mil neurônios pós-sinápticos. Adaptado de Kandel et. al. (2014). ... 83 Figura 22 – Exemplos de neurônios, segundo a classificação por número de processos que partem do corpo celular. Células: a) Unipolar; b) Bipolar; c) Pseudo-unipolar; e d) Multipolar. Adaptado de BEAR et al. (2006). ... 85 Figura 23 – Resultados experimentais para (a) pequena e (b) grande despolarização (60 mV) obtidos utilizando a técnica de Fixação de Tensão em axônio gigante de lula: (b.1) Corrente total na membrana (capacitiva e de fuga) em resposta à despolarização aplicada; (b.2) Corrente iônica de sódio e potássio após subtração de IC e IF, quando as toxinas bloqueadoras de canais (TTX para
o sódio e TEA para o potássio) foram utilizadas; e (b.3) Tensão de despolarização. Adaptado de Kandel et al. (2014). ... 100 Figura 24 – Curvas do potencial de ação (curva vermelha), da condutância do sódio (curva lilás com maior pico) e do potássio (curva lilás com menor pico) obtidas por Hodgkin e Huxley (KANDEL et al., 2014). ... 102 Figura 25 – Distribuição da corrente através da membrana durante a passagem de um potencial de ação em um período (NICHOLLS et. al., 2012). ... 103 Figura 26 – Ilustração das junções comunicantes. À esquerda encontra-se a situação na qual duas células (pré e pós-sináptica) se acoplam via alinhamento dos conexons. À direita, é possível verificar que a corrente elétrica que flui entre as células ocorre através dos poros nestes conexons. Modificado de Lent (2010). ... 107 Figura 27 – Sinal transmitido durante uma sinapse elétrica. Sua condução é virtualmente instantânea, com a resposta da célula pós-sináptica seguindo o sinal da primeira logo após 1 ms. Adaptado de Kandel et al. (2014). ... 109
Figura 28 – Sinapse química. (A) Um potencial de ação chega até a célula pré-sináptica, e isto promove a abertura dos canais de cálcio dependentes de tensão com consequente liberação deste íon no meio intracelular; (B) As vesículas se conectam com a membrana da célula pré-sináptica, liberando o neurotransmissor na fenda sináptica; E (C) O espalhamento deste transmissor, o qual se funde aos seus receptores na célula pós-sináptica e isto induz a abertura ou fechamento dos canais iônicos presentes nesta membrana. Consequentemente, o potencial da membrana neste local é alterado. Modificado de Kandel et al. (2014). ... 111 Figura 29 – Layout da MEA. No centro, encontram-se os eletrodos, enquanto as linhas azuis são as trilhas e os retângulos nas bordas da matriz são os pads de contato. À direita, destacam-se os eletrodos (200 μm de espaçamento), com diâmetro de (a) 30 μm; e (b) 20 µm e 40 µm. Além disso, nota-se mais uma diferença entre os dois projetos: a presença do eletrodo de referência na segunda versão de MEA (trilha verda mais larga à esquerda em (b)). ... 116 Figura 30 – Padrões desenhados para o primeiro nível de litografia – TiN – para a: (a) primeira versão da MEA. Nela, destacam-se os eletrodos (centro), e trilhas (diâmetro de 40 µm na porção inicial), que partem da estrutura anterior e se conectam aos pads de contato (periferia, em formato retangular). As marcas de alinhamento, que são essenciais para alcançar um nivelamento adequado entre os níveis, localizam-se nas bordas da lâmina; e (b) segunda versão da MEA, onde é possível notar que este condutor irá formar apenas as trilhas e pads de contato, com as marcas de alinhamento na região central. ... 118 Figura 31 – Padrões desenhados para o segundo nível de litografia, o nível de isolação – SiO2 –
para a: (a) primeira versão da MEA. Nela, destacam-se os 60 padroes circulares (centro, definindo o diâmetro do eletrodo: 30 µm), e retangulares (periferia, formando os pads de contato). As marcas de alinhamento, que são essenciais para alcançar um nivelamento adequado entre os níveis, localizam-se nas bordas da lâmina; e (b) segunda versão da MEA, onde é possível notar os padrões circulares (centro, definindo o diâmetro dos eletrodos: 40 µm e 20 µm), com o eletrodo de referência (esquerda) e as marcas de alinhamento na região central. ... 119 Figura 32 – Padrões desenhados para o terceiro nível de litografia, o nível de eletrodos – grafeno – para a: (a) primeira versão da MEA. Nela, destacam-se os 60 microeletrodos circulares (30 µm), A marcas de alinhamento, que são essenciais para alcançar um nivelamento adequado entre os
níveis, localizam-se nas bordas da lâmina; enquanto na (b) segunda versão da MEA nota-se eletrodos circulares (40 µm e 20 µm), com marcas de alinhamento na região central. ... 120 Figura 33 – Diagrama esquemático para a: (a) primeira; e (b) segunda versões da MEA produzida neste projeto de doutorado. ... 121 Figura 34 – Etapas de limpeza das lâminas de vidro: na primeira etapa (a), elas são submersas em solução detergente. Na sequência, (b) o recipiente contendo a solução detergente é transferido para a lavadora ultrassônica (UltraSonic Cleaner LJSC 1400, Unique). Por fim, as amostras passam pela terceira fase de limpeza, mergulhando-se as mesmas em solução de água com peróxido de hidrogênio (30% da UltraPure Solutions, Inc) e hidróxido de amônio (29% da J. T. Baker), na proporção de 5: 1: 1, respectivamente. ... 123 Figura 35 – Fotografia dos sistemas (a) DWL 66FS, e (b) MicroWriter ML3, utilizados para a definição dos padrões das MEAs, no Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer (CTI). ... 125 Figura 36 – Diagrama esquemático para o processo lift-off: (a) Deposição e espalhamento do fotorresiste sobre toda a superfície da lâmina; (b) definição do padrão negativo sobre o fotorresiste; (c) deposição do material condutor; (d) revelação da amostra; e (e) procedimento finalizado, deixando o metal somente sobre a região da lâmina onde foi projetado estar os eletrodos, trilhas e pads de contato das MEAs. ... 127 Figura 37 – Diagrama esquemático do sistema de pulverização catódica: (a) Os íons do gás inerte dentro da câmara trafegam até atingir o alvo, localizado na região inferior da imagem; (b) Neste ponto, por transferência de energia, este alvo é erodido pelos íons, causando a sua ejeção na forma de partículas neureas; (c) Por fim, estas últimas depositam-se sobre o substrato (amostra) de tal forma que cria um filme fino nele. Adaptado de SAMATERIALS (2015). ... 129 Figura 38 – Fotografia do sistema de pulverização catódica ULVAC MHC-9000 do Centro de Componentes Semicondutores e Nanotecnologias (CCSNano, Unicamp) para a formação de filmes de nitreto de titânio nas MEAs. ... 130 Figura 39 – Fotografia das amostras após a realização da etapa 2. As imagens referem-se à região condutora (TiN) das (a) primeira e (b) segunda versões, respectivamente. ... 131 Figura 40 – Diagrama esquemático do ECR (BIASOTTO, 2005). ... 133
Figura 41 – Fotografia da câmara do ECR-CVD durante a deposição de SiO2 sobre a amostra de MEA (centro da imagem). ... 135 Figura 42 – Fotografia das amostras após a realização da etapa 2. A imagem refere-se à região isolante (SiO2) da MEA fabricada aqui. ... 135
Figura 43 – Fotografias do processo de transferência de grafeno para a MEA. Pilha cobre/grafeno/PMMA em: (a) suspensão em solução de água com ácido nítrico (HNO3) para
corrosão da camada de grafeno desprotegida; e (b) imersão em solução Marble (CuSO4 (620 mmol/L) com H2O/HCl (1:1)) para que o cobre seja extraído, resultando em uma nova
pilha composta apenas de PMMA sobre grafeno. Por fim, em (c) é possível verificar a folha de grafeno em água, pronta para a transferência para a região central da MEA, onde localizam-se os microeletrodos (d). ... 139 Figura 44 – Fotografia dos protótipos das duas versões de MEAs produzidas e discutidas nesta tese de doutorado. ... 141 Figura 45 – Imagens obtidas por microscopia óptica das duas versões de MEA fabricadas, onde é possível verificar que há uma distribuição simétrica dos eletrodos em ambos os dispositivos. 142 Figura 46 – Imagem de Microscopia Eletrônica de Varredura para dois microeletrodos da primeira MEA fabricada ... 143 Figura 47 – Imagem de Microscopia Eletrônica de Varredura da segunda versão de MEA fabricada: (a, b) dois microeletrodos, onde na porção circular central está o grafeno, enquanto as demais regiões são cobertas pela isolação (SiO2); (c) imagem que destaca uma das bordas da
região ativa da MEA, mostrando alguns dos seus microeletrodos (estruturas circulares) e as trilhas que partem dos primeiros e alcançam os pads de contato (localizados nas extremidades da lâmina); e (d) ampliação do campo de visão com foco em dois sensores e as respectivas trilhas. ... 144 Figura 48 – Espectro Raman de quatro microeletrodos distintos de grafeno nas MEAs produzidas. ... 145 Figura 49 – Imagens do sistema empregado para a realização do teste de ruído nos microeletrodos das MEAs: (a) fotografia de um dispositivo acoplado ao soquete da MultiChannel
Systems; e (b) imagem da placa amplificadora da Intan Technologies, a qual permite o registro e transmissão dos sinais para o computador. ... 149 Figura 50 – Sinal de ruído captado (em µV) de quatro microeletrodos distintos das duas MEAs discutidas nesta tese de doutorado, ambas em função do tempo. Medida referente às (a) primeira, e (b) segunda versões produzidas, respectivamente. ... 150 Figura 51 – Imagem do ruído visualizado para uma MEA produzida com microeletrodos de 30 µm de diâmetro compostos apenas por TiN, com amostragem de 10 kHz e área ativa contendo dois meios de cultura (NeuroBasal e B27, totalizando 1 ml de solução). Este dispositivo foi anteriormente fabricado durante o projeto de mestrado (GOMES, 2015). ... 151 Figura 52 – Diagrama esquemático da MEA desenvolvida por Kireev et al. (2017): (a) Os microeletrodos são compostos apenas de grafeno, enquanto a isolação foi feita por HD-8820, tudo sobre substrato de silício ou borofloat; (b) Nota-se que este dispositivo é composto por 36 canais distribuídos em uma matriz quadrada (KIREEV et al., 2017). ... 152 Figura 53 – Diagrama esquemático do potenciostato ligado a uma célula eletroquímica da configuração empregada na medida de VC. Os símbolos “T”, “R” e “C” representam os eletrodos de trabalho, de referência e contra-eletrodo, enquanto “1” e “2” são os componentes onde o potencial E é aplicado, sem corrente fluindo, e medição da corrente conduzida no contra-eletrodo, respectivamente. Adaptado de (BROWNSON; BANKS, 2014; KHALAFI; RAIFEE, 2017). ... 154 Figura 54 – (a) Perfil potencial versus tempo usado durante o teste de voltametria cíclica. Durante o teste, o potencial é variado entre E1 e E2 de forma cíclica. Durante toda a varredura, um
potenciostato detecta a corrente resultante que aparece através da tensão aplicada; e (b) exemplo de voltamograma cíclico típico para um eletrodo a uma taxa de varredura de 100 mV/s, com destaque para os potenciais de pico catódico e anódico. Modificado de (ELGRISHI et al., 2018; BROWNSON; BANKS, 2014). ... 155 Figura 55 – Diferença na medida de voltametria cíclica quando é testado um (a) macroeletrodo e um (b) microeletrodo. Modificado de (BROWNSON; BANKS, 2014). ... 159
Figura 56 – Voltamograma cíclico para cinco eletrodos das MEAs produzidas com solução salina tampão de fosfato (PBS) a uma taxa de varredura de 20 mV/s, cujos sensores testados são compostos por: (a) TiN/ grafeno, e (b) grafeno. ... 161 Figura 57 - Voltamograma cíclico para um eletrodo de TiN de 30 µm de diâmetro obtido com a adição de solução salina tampão de fosfato (PBS) na área ativa e a uma taxa de varredura de 20 mV/s. Em cima é exibida a curva obtida para o microeletrodo da MEA fabricada durante o projeto de mestrado (GOMES, 2015) e embaixo, de uma MEA comercial padrão da MultiChannel Systems. ... 162 Figura 58 – Corrente senoidal resultante da aplicação de excitação senoidal em um sistema linear (RANDVIIR; BANKS, 2013). ... 168 Figura 59 – Resultado da medida de espectroscopia de Impedância para cinco eletrodos escolhidos de forma aleatória, em função do logaritmo da frequência, para (a) a primeira e (b) a segunda versões das MEAs tratadas nesta tese de doutorado, assim como (c) a resposta observada para um microeletrodo de TiN de MEA fabricada durante o projeto de mestrado (GOMES, 2015). ... 170 Figura 60 – Diagrama esquemático para os circuitos equivalentes utilizados para o ajuste das respostas do teste de EI para um microeletrodo de (a) ouro, e (b) grafeno (DU et al., 2015). .. 171 Figura 61 – Fotografia (acima) e diagrama esquemático (embaixo) da MEA planar UT Dallas. A MEA é composta por substrato empregado é o policarbonato, com região sensora de cromo com ouro e isolação de parileno (Charkhkar et al., 2016). ... 174 Figura 62 – Fotografia da MEA de 16 eletrodos de grafeno com nanopartículas de platina produzida por Lu et al. (2016). Nela, a isolação é por SU-8 com substrato de PET enquanto as trilhas e pads de contato são constituídas por cromo (10 nm) e ouro (100 nm). ... 175 Figura 63 – Resultados para o teste de espectroscopia de impedância para os 16 eletrodos da MEA: (a) módulo da impedância, e (b) ângulo de fase, em função da frequência. Adaptado de Thunemann et al. (2018). ... 176 Figura 64 – (a) Diagrama esquemático da MEA de 35 canais de grafeno; e (b) Curvas do módulo da impedância e do ângulo de fase obtidos para o dispositivo fabricado, ambas em função da frequência. Adaptado de JEONG et al. (2017). ... 176
Figura 65 – Comparação dos resultados observados para MEAs com microeletrodos de grafeno com relação à: (a) Capacidade de Injeção de Carga (cujas referências são: 1, Koerbitzer et al. (2016); 2, MultiChannel Systems (2017); 3, GOMES (2015); 3, Primeira versão produzida neste projeto de doutorado; 4, Lu et al. (2016); e 5, Segunda versão produzida neste projeto de doutorado); e (b) Impedância (cujas referências são: 1, Koeritzer et al. (2016); 2, Primeira e 3, segundas versões produzidas neste projeto de doutorado; 4, GOMES (2015); 5, Du et al. (2015); 6, Park et al. (2014); 7, Jeong et al. (2017); 8, Charkhkar et al. (2016), com microeletrodos de ouro; 9, Lu et al. (2018); e, 10, Thunemann et al. (2018)). ... 178 Figura 66 – Imagens obtidas sobre a região dos microeletrodos das MEAs fabricadas neste projeto (lente de 10X), com os precursores de células granulares cerebelares cultivados durante 35 DIV. ... 180 Figura 67 – Imagens obtidas sobre a região dos microeletrodos das MEAs fabricadas neste projeto com a lente de: (a) 10X, (b) 20X, e (c) 40X, com os precursores de células granulares cerebelares cultivados durante 35 DIV. ... 181 Figura 68 – Imagens de fluorescência da cultura de precursores de células granulares cerebelares. (a) Imagem obtida via microscopia óptica da região central da MEA testada com a cultura; (b) Imagem do mesmo local da primeira fotografia, mas com a marcação imunofluorescente das células. O material empregado para a marcação dos núcleos celulares foi o DAPI, enquanto as células de Purkinje foram marcadas por CALBINDINA e as células granulares, por MATH1, já que após os 35 DIV os precursores das células granulares amadureceram para as células granulares. ... 182
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Requisitos para próteses neurais (COGAN, 2008) ... 29 Tabela 2 – Valores de impedância e Capacidade de Injeção de Carga para os materiais mais comuns para eletrodos neurais (FERRO et. al., 2018; GOMES, 2015; WANG et. al., 2019). ... 55 Tabela 3 – Estado da arte para Matrizes de Microeletrodos ... 73 Tabela 4 - Concentração e potencial de equilíbrio (quando não há fluxo das espécies pela membrana) para os principais íons encontrados através da membrana neuronal quando em repouso para axônio gigante de lula, cujo gradiente de concentração é próximo àquele observado para neurônios de vertebrados, embora este exiba valor absoluto de concentração de 2 a 3 vezes inferior. Adaptado de KANDEL et. al. (2014). ... 93 Tabela 5 - Descrição do processo de limpeza dos substratos de vidro... 123 Tabela 6 - Comparação dos resultados obtidos nesta tese de doutorado e aqueles encontrados na literatura ... 183
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACoE: Enzima acetil colinesterase
CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CCSNano: Centro de Componentes Semicondutores e Nanotecnologias CA: Corrente alternada
CAC: Capacidade de armazenamento de carga CC: Corrente contínua
CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais CIC: Capacidade de injeção de carga CRT: Tubo de raio catódico
CTI: Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer DIV: Dias in vitro
DRG: Gânglios da raiz dorsal
ECR-CVD: Deposição em Fase Vapor por Ressonância Ciclotrônica do Elétron EI: Espectroscopia de impedância
FET: Transistor de efeito de campo HNO3: Ácido nítrico
IFGW: Instituto de Física ‘Gleb Wataghin’ IrOx: Óxido de irídio
ITO: Óxido de índio estanho KOH: Hidróxido de potássio MEA: Matriz de microeletrodos
NMI: Instituto de Ciências Naturais e Médicas PA: Potencial de Ação
PBS: Solução salina tampão de fosfato PCG: Precursor de célula granular PDMS: Polidimetilsiloxano
PEC: Polímero Eletricamente Condutor
PECVD: Deposição química na fase vapor melhorada por plasma PEDOT: Poli(etilenodioxitiofeno)
PET: Polietileno Tereftalato PMMA: Polimetimetacrilato
Pt: Platina
RMS: Valor Quadrático Médio SiO2: Dióxido de silício
Si3N4: Nitreto de silício
TEA: Tetraetilamônio TiN: Nitreto de titânio
TTX: Tetrodotoxina
UNIFESP: Universidade Federal de São Paulo VC: Voltametria Cíclica
LISTA DE SÍMBOLOS
𝜙: Gradiente de concentração AE: Área de todo o eletrodo
AJE: Área coberta do eletrodo
Ca2+: Íon cálcio
CE: Capacitância de todo o eletrodo
CH4: Gás metano
CJE: Capacitância da área coberta do eletrodo
Cl-: Íon cloreto
CPE: Elemento de fase constante
Cr: Cromo
Csh: Capacitância da trilha
D: Coeficiente de difusão
ECl: Potencial de equilíbrio do cloro
EK: Potencial de equilíbrio do potássio
ENa: Potencial de equilíbrio do sódio
Epa: Potencial de pico anódico
Epc: Potencial de pico catódico
F: Constante de Faraday
IC: Corrente capacitiva
IF: Corrente de fuga
I2D: Corrente de pico da banda 2D
IG: Corrente de pico da banda G
INa: Corrente de sódio
Ipa: Corrente de pico anódico
Ipc: Corrente de pico catódico
J: Fluxo de difusão
K+: Íon potássio
N: Número de elétrons transferidos Na+: Íon sódio
R: Constante dos gases
Rb: Resistência do meio de cultura
RCT: Resistência de transferência de carga
RL: Resistência de fuga
RS: Resistência da solução
T: Temperatura
t: Tempo
Vext: Potencial externo
Vint: Potencial interno
Vm: Potencial de membrana
VJ: Potencial no espaço entre a membrana neuronal e o eletrodo
Vpad: Potencial no pad de contato
x: Posição
[X]d: Concentração iônica do íon X dentro da célula neural
[X]f: Concentração iônica do íon X fora da célula neural
ω: Frequência radial
Z: Valência do íon
SUMÁRIO AGRADECIMENTOS ...VI RESUMO ... VII ABSTRACT ...IX LISTA DE FIGURAS ... X LISTA DE TABELAS ... XX LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... XXI LISTA DE SÍMBOLOS ... XXIII SUMÁRIO ...XXV 1 INTRODUÇÃO ... 27 1.1 OBJETIVOS ... 30 1.2 MOTIVAÇÃO ... 30 1.3 ESTRUTURA DA TESE ... 32 2 MÉTODOS DE MEDIÇÃO ... 34 2.1 TÉCNICAS TRADICIONAIS (KANDEL ET AL., 2014) ... 34 2.2 INSTRUMENTAÇÃO RECENTE ... 40 2.2.1 O que a MEA mede? (OBIEN et al., 2014) ... 41 2.2.2 Registro na MEA ... 42 2.2.3 Estimulação na MEA (TAKETANI; BAUDRY, 2006) ... 45 2.2.4 História da MEA (TAKETANI; BAUDRY, 2006)... 46 3 NEUROFISIOLOGIA ... 77 3.1 A DOUTRINA NEURONAL ... 77 3.1.1 O neurônio (KANDEL et al., 2014) ... 81 3.1.2 Células não neuronais ... 87 3.2 A TRANSMISSAO DA INFORMAÇÃO (LENT, 2010) ... 90 3.2.1 O potencial de repouso (KANDEL et al., 2014; LENT, 2010) ... 94 3.2.2 O potencial de ação ... 98 3.2.3 Condução dos sinais (NICHOLLS et al., 2012) ... 103
4 METODOLOGIA ... 114 4.1 PROJETO DOS PADRÕES DAS MEAS ... 114 4.2 FABRICAÇÃO DAS MEAS ... 121 4.2.1 Escolha e limpeza do substrato ... 122 4.2.2 Condutor ... 124 4.2.3 Isolação ... 131 4.2.4 Grafeno ... 136 4.2.5 Anel ... 140 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 141 5.1 OBSERVAÇÃO ESTRUTURAL ... 142 5.2 CARACTERIZAÇÃO DOS ELETRODOS ... 143 5.2.1 Investigação dos microeletrodos de grafeno ... 143 5.2.2 Caracterização eletroquímica dos microeletrodos ... 147 5.2.2.1 Teste de ruído ... 148 5.2.2.2 Voltametria Cíclica (KHALAFI; RAFIEE, 2017) ... 153 5.2.2.3 Espectroscopia de Impedância (MARKS et al., 2007; RANDVIIR; BANKS, 2013) ... 166 5.2.2.4 Teste de biocompatibilidade ... 178 6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ... 186 REFERÊNCIAS ... 189
1 INTRODUÇÃO
Durante a segunda metade do século XX na área de biologia, o principal foco de estudos dos pesquisadores circundava os assuntos relacionados ao gene. Entretanto, a partir do momento em que o século XXI surgiu, a atenção se voltou para a neurociência e especificamente os concei-tos de biologia da mente. A principal questão era compreender todos os processos relacionados às percepções do meio em que vivemos, e como agimos, aprendemos e lembramos de fatos.
Nas últimas décadas, o avanço das tecnologias tem criado outros campos no estudo cien-tífico do cérebro. Embora possua peso de apenas três quilos, este órgão é bastante complexo, sendo formado pela interconexão de células nervosas ou neurônios. Com isso, compreender como as respostas são geradas e conduzidas pelo mesmo ainda não está completamente defi-nido, embora técnicas de imagens sejam capazes de mostrá-lo em atividade. Isto é, reconhece os locais cerebrais que possuem conexão com o pensar e sentir e seus respectivos padrões de inter-conexões (KIM et. al., 2013; KUZUM et. al., 2014).
Na tentativa de elucidar as questões relacionadas a estes processos, uma grande varie-dade de técnicas de medidas foi desenvolvida ao longo do tempo para estudar os neurônios, as unidades básicas do cérebro (KANDEL et al., 2014). Uma das formas de estudar estes dados é através de eletrodos unitários, como eletrodo de fibra de carbono ou pela técnica de Fixação de Membrana. Embora apresentem vantagens, como registro elétrico em células unitárias com alta resolução temporal, a aplicação do segundo método está restrita a poucos neurônios por experi-mento, tornando-o inefetivo para monitorar a atividade de uma grande rede neuronal, além de ser invasivo (RASTOGI et. al., 2018).
Em contrapartida, a análise do comportamento de redes neurais de diversas células inter-dependentes exige a investigação destes muitos neurônios unitários de forma simultânea. Para superar este desafio, uma nova plataforma tem se tornado bastante popular com relação a estu-dos eletrofisiológicos com modelos in vitro: as Matrizes de Microeletroestu-dos, ou MEAs (KIM et. al., 2014; KIM et. al., 2018).
Uma MEA típica (Figura 1) consiste basicamente em uma grade específica de eletrodos, geralmente feitos de nitreto de titânio (TiN), com diâmetros variando entre 10 e 200 µm, cujos
desempenhos já foram bem descritos e estudados por décadas (KIREEV et. al., 2017a; KIREEV et. al., 2017b). Tais microeletrodos se conectam com o sistema de medidas externo por meio de trilhas passivadas, tudo sobre um substrato não condutor, que geralmente é de vidro (KIM et. al., 2018).
Figura 1 – Diagrama esquemático de uma Matriz de Microeletrodos tradicional. É composta pelo substrato, condu-tor (eletrodos, trilhas e pads de contato), isolação e um anel (que delimita a região onde o meio biológico deve
per-manecer durante os experimentos).
De forma simplificada, as células dispersas são plaqueadas na superfície da região ativa da MEA (central, onde localizam-se os microeletrodos) e, após alguns dias, sob adequadas condições biológicas (como temperatura, pH e meio nutritivo) e de crescimento (como astrócitos, ver Se-ção 2.1.2), elas naturalmente criam uma rede, a partir da qual a rede microeletrodos capta o sinal elétrico neuronal, simultaneamente, com propriedades funcionais próximas às visualizadas para experimentos in vivo, dentre as quais destacam-se a conectividade da rede, e efeitos farmacoló-gicos (EYTAN et. al., 2004; GABAY, 2009).
Portanto, durante a execução de experimentos extracelulares, a célula que está sendo es-tudada através da MEA fica próxima ou sobre o eletrodo metálico, que, por sua vez, registra o campo elétrico ao redor da mesma. Nesta configuração, a menor amplitude dos sinais extracelu-lares (a qual pode variar de 10 µV a até vários mV), comparado com os sinais intraceluextracelu-lares, pode depender de diversos fatores, tais como distância célula-eletrodo e as características elétricas do sensor (HEUSCHKEL, 2001).
Adicionalmente, a Tabela 1 sintetiza os principais parâmetros desejados para microeletro-dos voltamicroeletro-dos para algumas aplicações em humanos. Tais fatores permitiriam, inclusive, que eles sejam empregados como próteses neurais.
Tabela 1 – Requisitos para próteses neurais (COGAN, 2008)
Aplicação Posicionamento Limiar de
carga/fase (nC. ph-1) Limiar da den-sidade de carga (µC/ Cm2) Largura de pulso (µs) Visão Cortical Nervo óptico Intracortical 200.000 7-124 0,4-4,6 11 4-62 190-2300 200 25-400 200
Audição Tronco cerebral
audi-tivo
10-200 2,6-52 300
Estimulação cerebral profunda
Núcleo subtalâmico 135-400 2,3-6,7 60-200
Desde seu surgimento na década de 1980, verificou-se que esta tecnologia pode ser apli-cada em ampla gama de aplicações, tais como cultura de células dissociadas (PIMASHKIN et. al., 2016), e fatias de tecidos (FAN et. al., 2019), tanto em condições normais como patológicas indu-zidas (BENEKAREDDY et. al., 2018).
Somada à sua capacidade de registro da atividade elétrica em multilocais simultanea-mente, este dispositivo é capaz de injetar pulsos de estimulação no meio biológico durante dias ou até semanas além de atuar como uma interface não invasiva para as células, o que implica que é possível realizar experimentos de longa duração por até vários meses controlando tanto a tem-peratura quanto o pH da cultura (KIREEV et. al., 2017a). Dado que os principais receptores e me-canismos sinápticos e celulares que influenciam a atividade neural são conservados, este disposi-tivo não induz qualquer modificação celular significativa (RIJAL; GROSS, 2008).
Com isso, esta ferramenta surge como uma interessante opção para investigar a atividade e evolução da dinâmica da rede neural e os efeitos resultantes da aplicação de fármacos sobre esta amostra biológica.
1.1 OBJETIVOS
Este projeto de doutorado tem como propósito principal a fabricação de uma nova versão de Matrizes de Microeletrodos, ou MEAs, para serem aplicadas como dispositivos de estimulação e/ou medição de potenciais celulares de culturas de células neuronais.
Para tanto, são propostas aqui duas inovações. Primeiro, na forma de fabricação deste dispositivo. Tradicionalmente, a transferência dos padrões é realizada via fotolitografia de con-tato. Entretanto, propomos aqui a transferência por escrita direta, o que nos permite variar o layout do dispositivo e diminuir custos (dado que não é necessário produzir fotomáscaras). Se-gundo, no uso do grafeno como material dos eletrodos, sobre substrato de vidro.
1.2 MOTIVAÇÃO
Comparado com os métodos tradicionais de medição da atividade elétrica de células exci-táveis, como eletrodos unitários, a MEA possui diversas características interessantes que a tor-nam a melhor opção.
Dentre as motivações para seu uso, destacam-se as seguintes propriedades (TAKETANI; BAUDRY, 2006):
i. Sem causar danos às células excitáveis, a MEA permite o registro da sua atividade eletro-fisiológica por longos períodos, de até semanas, muito superior ao permitido para as téc-nicas tradicionais como Fixação de Membrana, que realiza medidas instantâneas. Isto por-que, em muitas vezes, acarreta a destruição celular pela extração de parte da sua mem-brana plasmática;
ii. Além de permitir a aplicação de estímulos elétricos através de seus microeletrodos, ela é composta por uma matriz deles. Dessa forma, possibilita identificar as interações célula – célula em multilocais no mesmo tecido e de forma não invasiva. Além disso, dado que a qualidade da medida é determinada principalmente pelo posicionamento do microele-trodo, a MEA surge com a vantagem por possuir a rede de microeletrodos. Assim, é capaz de captar os sinais em pontos distintos da cultura de células, fato que não ocorre nos métodos tradicionais, onde os neurônios são inspecionados individualmente, tornando a medida lenta e complicada. Portanto, a MEA facilita na monitoração das dinâmicas espa-cial e temporal da atividade elétrica in vitro; adicionalmente, a detecção da atividade elé-trica em diversos pontos permite também a diminuição da duração do experimento, já que a MEA registra e/ ou estimula simultaneamente em todo conjunto sensor; e,
iii. Pode ser empregada para procedimentos in vitro para estudos dos efeitos de drogas e toxinas, as quais impulsionam condições fisiopatológicas que podem simular danos in vivo.
Desde seu surgimento, por Thomas et. al. (1972), diversos pesquisadores têm focado seu interesse na aplicação e produção de novas MEAs. Entretanto, a pesquisa voltada para este dis-positivo somente obteve um progresso significativo nos últimos vinte anos, o que foi motivado principalmente pela ascensão da computação acessível e desenvolvimento dos sistemas comer-ciais para MEAs. Inicialmente, o principal material de eletrodos planares era o ouro. No entanto, com o tempo, os pesquisadores começaram a perceber um alto valor de impedância e, assim, iniciou-se a busca por novas alternativas para superar este impasse e obter dispositivos estáveis a longo prazo e capazes de captar sinais com melhor razão sinal-ruído (TAKETANI; BAUDRY, 2006). Embora haja uma ampla variedade de materiais disponíveis para compor o microeletrodos e a variedade de modelos, a MEA produzida neste projeto de doutorado se destaca principal-mente por dois pontos. Primeiro, ela possui área ativa transparente, uma vez que além de ser construída sobre substrato de vidro e com isolação de dióxido de silício, os microeletrodos (dis-postos na região central do dispositivo) são com(dis-postos por grafeno. Além das diversas vantagens da utilização deste material (tais como baixo nível de ruído, boa capacidade de injeção de carga
e biocompatibilidade), ele facilita também a observação óptica da cultura durante os experimen-tos. Por fim, este projeto de doutorado propõe também a definição dos padrões da MEA através de escrita direta, o que nos permite variar o layout do dispositivo com grande frequência, caso necessário, e diminuir custos, pois não é necessário gerar as fotomáscaras.
1.3 ESTRUTURA DA TESE
Esta tese de doutorado está organizada em seis capítulos. A seguir, uma descrição simpli-ficada de cada capítulo é apresentada:
Capítulo 1: Introdução, onde são inseridas informações simplificadas relacionadas ao projeto de doutorado, com os respectivos objetivos e motivações;
Capítulo 2: Métodos de medição. Aqui, são tratadas técnicas tradicional e recente para registro da atividade elétrica de neurônios ou fatias de tecido;
Capítulo 3: Conceitos de neurofisiologia, com a teoria de neurofisiologia pertinente, e o funda-mento de geração e transmissão da informação;
Capítulo 4: Procedimento experimental, apresentando o projeto das MEAs de grafeno, assim como o seu projeto de fabricação;
Capítulo 5: Resultados e discussões. Contém os principais resultados obtidos a partir da caracte-rização das MEAs fabricadas (observação óptica, testes do nível de ruído, de estimulação e carac-terização eletroquímica dos eletrodos) com as discussões pertinentes;
Capítulo 6: Conclusões e perspectivas, expondo as conclusões dos resultados de caracterização das MEAs produzidas e as perspectivas de pesquisas futuras, assim como as referências bibliográ-ficas
Apêndice, com uma síntese dos trabalhos apresentados e publicados durante a realização do pro-jeto de doutorado.
2 MÉTODOS DE MEDIÇÃO
Nesta seção, serão introduzidas as principais formas empregadas para mensurar a ativi-dade elétrica em um único neurônio ou em um grupo deles. Além da técnica de imagem óptica (WANG et. al., 2018), tais procedimentos podem ser divididos em duas classes: técnicas tradicio-nais (fixação de tensão e de membrana) (NOVAK et. al., 2013), e recente (MEA, foco de estudo neste projeto de doutorado) (GOMES et. al., 2019).
2.1 TÉCNICAS TRADICIONAIS (KANDEL ET AL., 2014)
Na eletrofisiologia clássica de fatias de tecido, os eletrodos empregados usuais são con-feccionados de vidro ou de metal, cuja implantação é executada de forma individual para estimu-lar e registrar a atividade elétrica delas (tipicamente, spikes, potenciais de campo evocados ou potenciais de campo espontâneos, sob condições estáticas ou de interface). Sua ponta deve ser pequena de tal forma que não cause danos e, ao mesmo tempo, seja capaz de conectar-se à celula (TAKETANI; BAUDRY, 2006; WANG et. al., 2018).
A partir do final da década de 1940, técnicas confiáveis de registro de potenciais elétricos através da membrana celular surgiram, possibilitando tanto a captação do potencial de mem-brana na situação de repouso como durante os potenciais de ação.
Micropipetas de vidro eram preenchidas por uma solução concentrada de sal, de tal forma a atuar como eletrodos os quais ficam posicionados em ambos os lados da membrana celular. Em suas extremidades traseiras são inseridos fios que, por sua vez, estão ligados ao osciloscópio (que mostra a amplitude do potencial de membrana medido em volts) por meio de um amplificador. Uma vez que o diâmetro da ponta deste microeletrodo é pequeno (menor que 1 µm), ele causa um dano celular relativamente pequeno.
Tais sensores têm sido amplamente utilizados para monitorar o potencial intracelular de neurônios unitários que aparecem após a aplicação de sinais elétricos excitatórios externos ou sensoriais naturais. Como resultado, isto permitiu a medição e compreensão das funções básicas do neurônio (NOVAK et. al., 2013).
Em 1949, Kenneth Cole criou a técnica conhecida como Fixação de tensão (voltage clamp, em inglês), através da qual Alan Hodgkin e Andrew Huxley (1950) proporcionaram a primeira des-crição completa dos mecanismos iônicos subjacentes no potencial de ação. Consiste na “fixação” do potencial de membrana em valores pré-definidos de forma a inibir que quaisquer variações de corrente através dela modifiquem este potencial (Figura 2). A partir disso, ou seja, controlando a tensão, o experimentador é capaz de registrar o efeito das suas alterações sobre a condutância da membrana para os íons individuais.
Figura 2 – Esquema de medida por Fixação de tensão. (A) O potencial de membrana é captado através do amplifi-cador ligado a um eletrodo interno e um externo; (B) O valor do potencial “fixado” pelo experimentador é alimen-tado no terminal positivo do amplificador com retroalimentação. Este, por sua vez, (C) subtrai o potencial de
mem-brana do potencial “fixado” e amplifica a diferença entre esses dois valores. A saída de tensão do amplificador é conectada ao eletrodo interno de corrente (que percorre todo o axônio); (D) A retroalimentação negativa assegura
que a tensão resultante no amplificador direcione uma corrente que modifique a tensão de membrana de forma a reduzir a variação entre ela e o potencial “fixado”. Para que a medida seja precisa, o potencial de membrana pre-cisa ser uniforme ao longo de toda a superfície do axônio e isto ocorre pois o eletrodo de corrente interna é alta-mente condutor. Provoca um curto-circuito na resistência axoplasmática e, assim, zera a resistência do axônio,
ani-quilando qualquer variação nesta tensão ao longo do axônio. Modificado de Kandel et. al. (2014).
Nela, são empregados dois pares de eletrodos, sendo cada um composto por um eletrodo intracelular e um extracelular. O primeiro par captura o potencial de membrana, enquanto o se-gundo, por sua vez, é responsável pela passagem de corrente por ela. Além disso, um amplificador
de retroalimentação negativa é usado, o qual consegue enviar o nível correto de corrente por esta membrana para que ela mude seu potencial para o valor constante estabelecido previa-mente.
Com a despolarização, um fluxo destes íons surge pela membrana e, apesar do resultado esperado a este evento ser uma variação do potencial de membrana, a fixação deste valor o man-tém na amplitude programada. Com isso, um influxo de sódio aparece (devido à sua força motriz eletroquímica), o qual, em uma situação normal, acarretaria uma despolarização da membrana, elevando a concentração de cargas positivas na região interna. No entanto, a fixação da tensão atua neste processo: remove cargas positivas da célula e as envia para o meio externo, gerando uma corrente de mesma amplitude, mas de sentido oposto à corrente iônica pela membrana. Com isso, esta técnica automaticamente impossibilita que esta última atinja um potencial de membrana diferente do potencial pré-estabelecido. Consequentemente, a carga líquida através da membrana se mantém, assim como a tensão no local (sem variação significativa).
Em um experimento característico, inicialmente, o potencial de membrana (que será tra-tado na Seção 3.2.1) é “preso” no seu valor de repouso. Quando um pequeno pulso de despola-rização de 10 mV é aplicado (Figura 23a), uma corrente de saída muito rápida descarrega instan-taneamente a capacitância da membrana (corrente capacitiva, IC). Esta, por sua vez, é seguida por
uma nova corrente de saída (corrente de fuga, IF) através dos canais iônicos de repouso não
de-pendentes (chamados também de canais de vazamento), mas de menor amplitude, a qual per-manece durante o período de existência desta etapa de tensão. Na sequência, após esta etapa, uma breve corrente de entrada capacitiva repolariza a membrana, fazendo com que o valor do seu potencial retorne ao nível inicial e corrente de membrana total a zero.
Em contrapartida, se um grande sinal de despolarização é injetado (Figura 23b), a captação da corrente se torna mais complicada: Ambas correntes capacitiva e de fuga exibem maior am-plitude, e, logo após a passagem da primeira e início da última, surge um terceiro tipo de cor-rente, que é para dentro da célula (negativa), a qual alcança um pico em apenas poucos milisse-gundos, diminui e dá lugar a uma corrente externa, que atinge o platô (permanecendo durante o período do passo de tensão).
A partir desta técnica, pode-se, portanto, verificar que esta fase de tensão despolarizante ativa sequencialmente dois diferentes tipos de canais dependentes de tensão (sensíveis a dois íons diferentes). Estes dois tipos, que produzem correntes com sentidos opostos na célula (um é voltado para o fluxo iônico que produz uma corrente para dentro da célula, enquanto o outro tipo gera corrente para fora), se sobrepõem parcialmente no tempo. Isto cria a questão mais com-plexa: como determinar seus cursos de tempo de forma separada.
Conforme será discutido na Seção 3.2.2, foram os pesquisadores Hodgkin e Huxley os res-ponsáveis por solucionar este impasse. Eles descobriram que é possível estudar de forma isolada os componentes iônicos e capacitivos da corrente separadamente através deste método. Por meio de experimentos com tetraetilamônio (que bloqueia canais de potássio depen-dentes de tensão) no axônio gigante de lula, eles verificaram que a corrente total da membrana é composta pelas correntes capacitiva (IC), de fuga (IF) e de sódio (INa). Como a condutância de
fuga é constante (ou seja, não varia em função do potencial de membrana ou do tempo), então IF pode ser encontrado e subtraído da corrente total na membrana, “sobrando” IC e INa. Dado que
IC é essencialmente instantânea e somente aparece rapidamente no início e término do pulso, ela
pode ser isolada por inspeção visual, mostrando que a corrente resultante é apenas dada pelo fluxo de sódio. De forma semelhante, constataram que é medida a IK quando a tetrodotoxina (que
bloqueia canais de sódio dependentes de tensão) é aplicada.
A partir dessas medidas, então, é possível encontrar a dependência do potencial e tempo com as variações na condutância da membrana provocada pela abertura ou fechamento dos ca-nais de sódio e potássio. Consequentemente, esta técnica dá informações acerca das caracterís-ticas destas duas classes de canais iônicos.
Já na década de 1970, os neurocientistas Bert Sakmann e Erwin Neher desenvolveram um refinamento deste procedimento. Produziram a técnica conhecida como Fixação de Membrana (patch clamp, em inglês), o que os garantiu um Prêmio Nobel já em 1991 (BEAR et. al., 2006).
Através deste método, as correntes iônicas que passam por apenas um canal da mem-brana celular podem ser registradas. A partir disso, foi possível constatar que os canais iônicos controlados por tensão normalmente só exibem dois estados: aberto ou fechado. Quando uma despolarização é introduzida na membrana neuronal, os canais de sódio se abrem de forma tudo
ou nada e, assim, injetam breves pulsos de corrente com amplitude constante e duração variável e, caso esta situação permaneça, esta estrutura irá rapidamente alterar seu estado aberto e entra em um novo de inativação, não permitindo que o fluxo deste íon continue ocorrendo.
Para tanto, uma micropipeta de vidro (1 μm de diâmetro), preenchida com uma solução salina similar ao material normalmente contido no fluido extracelular, pressiona a membrana do neurônio e ministra uma suave sucção por meio deste sensor. O eletrólito presente na micropi-peta entra em contato com um eletrodo metálico e, com isso, ela tem conexão com o circuito elétrico que mede a corrente que flui pelos canais iônicos sob a ponta desta pipeta (Figura 3) (KANDEL et l., 2014).
Figura 3 – Ilustração da técnica de Fixação de Membrana. Adaptado de Lent (2010).
Na sequência, no ano de 1980, Neher percebeu que a porção entre a pipeta e a região de membrana vizinha exibe um considerável aumento da sua vedação quando um pequeno nível de sucção é aplicado nesta pipeta. A consequência é o surgimento de uma região selada com alta resistência entre as regiões interna e externa da pipeta (>109 Ω), o que minimiza o ruído
eletrô-nico e facilita o registro, pois garante que os íons tenham apenas uma via para percorrer: canais na membrana adjacente, o que, consequentemente, amplia a aplicação da técnica de Fixação de Membrana para todos os canais iônicos que se relacionam com a excitabilidade elétrica celular (BEAR et. al., 2006).
Caso o eletrodo se desconecte da célula, a região de membrana adjacente pode ser remo-vida e, assim, é possível captar as correntes iônicas se potenciais elétricos constantes são injeta-dos pela membrana. Como um exemplo, considere que dentro dessa área há um canal de sódio dependente de tensão. Se o potencial de membrana passar de -65 mV para -40 mV, este canal tenderá a abrir e uma corrente fluirá através dele. Enquanto sua amplitude medida em função de tensão elétrica representa a condutância do canal, sua duração reflete o período no qual este se encontra aberto (BEAR et. al., 2006).
Em vista disso, esta técnica confirmou praticamente todas as conclusões de Hodgkin e Huxley. Revelou também a interação íon-membrana neuronal na geração dos sinais bioelétricos detalhadamente (LENT, 2010).
Todavia, apesar da importância deste trabalho e dos que foram produzidos a partir deste, estas abordagens clássicas são invasivas e exigem a utilização de micromanipuladores volumosos. Com isso, o registro em multilocais não pode ser realizado com muitas sondas, restringindo sua aplicação a uma pequena quantidade de neurônios por um período estabelecido (KANDEL, 2014). Adicionalmente, a medição de sinais celulares intracelulares a partir de apenas uma única célula explica de forma limitada os resultados significativos acerca das redes neurais (WANG et. al., 2018).
Para captar a atividade da rede neural, portanto, é imprescindível o registro de diversos neurônios e de forma simultânea. Com isso, torna-se possível estudar o papel que cada célula desempenha na atividade da rede.
Estudos relatam que é necessário tanto injetar uma determinada estimulação nas células como registrar sua atividade neural, no nível celular. O primeiro relato que demonstrou o inte-resse nesse campo foi produzido por Graham e Gerard, no ano de 1946, que mostrou os microe-letrodos de capilar de vidro desenvolvidos por eles (GRAHAM; GERARD, 1946).
Neste cenário, devido às desvantagens associadas aos métodos tradicionais para medi-ções de sinais celulares, houve a necessidade de novas alternativas. Dentre elas, uma opção inte-ressante que é capaz de realizar registros e estimulação de forma não invasiva e por longos perí-odos, muito superiores aos permitidos quando eletrodos convencionais são utilizados é a Matriz de Microeletrodos (MEAs).
2.2 INSTRUMENTAÇÃO RECENTE
Apresentadas como o “método conveniente não destrutivo para manter contato elétrico com uma cultura individual, em um grande número de pontos, durante períodos de dias ou se-manas” no ano de 1972 por Thomas et. al. (1972), atualmente as MEAs (Figura 1a) constituem o estado da arte para dispositivos que possibilitam estudos da dinâmica de redes neuronais (MAS-SOBRIO et. al., 2015).
Desde seu surgimento, elas têm sido empregadas em uma extensa gama de diferentes aplicações. Dentre elas, destacam-se o estudo da atividade espontânea de redes neurais dissoci-adas e fatias de tecido e respostas aos estímulos aplicados (elétricos ou químicos) (PIMASHKIN et. al., 2016; IMBODEN et. al., 2019), a pesquisa fundamental (compreensão do funcionamento e evolução da dinâmica de redes neuronais) (WANG et. al., 2018; MASSOBRIO et. al., 2015) e o mo-nitoramento de drogas (KITAGUCHI et. al., 2016; CLEMENTS, 2016). Podem auxiliar no estudo das funções fisiológicas cerebrais fundamentais (tais como na memória e aprendizado), exercendo um papel significativo no aumento do entendimento de doenças cognitivas, como a epilepsia e Alzheimer. Podem também contribuir na caracterização da dinâmica neuronal de invertebrados e diversas regiões cerebrais de mamíferos (tais como o córtex e hipocampo) (MASSO-BRIO et. al., 2015).
De forma simplificada, consistem basicamente em um arranjo bidimensional de microele-trodos especialmente projetadas para estimulação (química ou elétrica) e/ou detecção da ativi-dade elétrica de células eletricamente excitáveis, ou seja, células que conduzem sinais elétricos via íons e moléculas neurotransmissoras que cruzam a membrana celular, que podem estar iso-ladas ou ser tecidos neuronal, muscular e cardíaco (MASSOBRIO et. al., 2015; LEE et. al., 2017; DU et. al., 2015; TAKETANI; BAUDRY, 2006).
Quando utilizada para caracterização de neurônios, esta ferramenta atua de forma a pos-sibilitar a medida precisa da localização das células ativas e inativas na superfície da MEA, da transmissão dos sinais neurais e até a formação de rede neural entre múltiplos neurônios (a qual não pode ser captada através de dispositivos que possuem apenas um local de medição) (LEE et. al., 2017).
Dentre suas vantagens, incluem-se a capacidade de permitir (KIM et. al., 2014; TAKETANI; BAUDRY, 2006; AQRAWE et. al., 2017; HABIBEY et. al., 2017):
i. Registro da atividade eletrofisiológica celular e estimulação neuronal. Dado que a MEA propicia um ambiente controlado, sobre a qual as células se aderem (através de moléculas de adesão), a MEA não causa danos às células mesmo quando utilizada por longos perío-dos (até semanas);
ii. A observação óptica da cultura. Durante um experimento, a obtenção de imagens via mi-croscopia invertida, de fluorescência, confocal ou de varredura dupla também é possível, já que este dispositivo geralmente possui substrato e outros componentes transparentes; iii. O conhecimento das interações célula-célula em diferentes posições no mesmo tecido e de forma não invasiva. Uma vez que nos métodos tradicionais os neurônios são inspecio-nados individualmente, tornando a medida lenta e complicada, a MEA aparece com uma vantagem: possui um conjunto de eletrodos. Com isso, e considerando que um fator pri-mordial para a obtenção de medidas eletrofisiológicas de boa qualidade se baseia no po-sicionamento destes sensores, a MEA é capaz de captar a atividade elétrica neuronal em multilocais da cultura celular. Portanto, a MEA facilita na monitoração das dinâmicas es-pacial e temporal da atividade elétrica in vitro;
iv. Seu uso como um neuroimplante (dispositivo protético capaz de controlar e/ou substituir as funções de um tecido do sistema nervoso lesado) a longo prazo.
2.2.1 O que a MEA mede? (OBIEN et al., 2014)
Essencialmente, eletrodos neurais são desenvolvidos para os registros neurais: potenciais de ação, com altas razões sinal-ruído para muitos neurônios individuais. Especificamente para estudos in vitro, a MEA contribui para uma melhor compreensão acerca das conexões elétricas entre os neurônios em teste e a sua função no sistema nervoso (KIM et. al., 2018).
Inspirada nisso, cada microeletrodo deste instrumento é especialmente projetado para ser capaz de detectar tanto as variações no campo extracelular (geralmente com amplitude de
dezenas a centenas de microvolts e com duração inferior a 2 ms) provocadas pelo fluxo de cor-rente iônica através da membrana do neurônio mais próximo como também das células vizinhas. Entretanto, o efeito destas correntes transmembrana sobre o potencial medido pelo sensor varia conforme a amplitude do sinal e da distância até o local de registro.
Diferentemente dos Potenciais de Ação (ou PAs, Seção 3.2.2) intracelulares, que somente podem ser adquiridos através de técnicas invasivas, ou seja, acessando diretamente o interior dos neurônio (como Fixação de Membrana), os PAs extracelulares podem ser obtidos com a utilização de eletrodos próximos à célula com distâncias de ~100 μm da origem do spike (potencial elétrico que excede o limiar de disparo de PAs), geralmente em torno do soma ou do segmento inicial do axônio.
Além disso, a MEA também pode registrar potencial de campo local, que é o conteúdo do sinal registrado pelos microeletrodos na banda de baixa frequência (< 300 Hz). Ainda que a con-tribuição dos PAs extracelulares para estes potenciais ainda não esteja muito clara, acredita-se que um fator que pode colaborar para a produção deles é a sincronia dos PAs dos diversos neu-rônios existentes na cultura. Além disso, para neuneu-rônios corticais, a ideia hoje é que estes poten-ciais são originados devido a correntes sinápticas sincronizadas pela geração de dipolos.
2.2.2 Registro na MEA
Com o objetivo de obter bons sinais captados pela MEA, aconselha-se que os microeletro-dos que a compõem tenham dimensão próxima ao tamanho das células às quais se deseja testar. Isto é necessário, pois uma porção significativa do soma neuronal precisa estar em contato com a superfície condutora, dado que axônios individuais não são capazes de cobrir esta região. Além disso, embora sua dimensão possa variar dependendo da aplicação da MEA, e muitas vezes seja desejado um menor eletrodo, deve-se considerar que quanto menor for, maior é a sua impedân-cia, o que pode tornar a gravação e a estimulação ineficazes (GOMES et. al., 2019; VANPELT et. al., 2004).
Conforme pode ser visualizado na Figura 4, as células individuais podem se conectar aos eletrodos, com seu corpo celular revestindo parcialmente a sua superfície. A região “livre” deste
