Na sequência, a próxima etapa é estudar os microeletrodos produzidos. É importante, pois possibilita constatar se o processo de fabricação foi realizado de forma satisfatória.
5.2.1 Investigação dos microeletrodos de grafeno
O primeiro teste realizado para examinar a qualidade dos microeletrodos produzidos con- siste na observação do grafeno. Para tanto, a técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) foi utilizada, e seu resultado é apresentado nas figuras abaixo (Figura 46 e 47).
(a) (b)
(c) (d)
Figura 47 – Imagem de Microscopia Eletrônica de Varredura da segunda versão de MEA fabricada: (a, b) dois micro- eletrodos, onde na porção circular central está o grafeno, enquanto as demais regiões são cobertas pela isolação (SiO2); (c) imagem que destaca uma das bordas da região ativa da MEA, mostrando alguns dos seus microeletrodos
(estruturas circulares) e as trilhas que partem dos primeiros e alcançam os pads de contato (localizados nas extre- midades da lâmina); e (d) ampliação do campo de visão com foco em dois sensores e as respectivas trilhas.
Como pode ser notado, para ambas as MEAs tratadas nesta tese, o grafeno reveste apenas a região dos microeletrodos. Isto mostra que tanto o processo de transferência do grafeno, como as etapas de litografia e corrosão foram realizadas com sucesso.
Devido às propriedades singulares do grafeno, a microscopia óptica convencional muitas vezes não é capaz de caracterizar sua estrutura, uma vez que se torna necessário utilizar uma configuração específica para isso. Uma forma de contornar esta dificuldade é adotar a técnica de espectroscopia Raman. Trata-se de uma ferramenta importante, já que permite investigar a qua- lidade do material analisado, além de confirmar se a transferência deste material foi feita de forma satisfatória, e determinar o número de camadas de grafeno na MEA, através da radiação monocromática ao longo da espectro visível (MALDONADO, 2016).
O equipamento utilizado foi o espectrômetro Raman da Renishaw (Wotton-under-edge, Inglaterra), com laser de comprimento de onda de excitação de 488 nm. A resposta obtida para o grafeno sobre nossas MEAs é exibida na Figura 48.
Como pode ser notado, o dispositivo apresentou aproximadamente a mesma posição de picos Raman típicos do grafeno (MALDONADO, 2016; SILVA, 2015):
i. Banda D (1350 cm-1), que está associada a defeitos na estrutura do grafeno (ligações sp²)
e efeitos de borda (ligações incompletas que tornam mais intensa esta banda);
ii. Banda G (~ 1580 cm-1), que é atribuída aos modos de estiramento C=C da estrutura deste
material. Pode ser definida como um espalhamento Raman de primeira ordem, e aparece em todos os espectros Raman de grupos de carbono com hibridização sp²;
iii. Único perfil Lorentziano da banda G’ (~ 2750 cm-1), ligado à organização da estrutura no
plano bidimensional do grafeno, que, assim como a banda D, surge a partir de um pro- cesso de dupla ressonância. Entretanto, a banda G’ consiste em um harmônico de segunda ordem com plano de vibração distinto do plano para a banda D; e,
iv. Banda G* (~ 2450 cm-1), sendo caracterizado, também, como um processo Raman de du-
pla ressonância.
Tanto o formato quanto a intensidade do último pico (G’) fornecem informações acerca do número de camadas de grafeno e a ordenação de empilhamento sobre a amostra (SILVA, 2015). Conforme pode ser observado na Figura 48, ele exibe formato pontiagudo e é simétrico com uma largura à meia altura(ou full width at half maximum, FWHM) média próxima de 50 cm-1, o que é
evidência de uma camada de grafeno, uma vez que para haver multicamadas de grafeno crescida por processo CVD este valor deve ser superior a 60 cm-1 (BHAVIRIPUDI et al., 2010). Adicional-
mente, o posicionamento do pico G’ também deve ser estudado, uma vez que está ligado à de- formação do floco de grafeno, quando se considera a dopagem por contato (KOERBITZER et al., 2016).
Para confirmar esta afirmação, outro fator que pode ser retirado da medida é a razão das intensidades dos picos G e G’ (IG/ IG’), que está relacionada com a dopagem no grafeno devido à
presença de outro condutor na MEA (BEAMS et al., 2015; DAS et al., 2008). Se o valor obtido es- tiver dentro do intervalo de 2 a 5, então conclui-se que há monocamada de grafeno. Portanto, como o resultado médio encontrado a partir das medidas sobre as MEAs foi de 2,54, caracteri- zando uma única camada, característica desejável, uma vez que monocamadas deste material são
cerca de 10 a 14 vezes mais reativos, se comparado com filmes de grafeno de camada dupla (SAR- KAR, 2013).
Considerando a baixa intensidade do pico D (~ 1350 cm-1), é razoável afirmar também que
há uma grafeno de melhor qualidade presente nas MEAs, com uma baixa densidade de defeitos e impurezas, dado que a sua altura está ligada à existência de bordas e limites de subdomínios sp² (BHAVIRIPUDI et al., 2010; SILVA, 2015). Já o pico próximo à banda G’ (G*, ~1620 cm-1) indica
uma tensão no grafeno, o que pode ser atribuído ao processo de transferência (FERRARI et al., 2006).
Portanto, os resultados obtidos a partir da espectroscopia Raman mostram que o processo de transferência do grafeno sobre a MEA foi satisfatório, com baixa densidade de defeitos.
5.2.2 Caracterização eletroquímica dos microeletrodos
Conforme já discutido anteriormente, a atividade neural é captada na forma de potenciais extracelulares. Para tanto, um eletrodo próximo ao neurônio alvo detecta o disparo de cada neu- rônio e, com isso, quando se trata de MEAs, a razão sinal-ruído deve estar em torno de 5: 1 ou maior durante cada registro (GOMES, 2019).
Embora grande parte do ruído presente no sinal percebido pelas MEAs tipicamente derive de ruído neural (ou seja, de uma quantidade infinita de potenciais de ação indiferenciáveis), ele também depende da impedância dos microeletrodos. Consequentemente, se houver uma ele- vada impedância nestes microeletrodos, o desempenho da MEA será afetado, uma vez que a res- posta captada por eles será minimizada (DU et al., 2015; MULTICHANNEL SYSTEMS, 2018).
Dessa forma, dando procedimento à caracterização dos microeletrodos, três outros testes devem ser realizados nas MEAs: teste de ruído, Voltametria Cíclica (VC) e Espectroscopia de Im- pedância (EI).
5.2.2.1 Teste de ruído
A medição dos níveis de ruído foi obtida a partir do registro de potenciais elétricos nas MEAs, possibilitando, assim, verificar se os eletrodos funcionam adequadamente ou se estão de- feituosos tanto para os dispositivos fabricados neste projeto de doutorado como para um dispo- sitivo padrão da MultiChannel Systems novo. Inicialmente, o reservatório gerado pelo anel de vidro na região central das MEAs foi preenchido com solução salina tampão de fosfato 10 mM (PBS)9, totalizando 2 mL de solução.
Uma vez que as MEAs estão com o meio de cultura no reservatório, elas foram acopladas ao soquete da MultiChannel Systems. Na sequência, este conjunto foi conectado ao sistema RHD2000 da Intan Technologies (Los Angeles, Califórnia, ver Figura 49), com o eletrodo de refe- rência conectado ao canal terra do mesmo. Ele é composto por uma placa amplificadora de 32 canais com cabo de interface SPI para permitir o registro de sinais de biopotenciais (http://www.intantech.com).
A medida foi executada com taxa de amostragem de 10 kHz e dentro de uma gaiola de Faraday, sem filtragem digital. Considerando que não havia cultura biológica no reservatório das MEAs, acredita-se que o sinal captado consista apenas de ruído térmico dos amplificadores.
A Figura 50 exibe a amplitude do ruido detectado para dois microeletrodos de grafeno para as duas MEAs produzidas com nosso processo.
Como pode ser observado abaixo, a amplitude do sinal de ruído obtido para ambas as MEAs produzidas aqui é baixa e dentro da faixa esperada (até 10 µVp-p), o que torna a sua resposta compativel com aquela observada em MEAs comerciais padrões da MultiChannel Systems (MULTICHANNEL SYSTEMS, 2018).
Comparando-se os dois dispositivos produzidos, entretanto, é possível destacar que há uma pequena diferença nos seus resultados. Isto pode ter ocorrido devido a alguma variação no processo de fabricação, durante a etapa de deposição do condutor e/ou da camada de isolação, o que acaba afetando esta medida.
(b)
Figura 49 – Imagens do sistema empregado para a realização do teste de ruído nos microeletrodos das MEAs: (a) fotografia de um dispositivo acoplado ao soquete da MultiChannel Systems; e (b) imagem da placa amplificadora da
Intan Technologies, a qual permite o registro e transmissão dos sinais para o computador.
Para os canais produzidos, amplitudes de ± 5 µV e ±9 µV podem ser observadas, enquanto a MEA comercial padrão exiba niveis de até ± 10 µV, com formato randômico (dados não mostrados). Portanto, nossos eletrodos de grafeno em ambas as MEAs apresentaram sensibilidade a ruído adequada e inferior à encontrada no dispositivo comercial (MULTICHANNEL SYSTEMS, 2018).
Comparando-se ainda os resultados alcançados para as MEAs produzidas neste projeto de doutorado (exibidos na Figura 50), eles também foram próximos àqueles observados para MEAs compostas por microeletrodos de TiN (30 µm de diâmetro, veja Figura 51), produzidas durante o projeto de mestrado (GOMES, 2015).
(a) (b)
Figura 50 – Sinal de ruído captado (em µV) de quatro microeletrodos distintos das duas MEAs discutidas nesta tese de doutorado, ambas em função do tempo. Medida referente às (a) primeira, e (b) segunda versões produzidas,
Figura 51 – Imagem do ruído visualizado para uma MEA produzida com microeletrodos de 30 µm de diâmetro com- postos apenas por TiN, com amostragem de 10 kHz e área ativa contendo dois meios de cultura (NeuroBasal e B27,
totalizando 1 ml de solução). Este dispositivo foi anteriormente fabricado durante o projeto de mestrado (GO- MES, 2015).
É possível notar que a resposta de ruído encontrada para os nossos microeletrodos de grafeno exibiu amplitude similar ao apresentado pela MEA composta por TiN, que é o material padrão para este tipo de dispositivo, devido às suas características (tais como biocompatibilidade, baixa impedância, grande CIC (~1 mC/cm) e excelente estabilidade) (KOERBITZER et. al., 2016; TAKETANI; BAUDRY, 2006; WON et al., 2018). Isto indica que eles também apresentam potencial para serem empregados para medições de culturas de células neuronais.
Além disso, nossos resultados são tambem compatíveis com os valores encontrados por Kireev et al. (2017) (veja Figura 52). Em seu estudo, o ruído para seus microeletrodos de grafeno de 20 µm de diâmetro, sobre substrato de silício/ SiO2 e borofloat foi da ordem de 10,7 ± 7,2 µV
(a) (b)
Figura 52 – Diagrama esquemático da MEA desenvolvida por Kireev et al. (2017): (a) Os microeletrodos são com- postos apenas de grafeno, enquanto a isolação foi feita por HD-8820, tudo sobre substrato de silício ou borofloat;
(b) Nota-se que este dispositivo é composto por 36 canais distribuídos em uma matriz quadrada (KIREEV et al., 2017).
Enquanto isso, na pequisa publicada por Du et al. (2015), que também aborda medida de impedância (a qual será tratada nesta tese de doutorado também) para microeletrodos fabricados de 20 µm de diâmetro sobre substrato de quartzo, a amplitude do ruído medido foi 15 ± 5 µV (DU et al., 2015).
Consequentemente, é possível concluir que mesmo havendo uma pequena diferença entre as respostas obtidas para as MEAs geradas neste projeto de doutorado, as amplitudes de ruído medidas ainda são adequadas, tornando nossos microeletrodos adequados para serem empregados para medidas biológicas.
Com o intuito de confirmar esta afirmação, o valor da raiz quadrada média (ou root mean square em inglês, RMS) para o sinal de ruído captado foi encontrado. Para o sinal bruto (ou seja, sem filtragem), a amplitude alcançada para nossos microeletrodos de grafeno da primeira e segunda versões foi 2,84 µV e 3,75 µV, respectivamente. Este resultado também é satisfatório, dado que está dentro do intervalo 2,5-5 µV, faixa na qual um microeletrodo é considerado funcional (VIDOR, 2014).
5.2.2.2 Voltametria Cíclica (KHALAFI; RAFIEE, 2017)
Na sequência, o teste de Voltametria Cíclica foi realizado. Trata-se de uma técnica popular comumente utilizada no estudo dos processos de redução e oxidação de espécies moleculares e de reações químicas desencadeadas pela transferência de elétrons, incluindo a catálise. Geral- mente, os experimentos utilizam um sistema de três eletrodos mergulhados em uma solução com alta concentração de um sal denominado eletrólito de suporte.
Assim, em cada estudo voltamétrico, os eletrodos podem ser classificados como:
i. Eletrodo de trabalho (ou indicador), que consiste no eletrodo de interesse. Pode ser com- posto por diversos tipos de materiais (tais como mercúrio, carbono vítreo, platina, ouro, grafite e pasta de carbono), dependendo da sua janela de potencial10 e seu impacto nos
processos de transferência, com diferentes dimensões e formatos (tais como esférico, haste e disco). No caso de teste em MEAs, este componente é cada microeletrodo do dis- positivo;
ii. Contra-eletrodo (ou auxiliar). Juntamente com o anterior, ele cria um circuito o qual mede a corrente ao mesmo tempo que a corrente voltamétrica flui entre estes dois eletrodos. Ele deve ser não reativo e estável, com grande área de superfície de tal forma a prevenir uma limitação de passagem de corrente através da célula eletroquímica; e,
iii. Eletrodo de referência (como eletrodo padrão de hidrogênio, calomel saturado ou Ag|AgCl11): conforme seu nome indica, este componente proporciona uma tensão fixa de
referência para a medida, além de estabelecer uma tensão bem definida contra a qual o potencial do eletrodo de trabalho é medido.
10 Faixa de tensão na qual não há reações eletroquímicas nas superfícies dos eletrodos (KHALAFI; RAFIEE, 2017). 11 Uma vez que é complicado determinar precisamente o eletrodo de hidrogênio durante experimentos de rotina, o eletrodo calomel saturado e o de Ag|AgCl consistem nos sensores mais comumente empregados durante os experi- mentos, além de serem precisos para soluções aquosas. Entretanto, devido a existência de mercúrio no eletrodo de calomel, o que pode implicar em riscos à saúde, o último se destaca como melhor opção para utilização como ele- trodo de referência e é o mais comum (KHALAFI; RAFIEE, 2017).
Além disso, o componente essencial da configuração eletroquímica do teste de voltametria cíclica é o potenciostato (Figura 53), um circuito elétrico normalmente descrito em termos de amplificadores operacionais básicos. Seu sistema controla a tensão elétrica no eletrodo de traba- lho com relação ao eletrodo de referência, enquanto permite que aproximadamente nenhuma corrente atravesse o último, fluindo apenas pelos eletrodos de trabalho e contra eletrodo (o qual precisa ter seu potencial ajustado para permitir o aparecimento de uma reação eletroquímica oposta àquela no eletrodo de trabalho).
Figura 53 – Diagrama esquemático do potenciostato ligado a uma célula eletroquímica da configuração empregada na medida de VC. Os símbolos “T”, “R” e “C” representam os eletrodos de trabalho, de referência e contra-ele- trodo, enquanto “1” e “2” são os componentes onde o potencial E é aplicado, sem corrente fluindo, e medição da corrente conduzida no contra-eletrodo, respectivamente. Adaptado de (BROWNSON; BANKS, 2014; KHALAFI; RAI-
FEE, 2017).
Assim, no procedimento de VC, a tensão do eletrodo de trabalho é variada ciclicamente e a uma taxa constante entre dois valores (forma de onda triangular) com relação ao eletrodo de referência, ao mesmo tempo em que permite que uma corrente flua entre o eletrodo de trabalho
e um contra eletrodo (ELGRISHI et al., 2018; JEONG et al., 2017). Dessa forma, a curva resultante desta medida é denominada voltamograma cíclico. Nele, o eixo x representa um parâmetro do sistema, o potencial aplicado, enquanto o eixo y mostra a corrente resultante (vide Figura 54).
a) b)
Figura 54 – (a) Perfil potencial versus tempo usado durante o teste de voltametria cíclica. Durante o teste, o poten- cial é variado entre E1 e E2 de forma cíclica. Durante toda a varredura, um potenciostato detecta a corrente resul-
tante que aparece através da tensão aplicada; e (b) exemplo de voltamograma cíclico típico para um eletrodo a uma taxa de varredura de 100 mV/s, com destaque para os potenciais de pico catódico e anódico. Modificado de
(ELGRISHI et al., 2018; BROWNSON; BANKS, 2014).
O teste de VC foi, portanto, aplicado para tentar detectar se os microeletrodos da MEA funcionam adequadamente e se, consequentemente, poderão realizar as funções de captar sinais elétricos celulares e/ou estimular.
Para tanto, inicialmente é aplicado um potencial cuja amplitude não induz nenhuma rea- ção de redução na solução (sem transferência de elétrons). Na sequência, ele é variado até que atinja níveis mais negativos (catodicamente) do ponto A (potencial inicial formal, 𝐸 = 𝐸 ) ao ponto D (potencial de comutação), momento no qual aparecem reações de redução na solução, resultando na corrente conhecida como corrente catódica (ipc), até alcançar o primeiro pico da
curva de voltametria cíclica (ponto C da Figura 54), denominado tensão de pico catódico (Epc).
difusão tem sua espessura aumentada, comparada com a existente no ponto A (~10 µm) e surge quando todo o material na superfície do eletrodo foi reduzido. Entretanto, este quadro não per- manece por um longo período, uma vez que a espessura da camada de difusão (volume de solu- ção na superfície do eletrodo) cresce com o tempo (pois a solução não é agitada) e, com isso, a corrente diminui conforme a varredura continua (do ponto C ao D, momento no qual a camada de difusão atinge espessura de 40 µm, na Figura 54). A partir do momento no qual as reações de redução extinguem-se (ponto D da Figura 54), o potencial é varrido no sentido oposto até retornar ao valor inicialmente testado (o que está representado no trajeto do ponto D ao G da Figura 54). Caso esta reação seja do tipo reversível, então os produtos criados durante a primeira fase de variação do potencial e que estiverem na vizinhança do eletrodo oxidarão, o que induz o surgi- mento da corrente anódica (Ipa) até que surge na curva de VC um novo pico de tensão (simétrico
ao primeiro), denominado potencial de pico anódico (Epa), momento no qual todo o material na
superfície do eletrodo foi oxidado (ELGRISHI et al., 2018; PACHECO et al., 2013).
Os processos físicos relacionados ao formato da curva do voltamograma cíclico ‘reversí- vel’, para a reação 𝐴 + 𝑛𝑒 → 𝐵, baseiam-se em duas leis. As concentrações dos produtos de oxidação e redução são modificadas proporcionalmente à diferença de potencial administrada e do potencial formal da espécie em questão. Assim, a relação entre estas concentrações de equi- líbrio das formas reduzida e oxidada de um par redox na superfície do eletrodo é associada ao potencial (E) através da equação de Nerst, conforme mostra a Equação 8 (KHALAFI; RAFIEE, 2017):
𝐸 − 𝐸 = 𝑅𝑇 𝑛𝐹ln [𝐵] [𝐴] (8) Com: E = potencial aplicado
𝐸 = potencial formal, no qual as formas reduzida e oxidada aparecem com concentrações iguais
R = constante dos gases (JK-1mol-1)
T = temperatura absoluta (K)
F = constante de Faraday
Além disso, o consumo da forma de oxidação e a geração da forma de redução na super- fície do eletrodo gera uma diferença entre as concentrações dependentes da tensão na sua su- perfície e das concentrações massa das espécies eletroativas. Com isso, através destes gradientes de concentração são os responsáveis pela difusão das espécies de acordo com a primeira e se- gunda leis de Fick (KHALAFI; RAFIEE, 2017):
𝐽 = −𝐷 𝜕𝜙 𝜕𝑥 (9) 𝜕𝜙 𝜕𝑡 = 𝐷 𝜕 𝜙 𝜕 𝑥 (10)
Sendo J o fluxo de difusão (mol.m-2s-1), D, o coeficiente de difusão (m²s-1), 𝜙, o gradiente de con-
centração, x, a posição (m), e t, o tempo (s).
Dessa forma, dentre os parâmetros que podem ser extraídos de uma medida de voltame- tria cíclica, os mais importantes são a corrente de pico (IP), o potencial de pico (EP), o número de
elétrons transferidos por molécula de reagente (n), a constante de difusão (D) e a reversibilidade eletroquímica, as quais serão tratadas na sequência (MARKS et al., 2007).
As correntes de pico (tanto a catódica quanto a anódica), para um sistema reversível, po- dem ser descritas através da equação de Randles-Sevcik (MADOU, 2011):
𝑖 = 2,6910 𝑛 / 𝐴 (𝐷𝑣) / 𝐶 (11) Com: n = número de elétrons A = área do eletrodo D = coeficiente de difusão (5.10-6 cm²s-1) v = taxa de varredura (V/s) C = concentração das espécies
Portanto, pode-se notar que a IP é diretamente proporcional à concentração e a v1/2. Para
sistemas reversíveis, esta corrente é proporcional à taxa de varredura, mas o potencial de pico, não. Assim, a largura do pico pode ser obtida através da seguinte relação (MARKS et al., 2007):
𝐸 − 𝐸 / =
59
𝑛 , 𝑑𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑚 𝑚𝑉 𝑎 25º𝐶
(12)
Como pode ser observado na Figura 54, nos pontos B e E, as concentrações de A e B na superfície dos microeletrodos são iguais e, seguindo a equação de Nernst, E = Ep/2, que corres-
ponde ao potencial intermediário entre os dois picos (C e F12) da curva de VC. Ou seja, representa
os picos de potenciais médios dos processos de oxidação e redução, conforme consta na Equa- ção 13 (KHALAFI; RAFIEE, 2017):
𝐸 / =
𝐸 + 𝐸 2
(13)
Com:
𝐸 = potencial de pico catódico (de redução) 𝐸 = potencial de pico anódico (de oxidação)
Em função disso, e considerando a equação de Nernst, pode-se encontrar que 𝐸 consiste no potencial com concentrações iguais das formas de oxidação e redução. Uma vez que estas concentrações na superfície do eletrodo em um determinado potencial são também influencia- das pelos coeficientes de difusão, o E1/2 pode variar em função das constantes de difusão, ao
mesmo tempo em que a relação E1/2 – 𝐸 é dada conforme Equação 14 (KHALAFI; RAFIEE, 2017):
𝐸 / = 𝐸 + 𝑅𝑇 𝑛𝐹ln( 𝐷 𝐷 ) / (14)
12 Os dois picos da curva de voltametria cíclica encontram-se distantes em função da difusão do analito do microele- trodo e para ele (KHALAFI; RAFIEE, 2017).
Caso os pares redox nos quais as formas de oxidação e redução possuam constantes de difusão iguais, então 𝐸 também será igual.
Se o processo de transferência de elétrons for reversível, as correntes de pico anódico e catódico são iguais. Com isso, a separação dos picos, ou seja, a diferença entre o Epa e Epc (ou ΔEp)
depende apenas do número de elétrons (n) na reação, independentemente da velocidade de var- redura, como pode ser verificado na Equação 15 abaixo (MARKS et al., 2007):
∆𝐸 = 𝐸 − 𝐸 =59
𝑛 , 𝑑𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑚 𝑚𝑉 𝑎 25º𝐶
(15)
Neste ponto, entretanto, é interessante destacar que a resposta possui uma diferença sig- nificativa quando é analisado um macroeletrodo e um microeletrodo (Figura 55).
(a)
(b)
Figura 55 – Diferença na medida de voltametria cíclica quando é testado um (a) macroeletrodo e um (b) microele- trodo. Modificado de (BROWNSON; BANKS, 2014).
No primeiro, a eletrólise de A acontece através de toda a superfície do eletrodo testado, de modo que a difusão de A para ele ou de B para a superfície do eletrodo é do tipo planar. Nesta
situação, denominada “difusão limitada”, nota-se um pico assimétrico. Já nas suas bordas, região