Apresentadas como o “método conveniente não destrutivo para manter contato elétrico com uma cultura individual, em um grande número de pontos, durante períodos de dias ou se- manas” no ano de 1972 por Thomas et. al. (1972), atualmente as MEAs (Figura 1a) constituem o estado da arte para dispositivos que possibilitam estudos da dinâmica de redes neuronais (MAS- SOBRIO et. al., 2015).
Desde seu surgimento, elas têm sido empregadas em uma extensa gama de diferentes aplicações. Dentre elas, destacam-se o estudo da atividade espontânea de redes neurais dissoci- adas e fatias de tecido e respostas aos estímulos aplicados (elétricos ou químicos) (PIMASHKIN et. al., 2016; IMBODEN et. al., 2019), a pesquisa fundamental (compreensão do funcionamento e evolução da dinâmica de redes neuronais) (WANG et. al., 2018; MASSOBRIO et. al., 2015) e o mo- nitoramento de drogas (KITAGUCHI et. al., 2016; CLEMENTS, 2016). Podem auxiliar no estudo das funções fisiológicas cerebrais fundamentais (tais como na memória e aprendizado), exercendo um papel significativo no aumento do entendimento de doenças cognitivas, como a epilepsia e Alzheimer. Podem também contribuir na caracterização da dinâmica neuronal de invertebrados e diversas regiões cerebrais de mamíferos (tais como o córtex e hipocampo) (MASSO- BRIO et. al., 2015).
De forma simplificada, consistem basicamente em um arranjo bidimensional de microele- trodos especialmente projetadas para estimulação (química ou elétrica) e/ou detecção da ativi- dade elétrica de células eletricamente excitáveis, ou seja, células que conduzem sinais elétricos via íons e moléculas neurotransmissoras que cruzam a membrana celular, que podem estar iso- ladas ou ser tecidos neuronal, muscular e cardíaco (MASSOBRIO et. al., 2015; LEE et. al., 2017; DU et. al., 2015; TAKETANI; BAUDRY, 2006).
Quando utilizada para caracterização de neurônios, esta ferramenta atua de forma a pos- sibilitar a medida precisa da localização das células ativas e inativas na superfície da MEA, da transmissão dos sinais neurais e até a formação de rede neural entre múltiplos neurônios (a qual não pode ser captada através de dispositivos que possuem apenas um local de medição) (LEE et. al., 2017).
Dentre suas vantagens, incluem-se a capacidade de permitir (KIM et. al., 2014; TAKETANI; BAUDRY, 2006; AQRAWE et. al., 2017; HABIBEY et. al., 2017):
i. Registro da atividade eletrofisiológica celular e estimulação neuronal. Dado que a MEA propicia um ambiente controlado, sobre a qual as células se aderem (através de moléculas de adesão), a MEA não causa danos às células mesmo quando utilizada por longos perío- dos (até semanas);
ii. A observação óptica da cultura. Durante um experimento, a obtenção de imagens via mi- croscopia invertida, de fluorescência, confocal ou de varredura dupla também é possível, já que este dispositivo geralmente possui substrato e outros componentes transparentes; iii. O conhecimento das interações célula-célula em diferentes posições no mesmo tecido e de forma não invasiva. Uma vez que nos métodos tradicionais os neurônios são inspecio- nados individualmente, tornando a medida lenta e complicada, a MEA aparece com uma vantagem: possui um conjunto de eletrodos. Com isso, e considerando que um fator pri- mordial para a obtenção de medidas eletrofisiológicas de boa qualidade se baseia no po- sicionamento destes sensores, a MEA é capaz de captar a atividade elétrica neuronal em multilocais da cultura celular. Portanto, a MEA facilita na monitoração das dinâmicas es- pacial e temporal da atividade elétrica in vitro;
iv. Seu uso como um neuroimplante (dispositivo protético capaz de controlar e/ou substituir as funções de um tecido do sistema nervoso lesado) a longo prazo.
2.2.1 O que a MEA mede? (OBIEN et al., 2014)
Essencialmente, eletrodos neurais são desenvolvidos para os registros neurais: potenciais de ação, com altas razões sinal-ruído para muitos neurônios individuais. Especificamente para estudos in vitro, a MEA contribui para uma melhor compreensão acerca das conexões elétricas entre os neurônios em teste e a sua função no sistema nervoso (KIM et. al., 2018).
Inspirada nisso, cada microeletrodo deste instrumento é especialmente projetado para ser capaz de detectar tanto as variações no campo extracelular (geralmente com amplitude de
dezenas a centenas de microvolts e com duração inferior a 2 ms) provocadas pelo fluxo de cor- rente iônica através da membrana do neurônio mais próximo como também das células vizinhas. Entretanto, o efeito destas correntes transmembrana sobre o potencial medido pelo sensor varia conforme a amplitude do sinal e da distância até o local de registro.
Diferentemente dos Potenciais de Ação (ou PAs, Seção 3.2.2) intracelulares, que somente podem ser adquiridos através de técnicas invasivas, ou seja, acessando diretamente o interior dos neurônio (como Fixação de Membrana), os PAs extracelulares podem ser obtidos com a utilização de eletrodos próximos à célula com distâncias de ~100 μm da origem do spike (potencial elétrico que excede o limiar de disparo de PAs), geralmente em torno do soma ou do segmento inicial do axônio.
Além disso, a MEA também pode registrar potencial de campo local, que é o conteúdo do sinal registrado pelos microeletrodos na banda de baixa frequência (< 300 Hz). Ainda que a con- tribuição dos PAs extracelulares para estes potenciais ainda não esteja muito clara, acredita-se que um fator que pode colaborar para a produção deles é a sincronia dos PAs dos diversos neu- rônios existentes na cultura. Além disso, para neurônios corticais, a ideia hoje é que estes poten- ciais são originados devido a correntes sinápticas sincronizadas pela geração de dipolos.
2.2.2 Registro na MEA
Com o objetivo de obter bons sinais captados pela MEA, aconselha-se que os microeletro- dos que a compõem tenham dimensão próxima ao tamanho das células às quais se deseja testar. Isto é necessário, pois uma porção significativa do soma neuronal precisa estar em contato com a superfície condutora, dado que axônios individuais não são capazes de cobrir esta região. Além disso, embora sua dimensão possa variar dependendo da aplicação da MEA, e muitas vezes seja desejado um menor eletrodo, deve-se considerar que quanto menor for, maior é a sua impedân- cia, o que pode tornar a gravação e a estimulação ineficazes (GOMES et. al., 2019; VANPELT et. al., 2004).
Conforme pode ser visualizado na Figura 4, as células individuais podem se conectar aos eletrodos, com seu corpo celular revestindo parcialmente a sua superfície. A região “livre” deste
eletrodo fica conectado com a solução salina (meio de cultura), que, por sua vez, fica ligada ao terra. Dessa forma, após o registro da atividade elétrica celular por este sensor, a informação é transmita através das trilhas até os pads de contato, que se comunicam com o amplificador, com- ponente responsável pelo registro da somatória dos potenciais medidos (MASSOBRIO et al., 2016; TAKETANI; BAUDRY, 2006).
Figura 4 – Diagrama equivalente elétrico para registros extracelulares através de eletrodos planares da MEA. Após a detecção da atividade elétrica pelos eletrodos (região central do dispositivo), este sinal é transmitido para os pads
de contato via trilhas. Na sequência, ele é captado pelo amplificador (à direita na imagem) que, por sua vez, envia este dado ao sistema de medidas para seu posterior processamento pelo experimentador. Adaptado de TAKETANI;
BAUDRY (2006).
Se a pequena resistência do meio de cultura (Rb) sobre o eletrodo “livre” for desconside-
rada, a razão entre a tensão no pad de contato (Vpad) e no espaço entre a membrana neuronal e
o eletrodo (VJ) pode ser encontrada pela Equação 1 (TAKETANI; BAUDRY, 2006):
𝑉 𝑉 = 𝐶 𝐶 + 𝐶 ≈ 𝐴 𝐴 (1)
Onde: CJE é a capacitância da área coberta do eletrodo com tamanho AJE, CE é a capacitância de
Uma vez que Csh é muito maior que CE, a amplitude do sinal registrado varia linearmente
em função da relação entre a área coberta e área total do eletrodo. Dessa forma, se houver uma passivação ideal, com Csh negligenciada, e uso de filtros passa banda também ideais (ou seja, in-
finita impedância de entrada, pequena frequência de corte do filtro passa alta e alta frequência de corte do filtro passa baixa), os microeletrodos da MEA podem operar como seguidores de tensão independentes da frequência para o monitoramento dos sinais celulares sem corrente (TAKETANI; BAUDRY, 2006).
Baseada nesta teoria, Buitenweg et. al. (2003) propuseram considerações mais avançadas para melhorar a compreensão da conexão entre as células unitárias. Em seu trabalho, o estudo das propriedades elétricas entre a membrana neuronal passiva, a membrana com canais iônicos dependentes de tensão e o eletrodo planar é proposto via modelagem de elementos finitos ba- seada na geometria (TAKETANI; BAUDRY, 2006).
Diferentemente do caso para células unitárias, nos registros de sinais elétricos de fatia de tecido, a distribuição espacial dos potenciais neste material sobre a superfície dos microeletrodos é mensurada com relação ao eletrodo de referência que fica posicionado no meio de cultura (Fi- gura 5).
Figura 5 – Diagrama esquemático do sistema de medida da atividade elétrica de fatias de tecidos com a MEA. Seus eletrodos podem atuar como meios de registro dos sinais ou como estimuladores. Adaptado de TAKETANI; BAUDRY
Esta atividade elétrica, que pode ser instantânea ou induzida por estimulação, se distribui dentro dos compartimentos celulares (como seus dendritos ou cone de implantação do axônio) e entre as células através das conexões sinápticas. Isto provoca a geração de fluxos de corrente iônica através do fluido extracelular, a qual se relaciona com o gradiente de tensão extracelular que é modificado com o tempo e espaço dependendo do curso temporal da atividade temporal e da distribuição espacial e orientação das células (TAKETANI; BAUDRY, 2006).
Adicionalmente, com base no estudo de Egert et. al. (2002), foi observado que os registros podem exibir tanto potenciais de campo lentos, como spikes rápidos decorrentes dos PAs. Ou pesquisadores também notaram que os microeletrodos conseguem captar estes sinais (os spikes) em distâncias de até 100 μm a partir de um neurônio em uma fatia de tecido aguda, enquanto as fontes de sinal estão dentro de um raio de 30 μm ao redor do centro do eletrodo (TA- KETANI; BAUDRY, 2006).
2.2.3 Estimulação na MEA (TAKETANI; BAUDRY, 2006)
Além disso, conforme citado anteriormente, os eletrodos da MEA também podem ser em- pregados para estimulação elétrica extracelular, o que pode ocorrer através da aplicação de pul- sos de corrente ou de tensão no meio.
Em princípio, o circuito equivalente para a estimulação é igual ao exibido na Figura 4. A única diferença é a substituição do amplificador por uma fonte de estimulação. A injeção de ten- são nos microeletrodos da MEA carrega a capacitância da interface eletrólito-metal. Como con- sequência, rápidas, grandes e transitórias correntes capacitivas (e de sinal oposto nos pontos de subida e descida da curva dos pulsos de tensão) surgem e isto induz uma também transitória hiperpolarização e despolarização das membranas neuronais (FROMHERZ; STETT, 1995; STETT et. al., 2000).
Esta condição é similar ao efeito de rápidos pulsos de corrente bifásicos normalmente uti- lizados durante estimulação segura em tecidos. Apesar disso, a polarização da membrana celular depende principalmente do gradiente de tensão produzido pela densidade de corrente local, as- sim como a resistência do tecido nas proximidades das células. Dessa forma, o êxito do processo
de estimulação varia conforme a dissipação efetiva da corrente aplicada na interface entre ele- trodo e tecido e na região interna deste último. A carga gerada por estes pulsos de corrente, por sua vez, somente varia conforme a sua amplitude e duração, enquanto pulsos de tensão depen- dem também da resistência do tecido e a capacitância da interface entre eletrodo e tecido (TEHOVNIK, 1996).
Embora, em certos casos, espera-se que o eletrodo seja capaz de aplicar grandes pulsos estimulantes, por motivação eletroquímica, a tensão nele precisa ser controlada constantemente e mantida o mais baixo possível. Isto faz com que este eletrodo apresente uma elevada capaci- dade de injeção de carga, parâmetro que define o quanto ele pode carregar sem causar reações eletroquímicas irreversíveis na região entre eletrodo e eletrólito.
2.2.4 História da MEA (TAKETANI; BAUDRY, 2006)
Historicamente, o primeiro estudo relacionado à MEA foi realizado no ano de 1972, por Thomas et. al. (1972). Nele, os autores desenvolveram uma matriz de 30 eletrodos planares feitos de ouro com platina negra (com 100 μm de espaçamento) sobre vidro, para estudo da atividade espontânea de culturas de cardiomiócitos de galinha. A razão para a escolha destes materiais reside no fato do primeiro possuir baixa impedância, enquanto o último induz melhoria na relação sinal-ruído.No entanto, a camada de platina de tais eletrodos se degrada com o tempo, deixando- os instáveis (BLUM, 2007).
Os primeiros registros foram realizados a partir de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de pintinhos e não geraram bons resultados. Segundo os autores, as dificuldades observa- das nos testes deviam-se à existência de uma camada de glia entre os neurônios e o eletrodo. Apesar disso, este componente é essencial para a manutenção da cultura, já que é responsável por fornecer tanto suporte mecânico como nutrição aos primeiros. Entretanto, age também como um isolante, prejudicando a condução do sinal elétrico até o sensor (RAI-CHOUDRY, 1997; JUN- QUEIRA; CARNEIRO, 2006).
Já para os testes com cardiomiócitos dissociados de pintinhos, após a formação de uma camada de contração confluente sobre os microeletrodos, foi possível obter sinais robustos, com
amplitudes entre 20 e 100 μV, enquanto células isoladas ou aglomeradas não geraram nenhum sinal mensurável. De acordo com eles, isto ocorre porque a corrente que entra nas células e que inicia a sua contração pode criar potenciais extracelulares sobre uma grande porção desta célula. Portanto, quando células unitárias ou até um pequeno conjunto de células é testado, esta cor- rente não induz uma variação de tensão local suficiente na região próxima a um eletrodo.
Desde então, diversas pesquisas têm sido impulsionadas. No ano de 1977, Gross et. al. (1977) introduziram a ideia de uma matriz de 36 microeletrodos de ouro (10 μm de diâmetro, com 100 ou 200 μm de espaçamento), sem qualquer conhecimento acerca do trabalho de Thomas et. al. (1972). O diferencial de seu estudo reside no fato de conseguirem registrar PAs unitários a partir de um gânglio de caracol isolado, cujas amplitudes foram de até 3 mV (depen- dendo do tamanho da célula testada).
Na sequência, Pine e colaboradores (1980) formaram o primeiro grupo a acessar o sinal elétrico de um único neurônio dissociado com sucesso. A MEA empregada era formada por duas linhas paralelas de 16 eletrodos de ouro (com área de 10 µm² e espaçamento de 250 µm), plati- nizados e com isolação de dióxido de silício. Em neurônios do gânglio cervical superior de ratos (de 20 μm de diâmetro, crescidos de 1 a 3 semanas em cultura sobre substrato de colágeno fi- broso de 3 a 5 μm de espessura), eles perceberam que estes sensores podem ser utilizados para estimulação com pulsos de tensão de 0,5 V por 1 ms. Conseguiram também captar sinais a uma distância de 25 μm dos eletrodos com amplitudes médias de 50 µV, com razão sinal – ruído de 5 a 15: 1, similar ao observado in vivo, embora com menor amplitude. Esta resposta já seria espe- rada, uma vez que a resistividade cerebral é superior à do ambiente de cultura celular empregada no experimento com a MEA.
Já em 1982, o estudo de Gross e colaboradores (1982) mostrou a captação da atividade de culturas dissociadas da medula espinhal. Neste estudo, eles verificaram que o sinal captado é dependente da temperatura abaixo de 30ºC, de forma que cai rapidamente até um valor pequeno quando em temperatura ambiente.
Foi notado uma extensa variedade de padrões na atividade captada, com momentos pe- riódicos e não periódicos (Figura 6). Entretanto, tais resultados apenas foram analisados de forma mais aprofundada alguns anos mais tarde por Droge et. al. (1986) após novos experimentos.
Figura 6 – Sinais registrados por Gross et. al. através de três eletrodos muito distantes (até 1 mm) em toda a mono- camada de cultura cortical, durante quatro semanas in vitro (GROSS et. al., 1982).
Uma nova abordagem para a MEA foi, a seguir, proposta por Jobling et al. (1981). O dis- positivo usado aqui era composto por 9 eletrodos, que atuavam como portas de transistores de efeito de campo (ou field effect tranistors em inglês, FET) em um chip de silício. Para gravações em fatias de tecido do hipocampo, os sinais exibiram boa relação sinal-ruído ao mesmo tempo em que um eletrodo de estimulação convencional aplicava estimulação no trato da fibra.
A partir do ano de 1986, Wheeler e Novak produziram MEAs passivas para investigar a atividade de fatias do hipocampo, analisando também as densidades de fontes de corrente dos potenciais de campo (NOVAK; WHEELER, 1988; WHEELER; NOVAK, 1986). Sua MEA exibia 32 ele- trodos platinizados (com 20 µm de diâmetro e 200 µm de espaçamento) e passivação de polii- mida. Além disso, foram os primeiros a relatarem o uso de MEAs voltado para estudos farmaco- lógicos.
No ano de 1989, dois outros grupos empregaram as matrizes de microeletrodos fabricadas por Gilbert e Pine. Tais dispositivos eram compostos por 61 eletrodos de platina negra, trilhas de ITO e isolação de poliimida, tudo sobre substrato de vidro (Figura 7).
Figura 7 – MEA construída no laboratório de Pine. À esquerda, verifica-se a estrutura dos eletrodos, enquanto na direita é exibida uma fotografia deste dispositivo. Consiste em uma matriz de platina negra em formato hexagonal, com espaçamento intereletrodo de 70 μm, com trilhas de óxido de índio estanho (para não interferir na observação
óptica) e isolação de poliimida, sobre substrato fino de vidro (MEISTER et. al., 1994; REGEHR et. al., 1989).
O primeiro trabalho relatado foi produzido pelo grupo de Regehr e colaboradores (1989), cujo foco de estudo se concentrou em neurônios de invertebrados (caracóis, aplysia e sangues- sugas). Segundo os autores, foi possível registrar sinais de grande amplitude. Alguns neurônios estavam posicionados sobre os sensores e isto poderia selá-lo, o que faria com que o acoplamento capacitivo produzisse uma cópia do potencial de ação intracelular. Entretanto, o soma ou pro- cesso de outros neurônios estavam apenas próximos dos mesmos, e esta situação gera um selo fraco entre eles com consequente produção de corrente interna durante a propagação do poten- cial de ação.
Enquanto isto, Meister e seus colaboradores (MEISTER et al., 1994; MEISTER et al., 1989) empregaram a MEA de Pine com o intuito de estudar a atividade da retina de salamandra explan- tada. Durante a realização do experimento, que durou várias horas, ela se manteve saudável e os fotorreceptores responderam aos estímulos luminosos aplicados através de uma tela de tubos de raios catódicos (CRTs). Os sinais extracelulares observados eram bastante limpos e aumentados, o que acreditaram ser devido à condutividade relativamente pequena do tecido de retina sobre- jacente.
Mais tarde, o mesmo arranjo experimental empregado para os experimentos com sala- mandra foi também aplicado para testes com retinas de furões e ratos recém-nascidos (momento no qual o desenvolvimento das conexões da retina ainda ocorrem). Mesmo sem estímulos, eles obtiveram bons registros, o que mostra a existência de atividade espontânea (MEISTER et. al., 1991).
Já em 1991, o grupo de Fromherz usaram um FET no registro de potenciais de ação de grandes células de Aplysia Retzius, com diâmetro de aproximadamente 50 μm. Dado que a porta (de 6 a 10μm) isolada do FET foi completamente revestida pela célula, os autores afirmam que eles conseguiram visualizar uma ampla faixa de sinais, o que julgaram ser um efeito das variações do contato entre a porta e a célula, constituindo o acontecimento que iniciou a pesquisa por esta equipe para estudar a interface entre o FET e o neurônio (FROMHERZ et. al., 1991).
Outro trabalho interessante envolvendo MEAs pertence a Welsh e seus colaboradores. Após experimentos com as MEAs fabricadas no laboratório Pine, eles relataram que tais disposi- tivos também podem ser empregados para registros de culturas neurais durante longos períodos. A partir de testes com neurônios supraquiasmáticos (neurônios do núcleo supraquiasmático, no hipotálamo, responsáveis pela geração do ritmo circadiano do ciclo sono-vigília), eles obtiveram uma resposta bastante inesperada: não houve sincronização da cultura, mas uma oscilação da atividade de cada neurônio independentemente durante cerca de 1 dia. Consequentemente, isto os motivou a dizer que cada um desses neurônios deve ter seu próprio gerador de ritmo circadi- ano de forma independente (LENT, 2010; WELSH et. al., 1995).
Após isto, no ano de 1997, Thiébaud e seus colaboradores, ao concentrarem seus esforços no aperfeiçoamento no registro de atividade celular de fatias de tecidos, produziram MEAs tridi- mensionais (45 µm de altura) sobre substratos de silício perfurados (veja Figura 8). Além disso, um reservatório que contém o meio de cultura liga a fatia de tecido ao substrato (THIÉ- BAUD et. al., 1997).
Figura 8 – Ilustração do aparato experimental para medidas realizadas por Thiébaud et al. (1997).
Eles acreditavam que, se cada neurônio da rede fosse estimulado, seria possível verificar as respostas nos outros neurônios existentes na cultura. Entretanto, o resultado não foi este. Se- gundo os pesquisadores, a MEA convencional não respondeu da forma esperada porque não há especificidade do neurônio unitário para a estimulação e registro. Eles notaram também que a rede de processos dos neurônios sobre os microeletrodos é um obstáculo para a interação dos eletrodos com neurônios individuais. Com isso, Maher et. al. (1999) propuseram e fabricaram o que chamaram de “neurochip”, o que, inicialmente, consistia em uma matriz de 4 x 4 de poços (15 μm de profundidade) com espaçamento de 100 μm entre eles, sobre uma base de silício. Cada