Em geral, o diâmetro de eletrodos para MEAs pode variar de 10 µm a 200 µm (KIREEV et. al., 2017a; MASSOBRIO et. al., 2017). Considerando também que os diâmetros de neu- rônios DRG de ratos Wistar, foco de estudo aqui, estão entre 15 e 40 µm (NEVES, 2012), as di- mensões escolhidas neste trabalho devem ser próximas para que a MEA seja capaz de realizar as medições com cultura de células. Portanto, nossos microelectrodos foram projetados para exibi- rem diâmetros de 30 µm, e 20/ 40 µm para cada uma das versões geradas neste projeto de dou- torado, respectivamente.
Conforme já discutido no Capítulo 1, os sinais extracelulares que podem ser captados pe- los microeletrodos da MEA, assim como as características dos pulsos de estimulação (como am- plitude, duração) introduzidos no meio por eles depende da exclusivamente do tipo biológico a ser estudado. Com relação ao registro, a amplitude do sinal elétrico pode variar de 10 µV a até vários mV, com faixa de frequência entre 0,1 e 7 kHz (FATTAHI et al., 2014; HEUSCHKEL, 2001). Em contrapartida, embora a MEA seja comumente utilizada com sucesso para estimulação neuronal tanto in vitro como in vivo, em grande parte dos casos, os valores das correntes exigidas para a ativação dos neurônios extrapolam as amplitudes fisiológicas, e isto implica no surgimento de danos neuronais e até morte celular. Dessa forma, tem aumentado a demanda por eletrodos que necessitem de menor corrente de estimulação para a ativação neuronal com eficácia e fre- quência relevantes fisiologicamente (GHAZAVI et. al., 2015).
Pesquisas disponíveis na literatura indicam que, comparando-se microeletrodos de mesma área superficial, os modelos circulares requerem menores níveis de estimulação, além de
maior resistência à vedação, transferência de cargas durante pulsos de estimulação e densidade de corrente média. Portanto, eles são os mais eficientes quando se trata de provocar variações no potencial de membrana dos neurônios e, consequentemente, mais adequados para compor a MEA (GHAZAVI et. al., 2015).
Assim, o primeiro passo para a confecção deste dispositivo é o projeto dos padrões dese- jados da MEA. O layout foi produzido através do LASI7 (Layout System for Individuals, em inglês), um sistema que inicialmente foi projetado para desenhos de circuitos integrados, mas que pode ser utilizado também para dispositivos microeletromecânicos, discretos e outras nanotecnologias (https://lasihomesite.com/).
Para isso, foram concebidos dois conjuntos de padrões para serem empregadas com es- crita direta. Ambas versões de MEAs possuem área total de 49 mm x 49 mm, com 60 canais, os quais se ligam aos pads de contato (4,84 mm², com espaçamento de 0,2 mm) via trilhas (Figura 29).
A configuração de ambos os layouts de MEA produzidos neste projeto de doutorado se baseou no padrão da MultiChannel Systems, dado que o sistema de medidas, amplificação e aná- lise de sinais de amostras biológicas in vitro mais empregado é produzido e comercializado por esta empresa e, portanto, o dispositivo a ser introduzido nele deve possuir dimensões próximas àquelas apresentadas pela MEA comercial da MCS de tal forma que ele possa ser acoplado ao soquete (Figura 49(a)). Assim, o layout para cada uma das MEAs é da seguinte forma:
a) Primeira versão: A construção dos componentes que compõem este dispositivo se ba- seou no layout comercial padrão da MEA, ou seja, é composto por 60 microeletrodos de grafeno sobre TiN com 30 µm de diâmetro, distribuídos em uma região quadrada de 8 por 8, que se conectam aos pads de contato pelas trilhas;
b) Segunda versão: Embora esta MEA seja composta também por 60 microeletrodos, ela contém algumas modificações, comparada com a anterior e com os dispositivos en- contrados na literatura (Veja Seção 2.2.4). O conjunto de microeletrodos, que também são circulares, está distribuído em um formato octogonal. Outra diferença é com rela- ção à dimensão de cada microeletrodo; neste dispositivo, há fileiras intercaladas de eletrodos com diâmetros de 20 µm e 40 µm. Além disso, outro diferencial deste último
modelo é que tais microeletrodos são transparentes, sendo compostos apenas por grafeno sobre o óxido de silício.
(a)
(b)
Figura 29 – Layout da MEA. No centro, encontram-se os eletrodos, enquanto as linhas azuis são as trilhas e os re- tângulos nas bordas da matriz são os pads de contato. À direita, destacam-se os eletrodos (200 μm de espaça- mento), com diâmetro de (a) 30 μm; e (b) 20 µm e 40 µm. Além disso, nota-se mais uma diferença entre os dois projetos: a presença do eletrodo de referência na segunda versão de MEA (trilha verda mais larga à esquerda em
(b)).
Como, em geral, neurônios em fatias cerebrais possuem fontes de sinal em um raio de 30 µm ao redor do centro do eletrodo e podem ser captadas em até 100 µm, nossas MEAs são
adequadas, já que esta é a área de alcance do nosso microeletrodo (MULTICHANNEL SYS- TEMS, 2018).
Dessa forma, ambos os projetos podem ser divididos em quatro níveis básicos: condutor, isolação, eletrodos e espessamento de pads. No entanto, a diferença entre elas é a área em que o primeiro condutor (TiN) ocupa. Na primeira abordagem, forma os eletrodos, trilhas e pads de contato, enquanto na segunda, apenas as trilhas e pads de contato. Portanto, o grafeno, que forma os eletrodos na região central da MEA, com formato circular, estará sobre o TiN (primeira versão) e sobre SiO2 (segunda versão).
Assim, apesar da primeira exibir eletrodos opacos, o que impede a observação óptica nos locais sobre os eletrodos e trilhas (artefatos de imagem) com consequente perda de informação da cultura, o nosso segundo modelo de MEA, com eletrodos transparentes, torna possível moni- torar diretamente o cenário biológico em toda a região ativa, inclusive sobre a região sensora (PARK et. al., 2018).
A primeira camada da máscara projetada se refere ao nível condutor da MEA. Conforme pode ser verificado na Figura 30, ela forma a base microeletrodos (para a primeira versão), trilhas e pads de contato (para a segunda versão).
Na sequência, o próximo nível produzido foi o referente ao estágio de isolação. Para tanto, o material passivador deve permanecer em toda a amostra, exceto na região dos microeletrodos e pads de contato. Isto porque os primeiros devem estar em contato direto com o meio de cultura, enquanto os últimos devem “enviar” a informação biológica captada pelos primeiros para um sis- tema externo de medidas (Figura 31).
(a)
(b)
Figura 30 – Padrões desenhados para o primeiro nível de litografia – TiN – para a: (a) primeira versão da MEA. Nela, destacam-se os eletrodos (centro), e trilhas (diâmetro de 40 µm na porção inicial), que partem da estrutura ante- rior e se conectam aos pads de contato (periferia, em formato retangular). As marcas de alinhamento, que são es- senciais para alcançar um nivelamento adequado entre os níveis, localizam-se nas bordas da lâmina; e (b) segunda
versão da MEA, onde é possível notar que este condutor irá formar apenas as trilhas e pads de contato, com as marcas de alinhamento na região central.
(a)
(b)
Figura 31 – Padrões desenhados para o segundo nível de litografia, o nível de isolação – SiO2 – para a: (a) primeira versão da MEA. Nela, destacam-se os 60 padroes circulares (centro, definindo o diâmetro do eletrodo: 30 µm), e retangulares (periferia, formando os pads de contato). As marcas de alinhamento, que são essenciais para alcançar um nivelamento adequado entre os níveis, localizam-se nas bordas da lâmina; e (b) segunda versão da MEA, onde é possível notar os padrões circulares (centro, definindo o diâmetro dos eletrodos: 40 µm e 20 µm), com o eletrodo
de referência (esquerda) e as marcas de alinhamento na região central.
Por fim, o último nível projetado é para ser aplicado para definição da etapa com grafeno (eletrodos). Como pode ser verificado na Figura 32, os eletrodos em ambas as versões produzidas de MEAs neste projeto de doutorado exibem formato circular, estando posicionados na porção central do dispositivo.
(a)
(b)
Figura 32 – Padrões desenhados para o terceiro nível de litografia, o nível de eletrodos – grafeno – para a: (a) pri- meira versão da MEA. Nela, destacam-se os 60 microeletrodos circulares (30 µm), A marcas de alinhamento, que são essenciais para alcançar um nivelamento adequado entre os níveis, localizam-se nas bordas da lâmina; en- quanto na (b) segunda versão da MEA nota-se eletrodos circulares (40 µm e 20 µm), com marcas de alinhamento