UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
HELDER VERAS RIBEIRO FILHO
ESTUDO DA INTERAÇÃO PPARγ-CDK5, COM ÊNFASE EM
SUA MODULAÇÃO POR LIGANTES, E DA INTERAÇÃO
RECEPTOR NUCLEAR-DNA
CAMPINAS
2019
ESTUDO DA INTERAÇÃO PPARγ-CDK5, COM ÊNFASE EM
SUA MODULAÇÃO POR LIGANTES, E DA INTERAÇÃO
RECEPTOR NUCLEAR-DNA
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências, na Área de concentração em Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde
Orientadora: Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira Coorientador: Dr. Paulo Sérgio Lopes de Oliveira
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO HELDER VERAS RIBEIRO FILHO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ANA CAROLINA MIGLIORINI FIGUEIRA
CAMPINAS
2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira
Prof. Dr. Celso Eduardo Benedetti
Prof. Dr. Leandro Martínez Profa. Dra. Deborah Schechtman
Prof. Dr. João Renato Carvalho Muniz
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Agradecimentos
Aos meus pais Fátima Maria Barros Veras e Helder Veras Ribeiro por terem possibilitado minha formação acadêmica e terem sempre me apoiado em minhas decisões profissionais;
À Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira por ter me acolhido desde o início no Laboratório de Espectroscopia e Calorimetria (LEC) do Laboratório Nacional de Biociências (CNPEM) e ter garantido técnica e cientificamente a execução e conclusão da presente tese de doutorado. Agradeço por toda a confiança em mim depositada e por todas as oportunidades ofertadas e agradeço ainda pela paciência com que me ensinou as mais diversas técnicas experimentais; Ao Dr. Paulo Sérgio Lopes de Oliveira per ter me acolhido no Laboratório de Biologia Computacional (LBC) do Laboratório Nacional de Biociências (CNPEM) e ter possibilitado o intercâmbio de experiências das metodogias experimentias com as metologias in silico. Agradeço ainda pela intensa troca de conhecimento científico e pelas oportunidades;
Ao Dr. Celso Eduardo Benedetti (LNBio), ao Dr. Lendro Martínez, a Dra. Deborah Schechtman e ao Dr. João Renato Carvalho Muniz por terem avaliado a presente tese de doutorado e por suas contribuições e sugestões que muito engrandeceram o trabalho;
Ao Laboratório de Espectroscopia e Calorimetria (LEC), que se tornou minha casa durante os anos de doutorado, e a todos seus membros, em especial Aline Bridi, Beatriz Santos, Izabella Tambones, Jéssica Lois, Maiara Ferreira, Marielli Dias, Natália Videira, Nathalia Indolfo, Tabata Renee, Thais Tittanegro e Thayná Avelino, com quem convivi quase todos os dias nesses anos de doutorado e com quem compartilhei muitos momentos divertidos. Agradeço pela paciência em ensinar e compartilhar conhecimento sobre métodos experimentais e pela conversa pessoal e científica de todos os dias;
Ao Laboratório de Biologia Computacional (LBC), que me permitiu a inserção no mundo in
silico e estrutural e a todos seus membros, em especial Felipe Ferraz, João Guerra, José Geraldo,
Juan Faya, Mariana Grizante e Rodrigo Honorato por toda a paciência no ensinamento de técnicas computacionais e por toda troca de experiência;
A Dra. Albane Le Maire pelas discussões científicas diárias e a Dra. Fernanda Batista pelo suporte e toda atenção nas técnicas experimentais;
Ao Dr. Xavier Neto e ao Prof. Armênio Aguiar (UFC) por terem possibilitado minha vinda a Campinas e inserção no Laboratório Nacional de Biociências (CNPEM);
A todos os laboratórios e facilities do Laboratório Nacional de Biociências (CNPEM) e a todos seus colaboradores, bolsistas e estagiários, em especial o Laboratório de Purificação de Proteínas, o Laboratório de Espectrometria de Massas e o Laboratório de Bioensaios que possibitaram a execução do presente trabalho;
financeiro. O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Cógido de Financiamento 001 - N° do processo: 23038.006737/2012-56;
A todos meus amigos e familiares que me apoiaram e incentivaram durante os anos de doutorado.
desenvolvimento do Diabetes Mellitus tipo 2 (DMT2) e Síndrome Metabólica. Estudos recentes comprovam sua participação na relação entre resistência à insulina e DMT2, através do processo de fosforilação da S245 mediado pela CDK5. Esse processo, que afeta a expressão gênica, é ainda pouco entendido e sua modulação por ligantes de PPARγ pode representar uma promissora estratégia farmacológica antidiabética. Além disso, um melhor entendimento sobre a interação do PPARγ com sequências de reconhecimento de DNA, no processo de regulação gênica, podem esclarecer suas ações no contexto do DMT2. Dessa forma, os propósitos do presente trabalho foram (i) estudar estruturalmente a interação entre a CDK5 e o domínio de ligação ao ligante (LBD) do PPARγ, a fim de melhor compreender os mecanismos de modulação deste processo; (ii) elucidar o mecanismo de inibição da fosforilação do PPARγ mediada pela CDK5 e (iii) analisar a interação do domínio de ligação ao DNA (DBD) de receptores nucleares com sequências de DNA, objetivando o desenvolvimento de um modelo preditor de sítios de ligação no DNA para receptores nucleares. Na primeira etapa do trabalho, são apresentados detalhes sobre a interação CDK5-PPARγ, com proposição de um modelo computacional do complexo. O modelo permitiu a identificação de resíduos-chave para a interação, validados por anisotropia de fluorescência e para a fosforilação do PPARγ pela CDK5, validados por ensaios enzimáticos. Na segunda etapa, foi realizada uma avaliação estrutural, baseada em resultados experimentais, do mecanismo de inibição, por ligantes, da fosforilação do PPARγ. Nessa etapa, foi proposto um possível mecanismo para a inibição da fosforilação. Por fim, na terceira etapa do trabalho, foi construído e avaliado um preditor de sítios de ligação no DNA para receptores nucleares.
Palavras-chave: PPAR gama; Quinase 5 Ciclina-Dependente; Fosforilação; Diabetes Mellitus;
ABSTRACT
English Title: STUDY OF PPARγ-CDK5 INTERACTION, FOCUSING ON LIGAND MODULATION, AND DNA-NUCLEAR RECEPTOR BINDING
Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) is a nuclear receptor related to Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) and Metabolic Syndrome. Recent studies have supported its role as a link between insulin resistance and T2DM, through the S245 phosphorylation mediated by CDK5. This process is poorly understood and its modulation by PPARγ ligands represents a promising antidiabetic approach. Moreover, a full comprehension of PPARγ and DNA sequences interaction in gene regulation may help to understand its actions in the context of T2DM. Thus, the objectives of this work were (i) study the interaction between CDK5 and the ligand binding domain (LBD) of PPARγ, in order to understand its modulation mechanisms; (ii) elucidate the mechanism of the PPARγ phosphorylation inhibition and (iii) analyze the interaction between Nuclear Receptors DNA binding domain (DBD) and DNA sequences, aiming to predict DNA binding sites for nuclear receptors. Firstly, it was proposed an interaction model of CDK5-PPARγ by computational approaches. The model allowed to identify CDK5-PPARγ key residues related to this interaction and to S245 phosphorylation, all of them validated by fluorescence anisotropy experiments or phosphorylation assays. Secondly, it was performed a structural examination, based on experimental data, of the mechanism of S245 phosphorylation inhibition. Here, it was proposed the mechanism of such inhibition. Finally, in the third step, a DNA binding sites predictor for nuclear receptors was built and evaluated.
Keywords: PPAR gamma; Cyclin-Dependent Kinase 5; Phosphorylation; Diabetes Mellitus;
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação estrutural dos domínios do PPARγ ... 19
Figura 2 - Representação esquemática do processo da ativação de transcrição mediado pelo PPARγ ... 22
Figura 3 - Representação esquemática do reconhecimento de substratos por quinases ... 25
Figura 4 - Representação esquemática do mecanismo envolvido na fosforilação do PPARγ pela CDK5. ... 27
Figura 5 - Construção do domínio de ligação ao ligante (LBD) do PPARγ (207-476). ... 35
Figura 6 - Representação da sequência consenso de reconhecimento de substratos pela CDK5 humana. ... 44
Figura 7 - Análise estrutural das sequências de reconhecimento de substratos da CDK5. ... 46
Figura 8 - Estruturas cristalográficas do PPARγ e soluções de docking molecular entre PPARγ e CDK5. ... 48
Figura 9 - Modelo de interação entre PPARγ e CDK5/p25 ... 50
Figura 10 - Alinhamento estrutural da CDK5 e ERK2. ... 52
Figura 11-Eletroforese em gel de produto amplificado de PCR de colônia dos PPARγ mutantes ... 55
Figura 12 - Gel SDS-PAGE da purificação do PPARγ selvagem e mutantes. ... 56
Figura 13 - Cromatografia de gel filtração do PPARγ selvagem e mutantes. ... 57
Figura 14 - DLS do PPARγ selvagem e mutantes. ... 58
Figura 15 - CD do PPARγ selvagem e mutantes. ... 59
Figura 16 - Detecção da fosforilação do PPARγ usando diluições do anticorpo anti-KSP ... 62
Figura 17 - Detecção da fosforilação do PPARγ através do anticorpo anti-KSP e anti-S245 ... 62
Figura 18 - Detecção da fosforilação em PPARγ clivado ou expresso em presença de lambda fosfatase através do anticorpo anti-KSP ... 63
Figura 19 - Detecção da fosforilação em PPARγ clivado ou com mutação na S245 através anticorpo anti-KSP ... 64
Figura 20 - Detecção da fosforilação em diferentes quantidades de PPARγ clivado através anticorpo anti-KSP ... 64
Figura 23 – Análise da interação entre PPARγ selvagem e mutantes com CDK5 ... 68
Figura 24 - Análise de conservação do resíduo S245 e resíduos âncora propostos para o PPARγ ... 71
Figura 25 - Preparação do bacmid e expressão de CDK5 em células de inseto Sf9... 74
Figura 26 - Expressão e purificação da p25 em bactérias. ... 76
Figura 27 - Análise da CDK5 e p25 através de espectrometria de massas. ... 77
Figura 28 - Esquema representativo da interação entre PPARγ e CDK5/p25. ... 78
Figura 29 - Estrutura cristalográfica do domínio de ligação do ligantes (LBD) do PPARγ ... 82
Figura 30 - Análise da interação entre PPARγ e CDK5 em presença de Rosiglitazona ... 899
Figura 31 - Frequência de contatos entre ligantes que inibem a fosforilação da S245 e resíduos do PPARγ. ... 91
Figura 32 - Interações de ligantes que inibem a fosforilação da S245 com a alça H2’-H3 do PPARγ. ... 922
Figura 33 - Comparação dos valores de B-factor entre estruturas cristalográficas de PPARγ sem ligante ou com ligante que inibe a fosforilação da S245 (holo-PPARγ) ... 944
Figura 34 - Análise do desvio na posição dos resíduos entre estruturas de PPARγ sem ligantes e estruturas com ligantes que bloqueiam a fosforilação da S245 (HoloP-PPARγ) ... 977
Figura 35 - Alteração estrutural na posição do resíduo I341 após ligação de ligante que inibe a fosforilação da S245. ... 988
Figura 36 – Figura esquemática do mecanismo proposto de inibição da fosforilação da S245 . 100 Figura 37 - Esquema representativo da interação entre receptor nuclear e DNA ………...104
Figura 38 - Sequências utilizadas no módulo de varredura de TFBSs. ... 1099
Figura 39 - Esquema representativo do método de varredura em sequências de DNA ... 11010
Figura 40 - Perfil de energia de ligação para o PPARγ em héxades de DNA. ... 11111
Figura 41 - Perfil de energia de ligação para 46 receptores nucleares e héxades de DNA. ... 1122
Figura 42 - Varredura nas sequências de DNA RARE (A), M3 (B) e M7 (C) para homodímeros do receptor RARα. ... 1166
Figura 43 - Varredura na sequência de DNA TRE_pal para homodímeros do receptor THRβ. ... 1188
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Lista dos substratos de CDK5 na espécie humana com estruturas depositadas no banco de dados PDB. ... 45 Tabela 2 - Dados de raio de partícula (em nm) e percentual de polidispersão (% PD) para PPAR selvagem e mutantes ... 58 Tabela 3 – Temperaturas de melting (Tm) para PPAR selvagem e mutantes ... 60 Tabela 4 – Constantes de dissociação (Kd) entre PPARγ selvagem ou mutantes e CDK5 ... 69 Tabela 5 - Lista de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) associados aos resíduos de PPARγ S245, K261, K263 e K265 ... 70 Tabela 6 - Lista de ligantes de PPARγ identificados experimentalmente por inibir a fosforilação da S245... 81 Tabela 7 - Lista das estruturas cristalográficas do LBD do PPARγ utilizadas na análise estrutural ... 85 Tabela 8 - Constantes de dissociação dos receptores RARα e THRβ em sequências de DNA 1133
LISTA DE ABREVIATURAS E
SIGLAS
CD: Dicroísmo Circular (do inglês, Circular Dichroism)
DBD: Domínio de Ligação do DNA (do inglês, DNA Binding Domain) DLS: Espalhamento de luz dinâmico (do inglês, Dynamic Light Scattering) DMT2: Diabetes Mellitus Tipo 2
DO: Densidade Óptica
FITC: Isotiocianato de Fluoresceina GST: Glutationa S-transferase
HRE: Elementos Responsivos a Hormônios (do inglês, Hormone Response Element) IPTG: β-D-1-thiogalactopyranoside
Kd: Constante de Dissociação
LBD: Domínio de Ligação do Ligante (do inglês, Ligand Binding Domain) LBP: Cavidade de Ligação do Ligante (do inglês, Ligand Binding Pocket) LNBio: Laboratório Nacional de Biociências
MPT: Modificação Pós-Traducional PDB: Protein Data Bank
PPAR: Receptor Ativador da Proliferação de Peroxissomas
PWM: Matriz de Peso Posicional (do inglês, Position-Weighted Matrix) RAR: Receptor de Ácido Retinóico
RN: Receptor Nuclear ROSI: Rosiglitazona
SNP: Polimorfismo de Nucleotídeo Único (do inglês, Single Nucleotide Polymorphism)
TFBS: Sítio de Interação de Fatores de Transcrição (do inglês, transcription factor binding site) THR: Receptor de Hormônios Tiroidianos
Tm: Temperatura de melting TZD: Tiazolidinediona
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 16
O PPARγ e sua importância na modulação de processos fisiopatológicos ... 17
A estrutura do PPARγ ... 19
O processo de ativação do PPARγ ... 21
CAPÍTULO 1 ... 23
Estudo da interação entre PPARγ e CDK5 ... 23
1.1. Introdução... 23
1.1.1. A fosforilação como uma importante modificação pós-traducional do PPARγ ... 23
1.1.2. Reconhecimento de substratos por quinases ... 24
1.1.3. A interação entre PPARγ e CDK5: um link entre obesidade e resistência à insulina 26 1.1.4. A modulação da fosforilação da S245 do PPARγ ... 28
1.2. Justificativa e objetivos ... 31
1.3. Métodos ... 32
1.3.1. Análise computacional de sequências de reconhecimento de substratos de CDK5 32 1.3.2. Docking molecular ... 33
1.3.3. Alinhamento estrutural entre CDK5 e ERK2 ... 33
1.3.4. Análise da conservação e de SNPs de PPARγ ... 34
1.3.5. Plasmídeos e Mutagênese sítio dirigida ... 34
1.3.6. Expressão e purificação de proteínas ... 36
1.3.7. Avaliação biofísica dos PPARγ mutantes ... 39
1.3.8. Anisotropia de fluorescência... 40
1.3.9. Ensaio de fosforilação por Western Blot ... 41
1.3.10. Ensaio enzimático de fosforilação do PPARγ ... 42
1.4. Resultados e Discussão ... 44
1.4.1. Análise da sequência de reconhecimento da CDK5 no PPARγ e em outros substratos ... 44
1.4.3. Comparação estrutural entre CDK5 e ERK2 ... 51
1.4.4. Produção e avaliação biofísica do PPARγ selvagem e mutantes ... 54
1.4.5. Impacto das mutações do PPARγ na fosforilação desse receptor induzida pela CDK5 60 1.4.6. Efeito das mutações do PPARγ em sua interação com CDK5 ... 67
1.4.7. Análise de polimorfismos e de conservação no PPARγ ... 70
1.4.8. Padronização da expressão e purificação da CDK5 e de sua proteína parceira p2573 1.5. Conclusões e Perspectivas ... 78
CAPÍTULO 2 ... 80
Estudo do mecanismo de inibição da fosforilação da S245 do PPARγ ... 80
2.1. Introdução... 80
2.2. Justificativa e objetivos ... 84
2.3. Métodos ... 85
2.3.1. Coleta de estruturas cristalográficas de PPARγ ... 85
2.3.2. Análise do desvio de resíduos e B-factor ... 86
2.3.3. Anisotropia de fluorescência ... 88
2.4. Resultados e Discussão ... 88
2.4.1. Inibição da interação do PPARγ com a CDK5 pela Rosiglitazona ... 88
2.4.2. Contatos entre os ligantes que inibem a fosforilação da S245 e resíduos do PPARγ . 90 2.4.2. Análise do B-factor de estruturas cristalográficas de PPARγ com ou sem ligantes que inibem a fosforilação ... 92
2.4.3. Análise comparativa do desvio na posição dos resíduos em estruturas apo-PPARγ e holo-PPARγ ... 96
2.5. Conclusões e Perspectivas ... 100
CAPÍTULO 3 ... 102
Predição de sítios de ligação no DNA para receptores nucleares ... 102
3.1. Introdução... 102
3.2. Justificativa e objetivos ... 107
3.3. Métodos ... 108
3.3.1. Construção dos complexos dos receptores nucleares com DNA ... 108 3.3.2. Cálculo da energia de ligação entre os receptores nucleares e sequências de DNA . 108
3.3.3. Módulo de varredura para sequências de DNA ... 109
3.3.4. Anisotropia de fluorescência de sequências de DNA ... 110
3.4. Resultados e Discussão ... 111
3.5. Conclusões e perspectivas ... 119
Considerações Finais ... 120
REFERÊNCIAS ... 121
APÊNDICES... 132
APÊNDICE A - Tampões utilizados na purificação de proteínas ... 133
APÊNDICE B - Alinhamento múltiplo da sequência do PPARγ de 100 diferentes espécies .... 134
APÊNDICE C – Cromatogramas do sequenciamentos das mutações do PPAR ... 135
ANEXOS ... 137 ANEXO 1 ………138 ANEXO 2 ………139 ANEXO 3 ………140 ANEXO 4 ………141 ANEXO 5 ………142 ANEXO 6 ………143 ANEXO 7 ………144
INTRODUÇÃO
O PPARγ (Receptor Ativador da Proliferação de Peroxissomas, isotipo gama) é um fator de transcrição modulado por ligantes que pertence à superfamília de receptores nucleares (RN) e, juntamente com outros dois isotipos, PPARα e PPARβ/δ, compõem a subfamília de PPARs. Por serem codificados por genes diferentes e possuírem diferenças estruturais, os três isotipos diferem entre si em aspectos como distribuição tecidual, especificidade por ligantes e em papéis fisiopatológicos. Dada a diversidade de funções biológicas que modulam, e devido ao potencial terapêutico que os três isotipos possuem, essa subfamília vem sendo exaustivamente estudada.
O presente trabalho aborda variadas técnicas experimentais e computacionais, e concentra-se no estudo específico da interação entre o PPARγ e a quinase CDK5, dada sua importância no contexto do Diabetes Mellitus Tipo 2 (DMT2) e da obesidade. O trabalho foi dividido em 4 Capítulos, no primeiro deles está uma breve introdução sobre RNs e o PPARγ, alvo do presente trabalho, será apresentada com objetivo de fornecer bases para as discussões apresentadas nos capítulos subsequentes. No Capítulo 2 foi explorada, do ponto de vista estrutural, a interação entre o PPARγ e a CDK5. Nessa etapa, buscou-se entender o mecanismo estrutural de tal interação, com o objetivo de gerar novas oportunidades para o desenvolvimento racional de inibidores. O Capítulo 3 foi dedicado à elucidação do mecanismo de inibição, por ligantes de PPARγ, do processo de fosforilação. Por fim, dada a importância dos RN na regulação da expressão de genes envolvidos nos mais diversos processos biológicos, buscou-se no Capítulo 4 estudar mais detalhadamente o processo de interação e reconhecimento desses RNs com o DNA. Nesse Capítulo 3 foi descrito o desenvolvimento de um método computacional de predição de sítios de ligação para fatores de transcrição no DNA.
O PPARγ e sua importância na modulação de
processos fisiopatológicos
O PPARγ é alvo de um grande número de estudos científicos e, um dos fatores para isso, está na sua capacidade em modular diversos processos fisiopatológicos. Farmacologicamente, esse é o isotipo de PPAR com maior número de princípios ativos desenvolvidos, os quais são base de diversos medicamentos atualmente comercializados, como por exemplo, hipoglicemiantes orais. De forma geral, o PPARγ é altamente expresso nos adipócitos, possuindo papel chave na regulação da adipogênese, no balanço energético e na biossíntese de lipídeos (KLIEWER et al., 1997). Além disso, este receptor mantem a homeostase em tecidos não adiposos, evitando sobrecarga lipídica, em tecidos como o fígado e o músculo esquelético. Nos adipócitos, o PPARγ controla o equilíbrio dos níveis de liberação de adipocinas (leptina e adiponectina), que são mediadores da ação da insulina em tecidos periféricos, contribuindo assim para a manutenção da sensibilidade à insulina (KINTSCHER, 2005).
No contexto de processos metabólicos, o PPARγ tem um papel chave, e por essa razão é um importante alvo farmacológico na modulação de desordens metabólicas. Essas desordens estão principalmente relacionadas ao metabolismo alimentar, configuram um dos principais males da sociedade moderna, formando uma intrincada rede de patologias correlacionadas, como por exemplo, o Diabetes Mellitus (DM), que é doença de ordem endocrinológica caracterizada pela elevação da glicose no sangue, condição denominada de hiperglicemia (Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia). Segundo último levantamento, realizado em 2017, pela Federação Internacional de Diabetes (IDF), uma a cada doze pessoas são diabéticas, totalizando um alarmante número de 425 milhões de pessoas ao redor do mundo vivendo com essa doença, e ocasionando, em 2017, 4 milhões de mortes. Estima-se ainda que o número de diabéticos aumente para 629 milhões em 2045. No Brasil, a situação não é diferente, e esse país ocupa a primeira posição em relação ao número de indivíduos diabéticos nas Américas, com um total de 13,3 milhões de indivíduos acometidos pela doença, atingindo o quarto lugar no ranking mundial (International Diabetes Federation).
Para agravar ainda mais essa situação, uma das formas do DM, o DM tipo 2 (DMT2), pode cursar com outras patologias como a hipertensão e as dislipidemias, em uma síndrome denominada de Síndrome Metabólica (SM) (KASSI et al., 2011). No eixo central dessa síndrome
está a obesidade. Diversos estudos epidemiológicos e clínicos suportam uma substancial correlação entre obesidade e DMT2, sendo que a obesidade contribui em geral com 80% a 85% no risco do desenvolvimento do DMT2 (ABDULLAH et al., 2010; VÁZQUEZ et al., 2014; WANG et al., 2005). Apesar de ser um fator de risco bem estabelecido, as vias moleculares desse processo são complexas e ainda estão sob estudos. Na realidade, esse processo parece ser mediado por um balanço de múltiplos fatores que dependem de condições próprias de cada indivíduo (SCHENK; SABERI; OLEFSKY, 2008). Entre esses fatores está uma condição pré-diabética denominada resistência à insulina (KAHN; HULL; UTZSCHNEIDER, 2006; OLEFSKY; GLASS, 2010). A resistência à insulina configura uma condição na qual os tecidos alvo da insulina, como o fígado (BAZOTTE; SILVA; SCHIAVON, 2014), o músculo esquelético (BOUZAKRI; KOISTINEN; ZIERATH, 2005) e o tecido adiposo (DIMITRIADIS et al., 2011) não são capazes de responder adequadamente a esse hormônio circulante, e como consequência, as células beta produzem mais insulina para superar essa resistência (OLEFSKY; GLASS, 2010).
Com o objetivo de buscar terapias para o controle do DMT2, bastante esforço em pesquisas básicas e clínicas tem sido realizado, contribuindo de forma crescente para o entendimento da patogênese dessa doença. Acompanhando os avanços no entendimento do DMT2, novas alternativas farmacológicas foram e estão sendo desenvolvidas para controlar essa patologia. Como consequência, diversas classes de fármacos antidiabéticos são disponíveis atualmente, como a metformina, as sulfoniureias, as meglitinidas, os inibidores da α-glucosidase, os agonistas do receptor GLP-1, os inibidores de DPP-4 ou SGLT-2, e a classe das Tiazolidinedionas (TZD) (CHAUDHURY et al., 2017). Essa última classe de fármacos, em específico, tem recebido bastante destaque por modular uma recente via de comunicação descrita entre obesidade e resistência à insulina. Como descrito em mais detalhes no Capítulo 2, um recente estudo (CHOI et al., 2010) demonstrou que a Rosiglitazona, fármaco hipoglicemiante oral da classe das TZDs e agonista pleno do PPARγ, inibe a fosforilação do PPARγ pela CDK5, como parte do seu mecanismo de ação hipoglicemiante. Entretanto, apesar do seu potencial farmacêutico, fármacos da classe das TZDs, assim como recentes ligantes descritos de PPARγ, esbarram em efeitos adversos apresentados em estudos clínicos. Esses fatos intensificam a necessidade de estudos que busquem um melhor entendimento de como os PPARs funcionam e vias alternativas para sua modulação.
A estrutura do PPARγ
De maneira geral, a estrutura do PPARγ segue o padrão estrutural descrito para os receptores nucleares, sendo composta pelo domínio N-terminal A/B, pelo domínio C de ligação ao DNA (DBD), pela região de dobradiça ou hinge (dominio D) e pelo domínio E de ligação ao ligante (LBD) (DESVERGNE; WAHLI, 1999) (Figura 1). O domínio A/B, o menos conservado entre todos os RNs, ocupa a porção N-terminal e contém a função de ativação transcricional AF-1, que é independente de ligante e possui importante papel na transativação e recrutamento de cofatores (BUGGE et al., 2009). Além disso, essa região está sujeita a modificações pós-traducionais, tais como fosforilação, SUMOilação, ubiquitinação e O-GlcNAcilação (CHOI et al., 2014; KOPPEN; KALKHOVEN, 2010).
Figura 1 - Representação estrutural dos domínios do PPARγ
A estrutura cristalográfica do PPARγ (PDB ID: 3DZU) está representada em cartoon e colorida de acordo com seus domínios que estão indicados no esquema localizado acima da estrutura. AF-1: região de ativação 1; DBD: domínio de ligação ao DNA; LBD: domínio de ligação ao ligante; AF-2: região de ativação2.
O segundo domínio, seguindo no sentido N ao C-terminal, é o DBD. Esse domínio é o mais conservado entre os RNs e é constituído de duas α-hélices que são mantidas estáveis por dois átomos de zinco, formando estruturas denominadas “dedos de zincos”. Essa estrutura globular é capaz de reconhecer sequências alvos no DNA, denominadas de elementos de resposta ao PPAR (PPREs), compostas canonicamente de repetições de 6 nucleotídeos (em geral AGGTCA) separados por um ou dois nucleotídeos (WURTZ et al., 1996). Esse domínio é essencial para a atividade do PPAR, pois é o responsável por fazer a ponte entre a ativação do receptor e a consolidação do seu efeito gênico. Mais detalhes sobre a importância desse domínio na função transcricional do PPAR serão abordados no Capítulo 4.
O LBD, por sua vez, é formado por um conjunto de 12 α-hélices (mais uma hélice adicional H2’) arranjadas em três camadas, sendo duas superficiais e uma central. Esse domínio possui também uma folha-β (fitas S1 a S4), que juntamente com as hélices envolvem uma cavidade hidrofóbica na forma de Y, responsável pela interação com ligantes (UPPENBERG et al., 1998). Essa cavidade de interação de ligantes (do inglês, ligand binding pocket, LBP) está localizada entre as hélices H7, H10 e H3, sendo uma das maiores LBPs da superfamília de RNs, com volume aproximado de 1300 Å3 (GERMAIN et al., 2006; NOLTE et al., 1998). Ela é composta em sua maioria por resíduos hidrofóbicos, com exceção do fundo da cavidade que possui resíduos polares, como serinas, que podem fazer ligações de hidrogênio com os ligantes, estabilizando-os. De forma interessante, tanto o formato quanto a natureza do LBD têm algumas particularidades entre os RNs, fato que influencia diretamente sua especificidade por ligantes (GERMAIN et al., 2006). A porção C-terminal do LBD merece destaque por conter a função de ativação AF-2, que é formada pela estabilização da H12 contra as hélices H3, H4 e H11 do LBD. Quando um agonista de PPAR se acomoda no LBP ele interage com a H12, estabilizando-a contra as hélices supracitadas. A estabilização e “fechamento” dessa hélice cria um sítio propício para o recrutamento e interação de proteínas coativadoras que, por sua vez, permitem a formação de um complexo de proteínas essenciais para o início da atividade transcricional do PPAR (WURTZ et al., 1996).
Por fim, uma curta sequência de aminoácidos, denominada hinge ou região de dobradiça, conecta os domínios DBD e LDB previamente descritos. Além de possuir alguns sítios de modificações pós-traducionais, essa região possui como principal função, manter a mobilidade
entre os domínios, permitindo seu ajuste a diversas sequências de DNA e que estes receptores recrutem uma variada gama de proteínas coreguladoras (CHANDRA et al., 2008).
O processo de ativação do PPARγ
Como um fator de transcrição, o PPARγ exerce suas funções através da regulação de diversos genes. Para ativar a maquinaria transcricional, o PPARγ necessita passar por um processo de heterodimerização, etapa essencial para sua ligação ao DNA. Sem essa etapa, ou seja, na forma de monômero, o PPARγ é incapaz de exercer sua atividade transcricional (CHANDRA et al., 2008). Com a ligação do ligante, o PPARγ se heterodimeriza com um outro RN, o receptor retinóide X (RXR) (WRIGHT et al., 2014) e, no núcleo, recruta proteínas coativadoras, como CBP, TRAP220, proteínas da família SRC (coativador de receptor de esteroide, 1-3) RAP205 ou PGC1-ɑ que podem induzir a remodelação na cromatina por acetilação das histonas (Figura 2). Como consequência, os genes alvos se tornam acessíveis para a maquinaria de transcrição da polimerase II (KOPPEN; KALKHOVEN, 2010). Através dos DBDs, o heterodímero PPAR:RXR reconhece as PPREs no DNA, que podem conter ainda uma sequência adicional “AAACT” posicionada em 5’ (IJPENBERG et al., 1997). Apesar de canônicas, essas sequências de reconhecimento do DBD do PPARγ não são as únicas que promovem a interação. Como abordado no Capítulo 4, existem sequências de menor energia de interação que são também alvos da interação com receptores nucleares (AYERS et al., 2014; BLACKWELL et al., 1993; KASIBHATLA et al., 2000).
Em um estado inativo (sem ligante) o LBD do PPARγ mantém interação com proteínas corepressoras, como SMRT ou NCoR, as quais impedem o receptor de iniciar a transcrição de genes alvos. Isso se deve ao fato dos corepressores se associarem e ativarem histonas desacetilases (HDACs) (GUENTHER; BARAK; LAZAR, 2001), que levam a desacetilação de histonas em genes alvos e limitam a acessibilidade das sequências promotoras para a polimerase II (KOPPEN; KALKHOVEN, 2010). Apesar de sua importância, a ligação de um ligante ao PPAR não é uma etapa essencial para o processo de heterodimerização, ou seja, o processo pode ocorrer independente de ligante, apesar da conclusão do processo não ser a mesma: a ligação à região dos genes alvos (FEIGE et al., 2006).
Figura 2 - Representação esquemática do processo da ativação de transcrição mediado pelo PPARγ. Quando ativado por ligantes, o PPARγ se heterodimeriza com o receptor nuclear RXRα, e os DBDs de ambos receptores reconhecem sequências específicas no DNA denominados elementos de resposta ao PPARγ (PPRE). A ativação do PPARγ induz o recrutamento de proteínas coativadoras (CA) e desligamento de proteínas corepressoras. Esse processo induz o recrutamento de uma série de proteínas, incluindo histonas acetiltransferases, que promovem o remodelamento da cromatina, permitindo o acesso da RNA polimerase II e transcrição de genes alvo. LBD: Domínio de ligação ao ligante; LIG: ligante; DBD: domínio de ligação ao DNA; CA: coativadores; CR: corepressores; HATs: histonas acetiltransferases. Fonte: Autoria própria.
CAPÍTULO 1
Estudo da interação entre PPARγ e CDK5
1.1. Introdução
1.1.1.
A fosforilação como uma importante modificação pós-traducional do
PPARγ
Os RNs podem ter sua função regulada pela interação de ligantes com seu LBD, sejam eles endógenos ou exógenos. Porém, além dessa clássica modulação, os RNs podem sofrer modificações pós-traducionais (MPT), que vão regular sua expressão e atividade transcricional. Dentro do grupo de MPTs está o processo de fosforilação, que é alvo do presente trabalho. Além da fosforilação, os receptores nucleares podem sofrer processo de SUMOilação, ubiquitilação e GlcNAcilação e acetilação (CHOI; PARK; CHOI, 2014).
O processo de fosforilação tem como base a transferência de um grupamento fosfato de um doador, como o ATP, para resíduos específicos de um substrato, e tal processo é realizado por uma enzima do tipo quinase. O resultado biológico da fosforilação depende da quinase e do contexto celular no qual será realizada. No PPARγ, por exemplo, a fosforilação induzida pela ativação das MAPKs, ERK1/2 ou JONK1/2 quinases no resíduo S112, contido na AF1, reduz sua atividade transcricional através do recrutamento de corepressores (ADAMS et al., 1997), enquanto que a fosforilação do mesmo resíduo pela CDK9 e CDK7 aumenta a atividade do PPARγ (CHOI et al., 2014). Em comparação a maioria dos receptores nucleares, que são fosforilados majoritariamente na região N-terminal ou na região hinge, o PPARγ possui relevantes pontos de fosforilação no LBD (BRUNMEIR; XU, 2018). Além das quinases mencionadas, outras como a proteína quinase A e C, AMP quinase, glicogênio sintetase quinase-3 e a quinase dependente de ciclina 5 (CDK5) possuem também o PPARγ como alvo de fosforilação (BURNS; HEUVEL, 2007). A fosforilação do PPARγ no LBD, em especial pela CDK5, tem recebido bastante atenção, dado o impacto fisiopatológico consequente desse processo.
1.1.2.
Reconhecimento de substratos por quinases
Antes de realizar o processo catalítico de transferência do grupamento fosfato, as quinases necessitam reconhecer e interagir de forma específica e eficiente com seu substrato. A interação específica da quinase com seu substrato, de forma geral, é guiada por dois elementos. O primeiro é conhecido como “especificidade pelo peptídeo” e envolve o reconhecimento de sequências de aminoácidos específicas do substrato, denominadas sequências de reconhecimento (ou motivos de fosforilação). Essas sequências contêm o resíduo alvo da fosforilação, serina ou treoninas por exemplo, e resíduos sequêncialmente próximos que colaboram no processo de transferência do grupamento fosfato do ATP para o substrato. Dessa forma, esse primeiro elemento envolve a região catalítica de interface quinase-substrato (UBERSAX; FERRELL, 2007; ZHU; LIU; SHAW, 2005).
De forma representativa, o resíduo do substrato alvo de fosforilação é denominado P0 enquanto o seu parceiro de interação na quinase é indicado como S0 (Figura 3). Esse padrão segue-se para os resíduos sequêncialmente N-terminal ou C-terminal do resíduo alvo da fosforilação. Assim, um resíduo do substrato, localizado três resíduos após o resíduo alvo da fosforilação, é denominado P+3; enquanto seu parceiro de interação na quinase é S+3. Essa nomenclatura é bastante usual e representativa para a caracterização da sequência de reconhecimento alvo de quinases (Figura 3). Sequências de reconhecimento de diversas quinases podem ser obtidas em bancos de dados baseados em dados experimentais, como o
PhosphoSitePlus (HORNBECK et al., 2015). A identificação de substratos e suas sequências de
reconhecimento para uma quinase é bastante importante pois, quando alinhadas, essas sequências permitem a identificação de padrões ou consensos de reconhecimento e fosforilação (DUARTE et al., 2014).
Figura 3 - Representação esquemática do reconhecimento hipotético de substratos por quinases A esquerda está representado o tipo de reconhecimento contínuo, enquanto a direita o não-contínuo. Círculos em cor marrom representam resíduos da quinase e em verde do substrato. Os números dentro dos círculos indicam o número do resíduo em uma sequência linear, provenientes da estrutura primária da proteína. Fonte: Autoria própria.
Embora o sítio de reconhecimento das quinases em seus substratos seja formado normalmente por aminoácidos dispostos em uma sequência contínua (ou linear) (Figura 3), alguns substratos possuem sequências de reconhecimento alternativas. Nessas sequências alguns aminoácidos podem não estar dispostos linearmente, mas podem ocupar estruturalmente a posição de um aminoácido disposto de forma linear. Esse tipo de sequência de reconhecimento é denominado de “não-continua” (ou estrutural) e pode ser observado na representação da Figura 3. Conforme mostrado nessa figura, em uma sequência contínua, o aminoácido 6 do substrato corresponde a posição P+2, enquanto o 7 está disposto sequêncialmente ao aminoácido 6 e corresponde a posição P+3. Por outro lado, em uma sequência não-contínua, o aminoácido 7 do substrato, disposto sequêncialmente após o 6, pode não ocupar a posição P+3. Em vez disso, um outro, disposto sequêncialmente cinco resíduos após o 6 (aminoácido 12) pode, estruturalmente, se posicionar e ocupar a posição P+3. Esse é um caso de uma sequência de reconhecimento não-contínua ou estrutural, formada pelo enovelamento nativo da proteína substrato (DUARTE et al., 2014).
Além da sequência de reconhecimento envolvida no sítio catalítico das quinases, outros aminoácidos dos substratos, não incluídos nessa região, podem ser cruciais para a interação quinase-substrato. Esses aminoácidos envolvem um segundo elemento que guia a interação
chamado de “recrutamento de substrato”. Esse elemento está relacionado com o aumento da frequência de contato entre a quinase e seu substrato e pode ocorrer através de sítios de contato distantes do sítio catalítico. A ancoragem de substratos através desses sítios distantes está principalmente associada com interações eletrostáticas entre as proteínas (DE OLIVEIRA et al., 2016).
1.1.3.
A interação entre PPARγ e CDK5: um link entre obesidade e resistência
à insulina
A CDK5 é uma serina/treonina quinase dirigida a prolina. Essa classe de enzimas entrega um grupamento fosfato da posição γ do ATP para o grupo hidroxil de serinas ou treoninas, contidas em sua sequência específica de reconhecimento (ADAMS, 2001). A CDK5 tem preferência em fosforilar substratos que têm uma sequência consenso de reconhecimento formada por (S/T)PX(K/H/R), sendo S/T, serina ou treoninas; P, uma prolina, X qualquer aminoácido e K/H/R resíduos positivamente carregados (TARRICONE et al., 2001). Diferentemente de outras quinases da família das CDKs, a CDK5 não precisa ser fosforilada para se tornar ativa, mas sim interagir com parceiros regulatórios, como p39 ou p35 (TARRICONE et al., 2001).
Recentemente, Choi e colaboradores (2010) identificaram que citocinas pró-inflamatórias como TNF-ɑ e IL-6, elevadas no tecido adiposo de obesos, assim como elevados níveis de ácidos graxos, provocam a desregulação da CDK5 e a induzem a hiperfosforilar o resíduo S245 (ou resíduo S273 na isoforma 2 do PPARγ, a numeração S245 da isoforma 1 é bastante utilizada em estudos estruturais portanto será adotada aqui) do LBD do PPARγ, o que modifica a expressão de genes alvos específicos (CHOI et al., 2010) (Figura 4). Essa descoberta foi de grande impacto, pois a alteração do perfil de expressão gênica induzida pela fosforilação do PPARγ leva à resistência à insulina, colocando assim a fosforilação da S245 do PPARγ, mediada pela CDK5, como uma via importante na indução de resistência à insulina na obesidade. Ainda não está claro como a fosforilação da S245 pode alterar a expressão de genes regulados pelo PPARγ, mas uma hipótese, que atualmente está sendo desenvolvida por nosso grupo, é de que essa fosforilação altera o recrutamento de proteínas coreguladoras, o que modifica a perfil de expressão de certos genes (dados não publicados).
Figura 4 - Representação esquemática do mecanismo envolvido na fosforilação do PPARγ pela CDK5.
A figura mostra a relação entre a obesidade, iniciando na elevação dos níveis de citocina pró-inflamatórias, até a alteração de genes alvos regulados pelo PPARγ. Parte dos processos ocorre no citoplasma e outra parte no núcleo. TZDs: Tiazolidinedionas; AG: ácidos graxos. Fonte: Autoria própria.
Até o presente momento, não se sabe ao certo como os fatores pró-inflamatórios dos adipócitos ou mesmo o excesso de ácidos graxos possam hiperativar a CDK5, porém estudos em neurônios que também são afetados pela fosforilação do PPARγ mediada pela CDK5, mostram-se bastante elucidativos. Neurônios submetidos a certos estímulos, como por exemplo danos oxidativos, insultos neurotóxicos, ou mesmo isquemia, apresentam elevados níveis de cálcio intracelular, o que induz a ativação da cisteína-protease calpaina (TARRICONE et al., 2001; TSAI; LEE; CRUZ, 2004). Essa enzima proteolítica, por sua vez, cliva p35, um dos parceiros anteriormente mencionados da CDK5, em um fragmento N-terminal p10 e um C-terminal p25. De forma similar à p35, a p25 também é capaz de interagir com a CDK5 e ativá-la. Mais do que isso, a p25 tem uma meia vida maior que a p35 e, por ser mais distribuída no núcleo das células,
contribui para o deslocamento da CDK5 para essa região (PATRICK et al., 1999; TARRICONE et al., 2001). Juntos, esses processos levam a desregulação e ao prolongamento da atividade da CDK5 (PATRICK et al., 1999), produzindo hiperfosforilação de seus substratos, como o PPARγ (Figura 4).
Dessa forma, o aumento nos níveis de p25 parece ser o fator chave para a desregulação da CDK5 e, consequente hiperfosforilação do PPARγ. De fato, estudos utilizando tecido adiposo de camundongos submetidos a uma dieta de alto teor lipídico mostraram níveis elevados de p25 acompanhados de aumento na ativação de CDK5 (CHOI et al., 2010).
1.1.4.
A modulação da fosforilação da S245 do PPARγ
Dada a importância da interação entre o PPARγ e a CDK5 para o aumento da resistência à insulina na obesidade, torna-se de grande valia a modulação desse processo. Teoricamente, seria possível modular a fosforilação da S245 agindo nos dois principais componentes dessa reação, o substrato PPARγ ou a quinase CDK5. Na prática, a modulação tendo como alvo a CDK5 apresenta diversos obstáculos que a tornam inviável. Existem inibidores de CDK5 já bem estabelecidos, como a Roscovidina (MURUÁIS; LALIOTI; SANDOVAL, 2009), porém essa quinase está envolvida em diversas vias celulares (KAWAUCHI, 2014; WEI; TOMIZAWA, 2007) e seu bloqueio poderia produzir efeitos indesejáveis em outras vias de sinalização na célula. Além disso, conforme já descrito na literatura a inibição da CDK5 em tecido adiposo resulta na ativação de uma via alternativa de fosforilação da S245 do PPARγ, a via da ERK2. Essa quinase, de forma similar a CDK5, é uma serina/treonina quinase dirigida a prolina, e é também capaz de fosforilar o PPARγ no mesmo resíduo S245 (BANKS et al., 2014). Dessa forma, uma possível modulação da fosforilação via CDK5 é bastante ineficiente, o que transforma o PPARγ em um alvo prioritário.
1.1.4.1. O uso das TZDs como fármacos antidiabéticos
Como forma alternativa a modulação da fosforilação da S245 via CDK5, alguns estudos vêm buscando a modulação direta do PPARγ. Na realidade, antes mesmo da identificação dessa fosforilação, em 2010, fármacos da classe das TZDs, como Pioglitazona, Troglitazona e
Rosiglitazona eram amplamente utilizados por seus efeitos antidiabéticos, melhorando a sensibilização à insulina. Esses fármacos são ligantes de PPARγ, acomodando-se em seu LBP e ativando-o através do fechamento e estabilização da H12, o que permite o recrutamento de proteínas coativadoras e leva a ativação transcricional de genes específicos. Portanto, esses fármacos são considerados agonistas plenos do PPARγ. REF
Apesar do seu potencial em melhorar a resistência a insulina e produzir efeitos antidiabéticos, fármacos da classe dos TZDs produzem uma série de efeitos adversos que limitam seu uso. Em 1998, a única TZD no mercado era a Troglitazona. Essa TZD produzia efeitos hepatotóxicos potencialmente fatais, o que fez com que a Rosiglitazona e a Pioglitazona fossem recomendadas na clínica no ano seguinte (NISSEN, 2010). Apesar das vendas da Rosiglitazona chegar a 3,3 bilhões de dólares por ano, a partir de 2002 trabalhos começaram a reportar que essa classe de fármacos poderia induzir ataques cardíacos e isquemia no miocárdio, o que levou o FDA (do inglês, US Food and Drug Administration) a restringir o uso da Rosiglitazona. Outros efeitos adversos como inibição de formação óssea (GREY et al., 2007) e ganho de peso (CHAPUT et al., 2000) também são relacionados ao uso das TZDs.
Hoje sabe-se que os efeitos benéficos ou maléficos do uso das TZDs são independentes e gerados por mecanismos distintos. Enquanto os efeitos adversos estão relacionados a expressão de genes que induzem, por exemplo, adipogênese, e atribuídos a ativação máxima desse receptor (DUNN et al., 2011; KROKER; BRUNING, 2015), os efeitos antidiabéticos estão associados a inibição da fosforilação da S245 do PPARγ induzida pela CDK5 (CHOI et al., 2010). Nesse contexto, a identificação de agonistas parciais ou mesmo não-agonistas de PPARγ que mantenham sua capacidade de inibir a fosforilação deste receptor, tem se mostrado bastante promissora (CHOI et al., 2010; KROKER; BRUNING, 2015).
Como uma alternativa ao uso de ligantes de PPARγ que possam induzir respostas indesejáveis desse receptor ao interagir em seu LBP, a inibição direta da interação do PPARγ com a CDK5 parece ser uma solução bastante eficiente. Sem interação, a CDK5 seria incapaz de promover a fosforilação desse receptor, não alterando sua atividade, nem recrutando vias alternativas de fosforilação. De fato, a inibição de interações proteína-proteína (IPPs) tem ganhado bastante destaque atualmente dada a importância desse tipo de interação na regulação de processos biológicos (ARKIN; TANG; WELLS, 2014). Diversos inibidores de IPP, sejam eles pequenos ligantes ou moléculas maiores como peptídeos, possuem importante potencial
terapêutico e farmacológico, sendo que alguns estão em estudos clínicos (MULLARD, 2012; SCOTT et al., 2016). O antiplaquetário Tirofiban, por exemplo, é um medicamento já no mercado que inibe a interação entre duas proteínas (VILLOUTREIX et al., 2014). Porém, o desenvolvimento de inibidores de IPP depende bastante do pleno conhecimento estrutural da interface de interação entre os alvos.
Assim, a inibição da fosforilação da S245 do PPARγ é uma ferramenta potencial para a sensibilização a insulina e contra o diabetes. Conforme mostrado pelo sucesso antidiabético das TZDs, a modulação direta do PPARγ nessa via é um alvo promissor. Entretando a modulação não deve envolver a ativação do PPARγ, a fim de se evitar os efeitos adversos associados às TZDs. Nesse sentido, o pleno entendimento do mecanismo de fosforilação do PPARγ pela CDK5 tem muito a colaborar no desenvolvimento de novas abordagens de inibição da fosforilação da S245.
1.2. Justificativa e objetivos
Pautado na relevância do processo de fosforilação do PPARγ mediado pela CDK5 no contexto de resistência à insulina, o presente capítulo busca investigar como ocorre a interação entre essas duas proteínas do ponto de vista estrutural. O pleno entendimento da interação é de grande valia, pois permite a identificação de resíduos essenciais para a interação, permitindo assim, a proposição de pequenas moléculas ou mesmo peptídeos que possam ser desenhados para interagir especificamente na região crítica de interação. Dessa forma, o trabalho exposto no presente Capitulo teve como objetivos:
● Analisar o sítio de reconhecimento da CDK5 no PPARγ;
● Construir, por meio de dados estruturais e métodos computacionais, um modelo de interação entre o PPARγ e a CDK5/p25, e identificar resíduos chave para essa interação; ● Realizar mutações nos resíduos chave e avaliar por técnicas biofísicas as proteínas
mutadas;
● Analisar, por anisotropia de fluorescência, a interação entre os PPARγ mutados e a CDK5;
● Avaliar o impacto das mutações por ensaio enzimático de fosforilação;
● Avaliar a importância dos resíduos chave para a interação do PPARγ com a CDK5 do ponto de vista evolutivo.
1.3. Métodos
1.3.1.
Análise computacional de sequências de reconhecimento de substratos
de CDK5
Sequências alvo de fosforilação de substratos de CDK5 foram pesquisadas no servidor
PhosphoSitePlus (HORNBECK et al., 2015), sendo identificadas um total de 269. Dessas, foram
filtradas 122 sequências de substratos da espécie humana e essas sequências foram submetidas a um BLAST de proteína (servidor do NCBI) contra o banco de dados Protein Data Bank (PDB) para que fosse possível a identificação e coleta de estruturas cristalográficas de cada substrato. Foram selecionados apenas substratos com identidade e cobertura completas (100%) em relação às sequências de busca. Além disso, cada estrutura foi submetida a uma inspeção manual para confirmar a presença da sequência alvo de reconhecimento da CDK5.
Além da estrutura cristalográfica do PPARγ, foram identificadas um total de outras 4 estruturas de substratos de CDK5, contendo a sequência de reconhecimento dessa quinase. Esses substratos foram classificados, de acordo com o tipo de sequência consenso, em: contínuos ou não-contínuos. Substratos com resíduos carregados positivamente (lisina ou arginina) na posição P+3 da sequência de reconhecimento foram denominados de substratos com “consenso contínuo”, caso outros resíduos ocupem essa posição, os substratos foram classificados em substratos com “consenso não-contínuo”. Para comparação estrutural da sequência de reconhecimento da CDK5 entre os substratos, as 5 estruturas selecionadas foram alinhadas baseando-se nos átomos Cα e Cβ da serina ou treonina, resíduos alvo da fosforilação, e no átomo Cα da prolina na posição P+1. O alinhamento estrutural foi realizado utilizando-se o algoritmo
Mustang (KONAGURTHU et al., 2006) no programa YASARA (KRIEGER; VRIEND, 2014) e
1.3.2.
Docking molecular
O modelo de interação entre PPARγ e CDK5/p25 foi construído por meio de um docking rígido guiado por restrições de distância entre átomos dessas duas proteínas. A primeira restrição de distância foi aplicada entre o átomo OG da S245 do PPARγ, resíduo aceptor do fosfato γ do ATP, e o átomo CG do D126 da CDK5, resíduo que participa na transferência do fosfato γ na reação de fosforilação. A segunda restrição foi aplicada entre o átomo NZ da K261 do PPARγ, resíduo identificado como P+3 na sequência consenso de fosforilação da CDK5, e o átomo CD do E240 da p25, resíduo descrito previamente por interagir diretamente com resíduos na posição P+3 em substratos de CDK5.
Utilizando a distância de 7 Å entre os pares de restrições supracitadas foi realizado um experimento de docking molecular através da versão local do programa PatchDock (SCHNEIDMAN-DUHOVNY et al., 2005), que utiliza um algoritmo baseado em complementariedade geométrica entre as duas proteínas rígidas. Sabendo que o PPARγ apresenta regiões de alças flexíveis, foram utilizadas 5 estruturas de LBD de diferentes autorias para o experimento de docking (Figura 8B). A seleção dessas estruturas baseou-se na garantia da ausência de ligantes co-cristalizados e, portanto, foram coletadas estruturas que apresentavam a hélice H12 em um estado aberto e que não possuíssem densidade eletrônica não explicada dentro da cavidade do PPARγ. Cada uma das 5 estruturas de PPARγ foram docadas na estrutura cristalográfica da CDK5/p25 (PDB ID: 1UNL) e o melhor modelo de interação foi selecionado baseando-se no score utilizado no PatchDock. Esse score se baseia na divisão do receptor em camadas de profundidade, quanto maior for a prenetrância dos átomos do ligante em camadas mais profundas do receptor, sem sobreposição atómica, maior o score do docking. Após o
docking, a molécula de ATP foi posicionada no sítio de ligação do ATP na CDK5, baseando-se
em sua posição na estrutura cristalográfica da CDK2 (PDB ID: 4EOQ). Por fim, o melhor modelo foi submetido a minimização de energia utilizando o programa YASARA e o campo de força YAMBER3 (KRIEGER; VRIEND, 2014).
1.3.3.
Alinhamento estrutural entre CDK5 e ERK2
Ambas estruturas cristalográficas das quinases CDK5 (PDB ID: 1UNL) e ERK2 (PDB ID: 5LCK) foram obtidas do banco de dados PDB. O alinhamento estrutural entre essas proteínas foi realizado utilizando o algoritmo Mustang (KONAGURTHU et al., 2006) no programa
YASARA (KRIEGER; VRIEND, 2014). O modelo do complexo entre PPARγ e CDK5/p25, obtido segundo método descrito na seção 1.3.2., foi utilizado para seleção dos resíduos da CDK5 contidos na interface de interação com o PPARγ (5 Å de distância). Por sua vez, a estrutura cristalográfica da ERK2 foi estruturalmente alinhada com a CDK5 para seleção dos resíduos da ERK2 que potencialmente estariam na interface com o PPARγ. De posse dos resíduos de ambas quinases, na interface com o PPARγ, foi realizada uma análise de conservação entre os mesmos utilizando o programa Chimera (PETTERSEN et al., 2004).
1.3.4.
Análise da conservação e de SNPs de PPARγ
A análise da conservação da sequência de aminoácidos do LBD do PPARγ foi realizada utilizando um total de 100 diferentes espécies distribuídas em 4 classes de Tetrapodas: mamíferos (50), aves (39), répteis (9, incluindo espécies dos grupos Crocodolia [crocodilos e jacarés], Testudines [tartarugas] e Squatamata [lagartos e cobras]) e 2 anfíbios do grupo Anura (sapos e rãs). A seleção das espécies em cada classe foi realizada com colaboração da Dra. Mariana Bortoletto Grizanti. As sequências foram obtidas no banco de dados UniProt (UNIPROT CONSORTIUM, 2018), com utilização de grupos de sequência com ao menos 90% de identidade e tendo a espécie humana como membro representativo, para evitar a inclusão de proteínas relacionadas, como por exemplo coativadores de PPARγ. O alinhamento múltiplo de sequências foi realizado utilizando o algoritmo Muscle no servidor do EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/), com parâmetros padrões. A busca por Polimorfismos de Nucleotídeo Único (do inglês, Single Nucleotide Polymorphism, SNP) no LBD do PPARγ foi realizada no bando de dados dbSNPs (SHERRY, 2001) e a análise de SNPs foi realizada no SNP
Gene View usando como referência o genoma humano GRCh38.
1.3.5.
Plasmídeos e Mutagênese sítio dirigida
Os plasmídeos do PPARγ selvagem utilizados no presente trabalho são próprios do laboratório no qual foram realizados os experimentos (LEC- Laboratório de Espectroscopia e Calorimetria – LNBio/CNPEM) e estão inseridos em vetores de expressão pET-28a. A construção utilizada para expressão compreende o LBD do PPARγ (aminoácidos 207 - 476) e sua sequência está apresentada na figura 5. Esses plasmídeos serviram como molde para construção dos mutantes de PPARγ.
Figura 5 - Construção do domínio de ligação ao ligante (LBD) do PPARγ (207-476).
Em amarelo está representada a cauda de histidina utilizada no processo de purificação do PPARγ e em verde o sítio de reconhecimento e clivagem da trombina. Os resíduos indicados em azul são os resíduos que foram submetidos à mutagênese sítio dirigida no presente trabalho.
Para a obtenção dos clones de PPARγ mutados, foi utilizado um protocolo bem definido (QuikChange, Agilent) que compreende uma reação de PCR para cada mutante, utilizando como
template o domínio LBD do PPARγ inserido no vetor de expressão pET-28a. Após a
amplificação, o DNA parental foi digerido pela enzima DpnI (1 µL para cada 25 uL de reação), a 37 ˚C, por 1 h. Em seguida, os plasmídeos foram transformados em células de Escherichia coli
(E. coli), linhagem DH5α, para propagação de plasmídeos. Para confirmação da presença do
inserto de PPARγ em tamanho adequado (816 pb), pré-culturas transformadas foram submetidas a uma reação de PCR de colônia, com posterior corrida eletroforética em gel de agarose 1%. Os plasmídeos contendo inserto de PPARγ em tamanho adequado foram isolados e purificados por minipreparação plasmidial e a confirmação da presença da mutação pontual no DNA foi realizada por sequenciamento no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio).
Os plasmídeos de CDK5 e p25 foram gentilmente cedidos pelo professor Sang K. Park da Universidade de Ciência e Tecnologia de Pohang. Cada um deles foi subclonado, CDK5 no vetor pProexHTb e p25 em pET-28a, pelo aluno Rafael Cagliari (bolsista no programa bolsista de verão do CNPEM) e pela Dra. Fernanda Aparecida Heleno Batista. Os plasmídeos de CDK5 clonados no vetor de expressão pFastBac™ Dual foram adquiridos comercialmente (GenScript).
Todas as minipreparações plasmidiais foram realizadas seguindo protocolo do kit Wizard
Minipreps (Promega) e a concentração de DNA em amostras foram todas determinadas
1.3.6.
Expressão e purificação de proteínas
1.3.6.1. Expressão e purificação do PPARγ e mutantes
Para expressão protéica, os plasmídeos contendo PPARγ LBD selvagem ou mutado, foram submetidos a transformação em células de E. coli, linhagem para expressão gênica BL21(DE3). O crescimento para expressão foi realizado em meio LB (Luria-Bertani), em presença do antibiótico Canamicina (50 µg/mL), na temperatura de 22 ˚C, até se atingir a DO600nm de 0,8, momento no qual as células foram induzidas com 0,5 mM de
β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), por 16 h. Após isso, as culturas foram centrifugadas (16000 rcf, Avanti J26xPT, Beckman Coulter) e o sedimento proveniente desse processo foi ressuspendido em tampão de lise (Apêndice A). O extrato foi mantido em gelo durante 1 h e, posteriormente sonicado utilizando o equipamento Vibra Cell (10s de pulso e 10 s de descanso, amplitude de 35%) durante 10 min. A fração solúvel foi obtida por centrifugação a 36.000 rcf durante 40 min a 4 °C em centrífuga Avanti J26xPT (Beckman Coulter, rotor JA-25-50).
A etapa de purificação foi realizada por meio da técnica de cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) usando a resina Talon Superflow (Clontech). A fração solúvel foi incubada durante 1 h, a 4 °C, com a resina, na proporção de 1 mL de resina para cada litro de cultura expresso. Após período de incubação, a fração solúvel, juntamente com a resina, foram acodicionados em uma coluna de plástico PoliPrep (Biorad) para coleta do flow-through. Posteriormente, foram realizadas lavagens com tampão de lavagem (Apêndice A) e, por fim, o PPARγ foi eluído utilizando tampão de eluição (Apêndice A).
A amostra de eluição foi então submetida a uma segunda etapa de purificação, dessa vez pela técnica de gel filtração. A amostra foi injetada com fluxo de 0,3 mL/min em uma coluna de gel filtração Superdex 75 (16/60), acoplada a um sistema cromatográfico utilizando o equipamento AKTA Purifier (GE). A coluna foi equilibrada previamente com tampão (Apêndice A) e uma eluição isocrática foi realizada com 1,2 volumes de coluna.
1.3.6.2. Expressão e purificação de CDK5 e p25
1.3.6.2.1. Expressão e purificação em células de bactéria
A CDK5, clonada em vetor pProexHTb, foi expressa utilizando cepas de E. coli BL 21(DE3), previamente transformadas, em meio LB com antibiótico ampicilina (50 ug/mL). O crescimento da cultura foi realizado a 37 ° C, até atingir DO600nm de 0,8, momento no qual a
cultura foi induzida com 0,5 mM de IPTG durante 4 h, a 30 ° C. A lise e purificação por afinidade foram realizadas de acordo com protocolo descrito para o PPARγ na seção 1.3.6.1. A composição dos tampões dessas etapas está descrita no Apêndice A.
Após primeira etapa de purificação por afinidade, as amostras contendo CDK5 foram submetidas a uma segunda etapa de purificação utilizando a técnica de troca iônica. Antes da etapa de troca iônica, a eluição proveniente da purificação por afinidade foi submetida a uma troca de tampão (Tampão de Desalting, Apêndice A) utilizando uma coluna de desalting (HiTrap 5 mL, GE). Todas as frações provenientes da desalting foram então purificadas utilizando uma coluna de troca iônica (High Q).
A p25, clonada em pet28a, foi também expressa em cepas de E. coli BL 21(DE3). Testes foram realizados também em cepas BL21-codon plus, assim como co-expressão de CDK5 com p25, porém não foi obtido sucesso em nenhum dos casos. Para expressão da p25, o crescimento da cultura de células em meio LB foi realizado a 37 ° C, durante 4 h, até atingir DO600nm de 1,0,
quando então foi realizada indução com 0,5 mM de IPTG, a 20 ° C, por 16 h. As etapas de lise e purificação por afinidade foram realizadas de acordo com protocolo descrito para o PPARγ na seção 1.3.6.1. A composição dos tampões dessas etapas está descrita no Apêndice A.
1.3.6.2.2. Expressão e purificação em células de inseto Sf9
Devido ao baixo rendimento da expressão de CDK5 em bactérias, o sistema de expressão foi alterado para linhagem celular de inseto Sf9 (Spodoptera frugiperda), cedida pelo grupo do Prof. Dr. Kleber Fanchini do LNBio. O gene da CDK5, fusionado a Glutationa S-transferase (GST) e inserido em vetor pFastBac™ Dual, foi adquirido comercialmente (GenScript). As etapas de produção do vetor de transferência do baculovírus (bacmid) e produção de baculovírus pelas células de inseto foram todas realizadas de acordo com manual Bac-to-Bac® Baculovirus
Expression System (Invitrogen). As seguintes etapas foram realizadas com a colaboração da
especialista MSc. Renata Rocha de Oliveira (LNBio) e a MSc.Tabata Renee Doratioto (LNBio).
Na primeira etapa, a CDK5 contida no plasmídeo doador pFastBAc™ Dual, foi insetida no bacmid por meio de transformação (em meio S.O.C) de 150 ng desse plasmídeo em bactéria competente DH10Bac (E. coli). Após transformação por choque térmico, as células foram plaqueadas em placas com meio LB contendo os seguintes componentes: 50 µg/mL Canamicina, 7 µg/mL Gentamicina, 10 µg/mL Tetraciclina, 100 µg/mL Bluo-gal e 40 µg/mL IPTG. Após incubação de 48 h, a 37 ° C, as placas foram analisadas em busca de colônias brancas (bacmid recombinante com CDK5). As colônias azuis são bacmid sem recombinação (vazios). As colônias brancas foram coletadas e inoculadas em 10 mL de meio LB com crescimento por 24 h, a 37 ° C. O inóculo foi então submetido a procedimento de extração e purificação de DNA através de minipreparação plasmidial. O DNA extraído e purificado foi então submetido a reação de PCR para amplificação e confirmação da presença do bacmid com CDK5, segundo protocolo contido no manual Bac-to-Bac® (Invitrogen).
De posse dos bacmids contendo CDK5, estes foram transfectados, de acordo com manual, em células de inseto Sf9. Nessa etapa foram utilizadas 1 x 106 de células em 2 mL de meio estéril SF900-II (sem soro fetal bovino, Thermo Fisher Scientific) e Cellfectin II (Thermo Fisher
Scientific) foi o reagente escolhido para transfecção. A transfecção foi realizada em um poço de
placa de 6 poços (Cell Culture Plate - NEST). Após transfecção, as células foram mantidas por 72 h a 27 ° C para produção do vírus. Após esse período, os vírus produzidos foram coletados e armazenados (são denominados de P0). Nessa etapa, as células já iniciam a produção da proteína de interesse, no caso a CDK5, e a expressão pode já ser confirmada. 100 uL de vírus P0 foram então utilizados para infectar 10 mL de 2 x 107 células Sf9. Nessa etapa ocorre a amplificação do vírus para escalonar a quantidade produzida. As células infectadas foram mantidas a 27 ° C, por 96 h, e um novo estoque de vírus, agora denominado P1, foi coletado. Todos os estoques de vírus foram mantidos a 4 ° C e protegidos de luz. Esse processo foi realizado até se obter quantidade de vírus adequada para realização do ensaio de titulação viral. A titulação viral foi uma etapa utilizada para identificar a quantidade ideal de vírus para otimizar a expressão da proteína em estado solúvel. Nesse ensaio, diferentes quantidades de P1 (0,5, 1, 2 e 4 mL) foram usadas para
infectar 50 mL de cultura contendo 2 x 106 células cultivadas em erlenmeyers. Na condição controle, não foi realizada infecção viral.
Para purificação da CDK5, as células de inseto Sf9, previamente sedimentadas (500 g por 5 min) foram incubadas com Tampão de Lise (Apêndice 1). O processo de lise foi realizado de acordo com o descrito na seção 1.3.6.1. Após lise das células, a CDK5 com GST foi purificada do extrato proteico através de cromatografia por afinidade, utilizando resina Glutathione
Sepharose 4 Fast Flow (GE). A CDK5 foi eluída utilizando glutationa reduzida em tampão de
eluição (Apêndice A).
1.3.7.
Avaliação biofísica dos PPARγ mutantes
1.3.7.1. Espalhamento de luz dinâmico (DLS)
O espalhamento de luz dinâmico (do inglês, Dynamic Light Scattering, DLS) foi utilizado para avaliação do tamanho e distribuição do raio hidrodinâmico das proteínas, assim como a polidispersão da amostra. Um volume de 20 uL de cada amostra (na concentração aproximada de 3 mg/ml), previamente centrifugada a 14000 rpm por 10 min, foi utilizada para as avaliações, que compreenderam a distribuição de intensidade em relação ao tamanho da partícula da qual derivou-se a distribuição de massa. A aquisição dos dados foi feita a 18 °C, em cubeta de quartzo, com tempo de equilíbrio de 30 segundos, utilizando o equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern).
1.3.7.2. Dicroísmo circular
Para avaliar o impacto das mutações pontuais na estrutura secundária do PPARγ foi utilizada a técnica de dicroísmo circular (do inglês, Circular Dichroism, CD). Primeiramente foi realizada a aquisição através de 20 acumulações de varredura entre os comprimentos de onda de 190 a 260 nm (UV far) para cada amostra de PPARγ mutado ou selvagem na concentração de 5 µM, em tampão diluído 20x em água, previamente centrifugadas a 14000 rpm por 10 min. A aquisição dos dados foi realizada utilizando o espectropolarímetro J-810 (Jasco).
