1.4. Resultados e Discussão
1.4.7. Análise de polimorfismos e de conservação no PPARγ
Através de métodos computacionais de docking molecular e análises estruturais, juntamente com técnicas biofísicas para validação experimental, os resíduos K261, K263 e K265 do PPARγ mostraram ser de crucial importância para a fosforilação desse receptor pela CDK5. Dada sua importância nesse processo, esses resíduos foram então submetidos a uma busca por polimorfismo de nucleotídeo único (do inglês, Single Nucleotide Polymorphism, SNPs) com o objetivo de detectar se existem variações nesses aminoácidos na população humana que possam ser associadas a condições patológicas.
Até o presente momento, são conhecidos 195 SNPs de PPARγ em seu LBD, incluindo 71 SNPs sinônimos, 118 missenses, 3 nonsense e 3 com alteração de frame. Esses SNPs cobrem mais da metade do LBD do PPARγ (56%), mas de forma curiosa nenhum polimorfismo foi encontrado nas lisinas 261 ou 265, ou mesmo no resíduo alvo da fosforilação S245 (Tabela 5). Por outro lado, o resíduo K263 possui SNPs sinônimos e missenses produzidos por uma troca dos nucleotídeos A por G, e G por A, respectivamente. De forma interessante, a consequência dessas trocas de nucleotídeos é a manutenção do mesmo resíduo ou a troca por um resíduo de característica química semelhante, como é o caso da arginina. Esses achados sugerem uma forte pressão seletiva tanto sobre o resíduo S245 quanto sobre as lisinas 261, 263 e 265 na espécie humana.
Tabela 5 - Lista de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) associados aos resíduos de PPARγ S245, K261, K263 e K265
Residuos Posição no Chr. dbSNP ID Tipo Resultado
S245 - - - -
K261 - - - -
K263 12416756 Rs1370501806 Missense K -> R 12416757 Rs745936900 Synonymous K -> K
K265 - - - -
Os dados de SNPs foram coletados do banco de dados dbSNP e as informações sobre posição no cromossomo, identificador do SNP no banco de dados, tipo de SNP e a consequência do polimorfismo para a sequência da proteína são indicados.
Dada a conservação desses resíduos do PPARγ analisados em populações de humanos, foi realizada uma análise de conservação desses resíduos em outras espécies, dentro da
superclasse Tetrapoda, que inclui mamíferos, aves, répteis e anfíbios. Para isso, sequências do LBD do PPARγ de diferentes espécies foram coletadas e alinhadas. Um completo alinhamento de todas as sequências utilizadas, enfatizando a região de interesse da fosforilação, está apresentado no Apêndice B.
Figura 21 - Análise de conservação do resíduo S245 e resíduos âncora propostos para o PPARγ A, cladograma representativo da superclasse Tetrapoda usada na análise de conservação. Os grupos de vertebrados que fazem parte do clado Amniota estão dentro do retângulo em cinza escuro, enquanto os grupos que fazem parte da superclasse Tetrapoda estão dentro do retângulo cinza claro. A presença (retângulos preenchidos em preto) ou ausência (retângulos abertos) dos resíduos S245, K261, K263 ou K265, em cada grupo, estão apresentadas no lado esquerdo. A troca desses resíduos por outros resíduos, que é conversada entre os membros de cada grupo, está apresentada como o código do aminoácido (uma letra) dentro dos retângulos. B, Alinhamento de parte da sequência da LBD do PPARγ, que compreende a alça H2-H2’ (contém a S245), hélice H2’, e a alça H2’-H3 (contém os resíduos âncora), de espécies representativas de cada grupo analisado. Os grupos estão apresentados como cladograma e o alinhamento está mostrado no lado direito. O resíduo S245 está indicado em vermelho, enquanto os resíduos K261, K263 e K265, em azul. A estrutura secundária associada a sequência de aminoácidos do PPARγ humano está apresentada acima do alinhamento (setas para folha-β, retângulos para α-helices e linhas quando não houver estrutura secundária definida) e a identidade de cada sequência em comparação com a sequência do PPARγ está indicada a direita do alinhamento.
A partir desta análise, pode-se observar que todos os 4 resíduos avaliados são conservados nas espécies de mamíferos avaliadas, com exceção de 2 espécies de elefantes (Loxodonta africana) que possuem uma asparagina em vez de lisina na posição 263 (Figura 24). Aves e répteis também possuem elevado nível de conservação dos resíduos S245, K263 e K265, com exceção de duas espécies de tartarugas (Pelodiscus sinensis e Chelonia mydas) que possuem uma asparagina na posição 263. Por outro lado, diferentemente do observado em mamíferos, aves e repteis (exceto Pelodiscus sinensis) têm uma glutamina na posição 261, posição essa que corresponde a lisina P+3 em humanos. Esse mesmo fenômeno é observado nas 2 espécies de anfíbios analisadas, e adicionalmente, nessas espécies a lisina na posição 265 também é substituída por uma glutamina. Nessas espécies, os resíduos S245 e K263 são conservados em relação aos mamíferos.
Dessa forma, comparando a presença dos resíduos de PPARγ S245, K261, K263 e K265 na superclasse Tetrapoda, é possível observar que a simultânea presença desses 4 resíduos ocorre apenas em mamíferos, sugerindo uma importância evolutiva desses resíduos para esse grupo. Adicionalmente, o resíduo K261 parece ter uma importância particular para o grupo de mamíferos, uma vez que está presente apenas nessa classe de animais. Ademais, dado o fato de uma mutação nesse resíduo ser suficiente para inibir a fosforilação do PPARγ induzida pela CDK5, pode-se sugerir que essa fosforilação seja um evento que ocorra apenas em mamíferos e possa estar relacionado a novas demandas metabólicas exclusivas que surgiram nessa classe de animais. De fato, apesar da associação direta da resistência à insulina como efeito causal de doenças metabólicas e Diabetes, tem sido descrito que a resistência à insulina pode funcionar como um mecanismo de defesa contra o excesso de nutrientes sob certas condições (HOEHN et al., 2009; TAEGTMEYER et al., 2015).
Por essa razão, a fosforilação do PPARγ na S245 pode significar uma via evolutivamente importante adquirida pelos mamíferos. Outros achados, além dos apresentados aqui, suportam que o resíduo K261 parece ter um papel importante na regulação das modificações pós- traducionais do PPARγ. Recentemente, foram identificadas que algumas lisinas do PPARγ, o que inclui o K261, poderiam ser alvos de acetilação (JIANG et al., 2014). Em adipócitos, o PPARγ é deacetilado pela histona deacetilase HDAC3 e a inibição dessa enzima tem sido descrita por melhorar a sensibilização a insulina. A relação entre acetilação no resíduo K261 e a sensibilização a insulina não está bem compreendida ainda, porém, dada a importância proposta
do K261 no contexto da fosforilação do PPARγ, uma possível neutralização de sua carga positiva pela adição de um grupo acetil poderia interferir na interação do PPARγ com a CDK5 e reduzir sua fosforilação.
Outras lisinas do PPARγ, como a K240 e o resíduo âncora K265, já foram também identificados como alvos de acetilação (KRAAKMAN et al., 2018). Entretanto, apesar da associação feita por (KRAAKMAN et al., 2018) entre a deacetilação de ambas lisinas e a proteção contra obesidade, nesse estudo foram utilizados duplos mutantes dessas lisinas, o que dificulta isolar o efeito da acetilação especificamente da K265. A despeito disso, uma importante relação entre a fosforilação da S245 e a acetilação dos resíduos âncora do PPARγ parece existir e colaborar com a regulação de vias envolvidas com a resistência à insulina.