Expressão e purificação de proteínas

1.3.6.1. Expressão e purificação do PPARγ e mutantes

Para expressão protéica, os plasmídeos contendo PPARγ LBD selvagem ou mutado, foram submetidos a transformação em células de E. coli, linhagem para expressão gênica BL21(DE3). O crescimento para expressão foi realizado em meio LB (Luria-Bertani), em presença do antibiótico Canamicina (50 µg/mL), na temperatura de 22 ˚C, até se atingir a DO600nm de 0,8, momento no qual as células foram induzidas com 0,5 mM de β-D-1-

thiogalactopyranoside (IPTG), por 16 h. Após isso, as culturas foram centrifugadas (16000 rcf, Avanti J26xPT, Beckman Coulter) e o sedimento proveniente desse processo foi ressuspendido em tampão de lise (Apêndice A). O extrato foi mantido em gelo durante 1 h e, posteriormente sonicado utilizando o equipamento Vibra Cell (10s de pulso e 10 s de descanso, amplitude de 35%) durante 10 min. A fração solúvel foi obtida por centrifugação a 36.000 rcf durante 40 min a 4 °C em centrífuga Avanti J26xPT (Beckman Coulter, rotor JA-25-50).

A etapa de purificação foi realizada por meio da técnica de cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) usando a resina Talon Superflow (Clontech). A fração solúvel foi incubada durante 1 h, a 4 °C, com a resina, na proporção de 1 mL de resina para cada litro de cultura expresso. Após período de incubação, a fração solúvel, juntamente com a resina, foram acodicionados em uma coluna de plástico PoliPrep (Biorad) para coleta do flow-through. Posteriormente, foram realizadas lavagens com tampão de lavagem (Apêndice A) e, por fim, o PPARγ foi eluído utilizando tampão de eluição (Apêndice A).

A amostra de eluição foi então submetida a uma segunda etapa de purificação, dessa vez pela técnica de gel filtração. A amostra foi injetada com fluxo de 0,3 mL/min em uma coluna de gel filtração Superdex 75 (16/60), acoplada a um sistema cromatográfico utilizando o equipamento AKTA Purifier (GE). A coluna foi equilibrada previamente com tampão (Apêndice A) e uma eluição isocrática foi realizada com 1,2 volumes de coluna.

1.3.6.2. Expressão e purificação de CDK5 e p25

1.3.6.2.1. Expressão e purificação em células de bactéria

A CDK5, clonada em vetor pProexHTb, foi expressa utilizando cepas de E. coli BL 21(DE3), previamente transformadas, em meio LB com antibiótico ampicilina (50 ug/mL). O crescimento da cultura foi realizado a 37 ° C, até atingir DO600nm de 0,8, momento no qual a

cultura foi induzida com 0,5 mM de IPTG durante 4 h, a 30 ° C. A lise e purificação por afinidade foram realizadas de acordo com protocolo descrito para o PPARγ na seção 1.3.6.1. A composição dos tampões dessas etapas está descrita no Apêndice A.

Após primeira etapa de purificação por afinidade, as amostras contendo CDK5 foram submetidas a uma segunda etapa de purificação utilizando a técnica de troca iônica. Antes da etapa de troca iônica, a eluição proveniente da purificação por afinidade foi submetida a uma troca de tampão (Tampão de Desalting, Apêndice A) utilizando uma coluna de desalting (HiTrap 5 mL, GE). Todas as frações provenientes da desalting foram então purificadas utilizando uma coluna de troca iônica (High Q).

A p25, clonada em pet28a, foi também expressa em cepas de E. coli BL 21(DE3). Testes foram realizados também em cepas BL21-codon plus, assim como co-expressão de CDK5 com p25, porém não foi obtido sucesso em nenhum dos casos. Para expressão da p25, o crescimento da cultura de células em meio LB foi realizado a 37 ° C, durante 4 h, até atingir DO600nm de 1,0,

quando então foi realizada indução com 0,5 mM de IPTG, a 20 ° C, por 16 h. As etapas de lise e purificação por afinidade foram realizadas de acordo com protocolo descrito para o PPARγ na seção 1.3.6.1. A composição dos tampões dessas etapas está descrita no Apêndice A.

1.3.6.2.2. Expressão e purificação em células de inseto Sf9

Devido ao baixo rendimento da expressão de CDK5 em bactérias, o sistema de expressão foi alterado para linhagem celular de inseto Sf9 (Spodoptera frugiperda), cedida pelo grupo do Prof. Dr. Kleber Fanchini do LNBio. O gene da CDK5, fusionado a Glutationa S-transferase (GST) e inserido em vetor pFastBac™ Dual, foi adquirido comercialmente (GenScript). As etapas de produção do vetor de transferência do baculovírus (bacmid) e produção de baculovírus pelas células de inseto foram todas realizadas de acordo com manual Bac-to-Bac® Baculovirus

Expression System (Invitrogen). As seguintes etapas foram realizadas com a colaboração da

especialista MSc. Renata Rocha de Oliveira (LNBio) e a MSc.Tabata Renee Doratioto (LNBio).

Na primeira etapa, a CDK5 contida no plasmídeo doador pFastBAc™ Dual, foi insetida no bacmid por meio de transformação (em meio S.O.C) de 150 ng desse plasmídeo em bactéria competente DH10Bac (E. coli). Após transformação por choque térmico, as células foram plaqueadas em placas com meio LB contendo os seguintes componentes: 50 µg/mL Canamicina, 7 µg/mL Gentamicina, 10 µg/mL Tetraciclina, 100 µg/mL Bluo-gal e 40 µg/mL IPTG. Após incubação de 48 h, a 37 ° C, as placas foram analisadas em busca de colônias brancas (bacmid recombinante com CDK5). As colônias azuis são bacmid sem recombinação (vazios). As colônias brancas foram coletadas e inoculadas em 10 mL de meio LB com crescimento por 24 h, a 37 ° C. O inóculo foi então submetido a procedimento de extração e purificação de DNA através de minipreparação plasmidial. O DNA extraído e purificado foi então submetido a reação de PCR para amplificação e confirmação da presença do bacmid com CDK5, segundo protocolo contido no manual Bac-to-Bac® (Invitrogen).

De posse dos bacmids contendo CDK5, estes foram transfectados, de acordo com manual, em células de inseto Sf9. Nessa etapa foram utilizadas 1 x 106 de células em 2 mL de meio estéril SF900-II (sem soro fetal bovino, Thermo Fisher Scientific) e Cellfectin II (Thermo Fisher

Scientific) foi o reagente escolhido para transfecção. A transfecção foi realizada em um poço de

placa de 6 poços (Cell Culture Plate - NEST). Após transfecção, as células foram mantidas por 72 h a 27 ° C para produção do vírus. Após esse período, os vírus produzidos foram coletados e armazenados (são denominados de P0). Nessa etapa, as células já iniciam a produção da proteína de interesse, no caso a CDK5, e a expressão pode já ser confirmada. 100 uL de vírus P0 foram então utilizados para infectar 10 mL de 2 x 107 células Sf9. Nessa etapa ocorre a amplificação do vírus para escalonar a quantidade produzida. As células infectadas foram mantidas a 27 ° C, por 96 h, e um novo estoque de vírus, agora denominado P1, foi coletado. Todos os estoques de vírus foram mantidos a 4 ° C e protegidos de luz. Esse processo foi realizado até se obter quantidade de vírus adequada para realização do ensaio de titulação viral. A titulação viral foi uma etapa utilizada para identificar a quantidade ideal de vírus para otimizar a expressão da proteína em estado solúvel. Nesse ensaio, diferentes quantidades de P1 (0,5, 1, 2 e 4 mL) foram usadas para

infectar 50 mL de cultura contendo 2 x 106 células cultivadas em erlenmeyers. Na condição controle, não foi realizada infecção viral.

Para purificação da CDK5, as células de inseto Sf9, previamente sedimentadas (500 g por 5 min) foram incubadas com Tampão de Lise (Apêndice 1). O processo de lise foi realizado de acordo com o descrito na seção 1.3.6.1. Após lise das células, a CDK5 com GST foi purificada do extrato proteico através de cromatografia por afinidade, utilizando resina Glutathione

Sepharose 4 Fast Flow (GE). A CDK5 foi eluída utilizando glutationa reduzida em tampão de

eluição (Apêndice A).