1.4. Resultados e Discussão
1.4.8. Padronização da expressão e purificação da CDK5 e de sua proteína parceira p
Nas seções anteriores foram descritos dois métodos experimentais para avaliar a importância das lisinas K261, K263 e K265 no processo de fosforilação da S245 do PPARγ. Para o ensaio de fosforilação foi utilizado o complexo CDK5/p25 adquirido comercialmente (SignalChem), enquanto que para o ensaio de anisotropia de fluorescência utilizou-se CDK5 expressa e purificada, in house, no próprio Laboratório Nacional de Biociências (LNBio).
A quantidade necessária de CDK5 e p25 para se realizar ensaios biofísicos, como a anisotropia de fluorescência, é bastante elevada em relação a quantidade para ensaios enzimáticos, e o valor comercial do complexo ativo torna sua utilização em ensaios biofísicos inviável. Por essa razão, buscou-se a expressão in house dessas proteínas, o que não é um procedimento trivial, conforme apontado por outros grupos de pesquisa (QU et al., 2012). A primeira tentativa de expressão foi realizada em bactérias (de acordo com método descrito na seção 1.3.6.2.1), porém preliminarmente apenas a CDK5 foi expressa com sucesso, apesar do rendimento bastante pequeno (aproximadamente 200 µg para cada litro de cultura). O baixo rendimento na expressão dessas proteínas também já foi relatado por outros grupos de pesquisa (QU et al., 2012). Diante disso, outras alternativas em termos de protocolo para expressão da p25 em bactérias foram testados e validados com sucesso. Ademais, alternativas em relação ao
sistema de expressão da CDK5 obtiveram êxito, e um sistema de expressão em célula de inseto para essa proteína foi padronizado.
1.4.8.1. Análise da expressão e purificação da CDK5 em células de inseto Sf9
A expressão da CDK5 em células de inseto envolveu duas etapas gerais. Na primeira etapa foi construído um vetor de transferência do baculovírus (denominado bacmid) contendo o gene para expressão da CDK5. Em uma segunda etapa, o bacmid produzido foi introduzido em células de inseto para que estas pudessem produzir particulas de baculovírus recombinante e expressar a proteína CDK5 de interesse. Detalhes metodológicos das duas etapas estão contidos na seção 1.3.6.2.2.
Figura 22 - Preparação do bacmid e expressão de CDK5 em células de inseto Sf9.
A, gel de agarose 1% contendo DNA amplificado por PCR de bacmid vazio ou bacmids contendo gene da CDK5. B, eletroforese em gel SDS-PAGE das etapas de purificação da CDK5 em células de inseto Sf9. Os retângulos indicam bandas da CDK5 e GST nas eluições. C, eletroforese em gel SDS-PAGE de eluições provenientes do processo de expressão e purificação da CDK5 em diferentes quantidades de vírus para 50 mL de meio de cultura. Os retângulos indicam bandas de CDK5 na titulação viral escolhida (2 mL de vírus para 50 mL de meio). M: marcador; P: pellet; S: sobrenadante; FT, flow-through; L: lavagem e E:eluíção.
A primeira etapa de produção do bacmid é uma etapa bastante importante e delicada, pois deve-se garantir que o gene de interesse (no caso CDK5) seja corretamente inserido no vetor e que as preparações desse vetor estejam puras e livre de contaminação de vetores vazios. Esse tipo de contaminação pode reduzir a eficiência de produção de baculovírus pelas células de inseto. A Figura 25A mostra o produto de amplificação proveniente de análise de PCR de 2 bacmids contendo o gene da CDK5. O primeiro deles contém, além de bacmids com o gene da CDK5 (gene da CDK5: 1578 bp; bacmid com vetor pFastBac™ Dual da CDK5: 2560; total: ~4110 bp), também bacmids vazios (~ 300 bp) e, portanto, não foi utilizado. O segundo, por sua vez, apresenta uma banda em altura adequada (aproximadamente 4000 bp) e sem contaminação significativa, sendo usado na segunda etapa de produção do baculovírus.
Uma vez de posse dos bacmids, esses foram transfectados em células de inseto Sf9 para produção do baculovírus recombinante. Os baculovírus produzidos foram então coletados e infectados em células de inseto. Infecções sequenciais são feitas para permitir a amplificação viral, tendo como objetivo escalonar a produção de vírus para a fase de expressão proteica. Mesmo em fases iniciais de produção do vírus, as células são continuamente infectadas e iniciam a produção da proteína de interesse. Na Figura 25B está apresentado um gel SDS-PAGE das etapas de expressão e purificação da CDK5 no primeiro estágio de infecção viral (P1). É possível observar duas bandas (marcadas com retângulo) nas amostras de eluição (E1, E2 e E3) provenientes do processo de purificação por cromatografia de afinidade. As bandas superiores, em torno de 60 kDa, são referentes a CDK5 ligada a cauda de GST. As bandas inferiores, por sua vez, são referentes a GST livre.
Para otimizar a produção da CDK5 com menor gasto de vírus, foi realizado um procedimento de titulação viral, no qual foram testadas diferentes razões vírus/célula. Na Figura 25C está apresentado um gel SDS-PAGE de purificação da CDK5 a partir de 4 diferentes títulos virais (0,5, 1, 2 e 4 mL de vírus para 50 mL de meio de cultura). As bandas mais intensas, próximo a 60 kDa, correspondem a CDK5 com cauda de GST e é possível notar que no terceiro título utilizado (2 mL para cada 50 mL de meio de cultura) já existe uma saturação na produção de CDK5. Por essa razão padronizamos a terceira titulação para a expressão da CDK5 em células de inseto Sf9. O rendimento final aproximado foi bastante satisfatório em relação ao sistema de expressão em bactérias, com 1 mg de CDK5 para cada 50 mL de meio de cultura.
1.4.8.2. Análise da expressão e purificação da p25 em células de bactéria
De maneira diferente da produção de CDK5, a p25 teve satisfatórios níveis de expressão em células de bactérias após otimização do processo. Para os testes de expressão foram utilizadas cepas de BL21(DE3) e códon plus, com ou sem co-expressão de CDK5, sendo os melhores níveis de expressão obtidos utilizando BL21(DE3) sem co-expressão de CDK5. Outras condições de expressão, como tempo e temperatura de indução também foram testadas, e o método detalhado encontra-se na seção 1.3.6.2.1.
Figura 23 - Expressão e purificação da p25 em bactérias.
A, Eletroforese em gel SDS-PAGE das etapas de purificação da p25 em células de E.coli BL21. O retângulo indica a banda da p25 com causa de histidina após eluição com Imidazol. B, membrana de nitrocelulose indicando a detecção da p25 por Western Blot. Para detecção foi utilizado anticorpo anti-his (diluição de 1:3000) com incubação de 6 h a 4 ° C. O procedimento do Western Blot foi realizado de acordo com protocolo definido na seção 1.3.9. M: marcador; P: pellet; S: sobrenadante; FT, flow-through; L: lavagem e E:eluíção.
A Figura 26A apresenta o gel SDS-PAGE de expressão da p25 em cepa de E. coli BL21 nas melhores condições encontradas (indução a 20 ° C com 0,5 mM de IPTG por 16 h). Apesar de apresentar alguns contaminantes após etapa de purificação por afinidade, a eluição apresentou uma banda próxima a 25 kDa, tamanho esperado da p25. Para confirmação da presença da p25 na amostra, esta foi submetida a um Western Blot utilizando anticorpo para detecção da cauda de histidina. A Figura 26B apresenta a membrana de Western Blot revelada e pode-se observar uma
única banda na amostra eluída na altura próxima a 25kDa, o que mostra a presença da proteína p25.
Além de analisadas por Western Blot, tanto a CDK5 quanto a p25 tiveram suas sequências confirmadas por espectrometria de massas. As amostras de ambas proteínas provenientes do processo de purificação por afinidade, foram extraídas do gel SDS-PAGE e digeridas com tripsina. Os peptídeos advindos da digestão foram então detectados por espectrometria de massas. Todo o processo foi realizado de acordo com protocolos já padronizados do Laboratório de Espectrometria de Massas (LNBio) e assessorado pela Dra. Bianca Alves Pauletti. A Figura 27 mostra a sequência de cada uma das proteínas e a cobertura dos peptídeos identificados através da técnica de espectrometria de massas (em vermelho). A cobertura da p25 foi de 44% enquanto a CDK5 obteve cobertura de 55%. Essa análise confirma que as bandas indicadas nos géis SDS- PAGE correspondem a p25 ou CDK5, o que valida o sucesso da expressão e purificação inicial de ambas proteínas.
Dessa forma, tanto a CDK5 quanto a p25 foram expressas com sucesso, em níveis de produção adequados a demanda dos ensaios experimentais. Além de ensaios biofísicos, como anisotropia de fluorescência, a produção in house em quantidade adequada dessas proteínas, abre a possibilidade da montagem do complexo PPARγ-CDK5/p25 para cristalização e futura obtenção de estrutura cristalográfica.
Figura 24 - Análise da CDK5 e p25 através de espectrometria de massas.
Cobertura dos peptídeos detectados através da técnica de espectrometria de massas usando o equipamento Q-TOF. Em vermelho estão marcados os peptídeos detectados.
1.5. Conclusões e Perspectivas
Nesse Capítulo I foi explorada a interação entre o PPARγ e a CDK5/p25, com a construção de um modelo de interação entre essas duas proteínas (Figura 28). A análise de dados estruturais de substratos de CDK5, permitiu a identificação de um importante resíduo do PPARγ, K261, no seu reconhecimento pela CDK5. Apesar de sequencialmente distante da serina alvo da fosforilação, esse resíduo ocupa da região P+3 de reconhecimento da CDK5, tendo um papel crucial na especificidade a substratos. Juntamente a S245, a lisina 261 guiou a construção do modelo de docking entre PPARγ/p25. Esse modelo soma informações relevantes ao mecanismo de reconhecimento e fosforilação do PPARγ pela CDK5. Duas outras importantes lisinas, 263 e 265, foram identificadas nesse modelo por fazer contato com uma importante região da CDK5 que é rica em resíduos carregados negativamente. Esses contatos eletrostáticos formam um sítio de ancoragem distal que é bastante importante no mecanismo de encaixe de quinases aos seus substratos.
Figura 25 - Esquema representativo da interação entre PPARγ e CDK5/p25.
Dois elementos de reconhecimento da CDK5 são apresentados. O primeiro refere-se ao reconhecimento da sequência não contínua do PPARγ, formada pelos resíduos do PPARγ S245 (P0), P246 (P+1), F247 (P+2) e K261 (P+3). Este último está sequêncialmente distante da S245 mas ocupa estruturalmente a posição P+3, interagindo com o resíduo E240 da P25. O segundo elemento corresponde ao sítio de ancoragem distal formado pelos resíduos K263 e K265 do PPARγ e a região rica em resíduos negativamente carregados da CDK5. A CDK5 está colorida em cinza, a p25 em azul e os resíduos chave do PPARγ para sua interação com CDK5 estão em amarelo.
A importância desses resíduos de ancoragem distal é exemplificada pela presença de resíduos do PPARγ, como o K263 e K265, que mantêm contato com resíduos conservados entre a CDK5 e a ERK2, enzimas que compartilham a fosforilação da S245 do PPARγ. Ensaios biofísicos de anisotropia de fluorescência e ensaios enzimáticos de fosforilação validaram a relevância das lisinas K261, K263 e K265 na interação e fosforilação do PPARγ pela CDK5. Por fim, a conservação desses resíduos, assim como o S245, em mamíferos e a ausência de polimorfismo em humanos sugere um papel chave e uma função metabólica relevante adquirida evolutivamente.
A construção desse modelo abre possibilidades para o desenho racional de ligantes que tenham como alvo resíduos do PPARγ contidos na interface com a CDK5/p25. A região das lisinas nunca foi antes explorada como alvo de ligantes e configura uma alternativa ao tradicional LBP do PPARγ, que está estruturalmente relacionado aos efeitos adversos produzidos por agonistas de PPARγ. Além de pequenas moléculas, abre-se a possibilidade para desenho de peptídeos ou peptídeos miméticos com objetivo de inibir a interação do PPARγ com a CDK5/p25. Nesse caso, está em fase de construção um método para desenho de peptídeos, com colaboração do Prof. Dr. Paulo Sérgio Lopes de Oliveira (LNBio), que serão utilizados, entre outros fins, para inibição da interação entre PPARγ e CDK5/p25.
Adicionalmente, a padronização da expressão da CDK5 e p25 apresentada aqui irá permitir a obtenção do complexo dessas proteínas em quantidade suficientes para realização de ensaios biofísicos, como a anisotropia de fluorescência. Outras técnicas, que requerem uma quantidade maior de amostra, como é o caso da técnica de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) poderão ser usadas também para a investigação da interação entre CDK5/p25 e o PPARγ na presença de moduladores. Além disso, quantidades adequadas dessas proteínas poderão ser utilizadas para a obtenção de cristais do complexo PPARγ-CDK5/p25.
CAPÍTULO 2
Estudo do mecanismo de inibição da fosforilação da
S245 do PPARγ
2.1. Introdução
Desde 2010, com a identificação da importância da fosforilação do PPARγ pela CDK5 no contexto da resistência à insulina induzida pela obesidade, essa via obteve um grande enfoque por uma possível modulação para fins terapêuticos (CHOI et al., 2010). Desde então, diversos grupos vêm trabalhado na identificação de ligantes que inibam a fosforilação da S245 do PPARγ. Na realidade, como já mencionado no Capítulo 1, não tem sido buscado apenas ligantes que inibam a fosforilação, mas também que produzam uma mínima ativação desse receptor. Em 2018, nosso grupo identificou com sucesso um ligante de PPARγ sem propriedades agonistas, AM-879, que apresentou capacidade em inibir a fosforilação da S245 (FILHO et al., 2018). Além dos dados enzimáticos e celulares, a estrutura cristalográfica do PPARγ foi resolvida na presença desse ligante (Figura 29), em colaboração com a Dra. Albane le Maire.
É importante notar que dado o elevado número de estudos referentes ao PPARγ e sua modulação, uma extensa lista de ligantes desse receptor é conhecida. Porém, não se sabe ao certo quais desses ligantes não são capazes de inibir a fosforilação da S245 ou se ligantes endógenos clássicos desse receptor, como ácidos graxos, afetam esse processo. Até o momento, apenas uma molécula foi identificada por efetivamente se ligar no sítio de ligação ao ligante do PPARγ e não ser capaz de inibir sua fosforilação (BAE et al., 2016), porém a estrutura do PPARγ co- cristalizado com essa molécula apresenta densidades eletrônicas não explicadas no sítio do ligante, o que dificulta uma correta interpretação dos resultados.
Apesar de um grande número de moléculas que inibem a fosforilação da S245 já terem sido identificados (Tabela 6), o mecanismo pelo qual produzem esse efeito ainda está inconclusivo e merece destaque, uma vez que o completo entendimento desse mecanismo pode aprimorar o desenho de ligantes cada vez mais específicos para esse processo.
Tabela 6 - Lista de ligantes de PPARγ identificados experimentalmente por inibir a fosforilação da S245.
Ligante Referência
Rosiglitazona Choi et al., 2010; Liu et al., 2015 Pioglitazona Xie et al., 2015
AM-879 Ribeiro-Filho et al., 2018 F12016 Liu et al., 2015
L312 Xie et al., 2015
UCH1 Choi et al., 2014
SR1664 Choi et al., 2011 MRL24 Choi et al., 2010 BVT.13 Choi et al., 2010 nTZDpa Choi et al., 2010 Amorfrutin 1 Weidner et al., 2012 SB1405 Bae et al., 2016 SB1451 Bae et al., 2016 SB1453 Bae et al., 2016
Uma primeira hipótese para o mecanismo de inibição da fosforilação do PPARγ foi proveniente de experimentos de monitoramento da troca hidrogênio/deutério (HDX) (CHOI et al., 2010). Esses experimentos mostraram que um ligante que inibia a fosforilação, o MRL24, afetava a troca na região da S245, ou seja, essa região parecia estar menos flexível o que, segundo os autores, produziria uma configuração menos favorável para a fosforilação da CDK5. Entretanto, experimentos de HDX produzem resultados bastante dependentes da condição experimental. Por exemplo, apesar de Choi e colaboradores (2010) não observarem alterações significativas no HDX na região da serina na presença de Rosiglitazona, Amato e colaboradores (2012) mostraram que esse mesmo ligante estabiliza essa região. Além dessa região, outras duas parecem sofrer alterações na presença de ligantes: a H3 e a folha-β, ambas regiões que formam o bolsão hidrofóbico do PPARγ e fazem contato direto com os ligantes (AMATO et al., 2012; BAE et al., 2016; CHOI et al., 2011, 2016). Assim, experimentos de HDX realizados na tentativa de elucidar o mecanismo de inibição da fosforilação não permitiram ainda respostas conclusivas.
Figura 26 - Estrutura cristalográfica do domínio de ligação do ligantes (LBD) do PPARγ
A estrutura foi obtida do PDB com código 6AN1 e é proveniente de co- cristalização com a molécula AM-879, mostrada por inibir a fosforilação da S245 do PPARγ. Regiões do PPARγ relevantes para as discussões do presente capítulo estão indicadas, assim como o sítio de interação do ligante (LBP). Nessa estrutura, devido a sua mobilidade, a alça H2’-H3 não está completa e apresenta apenas uma porção N-terminal.
Apesar de não fazer parte dos resíduos que compreendem a interface de interação com a CDK5, o resíduo S342 do PPARγ foi apontado por sua aparente importância em relação aos ligantes que inibem a fosforilação (HUGHES et al., 2012). Comparando-se a eficiência de três ligantes em inibir a fosforilação, observou-se uma correlação positiva na força de interação desses ligantes com o resíduo S342 e sua capacidade em inibir a fosforilação. Porém, apesar de importante, esse achado ainda não justifica o mecanismo pelo qual esses ligantes a inibem.
Uma hipótese mais clara parece envolver a alça H2’-H3 (também conhecida como loop- Ω), que está localizada entre a hélice H2’ e a H3 do PPARγ. Evidencias computacionais e estruturais (MOTTIN; SOUZA; SKAF, 2015) indicam uma mudança conformacional dessa alça na presença de ligantes que inibem a fosforilação em relação a proteína sem ligantes. Dessa forma, esses ligantes manteriam a alça em uma posição desfavorável para a interação com a CDK5, e consequente fosforilação do PPARγ. Entretanto, caso essa hipótese seja verdadeira, a maneira pela qual os ligantes estabilizam essa região e a maneira pela qual essa modificação impacta na interação com a CDK5, não foram esclarecidas. Além disso, como os estudos utilizam basicamente o agonista Rosiglitazona, não se sabe se a mudança conformacional da alça H2’-H3
também ocorre na presença de outros ligantes que inibem a fosforilação. Na realidade, apesar de tentativas por métodos diferentes de se explicar esse fenômeno, o insucesso de uma completa resolução da questão pode ocorrer devido ao fato da interação tanto dos ligantes com o PPARγ, quanto deste último com a CDK5 requerer bastante adaptação e flexibilidade, o que dificulta a criação de um modelo estrutural definitivo.
2.2. Justificativa e objetivos
O completo entendimento do mecanismo pelo qual ligantes de PPARγ inibem a fosforilação desse receptor mediada pela CDK5 ainda não é bem entendida, mesmo para os pesquisadores pioneiros na identificação dessa fosforilação. A elucidação desse mecanismo é de alto impacto, pois permite o desenho de inibidores mais específicos para esse sistema. Portanto, considerando o valor científico da elucidação desse mecanismo, os objetivos desteCapítulo foram:
• Comparar estruturalmente estruturas do PPARγ sem ligantes com estruturas co- cristalizadas com ligantes que inibem a fosforilação da S245;
• Analisar e comparar o B-factor entre os grupos de estruturas mencionados acima; • Identificar e comparar os contatos mais frequentes dos ligantes no grupo de
estruturas de PPARγ com ligantes que inibem a fosforilação;
• Avaliar, por anisotropia de fluorescência, a interação do PPARγ com a CDK5 na presença de um dos ligantes que inibe a fosforilação, a Rosiglitazona.