UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL
Manipulação do efeito de Warburg em células de mamífero em cultura:
implicações para o metabolismo energético
Miguel Ricardo Guerreiro
MESTRADO EM BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA 2011
UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL
Manipulação do efeito de Warburg em células de mamífero em cultura:
implicações para o metabolismo energético
Dissertação de mestrado orientada por:
Doutora Ana Sofia Coroadinha (Instituto de Tecnologia Química e Biológica / Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Oeiras)
Doutora Maria Filomena Caeiro (Departamento de Biologia Vegetal, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Lisboa)
Miguel Ricardo Guerreiro
MESTRADO EM BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA 2011
i i. AGRADECIMENTOS
Quero prestar os meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que directa ou indirectamente contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho. Em particular:
à Doutora Paula Alves, pela oportunidade de realizar a minha dissertação na Unidade de Tecnologia de Células Animais (UTCA), e à Doutora Ana Sofia Coroadinha, pela oportunidade de integrar a equipa de Biotecnologia Molecular e Desenvolvimento de Linhas Celulares e pela orientação e disponibilidade;
à Ana Filipa Rodrigues, pela orientação técnica e científica, pela boa disposição e compreensão e pelo incansável auxílio no trabalho laboratorial e na elaboração da presente dissertação;
à Doutora Maria Filomena Caeiro pela orientação e disposição a ajudar prontamente. A todos os professores do meu percurso académico pelas boas memórias e ensinamentos que me preparam da melhor forma possível para esta difícil mas proveitosa jornada;
ao Doutor Rui Gardner e à Telma Lopes, do Laboratório de Citometria de Fluxo do Instituto Gulbenkian de Ciência, pela ajuda técnica necessária ao prosseguimento do presente trabalho;
a todos os colegas da UTCA por me terem recebido da melhor forma e por me terem ajudado sempre que precisava. Em particular à Vanessa Bandeira, Hélio Tomás, Paulo Fernandes e Doutora Rute Castro por todo o apoio e disponibilidade;
a todos os meus familiares, em particular aos meus pais e à minha irmã, por sempre terem acreditado em mim e pelo seu apoio nos momentos difíceis;
a todos os meus amigos, por todo o apoio e momentos de diversão e descontracção.
ii ii. RESUMO
A maioria das linhas celulares de mamífero usadas na produção de biofármacos complexos apresenta um elevado consumo de glucose e acumulação de quantidades significativas de lactato – fenótipo lactogénico associado ao efeito de Warburg – reduzindo a produtividade e qualidade do biofármaco. Este trabalho teve como objectivo a manipulação deste fenótipo, procurando reduzir a acumulação de lactato e aumentar a eficiência do metabolismo energético, com consequente aumento da produtividade e qualidade de partículas virais e anticorpos. As linhas celulares 293 FLEX GFP (produtora de retrovírus), MDCK E1 (produtora de adenovírus) e RPE A6 (produtora de anticorpos monoclonais) foram silenciadas para o factor 1 indutível por hipoxia (HIF1) e cinases 1 e 3 da piruvato desidrogenase (PDK1/3), os principais efectores deste fenótipo.
Nas células RPE A6 o silenciamento de HIF1 originou células com baixa capacidade proliferativa sugerindo a reversão da imortalização e entrada em senescência. Sem alterações aparentes no crescimento celular, nas células 293 FLEX GFP observou-se uma diminuição das taxas de consumo de glucose e de produção de lactato aliada a aumentos notáveis na produtividade celular (até 18,2x em partículas totais e até 21,6x em partículas infecciosas) e sua qualidade; o silenciamento adicional de PDK1/3 potenciou estes efeitos, destacando-se o aumento adicional (2,8x) da qualidade do produto final. Nas células MDCK E1 não se obtiveram reduções no consumo de glucose e produção de lactato e os aumentos na produção viral e sua qualidade foram moderados. Adicionalmente, observou-se nas células silenciadas aumento de poder redutor em 293 FLEX GFP e dos níveis de ATP em MDCK E1, suportando a redução do fenótipo lactogénico e aumento de eficiência do metabolismo energético.
Estes resultados evidenciam a manipulação do fenótipo lactogénico associado ao efeito de Warburg como potencial ferramenta de engenharia metabólica visando o aumento da produtividade de biofármacos complexos em cultura de células de mamífero.
Palavras-chave: efeito de Warburg; factor 1 indutível por hipoxia (HIF1); complexo da piruvato desidrogenase (PDH); metabolismo energético; produtividade celular.
iii iii. ABSTRACT
The majority of mammalian cell lines used in the production of complex biopharmaceuticals present high rates of glucose consumption accumulating significant amounts of lactate – lactogenic phenotype associated to the Warburg effect – which results in the reduction of cellular productivity and in final product quality. The goal of this work was the manipulation of this phenotype aiming at the reduction of lactate accumulation and the improvement of energy metabolism efficiency, to increase viral particles and antibodies productivity and quality. 293 FLEX GFP (retrovirus producer), MDCK E1 (adenovirus producer) and RPE A6 (monoclonal antibodies producer) cell lines were silenced for hypoxia-inducible factor 1 (HIF1) and pyruvate dehydrogenase 1 and 3 (PDK1/3), the major molecular effectors of this phenotype.
The silencing of HIF1 in RPE A6 cells resulted in cells with low proliferative capacity suggesting the reversion of immortality and entry into senescence. Without relevant impact in cellular growth, the 293 FLEX GFP cells showed a reduction in glucose uptake and lactate production rates along with a significant increase of cellular productivities (up to 18.2x in total and up to 21.6x in infectious particles) and its quality; further silencing of PDK1/3 potentiated the effects of HIF1 silencing, with special focus in the additional increase of final product quality (2.8x). In MDCK E1 cells no reduction of glucose uptake and lactate production rates was observed and viral productivity and its quality increased moderately. Additionally, it was observed an increase in intracellular reducting power in 293 FLEX GFP cells and in ATP levels in MDCK E1 cells, further supporting the reduction of lactogenic phenotype and the improvement of energy metabolism.
These results highlight the manipulation of lactogenic phenotype associated to the Warburg effect as a potential metabolic engineering tool for the improvement of complex biopharmaceuticals production in cultured mammalian cell lines.
Keywords: Warburg effect; hypoxia inducible factor 1 (HIF1); pyruvate dehydrogenase complex (PDH); energetic metabolism; cellular productivity.
iv iv. LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Descrição
cDNA ADN complementar (do Inglês complementary DNA)
DNA Ácido desoxirribonucleico (do Inglês Deoxyribonucleic Acid) ERO Espécies reactivas de oxigénio
GFP Proteína fluorescente verde (do Inglês Green Fluorescent Protein) HIF1 Factor 1 indutível por hipoxia (do Inglês Hypoxia Inducible Factor 1) LDH Lactato desidrogenase (do Inglês Lactate Dehydrogenase)
mRNA ARN mensageiro (do Inglês messenger RNA) ntshRNA non-target short hairpin RNA
PCR Reacção em cadeia da polimerase (do Inglês Polymerase chain reaction) PDH Complexo da piruvato desidrogenase (do Inglês Pyruvate
Dehydrogenase Complex)
PDHE1α Subunidade α do componente E1 do complexo piruvato desidrogenase (do Inglês E1 alpha subunit of pyruvate dehydrogenase complex) PDK Cinase da piruvato desidrogenase (do Inglês Pyruvate Dehydrogenase
Kinase)
PDP Fosfatase da piruvato desidrogenase (do Inglês Pyruvate dehydrogenase
phosphatase)
PI Partículas infecciosas PT Partículas totais
qRT-PCR PCR quantitativo por transcrição reversa (do Inglês Quantitative reverse
transcription polymerase chain reaction)
RFP Proteína fluorescente vermelha (do Inglês Red Fluorescent Protein) RNA Ácido ribonucleico (do Inglês Ribonucleic Acid)
shRNA short hairpin RNA
v
V.ÍNDICE
i. AGRADECIMENTOS ... i
ii. RESUMO ... ii
iii. ABSTRACT ... iii
iv. LISTA DE ABREVIATURAS ... iv
1. INTRODUÇÃO ...1
1.1. Cultura de células de mamífero e o fenótipo lactogénico ...1
1.2. Imortalização celular e o efeito de Warburg ...2
1.3. Impacto do efeito de Warburg em biotecnologia ...4
1.4. Objectivos principais ...5
2. MATERIAIS E MÉTODOS ...6
2.1. Linhas celulares e meios de cultura ...6
2.2. Produção de plasmídeos e vectores lentivirais ...6
2.3. Transdução celular, selecção e clonagem ...7
2.4. Estudos de crescimento e análise de metabolitos ...7
2.5. Extracção de RNA total e qRT-PCR ...8
2.6. Produção e titulação de vectores retrovirais...8
2.7. Produção e titulação de vectores adenovirais ...8
2.8. Determinação da actividade da lactato desidrogenase...9
2.9. Western Blot ...9
2.10. Quantificação de fosfatos de adenosina e nucleótidos de piridina ... 10
2.11. Quantificação de espécies reactivas de oxigénio... 10
2.12. Coloração para detecção de actividade da β-galactosidade ... 10
2.13. Cálculos ... 10
3. RESULTADOS ... 11
vi
3.2. Silenciamento simultâneo de HIF1, PDK1 e PDK3... 15
4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ... 24
5. PERSPECTIVAS FUTURAS ... 29
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 30
1 1. INTRODUÇÃO
1.1. Cultura de células de mamífero e o fenótipo lactogénico
Nos últimos anos tem-se verificado uma crescente procura de biofármacos complexos, como proteínas recombinantes e partículas derivadas de vírus, quer para fins terapêuticos quer para fins de diagnósticos in vivo. O potencial dos biofármacos derivados de vírus, em particular, tem vindo a aumentar devido às suas diversas aplicações profiláticas, terapêuticas e clínicas como a vacinação, o tratamento do cancro e a terapia génica 1. Actualmente, o sistema preferencial para a manufacturação destes produtos biofarmacêuticos complexos é as células de mamífero, usadas para a produção de mais de metade dos biofármacos existentes no mercado. Tal predomínio deve-se à sua semelhança com as células humanas no folding de proteínas e nas modificações pós-traducionais, como a glicosilação, aumentando a eficiência terapêutica e diminuindo o potencial imunogénico do produto final 2,3.
As células de mamífero em cultura, à semelhança de células transformadas, possuem um metabolismo energético desregulado, consumindo elevadas quantidades de glucose e acumulando quantidades significativas de lactato, com reduzida entrada de carbono derivado da glicólise no Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos (TCA) 4. Do ponto de vista da cultura de células para produção de biofármacos este fenótipo lactogénico tem simultaneamente um efeito negativo no crescimento e viabilidade celular e na produtividade e qualidade do biofármaco. Este fenómeno é ainda mais importante no caso das partículas derivadas de vírus para terapia génica, já que a sua infecciosidade é fortemente influenciada por variações no pH do meio de cultura 5. Diversas estratégias têm sido testadas de forma a reduzir os efeitos nocivos da acumulação de lactato no meio de cultura: fornecimento de glucose de forma controlada 6,7; suplementação do meio de cultura com substratos alternativos à glucose 8; remoção dos metabolitos tóxicos 9; desenvolvimento de meios de cultura com base na análise dos fluxos metabólicos, permitindo adaptar os seus constituintes às necessidades metabólicas das células 10,11; introdução da enzima piruvato carboxilase nas células 12-14; diminuição da expressão da lactato desidrogenase através da disrupção do gene Ldha por recombinação homóloga 15 ou através de RNA de interferência 16; ou introdução de um transportador para a frutose, constituindo uma alternativa ao consumo de glucose 17. No entanto, estas estratégias têm um sucesso limitado devido aos efeitos compensatórios causados pela apertada regulação homeostática intracelular, que não são facilmente alteráveis.
2 1.2. Imortalização celular e o efeito de Warburg
Nos anos 20, Otto Warburg observou que as células cancerígenas, comparativamente às células normais, apresentavam elevadas taxas de consumo de glucose, secretando a maior parte do carbono derivado da glucose sob a forma de lactato, em vez de o oxidar completamente 18,19 – um cenário que ficou conhecido como efeito de Warburg. Estudos recentes sobre o metabolismo energético de células cancerígenas sugerem que este resulta de alterações genéticas que ocorrem no processo de tumorigénese, principalmente durante a imortalização e transformação celulares, e que levam à desregulação do metabolismo energético central e ao aumento da actividade glicolítica 20. De facto, existem diversas vias de sinalização comuns ao controlo da proliferação e do metabolismo energético que levam à indução deste cenário, como a activação de oncogenes (MYC) e enzimas glicolíticas, ou a supressão do gene supressor de tumores P53 20,21. Interessantemente, muitas das vias de imortalização activadas no processo de tumorigénese são também recrutadas durante o estabelecimento de uma linha celular e, por isso, tendem a exibir características metabólicas associadas ao efeito de Warburg 20.
O principal efector molecular do efeito de Warburg é o factor 1 indutível por hipoxia (HIF1), um factor de transcrição heterodimérico constituído por uma subunidade β, expressa constitutivamente, e uma subunidade α, cuja expressão está dependente do oxigénio. Apesar de ser expressa em condições de baixa disponibilidade de oxigénio (hipoxia), a expressão constitutiva da subunidade α pode ocorrer em normoxia como resultado de alterações nos sistemas de sinalização para degradação proteica, provocadas durante o processo de imortalização celular. De facto, a sua sobre-expressão é característica comum a muitas células cancerígenas 22,23. O factor de transcrição HIF1 é responsável pela coordenação da alteração do metabolismo para glicólise com formação de lactato, com consequente aumento do consumo de glucose e acumulação de lactato, já que promove a expressão de vários componentes do metabolismo energético, nomeadamente transportadores de glucose (GLUT-1), enzimas da via glicolítica e de lactato desidrogenase (Figura 1) 24,25.
Para além do papel do HIF1 na promoção da glicólise com formação de lactato, estudos recentes revelaram uma significativa influência na respiração mitocondrial. Nos organismos aeróbios, o TCA possui um papel fundamental no metabolismo central das células, constituindo a via de produção de energia mais eficiente e fornecendo o poder redutor e intermediários necessários para as reacções de biossíntese. Normalmente, a glucose é convertida em piruvato no citoplasma, o qual é posteriormente canalizado para o TCA ao nível mitocondrial onde é oxidado a dióxido de carbono e água. A canalização do piruvato
3 para o TCA implica a sua conversão em acetil-CoA, numa reacção catalisada pelo complexo multi-enzimático piruvato desidrogenase (PDH). Sendo esta uma das reacções mais importantes do metabolismo celular, está sujeita a um elevado nível de regulação. Como tal, o complexo PDH é regulado por um ciclo reversível de fosforilação, caracterizado pela fosforilação (inactivação) e desfosforilação (activação) da subunidade α do componente E1 (PDHE1α), promovida por cinases (PDK) e fosfatases (PDP), respectivamente. Na PDHE1α de mamíferos existem três locais de fosforilação (Ser232, Ser293 e Ser300) que podem ser fosforilados por quatro isoenzimas (PDK1-4), sendo a PDK1 a única que consegue fosforilar todos os três locais 26,27. Interessantemente, a sobre-expressão de PDK1 e PDK3 é promovida por HIF1, levando assim à fosforilação de PDHE1α e inibição do complexo PDH (Figura 1). Consequentemente, a entrada do carbono derivado da via glicolítica no TCA ocorre em menor extensão e aumenta a conversão de piruvato a lactato, resultando no fenótipo lactogénico associado ao efeito de Warburg e na desregulação do metabolismo energético 24,28.
Figura 1: Vias do metabolismo energético reguladas pelo factor de transcrição HIF1. A sobre-expressão de
várias enzimas da via glicolítica e da enzima lactato desidrogenase (LDH) é promovida pelo factor 1 indutível por hipoxia (HIF1), levando ao aumento do consumo de glucose e à acumulação de lactato. A entrada do carbono derivado da glicólise no Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos (TCA) é realizada ao nível do complexo piruvato desidrogenase (PDH) sendo este regulado através de um ciclo reversível de fosforilação. HIF1 promove a expressão das cinases da piruvato desidrogenase (PDK1-4), resultando na fosforilação e consequente inibição do complexo PDH. Esquema adaptado de Kondoh (2008) 20.
Glucose Glucose 6P Fuctose 6P Glyceraldehyde-3P Fuctose 1,6 BP Dihydroxyacetone-P 1,3 Biphosphoglycerate 3 - Phosphoglycerate 2 - Phosphoglycerate Phosphoenopyruvate Pyruvate Cytoplasm Extracellular space hexokinase phosphoglucose isomerase phosphofructokinase GAPDH phosphoglycerate kinase phosphoglucomutase enolase Pyruvate kinase Pyruvate Acetyl-CoA TCA PDH PDH P PDF LDH Lactate PDK PDK2 PDK1 PDK3 PDK4 aldolase + + + + + + + + + HIF1
4 1.3. Impacto do efeito de Warburg em biotecnologia
A desregulação do metabolismo energético em células de mamífero em cultura, à semelhança das células cancerígenas, tem sido alvo de diversas hipóteses explicativas. A glicólise com formação de lactato tira partido de um nutriente abundante, a glucose, pelo que um elevado fluxo glicolítico pode gerar energia mais rapidamente do que a respiração mitocondrial. Como o fluxo glicolítico pode superar o da oxidação de piruvato pelo complexo PDH, é necessário um mecanismo para evitar a acumulação de piruvato, pelo que ocorre a sobre-expressão de lactato desidrogenase para a conversão do piruvato a lactato 24. Adicionalmente, células em contínua proliferação e com elevado consumo de nutrientes teriam, previsivelmente, uma maior respiração mitocondrial e consequente produção de espécies reactivas de oxigénio (ERO). Como tal, a diminuição da respiração mitocondrial, devido ao bloqueio do TCA ao nível do complexo PDH, pode estar associada a um aumento da protecção ao stress oxidativo. De facto, a acumulação de ERO e consequentes danos em macromoléculas a nível intracelular foi envolvida no processo de senescência celular 20. Como tal, as alterações metabólicas associadas ao efeito de Warburg poderão não só ter um papel ao nível de obtenção de energia, mas também de manutenção do estado proliferativo, por bypass da senescência [revisto em Vander Heiden et al. (2009) 29]. Esta adaptação metabólica das células de mamífero em cultura é, no entanto, desvantajosa do ponto de vista da sua aplicação biotecnológica na produção de biofármacos complexos. A acumulação de metabolitos tóxicos, como o lactato, tem um efeito negativo no crescimento e viabilidade celulares e na produtividade e qualidade do produto final. Adicionalmente, o bloqueio do TCA reduz a disponibilidade de poder redutor e de intermediários necessários às reacções de biossíntese e indispensáveis ao estabelecimento de sistemas de expressão de elevada produtividade e qualidade. Como tal, a manipulação do efeito de Warburg em células de mamífero em cultura adquire grande relevância no contexto biotecnológico.
A linha celular RPE A6 é uma linha celular humana recombinante usada como sistema de expressão estável de anticorpos monoclonais humanos. Para além dos referidos impactos da acumulação de lactato no crescimento e viabilidade celular, a alteração do pH poderá induzir a agregação proteica e um deficiente padrão de glicosilação 30, diminuindo a produtividade e qualidade do produto final e assim dificultando a sua aplicação terapêutica. A acumulação de quantidades significativas de lactato tem igualmente um impacto negativo sobre o crescimento de células MDCK E1, usadas na produção transiente de partículas adenovirais, e sobre a produtividade e qualidade dos vectores virais. A linha celular 293 FLEX GFP é uma linha celular humana utilizada para a produção estável de vectores
5 retrovirais recombinantes. Estes vectores apresentam-se como uma ferramenta de elevada eficiência quer na transferência de genes nos protocolos de terapia génica quer na apresentação de epitopos em vacinação 31. No entanto, a sua produção em larga escala tem sido dificultada pelas baixas produtividades de vírus infecciosos (na ordem das 106-107 partículas infecciosas por mL de cultura), perda acentuada da infecciosidade à temperatura de cultura (t1/2 ≈ 8h, 37º C) e elevado grau de contaminação das preparações virais com partículas
não infecciosas (apenas 1 em cada 100 partículas é infecciosa) 32,33. Como as aplicações em terapia génica humana, dependendo do protocolo clínico e da doença, requerem entre 107 e 1014 partículas infecciosas 34, com um elevado nível de purificação, é imprescindível o desenvolvimento de processos robustos aliados a células de elevada produtividade para a manufacturação destas partículas virais. Adicionalmente, 30 a 40% da partícula retroviral é constituída por lípidos (vírus com invólucro lipídico) 35. Como a síntese lipídica requer grandes quantidades de poder redutor, alterações a nível da sua disponibilidade intracelular terão previsivelmente impacto na estabilidade do vector e/ou produtividade das células produtoras.
1.4. Objectivos principais
O presente trabalho teve como objectivo a manipulação do fenótipo lactogénico associado ao efeito de Warburg, procurando simultaneamente reduzir a acumulação de lactato e aumentar a eficiência do metabolismo energético, com o consequente aumento da produtividade celular e qualidade do biofármaco. Para tal, recorreu-se à tecnologia de RNA de interferência, via transdução com vectores lentivirais, para o silenciamento de HIF1, PDK1 e
PDK3, os efectores do fenótipo lactogénico associado ao efeito de Warburg. Estudos de
silenciamento de PDK1 36 e PDK3 28 utilizando a tecnologia de RNA de interferência já demonstraram a viabilidade da reversão do fenótipo lactogénico associado ao efeito de Warburg sem que tal, aparentemente, afectasse o crescimento celular. No entanto, a manipulação efectuada neste trabalho – silenciamento sucessivo de HIF1, PDK1 e PDK3 – nunca foi estudada.
As linhas celulares 293 FLEX GFP, MDCK E1 e RPE A6 foram escolhidas pela sua importância a nível da produção de biofármacos complexos, tornando este projecto não só cientificamente atraente como tecnologicamente relevante.
6 2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Linhas celulares e meios de cultura
293 FLEX GFP é uma linha celular humana derivada de HEK293 (ATCC CRL-1573), produtora de vectores retrovirais recombinantes baseados no vírus da leucemia murina (Murine Leukemia Virus, MLV), pseudotipadas com o invólucro lipídico do vírus da leucemia do macaco gibão (Gibbon Ape Leukemia Virus, GaLV) e contendo um transgene codificante para a proteína fluorescente verde (Green Fluorescent Protein, GFP), estabelecidas como descrito em Coroadinha et al. (2006) 37. RPE A6 é uma linha celular humana, imortalizada pela telomerase, produtora de anticorpos monoclonais humanos por transfecção estável das células hTERT RPE-1 (ATCC CRL-4000). MDCK E1 é uma linha celular canina derivada de MDCK (ECCAC Nr 841211903), usada para produção de vectores adenovirais e estabelecida como descrito em Santiago et al. (em preparação) 38. Estas linhas celulares foram usadas para o estabelecimento de populações silenciadas, respectivos clones e controlos através de transdução por infecção com vectores lentivirais. A linha celular 293T (ATCC CRL-11268) foi usada para produção de vectores lentivirais e a linha celular Te671 (ATCC CCL-136) para titulação de partículas retrovirais infecciosas. Todas as linhas celulares foram mantidas em meio de cultura DMEM (Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado com 10% (v/v) de
Foetal Bovine Serum (FBS) (Gibco), a 37ºC e atmosfera húmida com 5% de CO2.
2.2. Produção de plasmídeos e vectores lentivirais
A construção short hairpin RNA (shRNA) para o silenciamento de HIF1, TRCN000000309, e o controlo non-target (ntshRNA) (Anexo 1) são baseados no plasmídeo pLKO.1-puro 39 e contêm um gene de resistência à puromicina, tendo sido adquiridos à „Sigma Mission®
RNAi‟ (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Foram produzidos vectores lentivirais para cada um dos shRNA em sistema transiente por co-transfecção com pSPAX2 e pMD2.G [gentilmente cedidos por Didier Trono do Swiss Federal Institute of Technology, através do repositório de plasmídeos da Addgene (Cambridge, MA, EUA)], que fornecem as funções de empacotamento e invólucro lipídico, respectivamente. Para o silenciamento de PDK1 e PDK3 e correspondente controlo ntshRNA foram adquiridos à „Sigma Mission® RNAi‟ vectores lentivirais custom-made semelhantes aos anteriores mas contendo um gene que codifica a proteína fluorescente vermelha (Red Fluorescent Protein, RFP). As sequências usadas não se
7 encontram validadas, tendo sido desenhadas simultaneamente para uma zona de homologia entre os genes PDK1 e PDK3 e entre os genomas humano e canino (Anexo 1).
2.3. Transdução celular, selecção e clonagem
Para o estabelecimento de populações shRNA (shHIF1 e ntshRNA), as células 293 FLEX GFP, MDCK E1 e RPE A6 foram inoculadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1x105 células/cm2; 24 horas depois o meio de cultura foi substituído por 600 µl de sobrenadante lentiviral preparado em meio de cultura contendo 8,0 μg/mL de polibreno (Sigma, Steinheim, Alemanha) e diluído de forma a atingir uma baixa multiplicidade de infecção (0,1). 48 horas após a infecção, as células foram colocadas sob pressão selectiva do antibiótico puromicina a 1,5 μg/mL (MDCK E1 e 293 FLEX GFP) ou 3,0 µg/mL (RPE A6) e mantidas em cultura durante 21 dias, substituindo-se o meio de cultura a cada 3 dias. As populações shHIF1 foram posteriormente clonadas em placas de 96 poços, inoculadas a uma densidade de 0,5 células/poço, tendo-se isolado cerca de 30 clones para cada uma delas. Para o silenciamento de PDK1 e PDK3, os clones shHIF1 escolhidos para continuar o estudo foram transduzidos como acima descrito usando uma multiplicidade de infecção superior `anteriormente usada (<1). As populações ntshRNA foram igualmente transduzidas com um segundo vector ntshRNA (Anexo 1). A selecção de células duplamente transduzidas foi efectuada por citometria de fluxo acoplada a sorteamento no sistema „MoFlo High-Speed Cell Sorter‟ (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca), tirando partido da fluorescência da RFP. As células sorteadas foram mantidas posteriormente em cultura sob pressão selectiva do antibiótico puromicina.
2.4. Estudos de crescimento e análise de metabolitos
Inocularam-se tissue-flasks de 25 cm2 a uma densidade de 1x104 células/cm2 (MDCK E1) e de 4x104 células/cm2 (293 FLEX GFP) em meio DMEM (Gibco) suplementado com 10% (v/v) FBS (Gibco). Para os estudos com células duplamente transduzidas usou-se adicionalmente um suplemento antioxidante a 0,1% (v/v) (Sigma). Durante 7 dias, ao longo da curva de crescimento, foram sendo retiradas amostras de sobrenadante que foram clarificadas por filtração a 0,45 µm e guardadas a -85ºC, até posterior análise. A concentração e viabilidade celulares foram determinadas pelo método de exclusão do azul de tripano (Gibco). As concentrações de glucose e lactato foram determinadas usando o sistema „YSI 7100 Multiparameter Bioanalytical System‟ (YSI Life Sciences, Yellow Springs, OH, EUA).
8 2.5. Extracção de RNA total e qRT-PCR
Para quantificar os níveis de expressão génica, o RNA total celular foi isolado usando o „RNeasy Mini Kit‟ (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa do RNA total foi efectuada segundo o protocolo de síntese de cDNA do „Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit‟ (Roche Applied Science, Manheim, Alemanha), usando 2 µg de RNA total e primers oligo dT. O qRT-PCR foi realizado em triplicados no termociclador „LightCycler® 480 Real-Time PCR System‟ (Roche Applied Science), segundo as instruções do kit „LightCycler® 480 SYBR Green I Master‟ (Roche Applied Science). O sinal de PCR foi definido segundo o Método da Segunda Derivada Máxima 40 e a expressão génica foi quantificada relativamente à expressão do gene
housekeeping RPL22, segundo o método 2-ΔCt 41. As sequências dos primers usados neste estudo (Anexo 2) foram desenhadas para locais de homologia entre células humanas e caninas recorrendo aos softwares BLAST 42 e Primer3 43.
2.6. Produção e titulação de vectores retrovirais
Para a titulação de partículas retrovirais infecciosas, células Te671 foram inoculadas a uma densidade de 5x104 células/cm2 em placas de 24 poços. Após 24 horas, o meio foi removido e as células foram infectadas, em duplicados, com 150 µl de sobrenadante viral (recolhido durante os estudos de crescimento) previamente sujeito a diluições em série em meio de cultura contendo 8,0 µg/mL de polibreno (Sigma). 48 horas após a infecção, a quantidade de células fluorescentes foi determinada por citometria de fluxo (CyFlow Space, Partec, Alemanha) e o título viral calculado de acordo com a Equação 1.
(Equação 1)
Para a titulação de partículas retrovirais totais seguiu-se o protocolo descrito em Carmo et al. (2004) 44, com as seguintes modificações: „Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit‟ (Roche Applied Science) para a síntese de cDNA e primer reverso para a GFP (Anexo 2). Para o qRT-PCR o mesmo sistema acima descrito foi usado, utilizando o par de
primers para a GFP. Diluições sucessivas do plasmídeo pGFP foram usadas para a construção
da curva-padrão.
2.7. Produção e titulação de vectores adenovirais
Para a produção e titulação de vectores adenovirais seguiram-se os protocolos descritos em Altaras et al. (2005) 45 e Kamen & Henry (2004) 46. Resumidamente, aquando
9 dos estudos de crescimento, células MDCK E1 com confluência de 80% foram transduzidas com um stock de Canine adenovírus type 2 (CAV-2), contendo o transgene da GFP, a uma multiplicidade de infecção de 5, em meio suplementado com 1% (v/v) de aminoácidos não essenciais (Sigma). Após 40 horas, foram recolhidas as fracções extra (recolha do sobrenadante) e intracelular [lise celular provocada por uma solução de Triton X-100 a 0,1% (v/v) em Tris-HCl 10 mM, pH 8] dos vectores adenovirais produzidos, procedendo-se à sua clarificação por centrifugação (10 minutos, 3000 g). Para a titulação de partículas infecciosas, foram inoculadas células MDCK E1 a uma densidade de 2x104 células/cm2 em placas de 24 poços e, 24 horas depois, o meio de cultura foi substituído por diluições sucessivas dos vírus recolhidos, em duplicados. A percentagem de células fluorescentes foi determinada 24 horas após a infecção. Para a titulação de partículas adenovirais totais, o DNA viral foi extraído usando o „Roche High Pure Viral DNA Kit‟ (Roche Applied Science). O qPCR foi realizado como descrito para a titulação de partículas retrovirais totais. A produtividade específica de partículas totais e infecciosas foi calculada tendo em conta o número de partículas produzidas e o número de células no período de produção.
2.8. Determinação da actividade da lactato desidrogenase
Para a determinação da actividade da enzima lactato desidrogenase, extractos celulares a uma densidade de 2x106 células/mL, recolhidas ao longo das curvas de crescimento, foram preparados previamente em tampão „M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent‟ (Pierce, Rockford, IL, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A actividade intracelular enzimática foi determinada através da monitorização espectrofotométrica a 340 nm da taxa de oxidação de NADH a NAD+ acoplada à redução de piruvato a lactato.
2.9. Western Blot
A expressão proteica foi detectada por Western Blotting após separação em gel de poliacrilamida NuPage a 4-12% (w/v) (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) com running buffer MOPS (conc. 1x, Invitrogen) das amostras desnaturadas a 72º C durante 10 minutos. Cada poço foi carregado com igual quantidade de proteína e as amostras correram durante 90 minutos a voltagem constante de 125 V, tendo sido posteriormente transferidas, durante 90 minutos, para membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Estas foram reveladas com os anticorpos listados no Anexo 3, detectadas com os respectivos anticorpos secundários conjugados com a peroxidase de rábano (HRP) (diluição 1:5000) e reveladas com „Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents‟ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA).
10 2.10. Quantificação de fosfatos de adenosina e nucleótidos de piridina
As razões ADP/ATP foram determinadas através do „EnzyLight™ ADP/ATP Ratio Assay Kit‟ (BioAssay Systems, Hayward, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. As razões NAD+/NADH e NADP+/NADPH foram determinadas recorrendo ao „EnzyChrom™ NAD/NADH Assay Kit‟ (BioAssay Systems) e „EnzyChrom™ NADP+/NADPH Assay Kit‟ (BioAssay Systems). Foram seguidas as instruções do fabricante.
2.11. Quantificação de espécies reactivas de oxigénio
Para determinar a carga intracelular de espécies reactivas de oxigénio (ERO) quantificou-se a velocidade de formação de um produto fluorescente resultante da oxidação da sonda H2DCFDA (Invitrogen). Para tal, placas de 96 poços foram inoculadas à densidade
celular acima descrita para os estudos de crescimento. 48 horas depois, adicionou-se uma solução de Saponina (Sigma) a uma concentração final de 0,04 mg/mL e incubou-se a 37ºC. Após 30 minutos adicionou-se a sonda a uma concentração final de 10 µM. A formação de fluorescência foi seguida durante 250 minutos a 485/528 nm (emissão/excitação). A velocidade de formação de fluorescência, uma medida directa da quantidade de ERO, foi calculada por regressão linear pelo método de ajuste dos mínimos quadrados da curva de fluorescência vs. tempo.
2.12. Coloração para detecção de actividade da β-galactosidade
Para averiguar a expressão da enzima β-galactosidade, inocularam-se placas de 6 poços com as densidades acima descritas para os estudos de crescimento. A meio da fase exponencial da curva de crescimento, as células foram fixadas e coradas como descrito em Sambrook & Russell (2001) 47.
2.13. Cálculos
Para determinar as taxas específicas de crescimento celular, produção/acumulação de metabolitos e de partículas virais foi considerada a equação de Boltzmann (Equação 2):
(Equação 2)
onde P representa os diferentes parâmetros, quer seja concentração de células viáveis, concentração de metabolitos, PI ou PT, C representa a concentração de células viáveis, t representa o tempo de cultura e µp é a taxa específica celular de cada parâmetro em estudo. O
11 3. RESULTADOS
3.1. Silenciamento de HIF1
No presente trabalho foi usado o sistema „Sigma Mission® RNAi‟ – construção humana – para o silenciamento de genes em linhas celulares humanas e caninas. A eficiência de silenciamento do sistema em células caninas foi previamente testada e confirmada com um gene repórter (turboGFP) (dados não apresentados).
Para a primeira fase de manipulação do efeito de Warburg, as linhas celulares 293 FLEX GFP, MDCK E1 e RPE A6 foram infectadas com vectores lentivirais transportando um
hairpin de silenciamento de HIF1, seleccionadas e clonadas por diluição limitante. Foram
isolados cerca de 30 clones por linha celular.
O silenciamento de HIF1 induziu diferentes respostas nas linhas celulares em estudo: nos clones MDCK E1 e 293 FLEX GFP não foram notadas alterações macroscópicas; contrariamente, a maioria dos clones RPE A6 apresentou alterações severas a nível morfológico (aumento das dimensões celulares e da razão citoplasma:núcleo) (Figura 2A-C) e do crescimento celular. Alguns destes clones perderam totalmente a capacidade proliferativa. Estas alterações sugeriram um cenário de senescência induzida pelo silenciamento de HIF1 48. Deste modo, procedeu-se à detecção de actividade da enzima β-galactosidade, descrita como um biomarcador de células em senescência 49 (Figura 2D-F). Na linha celular parental não se observou coloração indicativa da actividade da β-galactosidase, enquanto nos clones silenciados para HIF1 se obteve uma elevada coloração. Estes resultados sugeriram que, na linha celular RPE A6, o silenciamento de HIF1 poderá ter induzido a entrada das células num estado de senescência. Como tal, não se prosseguiu os estudos com esta linha celular.
Para a continuação dos estudos de caracterização do efeito do silenciamento de HIF1 foram escolhidos os clones FLEX shHIF1#21, FLEX shHIF1#25, MDCK shHIF1#15 e MDCK shHIF1#16 com base numa análise integrada da redução dos níveis de lactato desidrogenase, quantificação da expressão de HIF1 e screening preliminar do título viral (dados não apresentados). Para estes clones analisaram-se as curvas de crescimento e o metabolismo energético central (Figura 3 e Tabela 1), os níveis de lactato desidrogenase (Figura 4) e efeitos do silenciamento de HIF1 na expressão génica de PDHE1α, LDH (A e B) e PDK (1 e 3) (Figura 5).
12 Linha celular parental Clones silenciados
Figura 2: Impacto do silenciamento de HIF1 em células RPE A6. Alterações morfológicas observadas na
linha celular parental (A) e nos clones RPE shHIF1#18 (B) e RPE shHIF1#22 (C). Detecção de actividade de β-galactosidade, um biomarcador de senescência, em RPE A6 (D), RPE shHIF1#3 (E) e RPE shHIF1#24 (F). A barra da escala corresponde a 300 µm.
Os clones silenciados para HIF1 analisados apresentaram perfis bem como taxas específicas de crescimento idênticas às respectivas linhas celulares parentais. Em termos metabólicos, também não ocorreram alterações consideráveis nas taxas de consumo de glucose e de produção de lactato (Figura 3 e Tabela 1).
Figura 3: Curvas de crescimento celular. Células 293 FLEX GFP (A) e de MDCK E1 (B); a cada ponto da
curva de crescimento está associado um erro de 10% decorrente do método de contagem celular.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 0 24 48 72 96 120 144 168 D e n si d a d e c e lu la r (1 0 6c é lu la s/ mL ) Tempo de cultura (h)
293 FLEX GFP FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#25
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 0 24 48 72 96 120 144 168 D e n si d a d e c e lu la r (1 0 6c é lu la s/ mL ) Tempo de cultura (h) MDCK E1 MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#16 A B C D E F A B
13 Tabela 1: Taxas específicas de crescimento celular e metabolismo energético central
μcrescimento (h-1) γglucose (µmol/106células·h) γlactato (µmol/106células·h) 293 FLEX GFP 0,019 ± 0,002 0,12 ± 0,02 0,19 ± 0,03 1,6 ± 0,4 FLEX shHIF1#21 0,018 ± 0,002 0,13 ± 0,01 0,22 ± 0,02 1,7 ± 0,3 FLEX shHIF1#25 0,021 ± 0,001 0,11 ± 0,01 0,17 ± 0,03 1,5 ± 0,4 MDCK E1 0,026 ± 0,005 0,30 ± 0,08 0,55 ± 0,11 1,8 ± 0,9 MDCK shHIF1#15 0,028 ± 0,004 0,36 ± 0,05 0,65 ± 0,04 1,8 ± 0,4 MDCK shHIF1#16 0,026 ± 0,005 0,39 ± 0,06 0,73 ± 0,05 1,9 ± 0,4 Os erros na μcrescimento, γglucose e γlactato correspondem ao erro calculado por regressão linear segundo o método dos
mínimos quadrados; os erros no γlactato/γglucose correspondem à propagação de erro; (μcrescimento) taxa específica de
crescimento, (γglucose) taxa de consumo de glucose, (γlactato) taxa de produção de lactato.
De forma a averiguar se o silenciamento de HIF1 induziu alterações nos níveis de lactato desidrogenase quantificou-se a actividade intracelular da enzima (Figura 4). Nos clones FLEX não se observaram alterações relevantes. Por outro lado, nos clones MDCK observaram-se reduções de actividade entre os 30 e 40%.
Figura 4: Actividade intracelular da enzima lactato desidrogenase. Actividade enzimática nas células 293
FLEX GFP (A) e MDCK E1 (B), normalizada para as respectivas linhas celulares parentais; barras de erro correspondem ao erro calculado por regressão linear segundo o método dos mínimos quadrados.
Em termos de expressão génica (Figura 5), os clones FLEX shHIF1#21 e FLEX shHIF1#25 apresentaram uma diminuição da expressão de HIF1 de 62,8% e 50,0%, respectivamente. Para os restantes genes analisados não se observaram alterações significativas na sua expressão. Nos clones MDCK shHIF1#15 e MDCK shHIF1#16 observou-se uma diminuição da expressão de HIF1 (19,1% e 52,2%, respectivamente), de
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 293 FLEX GFP FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#25 A ct ivi d ad e n or m al iz ad a d a lac tat o d es id roge n as e 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 MDCK E1 MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#16 A ct ivi d ad e n or m al iz ad a d a lac tat o d es id roge n as e A B
14
LDHA (38,5% e 17,6%, respectivamente) e de PDK1 (64,0% e 54,4%, respectivamente). A
expressão génica de LDHA observada para as células 293 FLEX GFP e MDCK E1 está de acordo com a quantificação de actividade intracelular da enzima (Figura 4).
Figura 5: Expressão génica após silenciamento de HIF1. Células 293 FLEX GFP (A) e MDCK E1 (B); a
quantificação da expressão foi feita por qRT-PCR relativamente ao gene housekeeping RPL22 e normalizada para as respectivas linhas celulares parentais; as barras de erro correspondem ao desvio-padrão, n = 3; * p < 0,05, dado por um teste t bilateral para amostras não emparelhadas, entre 3 replicados; (HIF1) factor 1 indutível por hipoxia; (PDHE1α) subunidade α do componente E1 do complexo piruvato desidrogenase; (LDHA e LDHB) lactato desidrogenase A e B; (PDK1 e PDK3) cinase 1 e 3 da piruvato desidrogenase.
Um dos principais objectivos do presente estudo foi avaliar o impacto da manipulação do efeito de Warburg na produtividade celular. Neste sentido, quantificou-se a produção de partículas virais totais e infecciosas (Figura 6). O silenciamento de HIF1, ainda que moderado (máximo de 62,8%, de acordo com a Figura 5), resultou em alterações notáveis na produtividade das células 293 FLEX GFP, com especial destaque para o clone FLEX shHIF1#21, em que a taxa de produção de partículas totais aumentou 6,8x e a taxa de partículas infecciosas aumentou 21,2x, comparativamente à linha celular parental. Também nos clones MDCK silenciados para HIF1 se observou um aumento da produtividade viral, ainda que em menor extensão, particularmente o clone MDCK shHIF1#15 em que a produtividade específica de partículas totais aumentou 1,5x e a de partículas infecciosas aumentou 2,0x. A análise das razões PI:PT (Tabela 2) demonstrou ainda que, para ambas as linhas celulares, o silenciamento de HIF1 resultou numa produção viral de qualidade superior, isto é, com um maior número de partículas infecciosas por número de partículas totais.
** 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
HIF1 PDHE1α LDHA LDHB PDK1 PDK3
E xp re ss ão re lat iva n or m al iz ad a
293 FLEX GFP FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#25
** 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
HIF1 PDHE1α LDHA LDHB PDK1 PDK3
E xp re ss ão re lat iva n or m al iz ad a
293 FLEX GFP FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#25
15
Figura 6: Produtividade viral após o silenciamento de HIF1. Produtividade específica em células 293 FLEX
GFP (A) e células MDCK E1 (B); as barras de erro das produtividades específicas de partículas retrovirais totais e de partículas adenovirais (totais e infecciosas) correspondem ao desvio-padrão, n = 3 e n = 2, respectivamente; as barras de erro da produtividade específica de partículas retrovirais infecciosas correspondem ao erro calculado por regressão linear segundo o método dos mínimos quadrados; (βPT) produtividade específica de partículas
virais totais, (βPI) produtividade específica de partículas virais infecciosas.
Tabela 2: Qualidade das produções virais: razão PI:PT
293 FLEX GFP 1:145 ± 25 MDCK E1 1:217 ± 63
FLEX shHIF1#21 1:44 ± 8 MDCK shHIF1#15 1:159 ± 51
FLEX shHIF1#25 1:58 ± 11 MDCK shHIF1#16 1:166 ± 56
(PI:PT) razão partículas infecciosas:partículas totais; o erro corresponde à propagação de erro.
3.2. Silenciamento simultâneo de HIF1, PDK1 e PDK3
Após uma primeira fase de manipulação do efeito de Warburg por silenciamento de
HIF1, com a obtenção de clones com elevados níveis de produtividade viral, prosseguiu-se
para a segunda fase deste trabalho, envolvendo o silenciamento de PDK1 e PDK3. Os clones FLEX shHIF1#21 e MDCK shHIF1#15 foram então transduzidos com vectores lentivirais transportando hairpins de silenciamento para PDK1 e PDK3. Neste estudo foram introduzidos dois controlos – controlos non-target (ntshRNA) – em que o hairpin não tem qualquer alvo conhecido no genoma, activando no entanto a via do RNA de interferência. Estes controlos têm sido descritos como os melhores controlos negativos em estudos que recorram à tecnologia de RNA de interferência, permitindo a distinção entre os efeitos fisiológicos induzidos pela activação da via do RNA de interferência e os induzidos pelo silenciamento
0 20 40 60 80 100 120 0 1 2 3 4 5 6 293 FLEX GFP FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#25 βPI (10 -3 P I/ cé lu la ∙ h ) βPT (P T /c él u la ∙ h )
Partículas Totais Partículas Infecciosas
0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14 MDCK E1 MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#16 βPI (10 3P I/ cé lu la) βPT (10 5P T /c él u la)
Partículas Totais Partículas Infecciosas
16 génico 50,51. Células 293 FLEX GFP e MDCK E1 foram transduzidas com um hairpin
non-target (populações 1xntshRNA) e após selecção estas populações foram novamente
transduzidas com outro hairpin non-target (populações 2xntshRNA). As populações duplamente transduzidas foram seleccionadas por citometria de fluxo acoplada a sorteamento celular. Parte destas populações foram clonadas directamente por sorteamento e outra parte foi mantida como população. Por questões de limitação de tempo, o trabalho descrito nesta dissertação engloba apenas os resultados relativos às populações.
Avaliou-se o impacto da activação da via do RNA de interferência (populações ntshRNA), do silenciamento de HIF1 e do silenciamento duplo HIF1+PDK1/3 no crescimento celular não tendo sido observadas diferenças significativas (Tabela 3). Metabolicamente, as células FLEX shHIF1#21 e as duplamente silenciadas apresentaram reduções evidentes das taxas de consumo de glucose e de produção de lactato sem, no entanto, existir alteração nas razões lactato:glucose (Figura 7 e Tabela 4). Nas populações FLEX ntshRNA, em particular a população duplamente transduzida, foram observadas alterações na morfologia celular e visível aumento na concentração de lactato no meio de cultura, observações confirmadas pela obtenção de maiores taxas de produção de lactato. As células MDCK silenciadas, pelo contrário, apresentaram um ligeiro aumento nas taxas de consumo de glucose e de produção de lactato, ainda que sem alteração na razão lactato:glucose.
Tabela 3: Taxas de crescimento celular
μcrescimento (h-1) μcrescimento (h-1)
293 FLEX GFP 0,021 ± 0,002 MDCK E1 0,033 ± 0,003
FLEX 1xntshRNA 0,021 ± 0,002 MDCK 1xntshRNA 0,029 ± 0,002 FLEX 2xntshRNA 0,027 ± 0,0004 MDCK 2xntshRNA 0,037 ± 0,003 FLEX shHIF1#21 0,022 ± 0,001 MDCK shHIF1#15 0,031 ± 0,003 FLEX shHIF1#21
+shPDK1/3 0,024 ± 0,001
MDCK shHIF1#15
+shPDK1/3 0,037 ± 0,005
Os erros correspondem ao erro calculado por regressão linear segundo o método dos mínimos quadrados; (μcrescimento) taxa de crescimento celular.
17
Figura 7: Impacto nas taxas de consumo de glucose e de produção de lactato. Células 293 FLEX GFP (A) e
MDCK E1 (B); as barras de erro correspondem ao erro calculado por regressão linear segundo o método dos mínimos quadrados; (γmetabólica) taxa de consumo de glucose ou taxa de produção de lactato, conforme o caso.
Tabela 4: Metabolismo energético central: razões γlactato/γglucose
293 FLEX GFP 1,6 ± 0,3 MDCK E1 1,5 ± 0,3
FLEX 1xntshRNA 1,7 ± 0,3 MDCK 1xntshRNA 1,5 ± 0,5
FLEX 2xntshRNA 1,7 ± 0,3 MDCK 2xntshRNA 1,6 ± 0,2
FLEX shHIF1#21 1,6 ± 0,1 MDCK shHIF1#15 1,5 ± 0,3
FLEX shHIF1#21+shPDK1/3 1,5 ± 0,1 MDCK shHIF1#15+shPDK1/3 1,5 ± 0,2 Os erros correspondem à propagação de erro; (γglucose) taxa de consumo de glucose, (γlactato) taxa de produção de
lactato.
De forma a averiguar o impacto do silenciamento de PDK1 e PDK3 nos níveis de lactato desidrogenase, quantificou-se a actividade intracelular da enzima (Figura 8). Verificou-se uma redução de actividade total da enzima lactato desidrogenase nas células 293 FLEX GFP silenciadas. No entanto, nas células MDCK E1 não foram observadas diferenças na actividade enzimática.
Figura 8: Impacto na actividade intracelular da lactato desidrogenase. Actividade enzimática nas células
293 FLEX GFP (A) e MDCK E1 (B), normalizada para as respectivas linhas celulares parentais; barras de erro correspondem ao erro calculado por regressão linear segundo o método dos mínimos quadrados.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA FLEX 2xntshRNA FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#21 +shPDK1/3 γme ta b ó li c a (µ m ol /10 6cé lu las ∙ h )
Consumo de glucose Produção de lactato
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 MDCK E1 MDCK 1xntshRNA MDCK 2xntshRNA MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#15 +shPDK1/3 γme ta b ó li c a (µ m ol /10 6cé lu las ∙ h )
Consumo de glucose Produção de lactato
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA FLEX 2xntshRNA FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF#21 +shPDK1/3 A ct ivi d ad e n or m al iz ad a d a lac tat o d es id roge n as e
Tempo de cultura ≈64h Tempo de cultura ≈118h
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 MDCK E1 MDCK 1xntshRNA MDCK 2xntshRNA MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#15 +siPDIK1/3 A ct ivi d ad e n or m al iz ad a d a lac tat o d es id roge n as e
Tempo de cultura ≈68h Tempo de cultura ≈120h
A B
18 Nesta segunda fase, quantificaram-se igualmente os níveis de expressão génica de
HIF1, PDHE1α, LDH (A e B) e PDK (1 e 3) (Figura 9A-B). Contrariamente aos resultados
anteriormente obtidos (Figura 5), o clone FLEX shHIF1#21 revelou alterações para além das observadas no HIF1, nomeadamente a diminuição da expressão dos genes da LDHA (redução de 30,8%) e PDK1 (redução de 28,9%), relativamente à linha celular parental, em linha com o que acontecera anteriormente nos clones MDCK silenciados para HIF1. Na população duplamente silenciada observou-se uma diminuição significativa da expressão de PDK1 (redução de 63,0%) e de PDK3 (redução de 42,7%), relativamente à linha celular parental. No clone MDCK shHIF1#15 os resultados anteriormente obtidos foram validados; na população duplamente silenciada observou-se uma diminuição significativa de PDK1 (redução de 84,1%) e de PDK3 (redução de 21,8%), relativamente à linha celular parental. A expressão génica nos controlos ntshRNA foi idêntica à das respectivas linhas celulares parentais, excepção feita à quantificação de HIF1 na população MDCK 1xntshRNA que poderá dever-se a um erro de execução da técnica, já que tal resultado não é reprodutível na população MDCK 2xntshRNA.
Para além das alterações em termos de expressão génica, analisaram-se os efeitos na quantidade intracelular das respectivas proteínas (Figura 9C). Não foi possível detectar diferenças nos níveis proteicos de HIF1, possivelmente porque a técnica não tem sensibilidade suficiente para detectar pequenas variações de expressão num factor de transcrição que, per se, é transcrito em pequenas quantidades. Devido à elevada quantidade de proteína carregada que provoca a saturação do sinal e impossibilita a detecção de pequenas variações, também não se conseguiram observar alterações na quantidade proteica da subunidade α do componente E1 do complexo piruvato desidrogenase e na enzima lactato desidrogenase. No entanto, reduções evidentes de actividade intracelular da lactato desidrogenase já tinham sido observadas (Figuras 4 e 8). De salientar ainda as reduções evidentes na quantidade proteica de PDK1 e PDK3 nas células silenciadas, particularmente as duplamente silenciadas.
19
Figura 9: Expressão génica e proteica após silenciamento de HIF1 e PDK1 e PDK3. Quantificação da
expressão génica por qRT-PCR em células 293 FLEX GFP (A) e MDCK E1 (B); a quantificação da expressão foi realizada relativamente ao gene housekeeping RPL22 e normalizada para as respectivas linhas celulares parentais; as barras de erro correspondem ao desvio-padrão, n = 3; * p < 0,05, dado por um teste t bilateral para amostras não emparelhadas, entre 3 replicados. (C) Western Blot para detecção da expressão proteica; cada poço foi carregado com a mesma quantidade de proteína e os anticorpos utilizados encontram-se listados no Anexo 3; (HIF1) factor 1 indutível por hipoxia; (PDHE1α) subunidade α do componente E1 do complexo piruvato desidrogenase; (LDHA e LDHB) lactato desidrogenase A e B; (PDK1 e PDK3) cinase 1 e 3 da piruvato desidrogenase; (loading control) β-actina.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
HIF1 PDHE1α LDHA LDHB PDK1 PDK3
E xp re ss ão r el at iva n orm al iz ad a
293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA FLEX 2xntshRNA
FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#21+shPDK1/3
* * * * * * * * * 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
HIF1 PDHE1α LDHA LDHB PDK1 PDK3
E xp re ss ão r el at iva n orm al iz ad a MDCK E1 MDCK 1xntshRNA MDCK 2xntshRNA MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#15+shPDK1/3 * * * * * * * * * * * HIF1 PDK1 PDK3 PDHE1α fosforilado PDHE1α LDH Loading control A B C
20 Para avaliar o impacto desta manipulação adicional do efeito de Warburg na produtividade celular, quantificou-se a produção de partículas totais e partículas infecciosas (Figura 10). Nas células 293 FLEX GFP, as duas populações controlo ntshRNA apresentaram uma produção viral muito reduzida comparativamente à linha celular parental. No clone FLEX shHIF1#21, à semelhança dos resultados anteriormente obtidos (Figura 6), observou-se um notável aumento da produtividade. A população duplamente silenciada, apesar dos silenciamentos moderados de PDK1 e PDK3 (Figura 9), apresentou aumentos também eles notáveis na produção viral: 5,9x na taxa de produção de partículas totais e 18,5x na taxa de partículas infecciosas, relativamente à linha celular parental. Nas células MDCK E1, e ao contrário do observado para as 293 FLEX GFP, as duas populações controlo ntshRNA apresentaram aumentos na produção viral. No clone MDCK shHIF1#15 não se observou um aumento da produtividade de partículas totais como anteriormente (Figura 6), no entanto, a produtividade específica de partículas infecciosas foi 3,5x superior, relativamente à linha celular parental. A população duplamente silenciada, apesar de um ligeiro decréscimo na produção de partículas totais, apresentou um aumento da produção de partículas infecciosas de 2,2x, relativamente à linha celular parental.
A análise das razões PI:PT (Tabela 5) confirmou que o silenciamento de HIF1 resultou num aumento de qualidade da produção viral para ambas as linhas celulares. No entanto, apenas para as células 293 FLEX GFP o segundo silenciamento (shPDK1/3) resultou num melhoramento adicional notável relativamente ao obtido com o silenciamento de HIF1 (aumento de 2,8x na razão PI:PT).
Figura 10: Produtividade viral após o silenciamento de HIF1 e PDK1 e PDK3. Produtividade específica em
células 293 FLEX GFP (A) e células MDCK E1 (B); as barras de erro das produtividades específicas de partículas retrovirais totais e de partículas adenovirais (totais e infecciosas) correspondem ao desvio-padrão, n = 3 e n = 2, respectivamente; as barras de erro da produtividade específica de partículas retrovirais infecciosas correspondem ao erro calculado por regressão linear segundo o método dos mínimos quadrados; (βPT)
produtividade específica de partículas virais totais, (βPI) produtividade específica de partículas virais infecciosas. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA FLEX 2xntshRNA FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF#21 +shPDK1/3 βPI (10 -3 P I/ cé lu la ∙ h ) βPT (P T /c él u la ∙ h )
Partículas Totais Partículas Infecciosas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MDCK E1 MDCK 1xntshRNA MDCK 2xntshRNA MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#15 +shPDK1/3 βPI (10 3P I/ cé lu la) βPT (10 5P T /c él u la)
Partículas Totais Partículas Infecciosas
21 Tabela 5: Qualidade das produções virais: razão PI:PT
293 FLEX GFP 1 : 123 ± 15 MDCK E1 1 : 286 ± 22
FLEX 1xntshRNA 1 : 1248 ± 434 MDCK 1xntshRNA 1 : 126 ± 30 FLEX 2xntshRNA 1 : 282 ± 209 MDCK 2xntshRNA 1 : 118 ± 10
FLEX shHIF1#21 1 : 108 ± 33 MDCK shHIF1#15 1 : 88 ± 6
FLEX
shHIF1#21+shPDK1/3 1 : 39 ± 9
MDCK
shHIF1#15+shPDK1/3 1 : 107 ± 10 (PI:PT) razão partículas infecciosas:partículas totais; o erro corresponde à propagação de erro.
Observou-se que as populações controlo ntshRNA apresentavam uma intensidade de fluorescência reduzida, enquanto as células silenciadas apresentavam uma intensidade de fluorescência muito acentuada, comparativamente à linha celular parental (Anexo 4). Sendo a fluorescência conferida pela expressão do transgene viral, avaliou-se o impacto das manipulações efectuadas na expressão deste e das outras duas construções virais (gag-pol e
env GaLV) (Figura 11). As populações controlo ntshRNA apresentaram uma redução muito
acentuada na expressão dos genes gag-pol e do transgene, sem que a expressão de env GaLV fosse afectada de forma relevante. Contrariamente, o clone FLEX shHIF1#21 apresentou um aumento notável da expressão de gag-pol (17,4x) e de transgene (13,9x) e, em menor escala, do env GaLV (2,2x), comparativamente à linha celular parental. Estes aumentos foram igualmente observados na população duplamente silenciada e vão de encontro aos anteriormente obtidos para as produções virais (Figura 10). Semelhante análise para o componente E1 da linha celular MDCK E1 não foi realizada por limitação de tempo.
Figura 11: Expressão de genes virais em células 293 FLEX GFP. A quantificação da expressão foi realizada
por qRT-PCR relativamente ao gene housekeeping RPL22 e normalizada para a linha celular parental; as barras de erro correspondem ao desvio-padrão, n = 3 (gag-pol e transgene), n = 2 (env GaLV); * p < 0,05, dado por um teste t bilateral para amostras não emparelhadas, entre 3 ou 2 replicados.
* * * * * * * * * * * * 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
gag-pol transgene env GaLV
E xp re ss ão r el at iva n orm al iz ad a
293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA FLEX 2xntshRNA
22 O fenótipo de glicólise com formação de lactato foi sugerido por Kondoh et al. (2005)
52
como um mecanismo de protecção contra o stress oxidativo, devido à diminuição de fluxo através da cadeia respiratória. Para avaliar um possível cenário de stress oxidativo nas células silenciadas, quantificou-se as espécies reactivas de oxigénio intracelularmente (Figura 12). Interessantemente, quer o clone FLEX shHIF1#21 como a população duplamente silenciada apresentaram valores ligeiramente inferiores à linha celular parental e controlos ntshRNA. Nas células MDCK não foram observadas alterações.
Figura 12: Detecção de espécies reactivas de oxigénio (ERO). Taxa de detecção de ERO em células 293
FLEX GFP (A) e células MDCK E1 (B); as barras de erro correspondem ao desvio-padrão, n = 12; * p < 0,05, dado por um teste t bilateral para amostras não emparelhadas, entre 12 replicados.
De forma a determinar se os silenciamentos efectuados induziram um desbloqueio do TCA e consequente melhoria do estado energético – razão ADP/ATP – e do poder redutor disponível – razões NAD+/NADH e NADP+/NADPH – quantificaram-se os fosfatos de adenosina e os nucleótidos de piridina intracelularmente. Nas células 293 FLEX GFP não foram observadas diferenças nas razões ADP/ATP entre a linha celular parental, controlos ntshRNA e células silenciadas (Figura 13). Nas células MDCK E1 observou-se uma redução da razão ADP/ATP de 60,4% no clone silenciado para HIF1 e de 66,1% na população duplamente silenciada, relativamente à linha celular parental, indicativo de uma maior disponibilidade intracelular de ATP.
* * 0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA FLEX 2xntshRNA FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#21 +shPDK1/3 T axa d e d et ec ção d e E R O ( m in -1) 0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 MDCK E1 MDCK 1xntshRNA MDCK 2xntshRNA MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#15 +shPDK1/3 T axa d e d et ec ção d e E R O (m in -1) A B
23
Figura 13: Estado energético intracelular. Quantificação dos fosfatos de adenosina e respectivas razões
ADP/ATP em células 293 FLEX GFP (A) e células MDCK E1 (B); as barras de erro correspondem ao desvio-padrão, n = 3; * p < 0,05, dado por um teste t bilateral para amostras não emparelhadas, entre 3 replicados.
Na quantificação de nucleótidos de piridina (Figura 14) observou-se uma diminuição da razão NAD+/NADH de 38,7% e 14,9% no clone FLEX shHIF1#21 e na população duplamente silenciada, respectivamente, sugerindo um aumento do poder redutor disponível intracelularmente. Pelo contrário, nas células MDCK silenciadas observou-se um ligeiro aumento da razão NAD+/NADH.
A quantificação de NADP+ e NADPH em células 293 FLEX GFP e MDCK E1 resultou em valores inferiores ao limite de detecção do método, ainda que tenha sido usado quer o número de células recomendado pelas instruções de utilização do kit quer cerca de dez vezes mais. Por limitações de tempo, não foi possível repetir o ensaio de forma a incluir esses dados na presente dissertação.
Figura 14: Poder redutor disponível intracelularmente. Quantificação dos nucleótidos de piridina e
respectivas razões NAD+/NADH em células 293 FLEX GFP (A) e células MDCK E1 (B); as barras de erro correspondem ao desvio-padrão, n = 3; * p < 0,05, dado por um teste t bilateral para amostras não emparelhadas, entre 3 replicados. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA FLEX 2xntshRNA FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#21 +shPDK1/3 A D P /A T P 0 5 10 15 20 25 30 35 40 MDCK E1 MDCK 1xntshRNA MDCK 2XntshRNA MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#15 +shPDK1/3 A D P /A T P * * 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA FLEX 2xntshRNA FLEX shHIF1#21 FLEX shHIF1#21 +shPDK1/3 NAD +/N A D H * * 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 MDCK E1 MDCK 1xntshRNA MDCK 2xntshRNA MDCK shHIF1#15 MDCK shHIF1#15 +shPDK1/3 NAD +/N A D H * * A B A B
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