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Tumores Mesenquimatosos do Tubo Digestivo: Estudo de parâmetros clínico-patológicos e de prognóstico, com especial ênfase nos tumores estromais gastrointestinais

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Academic year: 2023

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António Manuel Ferreira de Gouveia

Tumores Mesenquimatosos do Tubo Digestivo

Estudo de parâmetros clínico-patológicos e de prognóstico, com especial ênfase nos Tumores Estromais Gastrointestinais

Dissertação de candidatura ao grau de Doutor apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Fevereiro de 2011

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Orientador: Prof. Doutor José Manuel Pedrosa Baptista Lopes Co-orientador: Prof. Doutor Silvestre Porfírio Ramos Carneiro

Artº 48, § 3º - A Faculdade não responde pelas doutrinas expandidas na dissertação (Regulamento da Faculdade de Medicina do Porto, 29 de Janeiro de 1931, Decreto nº 19337)

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5 JÚRI

Presidente: Reitor da Universidade do Porto

Vogais: Doutor Henrique Manuel Bicha Castelo, Professor Catedrático da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa;

Doutor José Manuel Pedrosa Baptista Lopes, Professor Associado da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, e orientador da tese;

Doutor António Taveira Gomes, Professor Associado Convidado da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto;

Doutor João António Pinto de Sousa, Professor Associado Convidado da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto;

Doutor Rui Manuel Vieira Reis, Professor Auxiliar da Escola de Ciências da Saúde da Universidade do Minho;

Doutora Ana Paula Soares Dias Ferreira, Professora Auxiliar da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto.

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CORPO CATEDRÁTICO DA FACULDADE DE MEDICINA DO PORTO

Professores Catedráticos Jubilados ou Aposentados Doutor Abel José Sampaio da Costa Tavares

Doutor Abel Vitorino Trigo Cabral

Doutor Alexandre Alberto Guerra de Sousa Pinto Doutor Amândio Gomes Sampaio Tavares Doutor António Augusto Lopes Vaz Doutor António Carvalho Almeida Coimbra Doutor António Fernandes da Fonseca

Doutor António Fernandes de Oliveira Barbosa Ribeiro Braga Doutor António Germano Pina da Silva Leal

Doutor António José Pacheco Palha

Doutor António Luís Tomé da Rocha Ribeiro Doutor António Manuel Sampaio de Araújo Teixeira Doutor Belmiro dos Santos Patrício

Doutor Cândido Alves Hipólito Reis

Doutor Carlos Rodrigo de Magalhães Ramalhão Doutor Cassiano Pena de Abreu e Lima

Doutor Daniel dos Santos Pinto Serrão

Doutor Eduardo Jorge da Cunha Rodrigues Pereira

Doutor Fernando de Carvalho Cerqueira Magro Gomes Ferreira Doutor Fernando Tavarela Veloso

Doutor Francisco Sousa Lé

Doutor Henrique José Ferreira Gonçalves Lecour de Menezes Doutor José Augusto Fleming Torrinha

Doutor José Carvalho de Oliveira

Doutor José Fernando de Barros Castro Correia Doutor José Luís Medina Vieira

Doutor José Manuel da Costa Mesquita Guimarães Doutor Levi Eugénio Ribeiro Guerra

Doutor Luís Alberto Martins Gomes de Almeida Doutor Manuel Augusto Cardoso de Oliveira Doutor Manuel Machado Rodrigues Gomes Doutor Manuel Maria Paula Barbosa

Doutora Maria da Conceição Fernandes Marques e Magalhães Doutora Maria Isabel Amorim de Azevedo

Doutor Mário José Cerqueira Gomes Braga Doutor Serafim Correia Pinto Guimarães

Doutor Valdemar Miguel Botelho Santos Cardoso Doutor Walter Friedrich Alfred Osswald

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8 Professores Catedráticos Efectivos

Doutor Alberto Coimbra Sobrinho Simões Doutor Manuel Mergulhão Castro Tavares Doutora Maria Amélia Duarte Ferreira Doutor José Agostinho Marques Lopes

Doutor Patrício Manuel Vieira Araújo Soares Silva Doutor Daniel Filipe Lima Moura

Doutor Alberto Manuel Barros da Silva Doutor José Manuel Lopes Teixeira Amarante Doutor José Henrique Dias Pinto Barros

Doutora Maria Fátima Machado Henriques Carneiro Doutora Isabel Maria Amorim Pereira Ramos

Doutora Deolinda Maria Valente Alves Lima Teixeira Doutora Maria Dulce Cordeiro Madeira

Doutor Altamiro Manuel Rodrigues Costa Pereira Doutor Rui Manuel Almeida Mota Cardoso Doutor António Carlos Freitas Ribeiro Saraiva Doutor Álvaro Jerónimo Leal Machado de Aguiar Doutor José Carlos Neves da Cunha Areias Doutor Manuel Jesus Falcão Pestana Vasconcelos

Doutor João Francisco Montenegro Andrade Lima Bernardes Doutora Maria Leonor Martins Soares David

Doutor Rui Manuel Lopes Nunes

Doutor José Eduardo Torres Eckenroth Guimarães Doutor Francisco Fernando Rocha Gonçalves Doutor José Manuel Pereira Dias de Castro Lopes Doutor Manuel António Caldeira Pais Clemente

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9 À Graça, ao João, à Luísa e à Carolina

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11 AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Doutor José Manuel Lopes, meu orientador e principal impulsionador deste projecto, pela amizade e pelo incentivo constantemente demonstrados. Pela transmissão do conhecimento científico, compreensão e, acima de tudo, pelo elevado grau de exigência, o meu sincero reconhecimento.

Ao Prof. Doutor Amadeu Pimenta, meu primeiro orientador e anterior Director de Serviço na Cirurgia Geral do Hospital de S. João, pela capacidade de transmitir, com generosidade e tolerância, as aptidões técnicas e humanas ímpares que sempre soube ostentar. Pelo crescimento pessoal e profissional, o meu profundo e eterno agradecimento.

À Dra. Olga Martinho, à Dra. Ana Gomes e ao Prof. Doutor Rui M. Reis, pela colaboração empenhada e pela valiosa participação na elaboração dos trabalhos.

Ao Prof. Doutor Valdemar Cardoso e ao Prof. Doutor M. Cardoso de Oliveira, meus anteriores Directores de Serviço na Cirurgia 4, Cirurgia B e Cirurgia Geral do Hospital de S. João, pelo apoio convicto do projecto e por sempre me terem incentivado na procura do conhecimento.

Ao Prof. Doutor Silvestre Carneiro, por ter aceitado incondicionalmente a co-orientação na fase final dos trabalhos, agradeço a disponibilidade e o encorajamento.

Ao Dr. Costa Maia, meu actual Director de Serviço na Cirurgia Geral do Hospital de S. João, pelo estímulo e por me ter facultado as condições necessárias à conclusão deste projecto.

À Prof. Doutora Fátima Carneiro, Directora do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de S.

João, e ao Prof. Doutor Sobrinho Simões, Director do Serviço de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina do Porto e do IPATIMUP, pelo acolhimento e pela forma como sempre facilitaram o acesso aos meios necessários ao desenrolar dos trabalhos.

À Dra. Paula Silva, pela amizade e pela inestimável e sempre abnegada colaboração.

À Dra. Ana F. Capelinha, ao Dr. Dionísio de la Cruz e a todos os co-autores, pela valiosa contribuição e partilha de ideias.

À Prof. Doutora Cristina Santos e ao Prof. Doutor Armando Teixeira-Pinto, pela ajuda preciosa na análise dos dados.

Ao Dr. Sousa Rodrigues, ao Dr. Aníbal Liberal, ao Dr. Aníbal Justiniano, ao Dr. Bernardo Bonifácio e ao Prof. Doutor Moutinho Ribeiro, pelo exemplo de competência e pela minha iniciação em Cirurgia.

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Aos elementos da Unidade Esófago-Gastro-Duodenal do Serviço de Cirurgia Geral, presentes e passados, pelo apoio, colaboração e amizade dispensados.

A todos os meus colegas, especialistas e internos, do Serviço de Cirurgia Geral no Hospital de S.

João, pelo interesse e cooperação nas diferentes actividades desenvolvidas.

Às secretárias dos Serviços de Cirurgia B, de Cirurgia Geral e de Anatomia Patológica do Hospital de S. João, pela dedicação e pelo auxílio sempre solícito.

À Novartis Oncology (Portugal), pelo financiamento de parte dos custos envolvidos na execução do projecto, e ao Sr. José Seara, por toda a atenção dispensada.

O trabalho só foi possível devido à necessária disponibilização de meios por parte de várias Instituições, das quais destaco: a Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, o Hospital de S.

João, E.P.E., o IPATIMUP e a Escola de Ciências da Saúde da Universidade do Minho. O meu voto de gratidão pela hospitalidade e pelas condições de trabalho que sempre souberam proporcionar.

Aos meus Pais, pelo modelo de trabalho e integridade que me souberam transmitir, e pelo apoio emocional e dedicação de toda uma vida.

Aos meus irmãos e aos meus familiares pelo incentivo e pelo apoio incondicional recebido ao longo dos anos.

Aos meus filhos, pela alegria que despertam e pela paciência revelada nos muitos momentos de ausência do pai.

À minha mulher, que em todos os momentos sinto ao meu lado, pelo estímulo, a compreensão e o carinho.

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Ao abrigo do Art. 8º do Decreto-Lei nº 388/70 fazem parte integrante desta dissertação os seguintes trabalhos publicados:

Gouveia AM, Pimenta AP, Capelinha AF, de la Cruz D, Silva P, Lopes JM. Surgical margin status and prognosis of gastrointestinal stromal tumor. World J. Surg. 2008 Nov, Vol 32 (11): 2375-82.

Gouveia AM, Pimenta AP, Lopes JM, Capelinha AF, Ferreira SS, Valbuena C, Oliveira MC.

Esophageal GIST: Therapeutic implications of an uncommon presentation of a rare tumor. Dis.

Esophagus 2005 Mar, Vol 18 (1): 70-73.

Gomes AL, Gouveia A, Capelinha AF, de la Cruz D, Silva P, Reis RM, Pimenta A, Lopes JM:

Molecular alterations of KIT and PDGFRA in GISTs: evaluation of a Portuguese series. J. Clin.

Pathol. 2008 Feb, Vol 61 (2): 203-8.

Martinho O, Gouveia A, Viana-Pereira M, Silva P, Pimenta A, Reis RM, Lopes JM. Low frequency of MAP kinase pathway alterations in KIT and PDGFRA wild-type GISTs. Histopathology 2009 Jul, Vol 55 (1): 53-62.

Martinho O, Gouveia A, Silva P, Pimenta A, Reis RM, Lopes JM. Loss of RKIP expression is associated with poor survival in GISTs. Virchows Arch. 2009 Sep, Vol 455 (3): 277-84.

Em cumprimento do disposto no referido Decreto-Lei declara que participou activamente na recolha e estudo do material incluindo em todos os trabalhos, tendo redigido os textos com a activa colaboração dos outros autores.

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15 ÍNDICE

Resumo 17

Abstract 21

Abreviaturas 25

INTRODUÇÃO 29

1 - Epidemiologia 32

2 - Características patológicas 33

Macroscopia 33

Microscopia 33

3 - Alterações genéticas KIT e PDGFRA e vias de sinalização

intracelular 33

4 - Alterações cromossómicas e do ciclo celular 37

5 - Marcadores imuno-histoquímicos no diagnóstico 38

6 - Diagnóstico diferencial 39

7 - Características clínicas 40

Apresentação clínica 40

GIST e neurofibromatose tipo I 41

GISTs pediátricos 41

GISTs associados com a tríade de Carney e com a díade de Carney

(síndrome de Carney-Stratakis) 42

GISTs familiares 42

Procedimentos de diagnóstico e estadiamento 43

8 - Avaliação do risco biológico e estadiamento dos GISTs 44 Factores de prognóstico e avaliação do risco biológico 44

Estadiamento clínico dos GISTs 47

9 - O papel da análise molecular no prognóstico e no tratamento

não-cirúrgico dos GISTs 48

10 - Tratamento 50

a) Doença primária localizada 50

Tumor residual microscópico (R1) 52

Cirurgia Laparoscópica 52

GIST primário localmente avançado 54

Tratamento adjuvante 55

Follow-up dos doentes 56

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b) Doença recidivada e metastática 56

Eficácia e tolerabilidade do imatinib como terapêutica de 1ª linha 57 Resistência e progressão da doença nos doentes submetidos a tratamento de

1ª linha com imatinib 60

Avaliação da resposta ao tratamento 62

Tratamento cirúrgico pós-imatinib em doentes com GIST avançado metastático 63 c) Eficácia da terapêutica de segunda linha dirigida a alvos

moleculares nos GISTs 64

Eficácia e tolerabilidade do sunitinib 65

A resposta ao sunitinib e o genótipo dos GISTs 67

Progressão da doença após tratamento com sunitinib 67

d) Opções terapêuticas após falência do tratamento dirigido a

alvos moleculares 68

OBJECTIVOS 71

Objectivo geral 73

Objectivos específicos 73

MATERIAL E MÉTODOS 75

1 - Parâmetros clínicos e cirúrgicos 77

2 - Parâmetros anátomo-patológicos e imuno-histoquímicos 77

3 - Extracção de ADN 78

4 - Análise de mutações nos genes KIT e PDGFRA 78

5 - Análise de mutações na região 3’ do exão 11 do KIT e nos genes

H-RAS,K-RAS,N-RAS e BRAF 79

6 - Análise da metilação no promotor do gene RKIP 79

7 - Follow-up e análise estatística 80

RESULTADOS 81

Trabalho I 83

Trabalho II 93

Trabalho III 99

Trabalho IV 109

Trabalho V 121

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES 131

Perspectivas futuras 151

Referências 153

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17 RESUMO

Introdução: Os tumores estromais gastrointestinais (GISTs) são os tumores mesenquimatosos mais frequentes no tracto gastrointestinal (GI), constituindo ~1-3% das neoplasias malignas nesta localização. A maioria dos GISTs é esporádica, mas há formas hereditárias, incluindo algumas famílias com mutações germinativas nos genes KIT e PDGFRA. O diagnóstico deve ser confirmado pelo estudo imuno-histoquímico dos tumores, integrado no contexto clínico e morfológico. Os GISTs expressam geralmente CD117 (95%) e CD34 (70%). O comportamento biológico é incerto e a classificação (incluindo > dimensão, índice mitótico e localização GI) em categorias de risco é útil para prever o comportamento clínico dos GISTs. Caracterizam-se por mutações activantes nos genes dos receptores tirosina-cinásicos KIT (até cerca de 85% dos casos) ou PDGFRA (5-8%) nas células tumorais, sendo que 10-15% não apresentam mutações destes proto-oncogenes (GISTs wild-type). A ressecção cirúrgica completa, sem linfadenectomia, é considerada o tratamento padrão dos GISTs primários localizados (sem evidência de disseminação peritoneal ou metastização à distância). A inibição KIT/PDGFRA com terapêuticas inibidoras tirosina-cinásicas (imatinib e sunitinib) permite o controlo de GISTs inoperáveis e/ou metastáticos.

A resposta clínica objectiva ao imatinib e sunitinib parece depender da presença e do tipo de mutações nos genes KIT e PDGFRA.

Objectivos: Estudar parâmetros clínico-patológicos, imuno-histoquímicos e moleculares numa série de doentes consecutivos (1989-2006) com GIST, diagnosticados no Hospital de São João: (I) analisar o valor prognóstico da qualidade das margens cirúrgicas no tratamento dos doentes com GIST primário; (II) avaliar os procedimentos de diagnóstico de GIST no esófago (localização rara) e rever as opções terapêuticas mais adequadas nesta localização; (III) avaliar o estado mutacional dos genes KIT e PDGFRA e a sua correlação com as características clinico-patológicas, e com o prognóstico dos doentes; (IV) identificar alterações moleculares alternativas em GISTs wild-type, potencialmente úteis para o diagnóstico e preditivas de resposta a terapêuticas dirigidas a novos alvos moleculares; e (V) avaliar a expressão de RKIP, a sua associação com parâmetros clínico- patológicos, e esclarecer o papel deste marcador em doentes com GISTs primários.

Material e métodos: Foram reavaliados os registos clínicos e anátomo-patológicos de todos os casos de GIST identificados (n=114). Foi avaliado todo o material anátomo-patológico disponível em cortes corados por HE e o diagnóstico de GIST estabelecido de acordo com a classificação OMS. Realizaram-se estudos imuno-histoquímicos em cortes representativos de cada tumor com o método do complexo estreptavidina-biotina-peroxídase. Foram utilizados nos diversos trabalhos os seguintes anticorpos: CD117, actina, desmina, proteína S100, CD34, fosfo-KIT, SCF, fosfo-ERK e RKIP. As amostras para extracção de ADN foram obtidas por dissecção de áreas seleccionadas. O estudo molecular incluiu as seguintes técnicas, consoante os trabalhos: amplificação por PCR ou PCR-SSCP, seguida de sequenciação directa, e análise mutacional dos genes KIT, PDGFRA, H- RAS, K-RAS, N-RAS, BRAF e RKIP. A análise da sobrevida global (SG), da sobrevida específica (SE) e da sobrevida livre de recidiva (SLR) dos casos submetidos a cirurgia de ressecção (n=104) foi realizada pelo método de Kaplan-Meier e com o teste Log rank. A associação entre variáveis clínico- patológicas, moleculares e a recidiva do tumor foi analisada com o teste Qui-quadrado ou com o teste exacto de Fisher. Na análise univariada foi utilizado o modelo de regressão de Cox

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separadamente para cada variável. A análise multivariada foi efectuada com o modelo de riscos proporcionais de Cox.

Resultados: (I) Obteve-se ressecção completa macroscópica (R0 ou R1) em 92,3% dos GISTs e margens microscópicas negativas (R0) em 75% dos casos. A ressecção cirúrgica dos GISTs primários associou-se a SE e SLR aos 5 anos de 87,7% e 89,8%, respectivamente. A taxa de recidiva foi significativamente (p=0,045) menor nos casos R0. Na análise multivariada, apenas a presença de tumor residual macroscópico (R2) se associou significativamente (p=0,013) a SE mais curta dos doentes. (II) Diagnosticou-se um GIST esofágico de alto risco de agressividade, com expressão CD117 e mutação no exão 11 do KIT (557del558). O caso (achado radiológico incidental, sem biópsia prévia) foi submetido a esofagectomia transtorácica de tipo Ivor Lewis, que permitiu obter margens R0. (III) 92% dos GISTs expressaram CD117, sem associação significativa entre essa expressão e a presença de mutações do KIT. Nos 78 doentes com estudo molecular, observou-se 56,4% com mutações do KIT, 91% das quais no exão 11 e 9% no exão 9. A presença de mutações do KIT associou-se a pior prognóstico e a sobrevida mais curta dos doentes (p=0,0460). Na análise do PDGFRA identificou-se mutações em 6% dos casos (15% dos GISTs KIT wild-type), 80% (4/5) das quais em tumores gástricos. Todos os GISTs com mutações do PDGFRA tinham expressão de CD117. De todas as mutações resistentes ao imatinib, identificou-se a mutação D842V em 2 GISTs desta série. (IV) Na reavaliação dos casos wild-type (n=29) identificaram-se 3 casos com duplicação no exão 11, permitindo ajustar para 33% a percentagem efectiva de GISTs wild-type na nossa série.

Nos GISTs wild-type (n=26), identificou-se co-expressão do ligando (SCF) e do receptor KIT (CD117) em ~65% dos casos e expressão de fosfo-KIT em ~30% dos casos com expressão de KIT e SCF. Não se identificaram mutações do H-RAS, K-RAS ou N-RAS (via de sinalização MAPK) nestes GISTs wild-type; identificou-se mutação activante V600E do gene BRAF num caso (4%) de GIST wild-type. Não se identificou qualquer mutação do BRAF nos GISTs com mutações do KIT ou do PDGFRA. A expressão de fosfo-ERK foi identificada em 30% dos casos wild-type e em 50% dos tumores sem expressão de fosfo-KIT. (V) A ausência de expressão citoplasmática de RKIP [8,5% (6/70) dos casos] associou-se significativamente com a presença de necrose (p=0,038) e com SE mais curta (p=0,023) dos doentes. Observou-se uma tendência (não significativa) entre a presença de expressão RKIP e a ausência de metastização. Não se identificou metilação do promotor do RKIP nos 6 GISTs sem expressão de RKIP.

Conclusões: (I) Na nossa série de 104 GISTs submetidos a cirurgia de ressecção, obteve-se ressecção macroscópica completa (R0 ou R1) do tumor em 92,3% dos casos. A SE e a SLR observadas enquadram-se com os resultados de outros estudos publicados. A taxa de recidiva foi significativamente menor nos casos R0, mas na análise multivariada apenas a ressecção R2 se associou significativamente a sobrevida mais curta dos doentes. De acordo com as recomendações de consenso actuais, os nossos resultados sublinham o valor prognóstico da ressecção macroscópica completa dos tumores, com o objectivo de se obterem margens microscópicas negativas e evitar a ruptura do tumor. (II) A opção terapêutica mais adequada para os GISTs do esófago depende da confirmação diagnóstica prévia, da localização no esófago, da dimensão/extensão loco-regional do tumor e do risco cirúrgico do doente. A esofagectomia, seguindo os princípios oncológicos, e sem prejuízo da opção neoadjuvante, é o procedimento cirúrgico indicado na maioria dos casos, para uma ressecção R0. (III) Descrevemos pela primeira vez a frequência de mutações do KIT e do PDGFRA numa série de doentes portugueses com

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GIST. A frequência global de mutações do KIT e do PDGFRA (63%) é concordante com os resultados de outros estudos, especialmente em populações ibéricas. Foram identificadas mutações do KIT em 56% dos casos e mutações do PDGFRA em 6% dos tumores. A presença de mutações do KIT parece associar-se com sobrevida mais curta dos doentes. A grande maioria (91%) das mutações activantes do KIT localiza-se no exão 11, indicando a possibilidade de resposta favorável à terapêutica destes doentes com imatinib. (IV) Este estudo constitui uma análise compreensiva da desregulação da via MAPK em GISTs wild-type (KIT e PDGFRA). Na ausência de mutações RAS sugere-se que a via da MAPK pode ser activada através de mecanismos autócrinos/parácrinos de SCF/KIT e/ou por mutação do BRAF num subgrupo de GISTs wild-type. As mutações activantes V600E nos GISTs wild-type levantam a possibilidade de terapêutica com inibidores da cínase RAF neste subgrupo de tumores. (V) Descreve-se pela primeira vez a associação significativa entre os níveis de expressão tumoral de RKIP e parâmetros clínico-patológicos em doentes com GIST.

Verificou-se que a perda de expressão de RKIP num subgrupo de GISTs parece ser independente da metilação do promotor, e associa-se significativamente a necrose tumoral e a sobrevida mais curta dos doentes. A participação de RKIP na progressão tumoral e no desenvolvimento de metástases sugere que este marcador pode ter potencial prognóstico, e pode permitir novas abordagens terapêuticas específicas, baseadas na modulação da expressão de RKIP em doentes com GIST.

Palavras-chave: GIST, tumor estromal gastrointestinal, GIST do esófago, margens cirúrgicas, sobrevida, imuno-histoquímica, análise mutacional, KIT, PDGFRA, wild-type, MAPK, BRAF, RKIP.

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21 ABSTRACT

Introduction: Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are the most common gastrointestinal tract (GI) mesenchymal tumors, accounting for ~1-3% of all malignant neoplasms in this location. Most GISTs are sporadic, but there are hereditary forms, including some families with germline KIT and PDGFRA gene mutations. GIST diagnosis must be confirmed by immunohistochemistry of tumors, and integrated with other clinical and morphological features. GISTs usually express CD117 (95%) and CD34 (70%). Biological behavior is uncertain and classification (including largest size, mitotic rate and GI site) in risk categories is useful for predicting clinical behavior of GISTs.

These tumors are characterized by oncogene mutations in KIT (up to ~85%) or PDGFRA (5-8%) receptor tyrosine kinases (RTKs) genes; 10-15% does not harbor any of the aforementioned gene mutations: so called wild-type GISTs. Complete surgical resection, without lymph node dissection, is considered standard treatment for primary localized GISTs (without peritoneal dissemination or metastatic disease). KIT/PDGFRA inhibition with tyrosine kinase inhibitors (imatinib and sunitinib) may control inoperable and/or metastatic disease. The objective clinical response to imatinib and sunitinib seems to be dependent on the presence and type of KIT and PDGFRA mutation.

Objectives: Study of clinicopathological, molecular and immunohistochemistry parameters in a series of consecutive (1989-2006) GIST patients, diagnosed at Hospital de S. João: (I) to analyze the prognostic value of surgical margins status in the treatment of primary GISTs; (II) to evaluate diagnostic procedures in esophageal GIST and review major therapeutic options for GISTs occurring in this rare GI site; (III) to assess the mutational status of KIT and PDGFRA genes and its correlation with clinicopathological parameters, and patient’s prognosis; (IV) to identify alternative molecular alterations in wild-type GISTs, which may be useful for diagnosis and as predictive markers of response with novel molecular targeted therapy; and (V) to evaluate RKIP expression, its association with clinicopathological parameters, and clarify the role of this marker in patients with primary GIST.

Material and methods: The clinical and pathological files of all identified GIST cases (n=114) were reevaluated. All available pathological material was evaluated with H&E stained sections and the diagnosis of GIST was established according to the WHO classification.

Immunohistochemistry analysis was performed in representative sections of each tumor using the streptavidin-biotin-peroxidase complex method. The following antibodies were used in the study:

CD117, actin, desmin, S100 protein, CD34, phospho-KIT, SCF, phospho-ERK and RKIP.

Samples for DNA extraction were obtained by dissection of selected areas. The study included also the following molecular techniques: PCR amplification or PCR-SSCP, followed by direct sequencing, and mutational analysis of KIT, PDGFRA, H-RAS, K-RAS, N-RAS, BRAF and RKIP genes. Overall survival (OS), disease-specific survival (DSS) and recurrence-free survival (RFS) analysis in resection cases (n=104) were analyzed with the Kaplan-Meier method and Log rank test.

Association between clinicopathological, molecular parameters and tumor recurrence was analyzed with Qui-square test or the Fisher exact test. The Cox regression model was used in the univariate analysis of each variable. Multivariate analysis was performed with the Cox proportional hazards model.

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Results: (I) We obtained complete macroscopic resection (R0 or R1) in 92.3% of GISTs and microscopic negative margins (R0) in 75% of cases. 5-year DSS and RFS was 87.7% and 89.8%, respectively, after surgical resection of patient’s primary GIST. The recurrence rate was significantly (p=0.045) lower in R0 cases. In the multivariate analysis, only the presence of macroscopic residual tumor (R2) was significantly associated (p=0.013) with shorter DSS. (II) An esophageal high-risk GIST was diagnosed, expressing CD117 and harboring a KIT mutation in exon 11 (557del558).

This case (a radiological incidental finding, without previous biopsy) underwent an Ivor Lewis transthoracic esophagectomy, and R0 margins were obtained. (III) 92% of GISTs expressed CD117, without significant association with KIT mutation status. Molecular analysis of 78 cases disclosed 56.4% KIT mutations, 91% of which in exon 11 and 9% in exon 9. KIT mutated cases associated with worst prognosis and shorter survival (p = 0.0460) of patients. PDGFRA analysis disclosed mutations in 6% of the cases (15% of KIT wild-type GISTs), 80% (4/5) of which were gastric. All GISTs with PDGFRA mutation displayed CD117 expression. Of all imatinib resistant mutations, only D842V mutation was identified in 2 GISTs of the series. (IV) The reevaluation of wild-type cases (n = 29) disclosed 3 cases with duplication in exon 11, allowing the adjustment to 33% of wild-type GISTs in our series. In wild-type GISTs (n = 26), co-expression of ligand (SCF) and KIT receptor (CD117) was observed in ~65% of the cases, and the expression of phospho- KIT in ~30% of the cases expressing KIT and SCF. No mutations of H-RAS, K-RAS or N-RAS (MAPK signaling pathway) were identified in our wild-type GISTs; BRAF V600E mutation was identified in a wild-type GIST case (4%). No BRAF mutation was observed in any KIT or PDGFRA mutated GIST. Phospho-ERK expression was observed in 30% wild-type cases and in 50% of GISTs without phospho-KIT expression. (V) The absence of RKIP cytoplasmic expression [8.5% (6/70) of the cases] was significantly associated with the presence of necrosis (p = 0.038) and shorter DSS (p=0.023) of patients. A trend (not significant) was observed between RKIP expression and lack of metastases. RKIP promoter methylation was not identified in any of the 6 GISTs lacking RKIP expression.

Conclusions: (I) In our series of 104 GISTs submitted to resection, complete macroscopic tumor resection (R0 or R1) was obtained in 92.3% of cases. The DSS and RFS values in our patients fit with results published in other studies. The recurrence rate was significantly lower in R0 cases, but in multivariate analysis only R2 resection was significantly associated with shorter survival of patients. According to the actual consensus recommendations, our results underline the prognostic importance of complete macroscopic surgical tumor resection, with the aim of achieving negative microscopic margins, and avoiding tumor rupture. (II) Most appropriate therapeutic option for esophageal GISTs depends on prior diagnostic confirmation, location in the esophagus, tumor size/loco-regional extension, and patient's performance status. An esophagectomy following oncologic principles, considering neoadjuvant option, is the recommended surgical procedure to achieve R0 resection in most cases. (III) We described for the first time KIT and PDGFRA mutation frequency in a series of Portuguese GIST patients. The overall frequency of KIT and PDGFRA mutations (63%) is consistent with results from other studies, namely in Iberian patients.

KIT mutations were identified in 56% and PDGFRA mutations in 6% of our GISTs. The presence of KIT mutation seems to associate with shorter survival of patients. The large majority (91%) of KIT mutations were in exon 11, indicating a favorable response to imatinib therapy. (IV) Our study represents a comprehensive analysis of MAPK pathway deregulation in (KIT and PDGFRA) wild-

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type GISTs. The observed absence of RAS mutations suggests that MAPK pathway may be activated by SCF/KIT autocrine/paracrine mechanisms and/or by BRAF mutation in a subset of wild-type GISTs. V600E mutation in wild-type GISTs raises the possibility of RAF kinase inhibitor therapy in this sub-group of patients. (V) We described for the first time a significant association between RKIP tumor expression level and clinicopathological parameters in GIST patients. Loss of RKIP expression in a subgroup of GISTs seems to be independent of promoter methylation, and associates significantly with tumor necrosis and shorter survival of patients. RKIP role in tumor progression and metastases development suggests that this marker may hold a potential prognostic value, and may allow new targeted therapy based on the modulation of RKIP expression in GIST patients.

Key-words: GIST, gastrointestinal stromal tumor, esophageal GIST, surgical margins, survival, immunohistochemistry, mutational analysis, KIT, PDGFRA, wild-type, MAPK, BRAF, RKIP.

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LISTA DE ABREVIATURAS

ABL Proto-oncogene Abelson

ACOSOG American College of Surgeons Oncology Group ADN Ácido desoxirribonucleico

AFIP Armed Forces Institute of Pathology AGITG Australasian Gastro-Intestinal Trials Group AIO German Working Group on Medical Oncology

ALK Anaplastic lymphoma kinase

ARG Arginase

ATP Adenosina trifosfato

BCR-ABL Fusion protein, product of Breakpoint cluster region - Abelson oncogene B-Raf; BRAF Serine/threonine-protein kinase B-raf; proto-oncogene que codifica B-Raf c-FMS Proto-oncogene que codifica CSF-1R

CGA Campo de grande ampliação CIC Célula intersticial de Cajal CpG Cytosine-phosphate-guanine

CSF-1R Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor (product of FMS proto-oncogene)

DAB Diaminobenzidina

DE Doença estável

dNTP Desoxirribonucleotídeo-trifosfato DOG 1 Discovered on GIST-1; TMEM16A

EC Extracelular

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

EMA European Medicines Agency

EORTC European Organization for Research and Treatment of Cancer ERK Extracellular signal-regulated kinase

ESMO European Society for Medical Oncology EUA Estados Unidos da América

FDA Federal Drug Administration

FGFR3 Fibroblast growth factor receptor 3 FLT3 FMS-like tyrosine kinase 3 receptor GFAP Glial fibrillary acid protein

GI Gastrointestinal

GIST Gastrointestinal stromal tumor

HE; H&E Hematoxilina-eosina; hematoxylin-eosin

HR Hazard ratio

HSP-90 Heat shock protein 90

ISG Italian Sarcoma Group

ITC Inibidor tirosina-cinásico

JM Justamembranar

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KIT; KIT Receptor tirosina-cinásico KIT; proto-oncogene KIT LMC Leucemia mielóide crónica

MAPK MAP kinase; mitogen-activated protein kinase MDE Mutation detection enhancement

MEK MAPK/ERK kinase

MSKCC Memorial Sloan-Kettering Cancer Center MSP Methylation-specific PCR

mTOR Mammalian target of rapamycin NCCN National Comprehensive Cancer Network NF1 Neurofibromatose tipo 1

NFkB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NIH National Institutes of Health

NS Não significativo

OMS Organização Mundial de Saúde p16INK4A Cyclin-dependent kinase (cdk) 4A inhibitor p27KIP1 Cyclin / cdk complexes inhibitor

pb pares de bases

PCR Polymerase chain reaction (reacção de polimerização em cadeia) PDGFA Platelet-derived growth factor A

PDGFRA e -B Platelet-derived growth factor receptor-α and -β PDGFRA e -B Proto-oncogenes PDGFRA e –B

PERSIST Post-resection Evaluation of Recurrence-free Survival for GastroIntestinal Stromal Tumors PET Tomografia por emissão de positrões

PET-FDG Tomografia por emissão de positrões com 18-fluordesoxiglicose PFI Pólipo fibróide inflamatório

PI3K-Akt Phosphatidylinositol 3 kinase - protein kinase B R0 /R1 /R2 Ressecção R0 /R1 /R2

RAF; RAF Serine/threonine-protein kinase; proto-oncogene RAF RAS Proto-oncogene RAt Sarcoma

RC Resposta completa

RECIST Response Evaluation Criteria in Solid Tumors

RET Glial cell-line derived neurotrophic factor receptor (rearranged during transfection) RKIP; RKIP Raf kinase inhibitory protein; proto-oncogene RKIP

RMN Ressonância magnética nuclear

RP Resposta parcial

RTK Receptor tirosina-cinásico

SCF Stem cell factor (factor de crescimento de células estaminais) SDH; SDH Succinato-desidrogenase; proto-oncogene que codifica SDH SE Sobrevida específica

SEER Surveillance, Epidemiology, and End Results

SG Sobrevida global

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27 SLP Sobrevida livre de progressão SLR Sobrevida livre de recidiva

SMA α-smooth muscle actin

SRC Non-receptor tyrosine kinase SRC family SSCP Single strand conformational polymorphism

SSG Scandinavian Sarcoma Group

STAT Signal transducer and activation of transcription STBSG Soft Tissue and Bone Sarcoma Group SWOG Southwest Oncology Group

TC Tomografia computadorizada TK 1 e 2 Domínios tirosina-cinásicos 1 e 2 TGM Tumor-grade-metastasis (staging system)

TMBNP Tumor maligno da bainha dos nervos periféricos TNM Classificação TNM de Tumores Malignos TPT Tempo para progressão do tumor TSH Hormona tireo-estimulante UICC Union for International Cancer Control VEGF Vascular endothelial growth factor VEGFR Vascular endothelial growth factor receptor

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29 INTRODUÇÃO

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31 INTRODUÇÃO

Os tumores estromais gastrointestinais (GISTs) são os tumores mesenquimatosos mais comuns do tracto gastrointestinal (GI), correspondendo a cerca de 1-3% das neoplasias malignas nesta localização. Ocorrem preferencialmente no tubo digestivo, embora também possam ser diagnosticados noutras localizações, como o epíploon ou mesentério. Durante décadas, antes do final dos anos 90, os tumores mesenquimatosos do tracto GI eram frequentemente classificados como tumores do músculo liso ou tumores das bainhas nervosas1. Quando apresentavam características de células de músculo liso na microscopia, eram classificados como leiomiomas ou leiomiossarcomas2, 3. Mais recentemente, tornou-se evidente que os GISTs são uma entidade independente, sendo os sarcomas mais comuns do tracto GI4, 5.

A designação “tumor estromal” foi utilizada pela primeira vez em 1983 por Mazur e Clark4. No entanto, esta designação não foi amplamente aceite até ao início dos anos 90, quando o CD34 foi identificado como marcador relativamente específico dos tumores estromais GI6.

Em 1998, Hirota et al. descreveram a existência de mutações activantes no gene do receptor tirosina-cinásico KIT nas células tumorais, bem como a expressão imuno-histoquímica da proteína KIT em GISTs7. O gene KIT codifica um receptor trans-membranar para o factor de crescimento de células estaminais — SCF (stem cell factor); o componente intracitoplasmático do receptor tem funções tirosina-cinásicas8. Em 2003, Heinrich et al.9 descreveram mutações no gene do receptor α do factor de crescimento derivado de plaquetas — PDGFRA (platelet-derived growth factor receptor-α), que constituem eventos patogénicos alternativos e mutuamente exclusivos em GISTs sem mutações KIT. Actualmente, até cerca de 85% dos GISTs têm mutações activantes no gene KIT e 5-8% mutações no PDGFRA, sendo que 10-15% dos casos não apresentam mutações destes proto- oncogenes (GISTs wild-type), podendo no entanto ter expressão de KIT9-12. A expressão de KIT (com o anticorpo CD117) nas células tumorais é um método fiável e sensível no diagnóstico dos GISTs13-15.

Há semelhanças morfológicas entre as células dos GISTs e as células intersticiais de Cajal (CIC), que são células localizadas designadamente em torno dos plexos mioentéricos do tracto GI, pacemakers das contracções peristálticas7, 16. As CIC expressam KIT e dependem do SCF para o seu desenvolvimento17, 18. Aceita-se que os GISTs têm origem em células intersticiais de Cajal ou em células estaminais precursoras das CIC7, 13, 19, 20.

No passado, os GISTs com comportamento maligno eram reconhecidamente os sarcomas mais resistentes ao tratamento convencional, com <10% de respostas clínicas após quimioterapia e/ou radioterapia21, 22. Em 2001, Joensuu et al.23 descreveram que o mesilato de imatinib (Glivec /Gleevec®; Novartis Pharmaceuticals, Basileia Suíça) era eficaz no tratamento do GIST. O imatinib, um inibidor dos receptores tirosina-cínase KIT e PDGFRΑ, é o tratamento padrão de 1ª linha em GISTs irressecáveis e/ou metastáticos KIT-positivos24, 25. Mais de 80% dos doentes

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beneficiam da terapêutica com este inibidor tirosina-cinásico e a mediana do tempo de sobrevida do GIST metastático atinge actualmente ~5 anos26, 27.

Os GISTs inoperáveis e/ou metastáticos são doenças controláveis, estando em fase de ensaio clínico nos últimos anos um número considerável de estudos com novos fármacos alternativos28. O avanço no conhecimento da biologia do GIST e a excelente resposta alcançada nos GISTs com o imatinib revelou-se um paradigma na terapêutica molecular dos tumores sólidos, proporcionando novos desafios para o esclarecimento das vantagens e limitações das designadas terapêuticas dirigidas contra alvos moleculares.

1 - Epidemiologia

A incidência do GIST nos EUA e na Europa é difícil de determinar, considerando que só recentemente foram generalizadamente reconhecidos e diagnosticados uniformemente como grupo individualizado. Os resultados do programa de vigilância epidemiológica SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Results) do National Cancer Institute de 1995 dos Estados Unidos da América (EUA) indicam 500-600 casos novos de GIST diagnosticados anualmente nos EUA29. Mais recentemente, estudos de base populacional realizados na Suécia30, Holanda31 e Islândia32, descrevem incidências de aproximadamente 14,5, 12,7 e 11 casos/milhão/ano, respectivamente.

Estes resultados permitem estimar a incidência anual na Europa em ~8.000-9.000 casos e nos EUA em ~4.000-5.000 casos /ano. No entanto, como muitos dos doentes sobrevivem períodos longos, a prevalência do GIST pode ser superior. Por outro lado, estes dados correspondem apenas a tumores detectados clinicamente, excluindo um número muito provavelmente substancial de micro-GISTs (< 1 cm), que apenas são detectados na autópsia ou, por exemplo, em gastrectomias realizadas por outras causas. Um estudo alemão em autópsias consecutivas identificou micro-GISTs (1-10 mm) em 22,5% de indivíduos com idade > 50 anos33. Os micro-GISTs expressam KIT e têm geralmente mutação oncogénica no gene KIT ou PDGFRA. Resultados semelhantes têm sido publicados por outros grupos34-37. Estes estudos sugerem que os micro-GISTs não progridem habitualmente (ou progridem muito lentamente) para tumores de grandes dimensões, com sintomas /sinais clínicos12.

Embora os GISTs ocorram em doentes de todas as idades, aquando do diagnóstico a maioria tem idade compreendida entre os 40-80 anos, com uma mediana de 60 anos27. Têm incidência idêntica em ambos os géneros38, embora algumas séries descrevam um ligeiro predomínio no género masculino27. Ocorrem raramente em crianças e adultos jovens. Os GISTs pediátricos são considerados um grupo clínico-patológico independente, com características distintas, e são diagnosticados predominantemente na segunda década de vida16, 39, 40.

A maioria dos GISTs é esporádica, mas foram descritas algumas famílias com mutações germinativas nos genes KIT41-49 e PDGFRA45, 50 e GISTs hereditários. Os doentes com síndromes hereditários como a neurofibromatose tipo I 51-53, a tríade de Carney (GIST gástrico, paraganglioma e condroma pulmonar)54 e a díade de Carney (paraganglioma, GIST gástrico)48 podem cursar com GISTs.

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33 2 - Características patológicas

Macroscopia

Os GISTs têm grande variedade morfológica na maioria das localizações, podendo ser diagnosticados como pequenos tumores incidentais ou tumores com grandes dimensões.

Apresentam-se muitas vezes como nódulos bem circunscritos e muito vascularizados, particularmente na localização gástrica ou intestinal. Os GISTs de menor dimensão são habitualmente nódulos subserosos, intramurais ou, com menor frequência, polipóides intraluminais;

os de maior dimensão desenvolvem-se geralmente com crescimento extraparietal e por vezes pediculado55. Ao corte, têm um aspecto carnudo, róseo ou branco-acastanhado e, nos casos de maior dimensão, podem ter áreas hemorrágicas, císticas ou necróticas.

Microscopia

As características microscópicas dos GISTs variam com o órgão envolvido55 e classificam-se geralmente em três subtipos de morfologia celular: fusiforme (70%), epitelióide (20%) ou misto (fusiforme e epitelióide)1. Nos GISTs de células fusiformes, as células têm citoplasma fibrilar eosinofílico claro, núcleo ovóide, e limite celular mal definido, muitas vezes com aspecto sincicial.

As células tumorais dispõem-se em feixes, que se entrecruzam, ou em novelos. As células fusiformes podem ter núcleos em paliçada ou vacuolização paranuclear proeminente que, apesar de sugestiva de fenótipo muscular liso, é muito comum nos GISTs. Os GISTs epitelióides são compostos por células arredondadas com citoplasma eosinofílico ou claro, organizadas em toalhas e ninhos. Cerca de 10% dos GISTs são mistos. Os GISTs têm geralmente estroma escasso e morfologia celular uniforme, com núcleos de cromatina fina e nucléolos aparentes56. A celularidade é variável e a matriz extracelular pode ser esclerótica, colagenosa ou mixóide. Ocasionalmente podem ser pleomórficos55 ou desdiferenciados57.

Após tratamento com inibidores tirosina-cinásicos, podem ter diminuição substancial da celularidade tumoral e esclerose acentuada ou transformação mixóide do estroma. Na maioria dos casos, a morfologia celular mantém-se idêntica à do tumor original. No entanto, após tratamento com estes agentes, têm sido descritos casos de modificação da morfologia celular fusiforme para epitelióide, padrão epitelióide pseudopapilar58 e, muito raramente, diferenciação rabdomiossarcomatosa59. Estas alterações podem dificultar o diagnóstico, especialmente quando o tumor também perde expressão de KIT. Nestes casos, a análise mutacional pode esclarecer o diagnóstico porque os tumores podem manter a mutação do KIT ou do PDGFRA58, 59.

3 - Alterações genéticas KIT e PDGFRA e vias de sinalização intracelular

Os genes KIT e PDGFRA localizam-se no braço longo do cromossoma 4 (4q11-q12)60. Codificam receptores tirosina-cinásicos (RTK) de tipo III que partilham características estruturais idênticas.

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São compostos por uma região extracelular (EC) para interacção com o ligando, uma região transmembranar, um domínio justamembranar (JM) e dois domínios cinásicos citoplasmáticos (TK1: bolsa de ligação ao ATP; e TK2: ansa de activação cinásica) (Fig. 1)61, 62.

Fig. 1: Representação esquemática dos receptores tirosina-cinásicos KIT e PDGFRA e distribuição das mutações mais frequentes nos GISTs9-12.

Os receptores KIT e PDGFRA são normalmente activados pela ligação dos respectivos ligandos — o ligando KIT (SCF/stem cell factor; mast cell growth factor; Steel factor) e o ligando PDGFA. A ligação de SCF na região EC resulta na homodimerização do receptor e na sua activação cinásica. A consequente auto-fosforilação do receptor (KIT/PDGFRA) ocorre nos vários resíduos de tirosina JM e citoplasmáticos. Estes resíduos fosforilados servem de pontos de ligação a diversas moléculas de sinalização secundária, activando cascatas de fosforilação e activação de substratos com funções de regulação da proliferação, diferenciação, adesão e sobrevivência ou apoptose celular63-67 (Fig. 2).

A actividade tirosina-cinásica do receptor é regulada pelo domínio JM, que, na ausência de activação pelo ligando, tem função inibidora68. A activação do KIT pode regular funções celulares fundamentais para o desenvolvimento e manutenção de vários tipos celulares, designadamente células germinativas e hematopoiéticas, mastócitos, melanócitos e células intersticiais de Cajal65, 69.

Uma mutação com ganho-de-função no gene KIT ou PDGFRA desencadeia sinalização oncogénica constitucional, ou seja, sem necessidade da acção dos respectivos ligandos. A desregulação da actividade tirosina-cinásica do receptor resulta na activação de vias de sinalização PI3K-Akt (phosphatidylinositol 3 kinase - protein kinase B), MAPK (mitogen-activated protein kinase; RAS/RAF/MEK) e, num nível relativamente mais baixo de activação, da via STAT (signal transducer and activation of transcription; STAT1, STAT3)63, 67, 70-73. A activação destas vias de sinalização intracelular condiciona alterações no ciclo celular, na translação de proteínas, no metabolismo e na apoptose celular (Fig.

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2). Estudos efectuados em extractos tecidulares de GISTs descreveram grande variação no grau de activação das diferentes vias de sinalização KIT. O melhor esclarecimento das vias de sinalização

Fig. 2: Vias de sinalização intracelular dependentes da activação dos receptores KIT e PDGFRA10, 63, 64.

envolvidas na patogénese dos GISTs poderá ser útil no estabelecimento de novas estratégias para o tratamento dos doentes com GIST avançado10, 71, 74-76.

As mutações activantes do KIT ocorrem noutras neoplasias: mastocitose77, tumores de células germinativas78, leucemia mielóide aguda79 e neuroblastoma80. Foram descritas mutações activantes do KIT, semelhantes às descritas em GISTs, num subgrupo de melanomas malignos das extremidades (pele) e das mucosas81.

A maioria dos GISTs tem mutações activantes dos receptores tirosina-cinásicos KIT (~75-85%) ou PDGFRA (~5-8%). Contudo, uma proporção de GISTs (10-15%) não tem quaisquer mutações do KIT ou do PDGFR (GISTs wild-type)9-12, 82.

As mutações nos genes KIT e PDGFRA são mutuamente exclusivas83. As mutações alteram duas regiões principais: os domínios reguladores EC (domínio de dimerização) e JM, e os domínios enzimáticos tirosina-cinásicos intracitoplasmáticos (TK1 e TK2). As mutações no domínio JM alteram a função auto-inibitória e causam activação cinásica84, 85 e as mutações na região EC causam dimerização do receptor independente do ligando9.

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A maioria das mutações do gene KIT ocorre no exão 11 (domínio JM) — 57-70%, e no exão 9 (domínio EC) — 5-18%9, 11, 86-91. As mutações KIT primárias também podem ocorrer no exão 13 (TK1: bolsa de ligação do ATP) e no exão 17 (TK2: ansa de activação cinásica), mas são raras (<2%) e os dados disponíveis limitados9, 11, 70, 87, 88, 90, 92. As mutações descritas no gene PDGFR envolvem os exões 12, 14 e 18, e correspondem às mutações homólogas nos exões 11, 13 e 17 do gene KIT, respectivamente. Em > 90% dos casos, as mutações do PDGFRA ocorrem nos codões 842-849 do exão 18, sendo a substituição D842V a mutação mais frequente (62,6%)11, 83.

Mais de uma década de estudos sobre as mutações do KIT e do PDGFRA nos GISTs indica que algumas das mutações podem associar-se a características histopatológicas bem definidas, e que há grande variação de mutações em GISTs de localizações gastrointestinais diferentes, “benignos” e

“malignos”75, 90, 93.

Os GISTs com mutação no exão 11 do gene KIT podem ocorrer em todo o tracto GI. Vários tipos de mutações podem ser observadas neste exão, mas as delecções são as alterações mais frequentemente descritas. As delecções, delecções-inserções e substituições de nucleotídeo no exão 11 foram descritas em GISTs do esófago ao ânus38, 94-98. O impacto prognóstico das mutações de genes de RTKs foi avaliado em diversos estudos retrospectivos, mas persiste controvérsia relativamente ao significado prognóstico das mutações do KIT no exão 11 dos GISTs. Alguns estudos descreveram que as mutações neste exão eram mais comuns nos tumores de maior dimensão, com índice mitótico mais elevado, sem nenhuma relação entre os diferentes tipos de mutações KIT neste exão e a morfologia celular, e que se associavam a evolução clínica “maligna”99,

100. Outros autores sugeriram que as mutações podiam ser detectadas tanto em tumores “malignos”

como “benignos” e clinicamente indolentes36, 70. Estudos mais recentes sugeriram que os diferentes tipos de mutações no exão 11 podem correlacionar-se com a evolução clínica dos tumores75. Os GISTs gástricos com delecções neste exão parecem ter tendência para cursar, na ausência de tratamento com imatinib, com um comportamento clínico mais agressivo do que os tumores com substituições de um nucleotídeo38. No entanto, a associação a comportamento biológico mais agressivo das delecções nos codões 557-558 do exão 11 descrita por diversos autores não foi confirmada em estudos recentes 10, 101-103.

Os GISTs com mutação no exão 9 ocorrem mais frequentemente no intestino delgado. Na maioria dos casos, as mutações caracterizam-se pela inserção de seis pares de bases, a duplicação de alanina e tirosina, e ocorrem quer em tumores primários quer em GISTs recidivados e/ou avançados89, 103. Os tumores com duplicações no exão 9 têm sido associados a evolução “maligna”86, 96, 104, 105. No entanto, um estudo de GISTs do intestino delgado com mutações no exão 9 não descreveu diferenças significativas na evolução clínica quando comparada com a de tumores com mutações no exão 1196.

Os GISTs com mutações nos exões 13 e 17 do KIT são ligeiramente mais prevalentes em localização intestinal. Estas mutações não parecem ter impacto nas características clínico- patológicas dos tumores, quando comparadas com os restantes tipos de GIST nesta localização.

GISTs com mutação no exão 13 localizados no estômago tendem a ser algo maiores e mais agressivos do que os GISTs gástricos sem esta mutação104.

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As mutações no gene PDGFRA ocorrem principalmente (∼6-7%) no exão 18 (TK2: ansa de activação cinásica) e no exão 14 (TK1: bolsa de ligação ATP), sendo raramente identificadas no exão 12 justamembranar (~1%)11, 12, 72, 83, 106-108. As mutações nos exões 14 e 18 do PDGFRA são sobretudo mutações missense. Os GISTs com mutações do PDGFRA predominam no estômago, têm morfologia epitelióide, estroma mixóide e pleomorfismo nuclear11, 106-109. Este subgrupo associa-se a comportamento clínico geralmente “benigno” e ausência de expressão KIT106, 107, 110-112. Os GISTs com a mutação D842V no exão 18 do PDGFRA são resistentes ao tratamento com imatinib e sunitinib9, 83, 87, 113.

Mais recentemente, foram também descritas mutações no exão 15 de BRAF (gene que codifica serine/threonine-protein kinase B-raf) em 5-13% dos GISTs wild-type de adultos114-116.

Os GISTs têm diferentes tipos de mutações nos genes KIT e PDGFRA e diferenças nas

“assinaturas moleculares” da expressão génica que podem explicar a complexidade biológica e a variabilidade da resposta ao tratamento com inibidores tirosina-cinásicos dos doentes com estes tumores117.

4 - Alterações cromossómicas e do ciclo celular

As mutações do KIT ou do PDGFRA são eventos precoces no desenvolvimento dos GISTs. A ocorrência de mutação é independente da dimensão do tumor. Observam-se em tumores incidentais microscópicos, múltiplos e "silenciosos", detectados em gastrectomias realizadas por outras causas, e em 10-20% dos indivíduos com idade > 60 anos, sem diagnóstico clínico de GIST34, 35. Estas evidências sugerem que as mutações estão envolvidas na oncogénese e na proliferação dos tumores, mas que não parecem ser decisivas para a transformação “maligna” dos GISTs36. A progressão clínica dos GISTs depende de eventos genéticos adicionais.

Nos estudos citogenéticos foram descritos desarranjos dos cromossomas 14 e 22. Cerca de dois terços dos GISTs mutantes KIT e PDGFRA têm monossomia no cromossoma 14 ou perda parcial de 14q72, 118, 119. Duas regiões de 14q, 14q11.2–q12 e 14q23–q24, parecem incluir genes de supressão tumoral importantes para o desenvolvimento precoce dos GISTs118-120. A perda do braço longo do cromossoma 22 (22q) foi descrita em ~50% dos casos. Esta alteração associa-se a progressão para comportamento biológico intermédio /”borderline” ou” maligno” dos GISTs 118, 121-123.

Os doentes pediátricos ou adultos com GISTs sem mutações KIT ou PDGFRA têm progressão citogenética insignificante quando comparados com a dos doentes com GISTs com mutações16, 124, sublinhando o facto de que os mecanismos que levam à progressão tumoral são diferentes em GISTs com mutação e em GISTs wild-type.

O gene supressor tumoral CDKN2A (p16INK4A) localizado no cromossoma 9p é inactivado através de vários mecanismos numa percentagem significativa de GISTs “malignos”125-129. A delecção, a

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mutação e a metilação do promotor contribuem para a diminuição da expressão de p16, que é um inibidor do ciclo celular. Os resultados de estudos imuno-histoquímicos descrevem uma correlação significativa com o comportamento agressivo, mesmo em tumores de baixo risco127-129.

Outro inibidor do ciclo celular, o p27KIP1, é frequentemente activado nos GISTs “malignos”, mas a associação com a progressão tumoral não foi confirmada consistentemente128, 130, 131. Embora a expressão destes marcadores indique uma tendência para a associação com comportamento biológico de alto risco ou “maligno”, nenhum deles parece ser factor de risco independente em análise multivariada.

5 - Marcadores imuno-histoquímicos no diagnóstico

O diagnóstico anátomo-patológico de GIST resulta da integração de dados morfológicos com os do estudo imuno-histoquímico, num contexto clínico adequado. Os GISTs expressam CD117/KIT (95%) e frequentemente CD34 (70%).

A expressão do KIT tem elevada especificidade e sensibilidade no diagnóstico diferencial dos GISTs com os tumores mesenquimatosos do tracto GI7, 13, 15, 20. Podem ser observados padrões diferentes de expressão KIT15. A maioria dos GISTs tem expressão citoplasmática forte e difusa do KIT (Fig. 3A), que muitas vezes se associa a padrão paranuclear (tipo dot). A extensão e o padrão da expressão KIT não se correlacionam com o tipo de mutação do KIT nem são preditivos da resposta aos inibidores tirosina-cinásicos.

Fig. 3: Expressão imuno-histoquímica de CD117/KIT (A) e de DOG1 (B) em GISTs de células fusiformes.

Estudos recentes descrevem a existência de um subgrupo de aproximadamente 4-5% de GISTs que não expressam CD117 — designados como GISTs KIT-negativos106, 107. Os GISTs com expressão KIT fraca ou focal, bem como os GISTs sem expressão do KIT, podem corresponder a tumores KIT wild-type (sem mutações KIT/PDGFRA) ou com mutações do PDGFRA106, 107. Ocorrem preferencialmente no estômago e epíploon e com morfologia epitelióide ou mista.

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Nos últimos anos surgiram novos anticorpos usados no diagnóstico do GIST. Estes marcadores foram identificados sobretudo através de estudos moleculares e têm despertado interesse no estudo do subgrupo de GISTs KIT-negativos.

O marcador mais relevante deste grupo é o DOG 1 (discovered on GIST-1) (Fig. 3B), também conhecido como TMEM16A, uma proteína trans-membranar de função desconhecida, descoberta através de análise de expressão génica132. Vários estudos publicados descreveram que os anticorpos anti-DOG 1 têm maior sensibilidade e especificidade do que o CD117 e o CD34, e que este anticorpo pode ser um marcador imuno-histoquímico específico de GIST, independentemente da existência de mutações KIT/PDGFRA ou da expressão KIT132-135. Os diferentes anticorpos monoclonais recentemente desenvolvidos para DOG 1 (ex: DOG 1.1; K9)133, 135 podem ser marcadores válidos na prática, particularmente no diagnóstico diferencial entre GISTs KIT- negativos e outros sarcomas24, 136-138.

Cerca de 1/3 dos GISTs KIT-negativos expressa DOG 1, sendo que os restantes 2/3, apesar de morfologia típica, continuam a ser difíceis de classificar no estudo imuno-histoquímico134.

Dependendo da morfologia histológica, o diagnóstico de GIST KIT-negativo pode ser problemático. A análise das mutações nos genes KIT e PDGFRA pode confirmar em definitivo o diagnóstico de GIST, não só em casos que apresentem morfologia equívoca, mas também nos GISTs sem expressão de CD117 e DOG1,24, 138 porque alguns destes tumores podem ter mutações num dos proto-oncogenes107, 110.

Neste contexto, importa salientar que a ausência de expressão KIT não justifica excluir doentes do tratamento com inibidor tirosina-cinásico (ITK). Algumas das mutações detectadas nos GISTs KIT-negativos (incluindo mutações do PDGFRA) são sensíveis ao tratamento com ITKs. Alguns GISTs wild-type respondem ao tratamento com ITKs. A análise mutacional deve ser considerada indispensável para a confirmação do diagnóstico e é boa prática na decisão terapêutica, designadamente com ITKs 11.

Outros marcadores frequentemente expressos no GIST, embora menos sensíveis e específicos, são o CD34, o h-caldesmon e a SMA (α-smooth muscle actin). O CD34 é uma glicoproteína trans- membranar presente nos precursores das células hematopoiéticas humanas e no endotélio vascular.

É expresso em ~80% dos GISTs gástricos, 50% do intestino delgado e 95% do esófago e recto 96,

139, enquanto o h-caldesmon é expresso em > 2/3 dos GISTs140, 141 e a SMA em ~30%142. Os GISTs raramente expressam desmina, que é geralmente focal. No entanto, tem sido descrita positividade em ~30% de GISTs KIT-negativos, especialmente no estômago e com morfologia epitelióide134. A proteína S-100 (5%) e as citoqueratinas são raramente expressas nos GISTs.

6 - Diagnóstico diferencial

Os principais diagnósticos diferenciais do GIST de células fusiformes são os tumores do músculo liso (leiomiomas e leiomiossarcomas), a fibromatose (desmóide), o schwanoma, o tumor miofibroblástico inflamatório, o pólipo fibróide inflamatório e o tumor fibroso solitário.

Referências

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