UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
RENATA ROCHA DO NASCIMENTO
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS, SECRETÓRIAS E MORFOFUNCIONAIS EM JEJUNO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 INOCULADOS COM A ESPÍCULA DO
CORONAVÍRUS SARS-COV-2
FORTALEZA 2022
RENATA ROCHA DO NASCIMENTO
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS, SECRETÓRIAS E MORFOFUNCIONAIS EM JEJUNO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 INOCULADOS COM A ESPÍCULA DO
CORONAVÍRUS SARS-COV-2
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia.
Orientadora: Profa. Dra. Mariana Lima Vale.
Coorientador: Prof. Dr. Lucas Antonio Duarte Nicolau.
FORTALEZA 2022
RENATA ROCHA DO NASCIMENTO
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS, SECRETÓRIAS E MORFOFUNCIONAIS EM JEJUNO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 INOCULADOS COM A ESPÍCULA DO
CORONAVÍRUS SARS-COV-2
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia.
Aprovada em: xx/xx/xxxx.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Profa. Dra. Mariana Lima Vale (Orientadora) Universidade Federal do Ceará - UFC
________________________________________
Prof. Dr. Lucas Antonio Duarte Nicolau (Coorientador) Universidade Federal Do Delta Do Parnaíba - UFDPar
_________________________________________
Prof. Dr. Marcellus Henrique Loiola Ponte De Souza Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Profa. Dra. Daniele Maria Ferreira Faculdade Pequeno Príncipe (FPP)
DEDICATÓRIA
Em primeiro lugar a Deus pelo Dom da vida e que com sua infinita sabedoria, foi um importante guia em minha trajetória.
Aos meus pais, Rosemary e Raimundo, meus maiores incentivadores, responsáveis por tudo de bom que está acontecendo em minha vida.
A vocês, eu dedico.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao meu grande e glorioso DEUS e à Nossa Senhora Aparecida, que em sua infinita sabedoria colocaram forças em meu coração para vencer essa grande etapa da minha vida. A fé no Senhor e em Nossa senhora, sem dúvidas, me ajudou a chegar até aqui.
Aos meus pais Rosemary e Raimundo (meus nenéns) um agradecimento muito especial.
Pelo esforço incondicional dedicado aos meus estudos, estando sempre ao meu lado, mesmo que, em momentos difíceis no qual pensei que jamais iria conseguir seguir adiante, sem vocês, a realização desse sonho se tornaria impossível. Saibam que são minha maior fonte de amor, carinho, coragem, determinação, força e inspiração, qualidades nas quais fizeram eu me tonar uma grande mulher.
A minha orientadora Prof. Dra. Mariana Vale, por ter aceitado a minha participação em seu grupo de pesquisa. Por todos os ensinamentos e contribuições que me ajudaram na finalização da minha dissertação e do meu amadurecimento científico, como consequência acarretando ao título de mestre. É uma honra tê-la como minha orientadora, principalmente por tudo que você representa na pesquisa cientifica. Acredite, por você, eu tenho muito carinho e admiração. Te adoro Profa.
Ao meu querido coorientador Prof. Dr. Lucas Nicolau por ter me concedido a confiança na realização de um projeto magnífico. Obrigado por todo conhecimento científico e pela coorientação maravilhosa, com dicas proveitosas e sempre surpreendentes. Saiba, que além de ser uma pessoa maravilhosa, és um excelente pesquisador, sempre indo além do inimaginável com propostas cientificas inovadoras e riquíssimas em conhecimento, capazes de nos levar muito além. É admirável sua competência ao conseguir formar parcerias de grande valia, no qual foram primordiais para finalização desse projeto. Te agradeço imensamente e espero um dia poder retribuir tudo o que fez por mim.
A Dra. Priscilla Fernanda (Pri) que tem participação especial em toda minha jornada cientifica, pois foi a primeira pessoa a acreditar no meu potencial, dando-me à oportunidade de fazer parte de um grupo de pesquisa. Tu és a principal responsável pelo meu despertar científico, convencendo-me o quão lindo e encantador ele é.
Ao Prof. Dr. Aldo Ângelo com contribuições cientificas riquíssimas, compartilhando
sua sabedoria, o seu tempo e sua experiência.
Aos colegas do LDI, Kleybson Sousa e Samilly Ribeiro por me ajudarem durante a realização dos experimentos na câmara de Ussing e no processo de análises dos dados, em especial a Dra. Cristhyane Costa, que além da ajuda em todos os experimentos com sua companhia agradável sendo de fundamental importância para finalização do trabalho, se tornou uma grande amiga.
Ao Prof. Dr. Pedro Magalhães por ter me permitido realizar análises funcionais no LAFARMULI, sempre com muita atenção e paciência. A Kalinne Gadelha e Karine Lima por sempre serem solicitas e por toda ajuda durante as análises contráteis.
A Profa. Dra. Lêda Castilho do laboratório LECC/UFRJ por ter cedido as espículas ao nosso grupo de pesquisa. Ao Prof. Dr. Marcelo Biondaro e a Prof. Dra. Ana Paula pelas contribuições histopatológicas. Ao professor Prof. Dr. Jefferson Almeida pelas análises ín silico.
Ao LAFICA pelas amizades construídas (Aurilene, Célia, Cristiane, Gisele, Katharine, Jussara, Rafael, Washigton e em especial ao aluno de iniciação cientifica Jonas) durante toda realização do projeto, tornando o ambiente laboratorial harmonioso. A Profa. Dra. Deysi Viana e ao Prof. Dr. Roberto César, por sempre se fazerem presente com boas sugestões, sempre encantados com os resultados do projeto, acreditem, isso me motivou imensamente, fazendo com que eu me dedicasse um pouquinho mais, dia após dia.
Aos meus pais científicos, Prof. Dr. Pedro Soares e Prof. Dr. Marcellus Loiola, por terem me acolhido desde o primeiro semestre da faculdade como aluna de iniciação cientifica, contribuindo com todo meu conhecimento e aprendizado. Para mim, vocês se tornaram uma grande inspiração.
Aos meus colegas do LEFFAG (Àlvaro - Alvin, Tiago - Codei, Kaíra - Dory, Genilson, Kerolayne - Kero, Suliana - Su, Cecilia - Ceci, Carlos - Carluxx, Marcos Aurélio - Ketin, Deisen, Jonathan - Jonh, Patricia - Paty, Humberto - Oneberto, Samara – Samys e Tiago - Ti) a maioria com um apelido carinhoso, demonstrando o quão foram e ainda são importantes em minha vida. Minha família cientifica, obrigada por se fazerem presente até os dias de hoje.
Sou uma eterna Leffaguense.
As minhas melhores amigas que se tornaram grandes irmãs (Maria Felipe, Klayre Sousa, Géssica Oliveira, Lorena Duarte, e ao Paulo Roberto). Tenho orgulho de ter amizades
saudáveis como a de vocês, com início na graduação perpetuando até os dias e hoje (7 anos), literalmente a famosa frase clichê “Da faculdade para vida”, nos representa. Peço a Deus que ilumine nossa amizade, permanecendo com muita alegria e felicidade.
Aos amigos da 1ª turma de biomedicina da UNIFANOR WYDEN, especialmente a Thais Melo, Dayane Lima, Gleyceane Gomes, Priscilla Babiuk e Sarah Leyenne, por todos os encontros com conversas agradáveis.
As minhas amizades construídas durante o curso de verão na FISFAR-UFMG em 2019 (Alan, Benedito, Ismael, Leonardo, Renata e Saulo), mesmo que de longe, a amizade de vocês foi fundamental nessa etapa da minha vida.
Aos funcionários do Centro de Biomedicina, em especial ao Jeferson (Jeff), José e Cláudia (Claudinha) pelas conversas paralelas nos corredores do Centro de Biomedicina, sempre solícitos e dispostos a me ajudarem.
A todos os funcionários do NPDM, em especial a Dona Ivonete e a Dona Simone, sempre muito carismáticas e preparadas a me ajudarem.
Aos colegas da turma de mestrado, pelas reflexões, críticas e sugestões recebidas.
A Universidade Federal do Ceará, é uma honra ter minha formação em uma universidade pública tão renomada.
À Instituição Capes pois o presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
A todos os outros professores do departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC, que contribuíram de alguma forma para a minha formação no mestrado.
Aos professores participantes da banca minha examinadora da qualificação e defesa (Professoras, Cristhyane Costa, Daniele Maria e Priscilla Fernanda e aos Professores Marcellus Henrique e Pedro Magalhães) pelo tempo, pelas valiosas colaborações e sugestões.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, especialmente a Laura e Milena, pela disponibilidade constante em ajudar.
Ao meu namorado Iranildo Araújo por dar mais sentido à minha vida, me ajudando e acreditando em meu potencial, por todo apoio dispensado nos momentos de angústia tornando os dias difíceis mais leves e felizes. Te amo vida. E aos meus filhos de quatro patas Belinha e
Bruce, por alegrarem minha vida dia após dia.
Aos meus avós Nazaré Miliano, Lindinalva Rocha e Jesuíno Ferraz por terem me ensinado valores que carrego comigo em todos os momentos da minha vida, em especial ao meu avô Manoel Paulo (in memorian) que infelizmente não tive o prazer de conhecê-lo, mas sei que em algum lugar deve estar vibrando com a minha vitória.
Aos meus padrinhos Maria De Fátima e João Do Nascimento por todo incentivo. Aos primos, primas, tios e tias por todo apoio, carinho e atenção, em especial ao meu tio Carlos Romão, um exemplo a ser seguido.
Por fim, deixo uma palavra de gratidão a todos que, de maneira direta ou indireta, contribuíram para que a realização desse trabalho. O meu muito obrigada!!
EPÍGRAFE
“
Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo propósito debaixo do céu Há tempo de nascer, e tempo de morrer; tempo de plantar, e tempo de arrancar o que se plantou.
”(Eclesiastes 3:1-2).
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS, SECRETÓRIAS E MORFOFUNCIONAIS EM JEJUNO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 INOCULADOS COM A ESPÍCULA DO
CORONAVÍRUS SARS-COV-2 RESUMO
INTRODUÇÃO: O SARS-CoV-2 é o vírus responsável pela Doença do Coronavírus 2019 (COVID-19), estudos relataram a incidência de sintomas gastrintestinais, incluindo diarreia, náusea/vômito e dor abdominal. Porém, até o momento os modelos experimentais que permitem entender a fisiopatologia da COVID-19 no trato gastrintestinal são extremamente limitados. Dessa forma, a inoculação da espícula de SARS-CoV-2 em alças jejunais pode ser uma ferramenta experimental para estudo da patobiologia dessa virose no TGI. OBJETIVO: Avaliar as alterações inflamatórias, secretórias e morfofuncionais causadas pela inoculação da espícula em alças jejunais de camundongos. MÉTODOS: Para ensaios in silico, a docagem molecular foi realizada avaliando a interação entre a espícula e os receptores envolvidos na secreção de eletrólitos intestinais. O modelo in vivo, baseou-se no método de looping intestinal com inoculação da espícula em alças jejunais isoladas. Os animais foram eutanásiados, as alças e os fluidos intestinais coletados para análises secretórias, inflamatórias, morfológicas, funcionais e contráteis. RESULTADOS: Nossos dados in silico mostraram que a espícula se liga ao CFTR (-1658.2 kcal.mol-1) e CaCC (-1593,3 kcal.mol-1). Enquanto os dados in vivo mostram que a inoculação da espícula demonstrou aumento (p<0,05) do VCI (288,6 ± 60,45 µl), acompanhado de secreção de Cl- (0,07541 ± 0,006 mEq/L), edema intestinal (PU aumentado - 109,2 ± 8,62 mg/cm) e aumento (p<0,05) da atividade de MPO (14,59 ± 1,50 U/mg de tecido).
Imagens histopatológicas demonstraram que a espícula induziu a migração de células inflamatórias (2,22 ± 0,06), alterações epiteliais (2,06 ± 0,07) e desarranjo na histoarquitetura da mucosa (1,97 ± 0,07). Além de, apresentarem diminuição da camada muscular (57,88 ± 0,866 µm), submucosa (37,98 ± 0,663 µm) e mucosa (120,9 ± 1,559 µm), com redução da profundidade (65,60 ± 1,142 µm) e largura (38,21
± 0,45 µm) das criptas, diminuição da altura dos vilos (218 ± 3,84 µm) e dos enterócitos (12,73 ± 0,20 µm), aumentando respectivamente a largura (Vilos: 77,60 ± 1,69 µm;
Enterócitos: 6,08 ± 0,10 µm). Houve diminuição das células de Paneth (2.29 ± 0,05 – 20,3% por cripta) e das células caliciformes, incluindo a diminuição de mucinas neutras (PAS) 12,15 ± 0,49), sulfomucinas (AB pH 1,0 – 8,53 ± 0,34) e sialomucinas (AB pH 2,5 – 6,26 ± 0,28). A espícula promoveu diminuição da expressão (p<0,05) de ocludina (12,08 ± 1,60 kDa) e da RET basal (9,29 ± 0,54 Ω/cm2) e apresentou redução (p<0,05) da resposta eletro-mecânica (0,123 ± 0,02 g). CONCLUSÃO: Conclui-se que a espícula desencadeou alterações na mucosa intestinal, caracterizadas por: 1) Secreção, incluindo dilação tecidual, acúmulo de fluido intestinal e efluxo de íons Cl-; 2) Resposta inflamatória, compondo-se de edema e infiltrado de polimorfonucleares;
3) Alterações histopatológicas no jejuno; 4) Comprometimento da integridade jejunal, em consequência da diminuição da expressão da TJs ocludina e da RET basal e 5) Alterações funcionais eletromecânicas, intermediada pela diminuição da força de contração do intestino.
Palavras-chave: COVID-19; SARS-CoV-2; Espícula; Mucosa intestinal.
INFLAMMATORY, SECRETORY AND MORPHOFUNCTIONAL CHANGES IN THE JEJUNUM OF C57BL/6 MICE INOCULATED WITH THE SARS-COV-2
CORONAVIRUS SPIKE ABSTRACT
INTRODUCTION: SARS-CoV-2 is the virus responsible for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), studies have reported the incidence of gastrointestinal symptoms including diarrhea, nausea/vomiting and abdominal pain. However, so far, experimental models that allow understanding the pathophysiology of COVID-19 in the gastrointestinal tract are extremely limited. Thus, inoculation of the SARS-CoV-2 spike into the jejunal loops could be an experimental tool to study the pathobiology of this virus in the GI tract. OBJECTIVE: To evaluate the inflammatory, secretory and morphofunctional alterations caused by the inoculation of the spike in the jejunal loops of mice. METHODS: For the in silico assays, molecular docking was performed to evaluate the interaction between the spike and the receptors involved in the secretion of intestinal electrolytes. The in vivo model was based on the intestinal loop method with spike inoculation in isolated jejunal loops. The animals were sacrificed, the intestinal loops and fluids collected for secretory, inflammatory, morphological, functional and contractile analyses. RESULTS: Our in silico data showed that the spike binds to CFTR (-1658.2 kcal.mol-1) and CaCC (-1593.3 kcal.mol-1). While in vivo data show that the inoculation peak showed an increase (p<0.05) in Volume of Intestinal Contents (VCI - 288.6 ± 60.45 µl), accompanied by Cl- secretion (0.07541 ± 0.006 mEq/L), intestinal edema (increase in wet weight - 109.2 ± 8.62 mg /cm) and increased (p<0.05) Myeloperoxidase (MPO) activity (14.59 ± 1.50 U/mg of tissue).
Histopathological images showed that the spike induced migration of inflammatory cells (2.22 ± 0.06), epithelial changes (2.06 ± 0.07) and disarray in the mucosal histoarchitecture (1.97 ± 0.07). In addition, they present a decrease in the muscle layer (57.88 ± 0.866 µm), submucosa (37.98 ± 0.663 µm) and mucosa (120.9 ± 1.559 µm), with a reduction in depth (65.60 ± 1.142 µm) and width (38.21 ± 0.45 µm) of the crypts, decrease in the height of the villi (218 ± 3.84 µm) and enterocytes (12.73 ± 0.20 µm), respectively increasing the width (Villi: 77, 60 ± 1.69 µm; Enterocytes: 6.08 ± 0.10 µm).
There was a decrease in Paneth cells (2.29 ± 0.05 - 20.3% per crypt) and goblet cells, including a decrease in neutral mucins (PAS) 12.15 ± 0.49), sulfomucins (AB pH 1.0 – 8.53 ± 0.34) and sialomucins (AB pH 2.5 – 6.26 ± 0.28). The spike promoted a decrease (p<0.05) in the expression of occludin (12.08 ± 1.60 kDa) and basal RET (9.29 ± 0.54 Ω/cm2) and showed a reduction (p<0.05) of the electromechanical response (0.123 ± 0.02 g ). CONCLUSION: It is concluded that the spike triggered changes in the intestinal mucosa, characterized by: 1) Secretion, including tissue dilation, accumulation of intestinal fluid and efflux of Cl- ions; 2) Inflammatory response, consisting of edema and polymorphonuclear infiltrate; 3) Histopathological changes in the jejunum; 4) Impairment of jejunal integrity, as a result of decreased expression of TJs occludin and basal RET and 5) Electromechanical functional changes, mediated by decreased intestinal contraction force.
Keywords: COVID-19; SARS-CoV-2; spike; Intestinal mucosa.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Manifestações extrapulmonares da COVID-19... 30
Figura 2 - Estrutura do SARS-CoV-2... 33
Figura 3 - Estrutura geral do DLR de SARS-CoV-2 ligado ao receptor ECA2...34
Figura 4 - Interfaces de ligações entre o DLR de SARS-CoV-2 e a peptidase ECA2.35 Figura 5 - Painel de casos confirmados da COVID-19 no mundo... 36
Figura 6 - Mecanismo de entrada de SARS-CoV-2...37
Figura 7 - Papel do sistema renina/angiotensina e sistema calicreína/cinina na homeostase corporal...39
Figura 8 - Papel hipotético do sistema renina/angiotensina e do sistema calicreína/cinina na patogênese da COVID-19...40
Figura 9 - Esquema do epitélio intestinal...43
Figura 10 - Mecanismos de secreção intestinal na diarreia secretória...47
Figura 11 - Modelo proposto para diarreia associada ao SARS-CoV-2...49
Figura 12 - Ensaio de docagem molecular...56
Figura 13 - Estrutura da espícula na conformação de pré-fusão...58
Figura 14 - Obtenção e alimentação dos animais...59
Figura 15 - Desenho experimental do modelo de inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...65
Figura 16 - Desenho experimental da localização e coleta do jejuno...67
Figura 17 - Esquematização da análise do volume do conteúdo intestinal...68
Figura 18 - Esquematização da análise da concentração de íons Cl- no lúmen Intestinal...69
Figura 19 - Esquematização da análise macroscópica...70
Figura 20 - Esquematização da análise de peso úmido...70
Figura 21 - Esquematização da análise da atividade de mieloperoxidase...72
Figura 22 - Esquematização da análise histolopatógica...76
Figura 23 - Esquematização da expressão de ocludina por meio da análise de western blotting...78
Figura 24 - Esquematização do efeito da espícula na função intestinal...82
Figura 25 - Esquematização do efeito da espícula no maquinário contrátil intestinal...84
Figura 26 - Docagem molecular 3D do complexo 6VYB/NBD2... ...88
Figura 27 - Docagem molecular 3D do complexo 6VYB/NBD1...89
Figura 28 - Docagem molecular 3D do 6VYB/CFTR...90
Figura 29 - Docagem molecular 3D do complexo 6VYB/CaCC...91
Figura 30 - Volume temporal de fluido intestinal após a inoculação de concentrações crescentes da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...94
Figura 31 - Concentração temporal de cloreto após a inoculação de concentrações crescentes da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...96
Figura 32 - Peso úmido temporal após a inoculação de concentrações crescentes da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...98
Figura 33 - Atividade temporal da enzima mieloperoxidase após a inoculação de concentrações crescentes da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...100
Figura 34 - Aspecto macroscópico após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...102
Figura 35 - Aspectos secretórios após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...104
Figura 36 - Aspectos inflamatórios após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...106
Figura 37 - Análise histopatológica do jejuno de camundongos após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...109
Figura 38 - Análise morfométrica do jejuno de camundongos após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...111
Figura 39 - Análise histopatológica das células de Paneth do jejuno de camundongos após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...112
Figura 40 - Análise histopatológica das células caliciformes do jejuno de camundongos após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...114 Figura 41 - Expressão da tight junction ocludina após a inoculação da espícula do
coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...115 Figura 42 - Resistência elétrica transepitelial basal da mucosa jejunal após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...116 Figura 43 - Resposta contrátil após a inoculação da espícula do coronavírus SARS- CoV-2 em alças jejunais isoladas...118 Figura 44 - Modelo hipotético de inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV- 2 em alças jejunais isoladas...136
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Descrição dos grupos experimentais da curva temporal após a inoculação de concentrações crescentes da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...61 Tabela 2 - Descrição dos grupos experimentais da curva concentração vs. resposta após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...62 Tabela 3 - Descrição dos grupos experimentais do modelo de inoculação da espícula
do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais
isoladas...63 Tabela 4 - Escore histopatológico. Esquema de pontuação para inflamação do intestino delgado mediada por antígenos luminais...73 Tabela 5 - Acoplamento de interação molecular entre peptídeos sintéticos e a espícula em seu estado aberto. O ensaio de encaixe molecular foi realizado utilizando o servidor ClusPro 2.0...87
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AB Azul Alciano, do inglês alcian blue
ADAM17 Desintegrina e Metaloprotease 17 ALT Alanina Aminotransferase
ANOVA Análise Unidirecional de Variância AngI Angiotensina I
AngII Angiotensina II Ang 1-7 Angiotensina 1-7
AST Aspartato Aminotransferase AT1R Receptor Tipo 1
BK Bradicinina, do inglês bradykinin BK1R Receptor de bradicinina tipo 1 CaCC Canal de Cloreto Ativado por Cálcio CEUA Comitê De Ética e Uso De Animais
CFTR Regulador de Condutância Transmembrana de Fibrose Cística
CI Cauda Intracelular
CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal COVID-19 Doença do Coronavírus 2019
CoVs Coronavírus
CT Cauda Citoplasmática
DABK Des-Arg-Bradicinina-9
DC Domínio Do Conector
DLR Domínio de Ligação ao Receptor DNT Domínio N-Terminal
DP Diferença de Potencial
DP1 Diferença de Potencial Basal
ECA Enzima Conversora de Angiotensina ECA2 Enzima Conversora de Angiotensina 2 EPM Erro Padrão da Média
ESPÍCULA Proteína S
HC Hélice Central
H&E Hematoxilina e Eosina
HTAB Tampão De Hexadeciltrimetilamônio IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M IL-6 Interleucina-6 IL-12 Interleucina-12
KRB Krebs-Ringer Bicarbonato
LAFICA Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer LDH Lactato Desidrogenase
LECC Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares
MasR Receptor Mas
MERS-CoV Síndrome Respiratória do Oriente Médio MLR Motivo de Ligação ao Receptor
MPO Mieloperoxidase
Na⁺ / K⁺ ATPase Bomba de Sódio e Potássio Adenosinatrifosfatases NBD1 Domínio de Ligação de Nucleotídeo 1 de CFTR NBD2 Domínio de Ligação de Nucleotídeo 2 de CFTR NKCC1 Co-Transportador de Cloreto de Sódio-potássio-1
NPDM Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento de Medicamentos OMS Organização Mundial de Saúde
PAS Ácido Periódico de Schiff
PBS Solução Salina Tamponada com Fosfato PGs Prostaglandinas
PF Peptídeo De Fusão
PN Proteína de Nucleocapsídeo PM Proteína de Membrana
PE Proteína de Envelope
PU Peso Úmido
RET Resistência Elétrica Transepitelial RH1 Repetição Heptada 1
RH2 Repetição Heptada 2 RNA Ácido Ribonucleico
RV Rotavírus
SARS Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus
SARS-CoV-2 Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus 2 SCU Sistema de Câmaras de Ussing
SDRA Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo SNE Sistema Nervoso Entérico
SCC Sistema Calicreína/Cinina SRA Sistema Renina/Angiotensina
SS Sequência De Sinal
S1 Subunidade 1
S2 Subunidade 2
TGI Trato Gastrintestinal
TJs Junções apertadas, do inglês tight junctions TLR Receptor Toll-like
TM Domínio Transmembranar
TMPRSS2 Serina Protease Transmembranar 2 TNF-α Fator de Necrose Tumoral-alfa UFC Universidade Federal do Ceará
UFR Universidade Federal de Rondonópolis UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro UFDPar Universidade Federal Delta do Parnaíba VCI Volume Do Conteúdo Intestinal
6VYB Espícula de SARS-CoV-2 em seu estado aberto
LISTA DE SÍMBOLOS
Ω Ohms
CaCl2 Cloreto de cálcio
CCh Carbacol
Cl- Cloreto
CO2 Dióxido de Carbono
H+ Hidrogênio
Ip Intraperitoneal
K+ Potássio
KCl Cloreto de potássio
kDa Quilodalton
HCO3- Bicarbonato
MgCl2 Cloreto de magnésio
n Número De Animais
Na+ Sódio
NaCl Cloreto de Sódio NaHCO3 Bicarbonato de Sódio NaH2PO4 Fosfato monossódico NHEs Trocadores de Na + / H + NO Óxido Nítrico
O2 Oxigênio
µL Microlitros
µM Micrometro
mL Mililitros
Mg Miligramas
g Gramas
i Intensidade de Corrente Elétrica H2O2 Peroxido de hidrogênio
h Hora
H2S Sulfeto de Hidrogênio
K+ Íon Potássio
kg Quilograma
log Logaritmo
M Molar
mg Miligrama
min Minuto
mL Mililitro
mm3 Milímetro cúbico
mmol Milimolar
Na+ Íon Sódio
NaOH Hidróxido de sódio
nm Nanômetro
nmol Nanomolar
pH Potencial hidrogeniônico
® Marca Registrada
rpm Rotação por minuto
UMPO Unidade de Mieloperoxidase
α Alfa
β Beta
γ Gama
δ Delta
μl Microlitro
µA Microampère
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...25 2. REFERÊNCIAL TEÓRICO...28 2. 1 COVID-19...29 2.1.1 SARS-CoV-2... 31 2.1.2 Espícula do SARS-CoV-2...33 2. 2 Epidemiologia da COVID-19...35 2. 3 Mecanismo de infecção viral do SARS-CoV-2...36 2. 4 ECA2 e os sistemas renina/angiotensina e calicreína/cininas...38 2. 5 Trato gastrintestinal ... 41 2.5.1 Papel do trato gastrintestinal na COVID-19...43 2.5.2 Intestino como local importante da regulação imune...45 2.5.3 Fisiopatologia da diarreia na COVID-19...46 3. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA ... 50 4. OBJETIVOS ... 52 4.1 Objetivo Geral...53 4.2 Objetivos Específicos... 53 5 MATERIAIS E MÉTODOS...54 5.1 Ensaio in silico...55 5.1.1 Docagem molecular...55 5.2 Ensaios in-vivo... 56 5.2.1 Drogas, reagentes, proteínas, soluções, equipamentos e outros materiais.... 56 5.2.2 Obtenção, produção e purificação da espícula...57 5.2.3 Animais...58 5.2.4 Cuidados com analgesia e anestesia...59 5.2.5 Considerações éticas...60 5.2.6 Considerações sobre biossegurança...60 5.2.7 Delineamento experimental...60 5.2.8 Modelo de inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas... 63 5.2.9 Localização, sutura e coleta do jejuno...66 5.2.10 Efeito secretório da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 no lúmen
intestinal... 67 5.2.10.1 Volume do conteúdo intestinal: ...67 5.2.10.2 Concentração de íons Cl-: ...68 5.2.11 Efeito inflamatório da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 no lúmen intestinal... 69 5.2.11.1 Macroscopia da alça jejunal...70 5.2.11.2 Peso úmido da alça jejunal...70 5.2.11.3 Ensaio da atividade de mieloperoxidase no tecido jejunal...71 5.2.11.4 Análise histopatológica do intestino delgado (jejuno)...72 5.2.11.4.1 Processamento histológico e avaliação histopatológica: ...72 5.2.11.4.2 Análise histomorfométrica...74 5.2.11.4.3 Processamento histológico e contagem das células de Paneth...74 5.2.11.4.4 Processamento histológico e contagem das células caliciformes...74 5.2.12 Avaliação da expressão da tight junction ocludina no intestino através de western blotting após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas... 77 5.2.13 Efeito da função de barreira intestinal após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...79 5.2.13.1 Avaliação dos parâmetros eletrofisiológicos basais por meio da Câmara de Ussing...79 5.2.13.2 Soluções perfusoras e soluções teste...79 5.2.13.3 Dissecação da amostra e montagem das câmaras...80 5.2.13.4 Medidas elétricas...80 5.2.14 Efeito da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 no maquinário contrátil intestinal após a inoculação em alças jejunais isoladas... 83 5.3 Análise estatística... 85 6 RESULTADOS... 86 6.1 Avaliação in silico das interações da espícula com proteínas de canais de cloreto e cálcio... 87 6.2 Efeito temporal da inoculação de concentrações crescentes da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas... 92 6.2.1 Parâmetros secretórios: ... 92 6.2.1.1 Volume do conteúdo intestinal... 92
6.2.1.2 Concentração de íons cloreto no fluido intestinal ... 95 6.2.2 Parâmetros inflamatórios:... 97 6.2.2.1 Avaliação do peso úmido da alça jejunal...97 6.2.2.2 Atividade de mieloperoxidase do jejuno... 99 6.3 Curva concentração vs. resposta após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas... 101 6.3.1 Aspectos secretórios: ... 101 6.3.1.1 Macroscopia da alça jejunal... 101 6.3.1.2 Volume do conteúdo intestinal... 102 6.3.1.3 Concentração de cloreto no fluido intestinal... 103 6.3.2 Aspectos inflamatórios: ... 105 6.3.2.1 Peso úmido da alça jejunal... 105 6.3.2.2 Atividade de mieloperoxidase do jejuno... 105 6.4 Padronização do modelo de inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV- 2 em alças jejunais isoladas... 107 6.4.1 Histopatologia do jejuno após a sensibilização com a espícula... 108 6.4.2 Morfometria do jejuno após a sensibilização com a espícula... 110 6.4.3 Análise Histopatológica das células de Paneth no jejuno...111 6.4.4 Análise Histopatológica das células caliciformes no jejuno...113 6.4.5 Efeito da expressão da tight junction ocludina após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas... 115 6.4.6 Avaliação da resistência elétrica transepitelial basal após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas...116 6.4.7 Avaliação da resposta contrátil após a inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais isoladas... 117 7 DISCUSSÃO ...120 8 CONCLUSÃO...134 9 PERSPECTIVAS FUTURAS...138 10 REFERÊNCIAS...142 11 ANEXOS...161 ANEXO I - Termo de aprovação pelo comitê de ética e uso de animais (CEUA) ... 162
Introdução
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1. INTRODUÇÃO
A pandemia relacionada a Doença do Coronavírus 2019 (COVID-19), gerou grande preocupação na população mundial, a doença se espalhou de maneira catastrófica, gerando um imenso impacto global não apenas de ordem biomédica e epidemiológica, mas também de repercussões e impactos sociais, econômicos, políticos, culturais e históricos sem precedentes na história recente das epidemias (GALANOPOULOS et al., 2020).
A COVID-19 é desencadeada por um vírus respiratório altamente transmissível e patogênico, inicialmente nomeado novo coronavírus pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e posteriormente renomeado como Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus 2 (SARS-CoV-2) pelo comitê internacional de taxonomia de vírus com base na análise filogenética (ZHU et al, 2020).
SARS-CoV-2 é um vírus de Ácido Ribonucleico (RNA) de fita simples com polaridade positiva e sequenciamento de genoma com aproximadamente 29,9 kilobytes (LU et al., 2020). Possuindo envelope variando de 60 a 140nm de diâmetro, com projeções de espículas em sua superfície, sendo estruturado por um formato de coroa, explicando de tal modo, o seu nome “coronavírus”. As glicoproteínas S dos coronavírus SARS-CoV-2 (espículas) são glicoproteínas de fusão viral de classe I, onde desempenha função crucial, pois são capazes de reconhecerem e se ligarem a receptores da Enzima Conversora de Angiotensina 2 (ECA2) e promoverem fusão das membranas celulares e virais, juntamente com a ação de enzimas proteolíticas responsáveis por auxiliarem a internalização viral, incluindo a Desintegrina e Metaloprotease 17 (ADAM17) e Serina Protease Transmembranar 2 (TMPRSS2) (HEURICH et al., 2014).
Uma das principais formas de transmissão do vírus ocorre diretamente pelo ar, por meio de gotículas respiratórias expelidas por um indivíduo infectado ao falar, tossir ou espirrar e potencialmente via material aerolisado, sendo assim, definida como transmissão humano-humano (KUMAR; KHODOR, 2020). Outros estudos relatam que a transmissão pode ocorrer também de forma indireta, através do contato com objetos contaminados e posteriormente levando a mão a boca, olhos ou nariz, definida como transmissão de fômite (ONAKPOYA et al., 2021).
O diagnóstico é dado pela busca do RNA viral nas secreções respiratórias por
testes moleculares especiais. Os achados laboratoriais comuns incluem contagens normais ou baixas de glóbulos brancos com proteína C reativa elevada. O tratamento é essencialmente de suporte, o papel dos agentes antivirais ainda não foi estabelecido. A prevenção envolve a recomendação do isolamento social de casos suspeitos e aqueles com doenças leves e medidas rigorosas de controle de infecções em hospitais, que incluem precauções de contato e gotículas (SINGHAL, 2020;
ADHIKARI et al., 2020).
Embora a COVID-19 seja uma doença de expressivo dano pulmonar, indicando que o vírus infecta preferencialmente as células epiteliais respiratórias, sendo este, o majoritário relato em pacientes que desenvolvem a forma mais severa, de modo que pode evoluir para pneumonia, Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA), a COVID-19 pode levar à disfunção de múltiplos órgãos. Muitas pessoas são assintomáticas, mas estima-se que a taxa de mortalidade de casos tenha uma variação de 2 a 3%, os idosos e pessoas com condições médicas pré-existentes (como doenças metabólicas e cardíacas) parecem ser mais vulneráveis a ficar gravemente doentes com o vírus (SINGHAL, 2020; ADHIKARI et al., 2020). Outros sítios que podem ser acometidos pelo SARS-CoV-2 incluem órgãos do sistema digestório, enquanto os pacientes geralmente apresentam febre e uma doença respiratória, outros pacientes também relatam sintomas gastrintestinais, como náuseas, vômito, dor abdominal e diarreia, apresentando-se como o sinal clínico mais prevalente (MEGYERI et al., 2021).
Os mecanismos envolvidos na patogênese dos sintomas gastrintestinais em pacientes com COVID-19 não estão completamente desvendados, os modelos animais para estudar a relação da espícula do SARS-CoV-2 e a mucosa intestinal são extremamente limitados. Assim, acreditamos que o modelo de inoculação da espícula do coronavírus SARS-CoV-2 em alças jejunais seria uma alternativa relevante para o estudo da patobiologia dessa virose no TGI. Dessa forma, compreender a fisiopatologia, mediante aspectos secretórios, inflamatórios, funcionais e contráteis envolvidos na patogênese da COVID-19 no intestino é de suma importância na busca de meios preventivos e terapêuticos dos pacientes acometidos.
REFERÊNCIAL TEÓRICO
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2. REFERÊNCIAL TEÓRICO 2. 1 COVID-19
A Covid-19 é uma infecção respiratória aguda grave, cujo microrganismo causal para doença é o coronavírus SARS-CoV-2. Em média, uma pessoa infectada pelo vírus da COVID-19 leva de 5 a 6 dias para desenvolver os sintomas (período de incubação), podendo ser totalmente assintomática, ou apresentar sintomas leves, graves ou críticos (WANG et al., 2020). A maioria dos pacientes apresentam sintomas leves, incluindo febre e tosse seca, porém, pacientes com quadros graves geralmente desenvolvem insuficiência respiratória aguda, falência múltipla de órgãos e lesão cardíaca aguda, enquanto os que progridem para quadros críticos podem evoluírem rapidamente para síndrome da insuficiência respiratória aguda, acidose metabólica, choque séptico, disfunção dos mecanismos de coagulação e falência funcional múltipla de órgãos
(
CHEN T. et al., 2020; HU et al., 2021; HUANG et al., 2020; WANG.et al., 2020; WU; MCGOOGAN, 2020). Idosos com comorbidades pré-existentes, incluindo diabetes, hipertensão, obesidade, tuberculose, entre outros, são mais propensas a evoluírem rapidamente para quadros graves e crítícos (CHEN et al., 2020).
Além da doença respiratória, a COVID-19 pode ser apresentada de maneira sistêmica (Figura 1), levando a lesões miocárdicas com complicações arrítmicas, lesões hepáticas, hipercoagulabilidade com complicações trombóticas, complicações neurológicas, como mialgia, dor de cabeça, tontura, consciência prejudicada, hemorragia intracraniana, hipogeusia e hiposmia, e até mesmo acidente vascular cerebral (BANSAL, 2020; BERGER, 2020; HAIMEI, 2020; HESS; ELDAHSHAN;
RUTKOWSKI, 2020; KOCHI et al., 2020; LEE; HUO; HUANG, 2020; PAYBAST et al., 2020; TREJO-GABRIEL-GALÁN, 2020). Também foram relatados sintomas gastrintestinais, incluindo náusea, vômito, dor abdominal e diarreia (GUPTA et al., 2020).
Figura 1 - Manifestações extrapulmonares da COVID-19.
Fonte: Adaptado de GUPTA et al., 2020.
A COVID-19 causada pela infecção com SARS-CoV-2 é capaz de desencadear manifestações pulmonares e extrapulmonares, promovendo efeitos deletérios em muitos outros sistemas de órgãos.
Alterações fisiológicas em pacientes infectados com SARS-CoV-2 compreendem alteração no metabolismo de carboidratos, apresentando quadro de hiperglicemia, elevação dos níveis de hemoglobina glicada e aumento da expressão de Lactato Desidrogenase (LDH). Alteração da atividade cardíaca, elevando os níveis de troponina cardíaca, provocando lesão e espessamento das cavidades cardíacas e fragmentação das placas ateroscleróticas. Alterações da atividade hepática, com aumentando da concentração sérica de Alanina Aminotransferase (ALT), Aspartato Aminotransferase (AST), bilirrubina e albumina. Alterações da atividade renal, elevando os níveis de creatinina sérica, ureia, proteinúria e hematúria (SILVA et. al., 2021).
O SARS-CoV-2 é capaz de desencadear alterações de mediadores
inflamatórios com altas taxas de citocinas como Interferon, mediadores da resposta imune inata à infecções virais, Interleucina 6 (IL-6), presente principalmente na resposta inflamatória aguda, bem como de quimiocinas pró-inflamatórias, recrutadores de células e moléculas do sistema imune para o sítio da inflamação e alterações dos níveis de ferritina, esse conjunto de alterações resulta na ativação de células endoteliais vasculares, disfunção dos microvasos locais, expressão da tromboplastina, também conhecida como fator tissular, envolvida no processo de coagulação, que culmina com a infiltração de neutrófilos e macrófagos nos tecidos, desenvolvendo hipóxia (insuficiência de oxigênio tecidual) e tempestade de citocinas (DIAS et. al., 2020; SILVA et. al., 2021).
Para o diagnóstico da COVID-19 pode ser realizado teste moleculares, RT-PCR que identifica a sequência do genoma viral de SARS-CoV-2 com 100% de especificidade e testes imunológicos que necessitam da presença de anticorpos formados pelo sistema imune do hospedeiro em resposta ao vírus: ELISA ou teste imunoenzimático que detecta anticorpos específicos para o vírus com 90% de especificidade e sensibilidade e o exame sorológico com o princípio de quimiluminescência para detecção das Imunoglobulinas G (IgG) e M (IgM), com sensibilidade de 91% para detecção do IgG e 68% para detecção do IgM (ALMEIDA et. al., 2021).
2.1.1. SARS-CoV-2
Coronavírus são vírus que apresentam os maiores genomas de RNA, cujo tamanho pode variar entre 27 a 32 kilobytes (SCHOEMAN e FIELDING, 2019). Já é bem elucidado na literatura que eles já foram capazes de infectar uma variedade de espécies aviárias e mamiferos, incluindo camundongos, ratos, morcegos, galinhas, perus, suínos, cães, gatos, coelhos, cavalos, bovinos e humanos e podem causar uma variedade de doenças graves, como gastroenterite e doenças do trato respiratório (DOMINGUEZ; ROBINSON; HOLMES, 2009; KIM et al., 2017; SCHOEMAN e FIELDING, 2019).
A subfamília dos coronavírus é dividida em quatro grupos: Alfacoronavírus (α- CoVs), Betacoronavírus (β-CoVs), Gammacoronavírus (γ-CoVs) e Deltacoronavírus (δ-CoVs) (CUI, LI, SHI, 2019; SCHOEMAN e FIELDING, 2019; WOO et al., 2009).
Atualmente existem sete tipos de coronavírus capazes de infectar seres humanos,
quatros deles causam sintomas leves de infecção respiratória, como resfriado comum (α-CoVs 229E e NL63; β-CoVs OC43 e HKU1) e os outros três desempenhas sinais e sintomas críticos com infecções respiratórias graves, devidos altas taxas de patogenicidade (MERS-CoV, SARS-CoV e SARS-CoV-2) (LIU; KUO; SHIH, 2020).
O SARS-CoV-2 está intimamente relacionado (88% de identidade) a dois coronavírus do tipo Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS) derivados de morcegos, coletados em 2018 em Zhoushan, leste da China, mas estavam mais distantes do SARS-CoV (~79% identidade) e MERS-CoV (~50% de identidade). Uma análise relativa do uso de códons sinônimos sugere que o SARS-CoV-2 é um recombinante entre o coronavírus de morcego e um coronavírus de origem desconhecida, e foi especulado que uma cobra poderia ter agido como reservatório (JI et al., 2020). A modelagem da homologia mostra que o SARS-CoV-2 possui uma estrutura de Domínio de Ligação ao Receptor (DLR) semelhante à do seu precursor SARS-CoV, apesar da variação de aminoácidos em alguns resíduos principais (LU et al., 2020).
O genoma viral de SARS-CoV-2 codifica dezesseis proteínas não estruturais (1- 16), responsáveis pela participação nos processos de transcrição, replicação e tradução do RNA, juntamente com a ação de proteínas estruturais, compreendendo a Proteína de Nucleocapsídeo (PN), a Proteína de Membrana (PM), a Proteína de Envelope (PE) e a proteína S (Espícula) necessárias para a montagem de novos virions (WANG et al., 2020). As proteínas estruturais (Figura 2) desempenham funções primordiais, a proteína N com formato helicoidal embala o genoma viral em ribonucleocapsídeo e interage com as outras proteínas estruturais durante a montagem dos virions levando à encapsulação do genoma (ARYA et al., 2020). A proteína M define a forma do envelope viral e é a proteína estrutural mais abundante, a proteína E promove a embalagem e reprodução viral, enquanto a espícula presente na superfície viral é o primeiro ponto de ancoragem do vírus para a célula hospedeira, dessa forma, o SARS-CoV-2 pode ser capaz de se ligar a receptores ECA2 em humanos pela interação com a glicoproteína da espícula viral (ARYA et al., 2020; LU et al., 2020).
Figura 2 - Estrutura do SARS-CoV-2.
Fonte: Adaptado de LI et al., 2020.
Proteínas estruturais do SARS-CoV-2: Proteína de Nucleocapsídeo (PN), Proteína de Membrana (PM), Proteína de Envelope (PE) e Proteína S (espícula).
2.1.2. Espícula do SARS-CoV-2
A glicoproteína da espícula (S, do inglês spike) do coronavírus é uma proteína de fusão viral classe I no envelope externo do vírion que desempenha um papel crítico na infecção viral, reconhecendo os receptores das células hospedeiras e mediando a fusão das membranas celulares e virais (LI, 2016). A espícula é sintetizada como uma proteína precursora que consiste em ~1.300 aminoácidos que é então clivada em uma Subunidade 1 (S1) amino terminal (~700 aminoácidos) e uma Subunidade 2 (S2) carboxila terminal (~600 aminoácidos). Três heterodímeros S1/S2 se reúnem para formar uma espícula trimérica saindo do envelope viral, S1 contém um DLR, enquanto a S2 contém um peptídeo de fusão hidrofóbico e duas regiões de repetição chamadas heptad repeated regions (BELOUZARD et al., 2012). Acionada pela ligação ao receptor ECA2, a espícula passa por uma transição de um estado de prefusão metaestável para um estado de pós-fusão estável durante a infecção, na qual a subunidade S1 de ligação ao receptor é clivada e a subunidade S2 de fusão sofre rearranjos conformacionais em larga escala para expor o peptídeo de fusão hidrofóbico, induzir a formação de um feixe de seis hélices e aproximar as membranas celulares e virais para fusão (BELOUZARD et al., 2012).
O DLR de SARS-CoV-2 apresenta dois domínios estruturais. Um subdomínio central de folha β antiparalela de cinco fitas (β1, β2, β3, β4 e β7) com hélices de conexão
curtas (β5 e β6, localizadas entre as fitas β4 e β7) e alças que formam o núcleo (α4 e α5), nesse contexto, a inserção estendida é justamente o Motivo de Ligação ao Receptor (MLR) que contém a maioria dos resíduos de contato do SARS-CoV-2 que se ligam ao ECA2 (Figura 3). Além desse subdomínio central, o DLR apresenta um subdomínio externo (β-hairpin) de duas fitas, com uma alça flexível estendida estabilizada por uma ligação dissulfeto, esse domínio utiliza seu subdomínio externo para reconhecer o domínio peptidase N-terminal de ECA2, semelhante ao relatado para SARS-CoV, β-hairpin forma um côncavo que embala a convexidade na superfície do domínio peptidade ECA2 (LAN et al., 2020; ZHANG et al., 2021).
Figura 3 - Estrutura geral do DLR de SARS-CoV-2 ligado ao receptor ECA2.
Fonte: Adaptado de LAN et al., 2020.
Estrutura geral do DLR do SARS-CoV-2 ligado a ECA2. ECA2 é mostrado em verde. O núcleo DLR do SARS-CoV-2 é mostrado em ciano e o MLR em vermelho. As ligações dissulfeto no DLR do SARS- CoV-2 são mostradas como bastões e indicadas por setas. A hélice N-terminal de ECA2 responsável pela ligação é marcada por um traço.
A nível atômico, cada domínio de ECA2 acomoda um único DLR com uma região de alça estendida do DLR compreendendo a hélice α 1 em forma de ponte do domínio da peptidase de ECA2. Existem três grupos de contatos entre o DLR de SARS-CoV-2 e a ECA2. No terminal N desta estrutura em forma de ponte, os resíduos Q498, T500 e N501 do DLR formam uma rede de ligações de hidrogênio com os resíduos de aminoácidos Y41, Q42, K353 e R357 do domínio ECA2. No terminal C de α em forma de ponte 1 hélice, DLR Q474 forma uma ligação de hidrogênio com a ECA2 Q24, com DLR F486 interagindo com o ECA2 M82 através de forças de van der Waals. Além disso, K417 e Y453 na proteína DLR interagem, respectivamente, com
D30 e H34 da proteína ECA2, como mostra a Figura 4 (YAN et al., 2020; ZHANG et al., 2021).
Figura 4 - Interfaces de ligações entre o DLR de SARS-CoV-2 e a peptidase ECA2.
Fonte: Adaptado de Yan et al., 2020.
Análise detalhada da interface entre o DLR de SARS-CoV-2 e ECA2. (A) Terminal N do DLR; (B) Terminal C do DLR; (C) Resíduos de aminoácidos K417 e Y453 na proteína DLR interagindo, respectivamente, com D30 e H34 da proteína ECA2. As interações polares são indicadas por linhas tracejadas vermelhas.
2. 2 Epidemiologia da COVID-19
Inicialmente a doença foi associada epidemiologicamente ao mercado de frutos do mar Huanan em Wuhan, na província de Hubei, na China (HUANG et al., 2020).
Pouco tempo depois foi determinada pela OMS como “pandemia” em 30 de janeiro de 2020 e posteriormente, em março do mesmo ano foi declarada como pandemia global, a partir de então, vem sendo mencionada como "a calamidade global mais crucial do século e o maior desafio que a humanidade enfrentou desde a segunda Guerra Mundial", a doença se tornou-se a quinta pandemia documentada desde a pandemia de gripe de 1918 (CHAKRABORTY; MAITY, 2020; OMS, 2020; LIU; KUO; SHIH, 2020).
Acredita-se que o SARS-CoV-2 seja uma repercussão de um coronavírus animal e, posteriormente, adaptou a capacidade de transmissão humano-humano (LIU; KUO; SHIH, 2020). É valido ressaltar que SARS-CoV-2 se espalha rapidamente e evolui continuamente na população humana, dessa forma, já foi capaz de infectar milhares de pessoas mundialmente (OMS, 2022). Assim, estima-se que até a presente data, em meados de novembro de 2022, existem mais de 629 milhões de casos confirmados no mundo (Figura 5), com mais de 6 milhões de mortes e 12 bilhões de
doses de vacina até o momento (OMS, 2022). Enquanto no Brasil de 3 de janeiro de 2020 às 16h42 (horário de Brasília) à 8 de novembro de 2022, foram confirmados mais de 34 milhões casos de COVID-19 com mais de 688 mil mortes, segundo a OMS. Até 12 de outubro de 2022, foram aplicadas mais de 487 milhões doses de vacina (OMS, 2022).
Figura 5 - Painel de casos confirmados da COVID-19 no mundo.
Fonte: OMS, 2022.
Globalmente, até às 16h42 (horário de Brasília) de 22 de agosto de 2022, foram notificados 593.269.262 casos de COVID-19, incluindo 6.446.547 mortes, reportados à OMS. Até 17 de agosto de 2022, foram administradas 12.409.086.286 doses de vacina.
2. 3 Mecanismo de infecção viral do SARS-CoV-2
O mecanismo de infecção viral do SARS-CoV-2 ocorre por meio de fusão direta do envelope viral com a membrana da célula hospedeira, ou através da fusão de membrana dentro do endossoma após a endocitose (ZHANG et al., 2021). O início da infecção é mediado através da interação do DLR da espícula presente na subunidade S1 de SARS-CoV-2 aos receptores ECA2 amplamente expressos nas superfícies das células do pulmão, intestino, fígado, coração, endotélio vascular, testículo e rim, enquanto S2 promove a fusão das membranas celulares e virais (Figura 6) (YAN et al., 2020; WAN et al., 2020). A ECA2 é uma proteína de membrana integral tipo I composta por 805 aminoácidos, a enzima migra para a superfície das células após a transcrição com seu peptídeo de sinal N-terminal e é ancorada por meio de um
Domínio Transmembranar (TM) C-terminal é formada por um domínio de peptidase N- terminal composto por dois lobos, após o contato de SARS-CoV-2 com a superfície das células hospedeiras, o DLR de SARS-CoV-2 liga as pontas de um dos lobos para iniciar a entrada viral (DONOGHUE et al., 2000; MARIAN, 2013; TIPNIS et al., 2000;
WANG et al., 2020).
Figura 6 - Mecanismo de entrada de SARS-CoV-2.
Fonte: Adaptado de Romah et al., 2020.
A de infeção viral de SARS-CoV-2 é iniciada pela ligação da espícula de SARS-CoV-2 ao receptor da célula hospedeira (ECA2), juntamente com a ação de enzimas proteolíticas TMPRSS2, responsável pela ativação da espícula por quebra proteolítica. A espícula é composta pelas subunidades S1 (responsável pela ligação a ECA2) e S2 (promove a fusão das membranas celulares e virais), apresenta um Domínio Transmembranar (TM) e a cauda intracelular (CI).
Após a ligação do DLR da espícula viral nos receptores de ECA2 e internalização do vírus, ocorre uma downregulation destes receptores tanto na internalização do vírus que carrega consigo uma vesícula contendo ECA2 internalizada como também estes receptores são catalisados por enzimas proteolíticas transmembranares como ADAM17, furina, TMPRSS2 e catepsina B/L (HEURICH et al., 2014; HOFFMANN et al., 2020; LAMBERT et al., 2005; PALAU;
RIERA; SOLER, 2020). O processamento proteolítico ativa a espícula e permite a fusão da membrana viral-hospedeiro, seguida pela liberação do RNA viral no
citoplasma do hospedeiro e extrusão da porção extracelular da ECA2. No citoplasma, o RNA viral utiliza o hospedeiro e seu próprio maquinário para replicar seu material genético e montar novas partículas virais (HOFFMANN; KLEINE; POHLMANN, 2020).
Pela semelhança viral do SARS-CoV-2 diante do seu irmão mais velho SARS-CoV, as publicações mais recentes têm levado a compreensão de que a espícula do coronavírus SARS-CoV que consiste em três heterodímeros S1-S2 ligam-se ao receptor celular (ECA2) e medeia a fusão das membranas celulares e virais através de uma transição de conformação pré e pós-fusão, e que estes mecanismos também foram observados no SARS-CoV-2 (SONG et al., 2018; HOFFMANN et al., 2020).
Visivelmente, o SARS-CoV-2 demonstra um tropismo celular extremamente amplo, pois além de infectar células epiteliais alveolares do tipo II e células ciliadas nos pulmões, o vírus também pode infectar células cerebrais e células epiteliais intestinais, levando a inflamação cerebral e sintomas intestinais (KUMARI et al., 2021;
LAMERS et al., 2020; ZHENG et al., 2021).
2. 4 ECA2 e os sistemas renina/angiotensina e calicreína/cininas
Em condições fisiológicas a ECA2 tem um papel extremamente importante em dois grandes sistemas do organismo humano, Sistema Renina/Angiotensina (SRA) e Sistema Calicreína/Cinina (SCC) responsáveis por regularem funções essenciais (Figura 7): O SRA participa da manutenção da pressão arterial e do controle hidroeletrolítico, o sistema inicia com a liberação do angiotensinogênio pelo fígado convertido em Ang I pela renina produzida no rim, enquanto a Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) é responsável por clivar Angiotensina I (AngI) em Angiotensina II (AngII), ECA2 cliva AngII em Angiotensina 1-7 (Ang 1-7), AngII pode atuar em dois receptores de membrana com efeitos opostos (AT1 e AT2), sua ligação aos receptores AT1 promove ação pró-inflamatória, vasoconstricção e hipertensão e a ligação a receptores AT2, produz efeito anti-inflamatório e cardioprotetor, inibindo a vasoconstrição (PERLOT e PENNINGER, 2013). Ang 1-7 pode se ligar a receptores AT2 e a Receptores Mas (MasR), produzindo efeitos antiinflamatórios, cardioprotetores e hipotensores, gerando vasodilatação (PERLOT e PENNINGER, 2013). Resumindo o SRA induz vasoconstrição, hipertensão, inflamação, fibrose e proliferação por meio do eixo ECA / Ang II / Ang II do Receptor Tipo 1 (AT1R), e induz
efeitos antagônicos por meio do eixo ECA2 / Ang (1-7) / Mas. (SANTOS et al., 2018).
Enquanto no SCC responsável no processo de coagulação sanguínea, controle da pressão arterial, contração e relaxamento do músculo liso e respostas inflamatórias, a ECA2 tem um papel fundamental, pois atua na hidrolize de Des-Arg-Bradicinina-9 (DABK), um metabólito ativo de Bradicinina (BK) e agonista dos receptores de BK tipo 1 (BK1R), em um processo inflamatório esses receptores são regulados positivamente por mediadores inflamatórios (CAMPBELL, 2003).
Figura 7 - Papel do sistema renina/angiotensina e sistema calicreína/cinina na homeostase corporal.
Fonte: Adaptado de NICOLAU; MAGALHÃES; VALE, 2020.
1) A renina cliva o angiotensinogênio produzindo AngI, que é rapidamente convertida em AngII pela ECA. A AngII liga-se a dois receptores de membrana (AT1 e AT2) com efeitos antagônicos na homeostase. A ativação de AT1 promove pró-inflamatório e aumento da pressão arterial e a ativação de AT2 produz efeitos cardioprotetores e anti-inflamatórios. AT2 também é alvo da Ang1-7, produto da atividade enzimática da ECA2 sobre a AngII, que por sua vez diminui a concentração de AngII. MasR, outro sítio de ligação da Ang 1-7, produz efeitos anti-inflamatórios, cardioprotetores e hipotensores. (2) A ligação entre as duas vias ocorre através das ECAs que também possuem atividades catabólicas sobre a BK e seu análogo, DABK. BK e DABK são produtos de KKS. Através da calicreína, o cininogênio é clivado gerando BK que é metabolizado a DABK pela cininase I. O receptor BKB1R (ativado por DABK), em condições fisiológicas, tem atividade basal (constitutiva) e promove vasodilatação, mas é suprarregulado em condições inflamatórias, com importante efeitos neste cenário. BKB2R (ativado por BK) é constitutivo e participa da homeostase de órgãos como coração e rim.
Pouco tempo depois após o início da COVID-19, nosso grupo de pesquisa
hipotetizavam alguns mecanismos envolvidos diante do cenário pandêmico da COVID-19 (Figura 8), uma de nossas hipóteses estava diretamente relacionado a downregulation de ECA2, impedindo a degradação de AngII em Ang1-7 e a hidrólise de DABK, consequentemente o acúmulo de AngII e DABK, com ativação de AT1R e BK1R, levaria a repercussões pro-inflamatórias, resultando em um ciclo vicioso de feedback positivo e como consequência final a famosa “tempestade de citocinas”
(NICOLAU; MAGALHÃES; VALE, 2020). Logo após, Garvin e colaboradores (2020) estudaram genes de células através de lavado broncoalveolar de pacientes com COVID-19, os autores observaram desequilíbrio nos SRRA e KKS, downregulation de ECA2 e demostraram que além da famosa “tempestade de citocinas” a “tempestade de BK” era notória.
Figura 8 - Papel hipotético do sistema renina/angiotensina e do sistema calicreína/cinina na patogênese da COVID-19.
Fonte: Adaptado de NICOLAU; MAGALHÃES; VALE, 2020.
(1) SARS-CoV-2 por meio das espículas se liga a ECA2, mecanismo pelo qual ele entra na célula-alvo.
Essa ação promove uma downregulation de ECA2 por sequestro e internalização, bem como por clivagem de seu domínio extracelular. A sobrerregulação da ECA2 causa desequilíbrio do SRA, acúmulo de AngII e diminuição da Ang1-7, o que desloca a ligação da AngII em direção ao AT1, levando a mecanismos pró-inflamatórios e de lesão cardiovascular. (2) A regulação negativa de ECA2 causa desequilíbrio do acúmulo de KKS, DABK e ativação de BKB1R levando a repercussões pró- inflamatórias. A invasão de SARS-CoV-2 na célula-alvo também depende de uma protease de
membrana TMPRSS2, necessária para a clivagem da espícula. O TMPRSS2 ativo adicionalmente cliva o cininogênio, ativando a produção de BK. O próprio vírus também expressa uma cisteína protease que pode ativar a via da cinina pela interação com o cininogênio. BK via BKB2R também contribui para a via pró-inflamatória ativando a síntese de Óxido Nítrico (NO) e Prostaglandinas (PGs). (3) BKB1R é fortemente regulado positivamente por mediadores inflamatórios (principalmente citocinas), aumentando a permeabilidade endotelial e migração de leucócitos. Um ciclo de feedback positivo entre BKB1R e citocinas gera tempestade de citocinas, que por sua vez, levam o corpo a um cenário semelhante à sepse. (4) A calicreína (de SCC), adicionalmente, causa desequilíbrio do sistema de coagulação pela ativação do fator 12 e da plasmina. Os dois mecanismos contribuem para a formação de microtrombos intravasculares, observados principalmente no tecido pulmonar. A presença de plasmina aumenta a clivagem das espículas, o que aumenta a virulência do SARS-CoV-2.
2. 5 Trato gastrintestinal
O Trato Gastrintestinal (TGI) é um sistema do organismo humano responsável por funções de extrema importância, logo, participa dos processos de digestão, absorção, transporte e excreção. É composto principalmente por boca, faringe, esôfago, estômago, intestino delgado, intestino grosso, reto e ânus, o ducto biliar e pancreático se apresentam como principais ramos laterais do TGI (CHENG et al., 2010). Esses órgãos denotam variações estruturais e funcionais distintas, melhor dizendo, a cavidade oral representa o primeiro segmento do tubo digestivo, seguido da faringe responsável por receber e fazer a passagem do ar inalado e dos alimentos ingeridos. Posteriormente, localiza-se o esôfago, no qual se dedica ao transporte da comida ingerida até o estômago, local onde ocorre o início do processo de digestão (LIAO; ZHAO; GREGERSEN, 2009).
Dando continuidade ao processo digestivo, começando no piloro do estômago e terminando na válvula ileocecal, encontra-se o intestino delgado, um órgão tubular de 6 a 7 metros de comprimento que subdivide em três regiões: Duodeno, possuindo cerca de 25 a 30 cm, jejuno com aproximadamente 2,5 m e o íleo dispondo de 2 à 4 m de comprimento. A digestão (quebra mecânica e química de substâncias/nutrientes) e absorção de nutrientes, incluindo carboidratos, proteínas, gorduras, água e vitaminas lipossolúveis, minerais e micronutrientes, são funções primordiais do intestino delgado (VOLK e LACY, 2017).
O intestino delgado é dividido em três segmentos: duodeno, jejuno e íleo. É o local final da digestão dos alimentos, absorção de nutrientes, secreção endócrina e
exócrina e barreira imunológica. O epitélio intestinal dispõe de criptas e vilos, esses arranjos aumentam coletivamente a área da superfície para absorção máxima de nutrientes (BOWCUTT et al., 2014). Em relação a arquitetura tecidual, a parede do intestino delgado é composta por quatro camadas, mucosa, submucosa, muscular e serosa (LIAO; ZHAO; GREGERSEN, 2009). No epitélio intestinal existe uma monocamada celular que contem células M, células caliciformes, células de Paneth, células epiteliais colunares, as quais tem papel fundamental na manutenção da homeostase local. Essa monocamada celular forma uma barreira conectada com sofisticadas junções celulares, as famosas Tight Junctions (TJs), como a junção de oclusão, claudina-1, ocludina e zônula de oclusão 1 e desmossomos criando uma barreira selada, porém, dinâmica (NIEVES; LANGKAMP-HENKEN, 2002). Os enterócitos (células absortivas), linfócitos intraepiteliais (LIE), as células enteroendócrinas, as células de Paneth e as células caliciformes também participam dessa composição (Figura 9).
Os enterócitos têm como principal função absorver, por meio de transporte ativo, as moléculas nutrientes produzidas durante a digestão. Já as células caliciformes, estão distribuídas entre os enterócitos e produzem mucinas neutras e ácidas, subdivididas em sulfatadas (sulfomucinas) e a não sulfatadas (sialomucinas), responsáveis por originarem o muco, que lubrifica o epitélio e o auxilia na proteção e no transito intestinal (MOAL; SERVIN, 2006; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013)).
Os LIE são em geral linfócitos T que captam informações antigênicas e modulam o crescimento epitelial, exercendo papel importante na tolerância imunológica (ELIA;
SOUZA, 2001). As células de Paneth estão localizadas no fundo das criptas e produzem peptídeos antimicrobianos que regulam a microbiota intestinal, bem como os fatores de crescimento envolvidos na manutenção de células tronco, em humanos as células de Paneth são constituintes normais do intestino delgado, apêndice e ceco, porém, em camundongos são mais abundantes no jejuno e não são detectadas no intestino grosso (NISHIYAMA; SUGIYAMA; MUKAI, 2016). As células enteroendócrinas representam cerca de 1% de todas as células epiteliais e produzem hormônios, os quais regulam diversas funções do epitélio intestinal (GERBE;
LEGRAVEREND; JAY, 2012).
Por fim, instituindo a porção final do TGI, situa-se o intestino grosso com aproximadamente 1,5 m de comprimento, subdividindo-se em 4 porções, abrangendo
