CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE Staphylococcus aureus E Salmonella sp. ISOLADAS DE LINGUIÇA ARTESANAL

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO PRO-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL

MARIA GABRIELA ALVES COSTA

CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE Staphylococcus aureus E Salmonella sp. ISOLADAS DE LINGUIÇA ARTESANAL

MOSSORÓ/RN

2020

MARIA GABRIELA ALVES COSTA

CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE Staphylococcus aureus E Salmonella sp. ISOLADAS DE LINGUIÇA ARTESANAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção Animal da Universidade Federal Rural do Semi- Árido como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestre em Produção Animal.

Linha de Pesquisa: Tecnologia de Produtos de Origem Animal

Orientador: Prof. Dr. Jean Berg Alves da Silva

MOSSORÓ/RN

2020

© Todos os direitos estão reservados a Universidade Federal Rural do Semi-Árido. O conteúdo desta obra é de inteira responsabilidade do (a) autor (a), sendo o mesmo, passível de sanções administrativas ou penais, caso sejam infringidas as leis que regulamentam a Propriedade Intelectual, respectivamente, Patentes: Lei n° 9.279/1996 e Direitos Autorais: Lei n° 9.610/1998. O conteúdo desta obra tomar-se-á de domínio público após a data de defesa e

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Graduação e Programas de Pós-Graduação da Universidade.

MARIA GABRIELA ALVES COSTA

CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE Staphylococcus aureus E Salmonella sp. ISOLADAS DE LINGUIÇA ARTESANAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção Animal da Universidade Federal Rural do Semi- Árido como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestre em Produção Animal.

Linha de Pesquisa: Tecnologia de Produtos de Origem Animal

Defendida em: 18 / 02 / 2020.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________

Profa. Dra. Maria Rociene Abrantes (CISNE) Membro Examinador

_______________________________________

Profa. Dra. Nathalia Cristina Cirone Silva (UNICAMP)

Membro Examinador Externo

DEDICATORIA

Aos meus avós maternos, Maria Ivete Alves e Gilberto Alves Maia que ajudaram junto com meus pais na minha educação e que se fizeram presentes em vários momentos da minha vida, como ainda fazem no meu coração. Por me mostrarem que sempre devemos fazer aquilo que gostamos independentemente do valor e das consequências.

In memoriam

Melhor do que ser feliz, é viver

Vinicius de Moraes

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter me dado o dom da vida e a oportunidade de poder realizar esse sonho sempre me guiando e abençoando nessa caminhada.

Agradeço ao meu Orientador, Jean Berg Alves da Silva, pela confiança que depositou em mim desde o período de graduação quando me aceitou para ser estagiaria no laboratório e me fez seguir até o mestrado. Pela paciência, generosidade e companheirismo de ter me conduzido até o hoje. Por sempre está disponível a me ajudar mesmo na correria da vida, ter você como orientador foi essencial. Muito obrigada.

A Banca Examinadora, Maria Rociene Abrantes por ser essa mulher tão extraordinária que faz o que for preciso para ajudar, que é uma inspiração para mim, sempre me fazendo rir com seu jeito de ser e pensar de forma diferente. A Nathália Cristina Cirone Silva por ter me ajudado a guiar meu trabalho e me acolhido em seu laboratório tão bem, por ter sido compreensiva com o tempo e pela ajuda na execução do meu trabalho.

Aos meus queridos pais, Maria Auxiliadora Alves Costa e Francisco Firmino da Costa Filho, por serem minha base, pelo esforço, dedicação e carinho durante meu crescimento pessoal e profissional. Por terem me amado e me dado suporte nas conquistas e perdas da minha vida, principalmente na criação diária do Bernardo, amo vocês! Não sei o que seria de mim sem os puxões de orelha, as conversas e risadas com vocês.

Agradeço também ao meu irmão, Marcos Vinicius Alves Costa e Gracy Martins, pelo nosso crescimento junto com tantas diferenças, mas ao mesmo tempo semelhanças, carinho e amor um pelo outro, pelos dias que me fizeram companhia, por tudo que representam para mim. Amo vocês.

Agradeço a meu esposo, Roosevelt de Araújo Sales Júnior, que fez de tudo para me ver animada, me mostrou que não podemos desistir dos meus compromissos e tarefas, pelo acompanhamento durante as noites de estudo e de experimento no laboratório, por sempre se fazer presente, por me amar e aguentar noite e dia, por ser fundamental em todos os dias da minha vida me levando a acreditar que sou capaz de fazer o que for preciso. Obrigada por não desistir de mim e pelo cuidado que sempre demonstra, te amo.

Ao meu filho, Bernardo Alves de Araújo Sales por ser tão maravilhoso comigo.

Ele faz uma diferença na minha vida, me transformou em uma nova pessoa mudando

minha forma de pensar, agir, sentir e principalmente amar. Ele sempre poderá contar

comigo assim como se faz presente em todos os momentos junto a mim. Eu te amo filho!

Agradeço, a minha família toda, todos tios, tias e primos que estão todos os finais de semana no churrasco de casa, por estarem em cada natal, ano novo, aniversário juntos e reunidos. Por serem o significado de família e os melhores exemplos de união na minha vida.

Agradeço a Ayala Oliveira do Vale Souza pela amizade e cumplicidade durante esses dois anos juntas nessa batalha diária. Uma amizade que vou levar pelo resto da minha vida, foram muitos momentos de conversa, risada, choro e desespero. Por essa eu não esperava dentro do LIPOA. Obrigada por tudo, por ser tão extraordinária e fazer parte da minha vida.

Agradeço a Anderson Clayton da Silva, aluno da UNICAMP que me ajudou na execução do meu trabalho com tanta paciência e carinho. Um grande cientista que eu tive o prazer de conhecer e fazer amizade para a vida. Obrigada por ser tão extrovertido, parceiro mesmo com a distância e carinhoso por me fazer rir das situações ou ver a vida de um outro jeito.

Agradecer ao LIPOA pelo acolhimento durante esse tempo com muito carinho, conversas, confraternizações e em especial agradecer a Carolina, técnica do laboratório, por ter sido essencial em todo o meu processo profissional e pessoal, pelas risadas, pelas conversas de mãe, pelo dia a dia, pelas ajudas quando não estava presente ou vice-versa.

Obrigada e contem comigo!

Agradecer ao companheirismo de Carla Campelo, Jovilma Soares, Kewen

Santiago, Andrezza, Manuella. Vocês foram ótimos no meu amadurecimento durante

esses dois anos de mestrado por mais que passamos muito ou pouco tempo juntos já foi

maravilhoso por fazerem de alguma forma a diferença em minha vida.

RESUMO

Staphylococcus aureus e Salmonella sp. são bactérias envolvidas em surtos de doenças transmitidas por alimentos por causarem desde gastroenterites como infecções sistêmicas.

O objetivo do trabalho é identificar a presença de cepas de Staphylococcus aureus e Salmonella sp., bem como caracterizar esses microrganismos quanto aos seus genes de virulência e resistência em isolados de linguiça artesanal no estado do Rio Grande do Norte. Para o trabalho foram coletadas um total de 50 amostras de linguiça artesanal (30 da empresa A e 20 da empresa B) e realizado análise microbiológica para Staphylococcus spp. e Salmonella sp. Depois de realizado isolamento das cepas e provas bioquímicas, as amostras foram submetidas à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para identificação de espécies (Staphylococcus aureus e Salmonella sp.), presença de enterotoxinas, genes de resistência a antibióticos, genes de virulência, genes de resistência a sanitizantes e formação de biofilmes. Além disso, foi realizado antibiograma para as duas espécies. Para Staphylococcus aureus das 16 cepas que apresentaram coagulase positiva, 8 cepas foram positivas para o gene nuc. Dessas 8 cepas, 3 isolados apresentaram genes de enterotoxinas (sea, seg, sei), já para os genes de resistência apenas uma cepa apresentou o gene mecA.

Os genes regulatórios agr no presente estudo obteve 6 cepas com agrI e 2 cepas com o agrIII, as cepas de S.aures não apresentaram genes de resistência a sanitizantes e apresentaram os genes icaA e icaD para formação de biofilme. No antibiograma 88% dos isolados de S.aureus apresentaram resistência a oxacilina. Para Salmonella sp., das 75 cepas analisadas, 49 apresentaram sorologia e coloração positiva para a espécie. Destas, 34 isolados obtiveram o gene invA. As 34 foram submetidas a presença de genes de virulência, como: ssaR, sipB, sipA, sifA, sopB, sipD, sopD. As cepas de Salmonella isoladas apresentaram, pelo menos, dois genes de virulência dos testados no estudo. Essas cepas eram provenientes da mistura antes de embutir e da linguiça pronta. Para o antibiograma, 35% das cepas de Salmonella apresentaram resistência a tetraciclina.

Conclui-se que há necessidade de mais atenção para segurança de alimentos, visto que foi constatado uma grande quantidade de microrganismos patogênicos e de genes de virulência e resistência dos mesmos, bem como medidas nas empresas e no Estado para realizar adequações que garantam um produto com boa qualidade ao consumidor.

Palavras-chaves: Doenças transmitidas por alimentos; Staphylococcus aureus;

Salmonella sp; Genótipo; Linguiça artesanal.

ABSTRACT

Staphylococcus aureus and Salmonella sp. are bacteria involved in outbreaks of foodborne diseases since they cause gastroenteritis as systemic infections. The objective of the work is to identify the presence of strains of Staphylococcus aureus and Salmonella sp., as well as to characterize these microorganisms in terms of their virulence and resistance genes in artisanal sausage isolates in the state of Rio Grande do Norte. For the work, a total of 50 samples of artisanal sausage were collected (30 from company A and 20 from company B) and a microbiological analysis for S.aureus and Salmonella sp. After performing biochemical tests and isolating the strains, the samples were subjected to Polymerase Chain Reaction (PCR) to identify species (Staphylococcus aureus and Salmonella sp.), presence of enterotoxins, antibiotic resistance genes, virulence genes , sanitizing resistance genes, biofilm formation. In addition, an antibiogram was performed for both species. For Staphylococcus aureus of the 16 strains that presented positive coagulase, 8 strains were positive for the nuc gene. Of these 8 strains, 3 isolates had enterotoxin genes (sea, sec, sei), whereas for resistance genes only one strain had the mecA gene. The regulatory genes agr in the present study obtained 6 strains with agrI and 2 strains with agrIII, the strains of S.aures did not show genes for resistance to sanitizers and presented the icaA and icaD genes for biofilm formation. In the antibiogram, 88% of S.aureus isolates showed resistance to oxacillin. For Salmonella sp, of the 75 strains analyzed, 49 showed serology and positive color for the species. Of these, 34 isolates obtained the invA gene. The 34 were submitted to virulence genes, such as: ssaR, sipB, sipA, sifA, sopB, sipD, sopD. The isolated Salmonella strains had at least two virulence genes from those tested in the study. These strains came from the mixture before filling and the sausage was ready. For the antibiogram, 35% of Salmonella strains showed resistance to tetracycline. It is concluded that there is a need for more attention to food safety, since a large number of pathogenic microorganisms and virulence and resistance genes were found, as well as measures in companies and in the State to carry out adjustments that guarantee a product with good quality to the consumer.

Keywords: Foodborne diseases; Staphylococcus aureus; Salmonella sp; Genotype;

Artisanal sausage.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Coloração de Gram de cepas Gram-positivas... 23

Figura 2. Coloração de gram com cepas Gram-negativas ...24

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Perfil de resistência a antimicrobianos em cepas de Staphylococcus aureus obtidos no processamento de linguiça artesanal...42 Gráfico 2. Perfil de resistência de cepas de Salmonella sp isoladas de linguiça artesanal.

...47

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Genes pesquisados e seus respectivos primers, pares de base, anelamento e controle positivo... 27 Tabela 2. Primers e suas propriedades, utilizados na PCR para detecção dos genes de virulência em Salmonella sp...32 Tabela 3. Isolados e os seus genes de tipagem por agr, resistência a sanitizantes e formadores de biofilme. ... 36 Tabela 4. Identificação de espécies pelo sequenciamento do gene sodA...40 Tabela 5. Perfil genotípico de cepas de Salmonella sp isoladas de linguiça artesanal ....41

Tabela 6. Perfil genotípico de cepas de Salmonella sp isoladas de linguiça artesanal...44

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BHI: Brain Heart Infusion broth DNA: Ácido desoxirribonucleico

DTA’s: Doenças transmitidas por alimentos

g: Gramas

h: Horas

LIA: Agar Lisina Ferro

LIPOA: Laboratório de Inspeção em Produtos de Origem Animal MAPA: Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

ml: Mililitro

PCR: Proteína C-Reativa pH: Potencial hidrogeniônico

RN: Rio Grande do Norte

rpm: Rotações por minuto S aureus: Staphylococcus aureus

sp: Classificação de gênero

TSI: Triple Sugar Iron Agar

UFERSA: Universidade Federal Rural do Semiárido

UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas

XLD: Ágar de desoxicolato-lisina-xilose

LISTA DE SIMBOLOS

%: Porcentagem

°C: Graus Celsius

µg: Microgramas

µl: Microlitro

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...18

2. OBJETIVOS ...20

2.1 Objetivo geral ...20

2.2 Objetivos específicos ...20

3. REFERENCIAL TEÓRICO ...21

3.1 Linguiça ...21

3.2 Características morfológicas de Staphylococcus aureus ...22

3.3 Fatores de Virulência do Staphylococcus aureus...23

3.4 Características morfológicas de Salmonella ...24

3.5 Patogenicidade e genes de virulência de Salmonella ...24

4. MATERIAL E METÓDOS ...27

4.1 Coleta das amostras...27

4.2 Análise microbiológica ...28

4.3 Pesquisa de Staphylococcus spp...29

4.4 Prova Catalase ...29

4.5 Prova Coagulase ...29

4.6 Pesquisa de Salmonella sp ...29

4.7 Caracterização molecular do Staphylococcus aureus ...30

4.8 Sequenciamento gene sodA...34

4.9 Caracterização molecular Salmonella sp ...34

4.10 Antibiograma Staphylococcus aureus e Salmonella sp...37

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 38

5.1 Caracterização bioquímica e molecular de Staphylococcus aureus ...38

5.2 Detecção de genes produtores de enterotoxinas, resistência a antibióticos e sanitizantes, formadores de biofilme e tipagem por agr ...39

5.3 Gene sodA...41

5.4 Antibiograma Staphylococcus aureus ...42

5.5 Caracterização molecular Salmonella sp ...44

5.6 Antibiograma Salmonella ...46

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...48

REFERÊNCIAS

18

1. INTRODUÇÃO

Doenças transmitidas por alimentos (DTA’s) são doenças causadas ao indivíduo pela ingestão de alimentos contaminados com microrganismos patogênicos ou por substâncias químicas. Estas doenças estão associadas a problemas de saúde pública no mundo inteiro e cada vez mais faz-se necessário alternativas para reduzi-las (FERRAZ et al., 2015).

As DTA’s causadas por microrganismos patogênicos estão diretamente associadas a qualidade higiênico sanitárias do processamento de alimentos de origem animal como, queijos e derivados, produtos cárneos, pescado, entre outros. Essa qualidade pode variar de acordo com a forma de manipulação dos alimentos e os critérios de boas práticas de fabricação (GEORGES, 2015).

O Staphylococcus aureus e a Salmonella são bactérias patogênicas que estão diretamente associadas a esses surtos pois, geralmente, são microrganismos transmitidos ao alimento pela manipulação inadequada. Quando em contato no hospedeiro essas bactérias podem causar desde a gastroenterites como infecções mais severas que podem levar a morte (PERLIN et al., 2015).

Georges et al. (2019), relatam que os surtos ocorridos entre 2000 e 2018 resultou em 12 mil casos de surtos e 200 mil pessoas doentes, casos esses que estão relacionados com a presença de um dos dois microrganismos. Ressaltam ainda que a presença de Salmonella sp. foi confirmada em 32% dos casos e S. aureus em 17% dos casos.

Esses microrganismos patogênicos estão sendo relatados em diversos estudos voltados para carnes e produtos cárneos, como os embutidos. Estudos realizados em linguiças por Viestel et al. (2000) mostram a presença de Staphylococcus aureus em 76,6% das amostras e ausência para Salmonella sp. Entretanto Rall et al. (2009) analisaram 75 linguiças de frango de diferentes estabelecimentos no estado de São Paulo e identificaram que 86,7% das linguiças estavam contaminadas com Salmonella sp.

A comercialização de carnes e embutidos (Salsicha, mortadela, linguiça e patês)

no Brasil vem ganhando destaque nos últimos anos pois tais produtos fazem parte da

alimentação de uma parcela de consumidores brasileiros. Dentre os embutidos o mercado

da linguiça é o que mais tem lucrado pois é um produto que apresenta baixo custo na sua

fabricação e não necessita de tecnologia de ponta (SANTOS et al., 2015).

19

Para a fabricação de uma linguiça o processo é simples, o primeiro passo é a matéria prima onde a carne utilizada deve ser livre de nervos, tecidos com hematomas, ossos e outros objetos estranhos. No segundo passo, a matéria prima passa pelo processo de moagem. Em seguida, passa pelo processo de condimentação onde será inserido temperos da formulação da linguiça. O quarto passo é o embutimento, onde a mistura deve ser embutida como uma massa compacta sem espaço de ar para evitar oxidação ou ranço. Depois é submetida ao envoltório e armarrio. O armarrio é o processo pelo qual as extremidades dos envoltórios e regiões de torção devem ser amarradas com fio de algodão. As formulações que passam por processo de defumação vêm logo em seguida, caso não seja necessário defumação as linguiças seguem para armazenamento e finalmente comercialização (FERREIRA et al., 2009).

A segurança alimentar dos consumidores é um desafio pois produtos cárneos e

embutidos cárneos, como a linguiça, passam por um processo intenso de manipulação em

cada etapa de sua produção, motivo esse que está diretamente ligado a qualidade e

segurança desses alimentos. Além disso o processo de fabricação da linguiça é simples e

não há necessidade de tecnologia sofisticada fazendo assim com que qualquer

estabelecimento possa produzir. Assim, o objetivo do trabalho é identificar a presença de

cepas de Staphylococcus aureus e Salmonella sp., bem como caracterizar esses

microrganismos quanto aos seus genes de virulência e resistência em isolados de linguiça

artesanal no estado do Rio Grande do Norte.

20

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Identificar e caracterizar bioquimicamente e molecularmente cepas de Staphylococcus aureus e Salmonella sp. isoladas de linguiça artesanal produzidas no Rio Grande do Norte

2.2 Objetivos Específicos

✓

Verificar presença de genes de enterotoxinas, resistência a antibióticos e sanitizantes, genes de formação de biofilme e genes de regulação nos isolados de Staphylococcus aureus;

✓

Avaliar a resistência de S. aureus e Salmonella sp. a antibióticos;

✓

Verificar presença de genes de virulência em isolados de Salmonella sp.;

21

3 REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 Linguiça

Segundo Instrução Normativa n°4, de 31 de Março de 2000, da Secretaria de Defesa Agropecuária do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), entende-se linguiça como produto cárneo industrializado obtido de carnes de animais ou açougue acrescentados ou não de tecido adiposo, ingredientes, embutidos em envoltório natural ou artificial e submetido ao processo tecnológico adequado.

A linguiça é um embutido cárneo que tem um valor cultural e gastronômico em muitos países, elas são consumidas por muitos anos no mundo inteiro. É considerada um alimento que contribui para conservação da carne e agrega valor a mesma. O sucesso na fabricação desse produto depende de cuidados com a matéria prima e condimentos utilizados, moagem da carne, mistura dos condimentos, escolha do envoltório, seu embutimento e armazenagem (ADAMI et al., 2015).

Os diferentes sabores da linguiça são resultados de modificações na quantidade de carne utilizada, tamanho de corte, condimentos utilizados, disco de moagem, presença ou ausência de secagem e defumação. Essas modificações são essenciais para garantir o sucesso do embutido cárneo e um dos principais motivos de ganhar todo esse valor cultural pois acaba atingindo a todos os tipos de consumidores (BOHRZ et al., 2013).

Atualmente vem sido discutido e apresentados produtos alimentícios artesanais, esse termo compreende como a transformação da matéria prima de forma manual, ou seja, com as próprias mãos sem utilização de equipamentos ou maquinas industriais. O processo envolve criatividade e habilidade e causa não só valor, mas também identidade cultural. Entretanto, é de onde surge toda uma problemática visto que linguiças são produtos que passam por severa manipulação e, em seguida, comercialização para consumo (COELHO; BARBOSA, 2015).

Para a obtenção de uma linguiça de qualidade é necessário escolher uma matéria-

prima adequada, manter a higiene pessoal do manipulador em dia e limpeza dos

equipamentos usados na fabricação. A carne utilizada deve ser oriunda de animais

saudáveis, abatidos em condições de higiene e com selo de certificação de inspeção de

produtos de origem animal (BEZERRA et al., 2012).

22

Manter essa qualidade é muito importante pois alimentos muito manipulados são mais susceptíveis a contaminação por microrganismos patogênicos e podem acabar causando doenças transmitidas por alimentos (DTA’s) aos consumidores. Dentre esses microrganismos, o Staphylococcus aureus e Salmonella sp. são bactérias que estão constantemente associadas a surtos de doenças transmitidas por alimentos (MORAIS et al., 2018).

O Brasil tem crescido e investido cada vez mais em produtos de origem animal, principalmente, em proteína animal. Segundo a EMBRAPA (2018), o Brasil, é o segundo

Atrelado a esse fator também estão os embutidos cárneos que tem se tornado cada vez

mais comum nos freezers dos supermercados e na mesa do consumidor.

Silva et al. (2018) relatam que a Salmonella, no estado de São Paulo, é a bactéria que apresenta mais casos notificados. Dentre eles, os produtos cárneos e a base de ovo são os que estão mais envolvidos aos surtos devido a presença de diversos nutrientes, baixa acidez e alta atividade de água. Correia et al. (2014) realizaram estudos em linguiças tipo frescal, observaram uma contaminação pelo Staphylococcus aureus nas amostras e explicaram que esse fato ocorre pela não execução das boas práticas de manipulação de alimentos.

3.2 Características morfológicas de Staphylococcus aureus

O Staphylococcus spp. é uma bactéria arranjada em cachos e/ou isolada, imóveis, Gram-positiva, mesófilas, catalase positiva, não formadora de esporos e coagualse positiva. É um dos agentes mais comuns em surtos de intoxicação alimentar pois esta é decorrente da ingestão de enterotoxinas presente no alimento que são formadas pela bactéria. Dentro desse grupo encontramos várias espécies de importância clinica pois estão associadas a causa de enfermidades aos seres humanos, porém o de maior destaque é o Staphylococcus aureus. Esse microrganismo tem habitat no meio ambiente e grande parte nos humanos de maneira comensal/benigna em mãos, mucosa e flora do nariz, além disso essa bactéria apresenta grande importância publica devido infectar animais e homens, sua contaminação pode ser de forma direta ou por fômites (TORTORA, 2012;

RUBAB et al., 2018; FEITOSA et al., 2017).

23

Figura 1. Coloração de Gram de cepas Gram-positivas. Fonte: Informação do autor

3.3 Fatores de Virulência do Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus apresenta capacidade de se adaptar em diferentes condições ambientais e atrelado a esse fato estão os fatores de virulência do microrganismo. O Staphylococcus aureus promove adesão aos componentes da matriz extracelular do hospedeiro, danificam suas células e protegem a bactéria do sistema imunológico (GUILLÉN FRETES et al., 2015).

Os fatores de virulência são componentes presentes na superfície da bactéria e que são capazes de reconhecer a matriz extracelular do hospedeiro como o fibrinogênio, fibronectina e colágeno. Essa adesão, importante passo para infecção, é mediada por proteínas presentes na parede celular da bactéria. As cepas de S. aureus secretam toxinas hemolíticas, nucleases, proteases, lipases, hialuronidase e colagenase, esse grupo de enzimas tem função de conversão dos tecidos dos hospedeiros em nutrientes necessários para o crescimento da bactéria no organismo infectado (CARFORA et al., 2015).

Acosta et al., (2017) descrevem outro mecanismo associado ao fator de virulência, que é a capacidade da bactéria de resistir a fagocitose. O mecanismo é mediante a expressão da proteína anti-opsônica, essa proteína está associada a superfície e a capsula de polissacarídeo que acaba interferindo na deposição de anticorpos e, consequentemente, na formação do complexo das vias clássicas, o que dificulta a degradação da bactéria e favorece a infecção do organismo pelo mesmo.

Alguns desses fatores são influenciados pela presença de genes regulatórios como

os agr (agrI, agrII, agrIII, agrIV). E estão ligados a genes de produção de enterotoxinas,

24

(sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej), bem como genes de resistência a antibióticos, mecA e mecC, resistência a sanitizantes, qacA/B e qacC, e os de formação de biolfilme bacteriano que ajudam o S. aureus na infecção e sobrevivência no organismo hospedeiro (CERVANTES-GARCIA et al., 2014).

3.4

A Salmonella, é uma bactéria gram negativa, da família Enterobacteriaceae, não formadora de esporos e anaeróbica facultativa. Seu habitat natural é o trato gastrointestinal dos seres humanos e de animais. Há relatos na literatura de que apresentam mutação genéticas pontuais, e, consequentemente, resistência à quinolonas.

O gênero inclui várias espécies e sorotipos patogênicos, o mais importante inclui Salmonella typhimurium pois é responsável por causar a febre tifóide (BERGAMO et al., 2018; MAKA et al., 2017).

Figura 2. (A) Coloração de gram com cepas Gram-negativas. Fonte: informações do autor.

3.5 Patogenicidade e genes de virulência de Salmonella

Patogenicidade é a capacidade de um microrganismo causa doença e a virulência

está associada a gravidade da mesma. A Salmonella é uma bactéria patogênica que pode

expressar genes capazes de codificar fatores de virulência e provocar assim uma doença

ao organismo contaminado. Essa bactéria pode causar desde uma infecção

gastrointestinal ou até uma infecção sistêmica mais severa, isso depende do estado

25

imunológico do hospedeiro, quantidade do inoculo e fatores de virulência (ANJOS et al., 2016).

A contaminação por Salmonella é principalmente via fecal-oral, entretanto também pode acontecer pela pele lesionada, pelo trato digestivo e trato respiratório. Após contaminação, a bactéria adere-se no intestino delgado, invadem a mucosa intestinal e pela destruição da camada epitelial por metabólitos bacterianos. Desse modo, o quadro do indivíduo é uma patologia gastroentérica, mas na existência de outros sorotipos os fagócitos podem transportar as cepas para órgãos como o baço e fígado facilitando ainda mais a sua disseminação e podendo levar o indivíduo a morte (FAI et al., 2011;

HERRERA; JABIB, 2015).

A Salmonella através de sua capacidade de modular seus genes de virulência consegue resistir aos mecanismos de defesa do hospedeiro, dentre eles temos pH estomacal, aumento de temperatura, alta osmolaridade, peristaltismo, lisoenzimas e microbiota local. Os fatores de virulência são importantes para o microrganismo pois é de onde eles conseguem se aderir a célula do hospedeiro, invadir, colonizar e multiplicar.

Os fatores são expressos por genes de virulência localizados em regiões cromossômicas da bactéria, chamadas ilhas de patogenicidade (OLIVEIRA et al., 2013).

Dentro das ilhas de patogenicidade temos SPI – 1, SPI – 2, SPI – 3, SPI – 4, SPI – 5, SPI – 6, SPI – 7, SPI – 8, SPI – 9, SPI – 10, SPI – 11, SPI – 12, SPI – 13, SPI – 14, SPI- 15, SPI- 16 e SPI – 17. A ilha SPI-1 é a responsável pelos genes necessários para invasão do microrganismo e contem produtos de expressão genica para o Sistema de Secreção do Tipo III (SSTIII). Esse sistema facilita a translocação de proteínas efetoras para o interior do citoplasma da célula hospedeira. Os genes relacionados a esse sistema são invA, sipA, sipB, entre outros. Seu mecanismo é comum nas bactérias com característica gram negativa e apresenta uma estrutura molecular de invasão que lembra uma agulha (WEE; HUGHES, 2015).

A ilha SPI – 2 é a responsável pela sobrevivência da Salmonella nos fagócitos e

de se replicar dentro de vesículas. Os genes envolvidos são envolvidos para proliferar em

tecido intestinal e causar infecções serias. Dentre os genes temos os operons ssaR,

responsável pela síntese de proteínas do sistema SISTIII, o operos ssr, que regula os sse,

ssa, ssc ativando ou reprimindo os genes para mudanças de osmolaridade e pH na célula

do hospedeiro (JENNINGS et al., 2017).

26

No SPI-3 estão os genes de sobrevivência do microrganismo no interior de macrófagos. O gene mgtB ganha destaque por realizar o transpore de magnésio quando este está em baixas concentrações o que é importante para adaptação no interior dos fagossomos (BATISTA et al., 2015).

Na ilha SPI – 4 temos genes que codificam proteínas para colonização intestinal como secreções de citotoxinas que tem capacidade de induzir a apoptose em macrófagos infectados. A ilha seguinte, SPI – 5, apresenta genes como o spoB e sopA que estão relacionados com ativação de canais de cloro na célula hospedeira e, consequentemente, perca do fluido resultando em diarreia. O SPI-6 apresenta o operon fimbrial e o SPI – 7 é capaz de codificar o antígeno capsular que são importantes para a internalização da bactéria (MANNING et al., 2015; CAO et al.,2014).

O SPI-8 está relacionado a produção de bacteriocinas, o SPI – 10 estão genes

responsáveis pela codificação da fímbria, que são flagelos proteicos presentes na

membrana da bactéria. A SPI-11 também tem funcionalidade para a sobrevivência do

microrganismo no interior do macrófago. SPI-12 contribui para a polimerização da actina

na célula hospedeira através de uma proteína codificada. O restante das ilhas ainda não

se tem funções descritas (ESPINOZA et al., 2017; HASSENA et al., 2015).

27

4 MATERIAL E METÓDOS

4.1 Coleta das amostras

Para o trabalho foram realizadas coletas em duas empresas produtoras de linguiça artesanal pertencentes a municípios distintos do estado do Rio Grande do Norte. As coletas das amostras na empresa A foram realizadas semanalmente entre os meses de março e maio de 2019 e as coletas referentes a empresa B foram com frequência quinzenal durante junho e julho de 2019. Foram coletadas para a pesquisa a matéria-prima utilizada no sabor da linguiça, massa com todos os ingredientes da linguiça e a linguiça.

Na tabela 1 temos os sabores das linguiças com suas respectivas matérias-primas para fabricação, o que contem em cada mistura nas massas das linguiças e de qual empresa elas são provenientes. Na empresa A foram coletadas um total de 30 amostras e na empresa B um total de 20 amostras.

Tabela 1. Perfil dos sabores das linguiças coletadas e a empresa proveniente

Sabor da Linguiça Matéria-prima Massa Empresa

Carne de sol Carne de sol Carne de sol com especiarias A Carne de sol com queijo de

coalho

Carne de sol /

Queijo de

coalho

Carne de sol com queijo de

coalho e especiarias A e B Nordestina Carne de sol /

Carne suína

Carne de sol com carne suína e especiarias

A

Carneiro Carne de

carneiro

Carne de carneiro com especiarias

A e B Carneiro com queijo de

coalho

Carne de

carneiro / Queijo de coalho

Carne de carneiro com queijo de

coalho e especiarias B

Suína com ervas Carne suína Carne suína com especiarias A Suína com queijo Carne suína /

Queijo de

coalho

Carne suína com queijo de

coalho e especiarias B

Frango Carne de frango Carne de frango com especiarias B

28

Frango com bacon Carne de frango/

Bacon

Carne de frango com bacon em cubos e especiarias

B Frango com queijo Carne de frango/

Queijo de

coalho

Carne de frango com queijo de

coalho e especiarias B

Todos os produtos provenientes da empresa A obtinham certificação de inspeção desde a matéria prima até o produto final. Na empresa B o produto final não apresenta certificação de inspeção, porém para as matérias-primas, com exceção da carne de sol e carne de carneiro utilizadas, todos os outros produtos obtinham certificação de inspeção.

As amostras coletadas (matéria-prima, mistura com todos os ingredientes da linguiça e linguiça final) eram armazenadas em saquinhos tipo ziplock, estéreis, acondicionadas em caixas térmicas com gelo reciclável e transportadas para o Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal - LIPOA, da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), para análise microbiológica.

O trabalho foi divido em dois experimentos: Experimento I: Contagem e caracterização bioquímica de Staphylococcus aureus e presença de Salmonella sp nas amostras de matéria prima, massa e linguiça produzida de forma artesanal; Experimento II: Caracterização genotípica e pesquisa de genes de virulência e perfil fenotípico de Staphylococcus aureus e Salmonella sp isolados da matéria prima, massa e linguiça produzida de forma artesanal.

Experimento I

As análises do experimento I foram realizadas no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal (LIPOA) localizado na Universidade Federal Rural do Semi- Árido (UFERSA) em Mossoró – RN.

4.2 Análise microbiológica

Para as análises microbiológicas, foram pesadas 25g de cada amostra de forma asséptica e transferidas para sacos plásticos estéreis, onde foram acrescentados 225 mL de água peptonada tamponada estéril para posterior homogeneização em “Stomacher”

durante 2 minutos, obtendo-se assim a diluição 10

, a partir da qual foram obtidas as

demais diluições decimais até 10

. Após a diluição, as amostras foram submetidas a

pesquisa de Staphylococcus coagulase positiva e presença de Salmonella sp. utilizando a

29

metodologia oficial brasileira para análises microbiológicas de alimentos (BRASIL, 2003).

4.3 Pesquisa de Staphylococcus spp.

Após realização das diluições até a diluição 10

, utilizou-se 0,1 mL das diluições 10

, 10

e 10

para a semeadura em superfície em placas de petri contendo ágar Baird- Parker acrescido de emulsão de gema de ovo e telurito a 5%, as quais foram incubadas a 37ºC, por 48 horas. Após incubação foi realizada isolamento das colônias que apresentaram coloração negra brilhante, contendo ou não halo, sendo isoladas até cinco colônias por placa. Posteriormente procedendo coloração de Gram, se confirmado colônia Gram positiva, e morfologia em cocos eram repicadas em tubos contendo BHI caldo (Brain Heart Infusion broth) para realização das provas bioquímicas (BRASIL, 2003).

4.4 Prova Catalase

Para verificar presença da enzima catalase, foi utilizada uma lâmina de vidro contendo uma gota de Peróxido de hidrogênio à 3% e uma alíquota da amostra incubada em BHI caldo. Em aproximadamente 60 segundos foi possível observar a formação ou não de borbulhas. Havendo produção de borbulhas, considera-se amostra catalase positiva (BRASIL, 2003).

4.5 Prova Coagulase

Retirou-se 0,1 mL da amostra em BHI caldo para tubos de ensaio contendo 0,2 mL 200 µl de plasma de coelho. O material foi incubado à 36°C em estufa por 24h para observar formação de coágulos. O resultado foi obtido a partir de uma escala que vai de

“reação negativa (1+, 2+) à reação positiva (3+ e 4+)” (BRASIL, 2003).

4.6 Pesquisa de Salmonella sp.

Na pesquisa de Samonella sp, a diluição 10

foi incubado em estufa bacteriológica

por 16 a 20 horas a 36±1°C. Este procedimento foi realizado para pré-enriquecer a

amostra. Em seguida, procedeu-se com a etapa de enriquecimento utilizando-se caldos

seletivos para Salmonella sp. Realizou-se a diluição de 0,1; 1 e 1 mL, respectivamente

em 10 mL de caldos Rappaport Vassiliadis, Tetrationato e Selenito cistina, com posterior

incubação em banho-maria a 41±0,5°C. Após 24 horas, semeou-se o conteúdo de cada

30

caldo, com auxílio de alça de platina, realizando-se estrias para obtenção de colônias isoladas em placas de Petri contendo os meios sólidos seletivos Rambach Ágar e Ágar Salmonella Shigella. As placas foram incubadas invertidas 36±1°C durante 24 horas.

Após o isolamento, a suspeita da presença Salmonella sp. foi investigada através das seguintes provas bioquímicas: reação em Agar TSI, presença de lisina descarboxilase e prova da urease (BRASIL, 2003)

Experimento II

As análises do experimento II foram realizadas em parceria com o Laboratório de Toxinas Bacterianas localizado na Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) em Campinas – SP. Os isolados de Staphylococcus coagulase positiva e Salmonella sp foram transportados congelados para o laboratório em eppendorf (2mL) contendo meio BHI ágar.

4.7 Caracterização molecular do Staphylococcus aureus

Para extração do DNA, os isolados positivos para o teste de coagulase foram nomeados de A1 até A20 e repicados em um tubo contendo caldo BHI e encubados a 36

± 1ºC durante 24 horas. Em seguida, por esgotamento foram estriados em placas de Petri contendo ágar BHI e encubados por 36 ± 1ºC durante 24 horas. Após o tempo de incubação foi adicionado uma colônia da placa em um microtubo contendo 1mL de água Miliq ultrapura estéril, seguindo de centrifugação, 12.000 rpm, durante 1 minuto. O sobrenadante foi descartado e o pellet submetido à metodologia de extração de DNA conforme recomendações do fabricante do kit comercial. Foi utilizado o Kit Comercial InstaGene™Matrix (Bio-Rad laboratório). Adicionou-se 200 µL do reagente de extração ao pelete, então aquecido à 56°C em banho-maria durante 30 minutos, posteriormente homogeneizado em vortex por 10 segundos, seguido de um novo aquecimento à 100°C por 8 minutos, homogeneizado em vortex ao término e centrifugado à 12.000 rpm durante três minutos. Obtido o DNA, o material foi armazenado à -20°C.

Para a confirmação de S. aureus através do gene nuc, bem como pesquisa de genes

de produção de enterotoxinas, resistência a antibióticos e sanitizantes, formadores de

biofilme e tipagem por agr tipyng foram realizadas em todas as cepas à amplificação do

gene nuc para identificar S. aureus. Em todas as cepas positivas para S. aureus foi

realizada a pesquisa de PCR dos genes responsáveis pela produção das seguintes

enterotoxinas clássicas: sea, seb, sec, sed, see, e não clássicas: seg, seh, sei, sej, os genes

31

de resistência a antibióticos: mecA e mecC, os genes de resistência a sanitizantes: qacA/B e qacC, os genes que codificam a formação de bifilme: bap, icaA e icaD. Além disso, também foi realizada tipagem por agr typing, onde foram investigados os quatro grupos agr (I, II, III, IV). Em todas as PCR foram incluídos controles positivo e negativo.

Para amplificação de todos os genes pesquisados foi realizada uma reação de 25 µL contendo: 5 µL de Buffer 5x (Promega), a 4 µL de MgCl

25mM (Promega), 0,5 µL de dNTP 10 mM (Invitrogen), 1 µL de cada par de primer Forward e Reverse (Invitrogen ou Sigma dependo do gene), 0,25 µL Taq Polymerase (Promega), 4 µL de DNA e o quanto for necessário de água Mili-Q ultra pura para completar a reação de 25 µL. Os primers utilizados se encontram na tabela 2.

As reações foram realizadas em termociclador nas seguintes condições:

Desnaturação inicial de 94-95ºC/2-5 minutos, ciclos de 30 a 33 (variavam de acordo com

o primer), desnaturação de 94-95ºC/30 1-2 minutos, temperatura de anelamento conforme

as referências citadas na tabela 1, extensão de 72ºC/1 minutos; extensão final de 72°C/5-

10 minutos.

32

Tabela 2. Genes pesquisados e seus respectivos primers, pares de base, anelamento e controle positivo.

Gene Oligonucleotídeos (5´3´) Tamanho (pb) Anelamento (ºC) Controle

positivo Referência

nuc F: TCGCTTGCTATGATTGTGG

359 56 ATCC 23235 (SASAKI et al., 2010)

R: GCCAATGTTCTACCATAGC

sea F:TTGGAAACGGTTAAAACGAA

120

53

ATCC13563

(JOHNSON et al., 1991) R:GAACCTTCCCATCAAAAACA

seb F:TCGCATCAAACTGACAAACG

478 ATCC14458

R:GCAGGTACTCTATAAGTGCC

sec F:GACATAAAAGCTAGGAATTT

257 ATCC19085

R:AAATCGGATTAACATTATCC

sed F:CTAGTTTGGTAATATCTCCT

317 ATCC23235

R:TAATGCTATATCTTATAGGG

see F:AGGTTTTTTCACAGGTCATCC

209 54 ATCC27664 (MEHROTRA et al., 2000)

R:CTTTTTTTTCTTCGGTCAATC

seg F:AAGTAGACATTTTTGGCGTTCC

287

53

ATCC23235

(OMOE et al., 2002) R:AGAACCATCAAACTCGTATAGC

seh F:GTCTATATGGAGGTACAACACT

213 FRI361

R:GACCTTTACTTATTTCGCTGTC

sei F:GGTGATATTGGTGTAGGTAAC

454 54

ATCC23235 R:ATCCATATTCTTTGCCTTTACCAG

sej F:CATCAGAACTGTTGTTCCGCTAG

142 64 (NASHEV et al., 2004)

R:CTGAATTTTACCATCAAAGGTAC

mecA F: GGGATCATAGCGTCATTATTC

527

57

N315 (CUNY et al., 2011) R: AACGATTGTGACACGATAGCC

mecC F: GCTCCTAATGCTAATGCA

304 1877a (GÓMEZ-SANZ et al.,

2010)

R: TAAGCAATAATGACTACC

33

Gene Oligonucleotídeos (5´3´) Tamanho (pb) Anelamento (ºC) Controle

positivo Referência qacA/B F: TCCTTTTAATGCTGGCTTATACC

220

59

1591a

(ZMANTAR et al., 2011) R: AGCCKTACCTGCTCCAACTA

qacC F: GGCTTTTCAAAATTTATACCATCCT

249 FRI361

R: ATGCGATGTTCCGAAAATGT

bap F: CCCTATATCGAAGGTGTAGAATTG

971 5008E (CUCARELLA et al., 2001)

R: GCTGTTGAAGTTAATACTGTACCTGC

icaA F: CCTAACTAACGAAAGGTAG

1315

49 N315 (VASUDEVAN et al.,

2003) R: AAGATATAGCGATAAGTGC

icaD F: AAACGTAAGAGAGGTGG

R: GGCAATATGATCAAGATAC 381

agrI F: GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT

440

52

COL

(SHOPSIN et al., 2003) R: ATGCACATGGTGCACATGC

agrII F:GTATTACTAATTGAAAAGTGCCATAGC

572 N315

R: ATGCACATGGTGCACATGC agrIII F: CTGTTGAAAAAGTCAACTAAAAGCTC

406 ATCC25923

R: ATGCACATGGTGCACATGC

agrIV F: CGATAATGCCGTAATACCCG

588 C02B04

R: ATGCACATGGTGCACATGC

34

Para visualização dos fragmentos de DNA foi preparado o gel de agarose 1,5%

com 5 mL de TBE 10x E 95 mL de água Mili-Q ultrapura estéril, 1,5 g de agarose, 3 µL de syber. Em cada pocinho formado, foram depositados 5 µL da reação de PCR, a partir disso submetidos a eletroforese por 60 minutos. Foi possível observar o resultado através do fotodocumentador.

4.8 Sequenciamento gene sodA

Nos isolados A4, A5, A6, A8, A9, A12, A13, A15 onde não foi detectado o gene nuc para a espécie Staphylococcus aureus realizou-se amplificação do gene sodA, posteriormente o produto de PCR foi purificado e enviado para o sequenciamento Sanger no Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) com intuito de identificar a espécie.

4.9 Caracterização molecular Salmonella sp.

Os isolados de Salmonella sp. foram nomeados de S1 até S49 e submetidos ao teste de sorotipagem, onde o soro que entra em contato com a cepa contem anticorpos complementares de soro grupos de Salmonella polivalente. As amostras que foram positivas na sorotipagem seguiram para a extração de DNA e identificação genética.

Para a extração de DNA, as cepas foram repicadas em um tubo contendo caldo BHI e encubadas a 36 ± 1ºC durante 24 horas, depois por esgotamento foram estriadas em placas de Petri contendo ágar BHI a 36 ± 1ºC durante 24 horas. Após esse período, isolou- se uma colônia de cada amostra, transferiu para um microtubo contendo 200 µL de água Miliq ultrapura estéril e aqueceu a 100°C durante 10 minutos em Banho-Maria. Em seguida foi resfriado em banho de gelo por 10 minutos e centrifugada a 13.000 rpm por 2 min. Obtido o DNA, o material foi armazenado à -20°C (HU et al., 1999).

Em todas as cepas foram realizadas à amplificação do gene invA para identificar Salmonella. Todas as cepas positivas para Salmonella foram submetidas a pesquisa de PCR dos genes responsáveis pela produção de genes de virulência: ssaR, sipB, sipA, sopB, sifA, spvB, sipD, sopD. Em todas as PCR foram incluídas o marcador molecular.

Para amplificação de todos os genes pesquisados foi realizada uma reação de 25 µL

contendo: 5 µL de Buffer 5x (Promega), a 4 µL de MgCl

25mM (Promega), 0,5 µL de

dNTP 10 mM (Invitrogen), 1 µL de cada par de primer Forward e Reverse (Invitrogen ou

Sigma dependo do gene), 0,25 µL Taq Polymerase (Promega), 4 µL de DNA e o quanto

for necessário de água Mili-Q ultra pura para completar a reação de 25 µL.

35

As reações foram realizadas em termociclador nas seguintes condições:

Desnaturação inicial de 94-95ºC/2-5 minutos, ciclos de 30 a 33 (variavam de acordo com

o primer), desnaturação de 94-95ºC/30 1-2 minutos, temperatura de anelamento conforme

as referências citadas na tabela 2, extensão de 72ºC/1 minutos; extensão final de 72°C/5-

10 minutos.

36

Tabela 3: Oligonucleotídeos e suas propriedades, utilizados na PCR para detecção dos genes de virulência em Salmonella sp.

Gene

Oligonucleotídeos (5' - 3') Tamanho (bp) Temperatura(°C) Referência

invA F TCATCGCACCGTCAAAGGAAC 284 60°C ARNOLD et al., 2004

invA R CACGATATTGATATTAGCCCG

sopB F CGGACCGGCCAGCAACAAAACAAGAAGAAG 220 66,5°C SKYBERG et al., 2006

sopB R TAGTGATGCCCGTTATGCGTGAGTGTATT

sopD F ACGACCATT TGCGGCG 1291 56,5 HUR et al., 2011

sopD R GAGACACGCTTCTTCG

sipA F CCAGGGGTCGTTAGTGTATTGCGTGAGATG 550 66,5°C SKYBERG et al., 2006

sipA R CGCGTAACAAAGAACCCGTAGTGATGGATT

sipB F GGACGCCGCCCGGGAAAAACTCTC 875 66,5°C SKYBERG et al., 2006

sipB R ACACTCCCGTCGCCGCCTTCACAA

sipD F ATGCTCCTTGCAGGAAGCTTTTG 1029 53°C SHAH et al., 2011

sipD R TTAATATTCAAAATTATTCCG

ssaR F GTTCGGATTCATTGCTTCGG 1628 50°C HUR et al., 2011

ssaR R TCTCCAGTGACTAACCCTAACCAA

sifA F TTTGCCGAACGCGCCCCCACACG 449 66,5°C SKYBERG et al., 2006

sifA R GTTGCCTTTTCTTGCGCTTTCCACCCATCT

spvB F CTATCAGCCCCGCACGGAGAGCAGTTTTTA 717 66,5°C SKYBERG et al., 2006

spvB R GGAGGAGGCGGTGGCGGTGGCATCATA

37

Para visualização dos fragmentos de DNA foi preparado o gel de agarose 1,5%

com 5 mL de TBE 10x E 95 mL de água Mili-Q ultrapura estéril, 1,5 g de agarose, 3 µL de syber. Em cada pocinho formado, foram depositados 5 µL da reação de PCR, a partir disso submetidos a eletroforese por 60 minutos. Foi possível observar o resultado através do fotodocumentador.

4.10. Antibiograma Staphylococcus aureus e Salmonella sp.

O teste de sensibilidade a antibióticos foi realizado pelo método de disco-difusão em ágar, e interpretados de acordo com a Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2018).

Os antibióticos testados para as cepas de Salmonella sp. foram Ácido Nalidicxico 30µg (NAL), Ampicilina 10µg (AMP), Ciprofloxacina 5µg (CIP), Cefotaxima 30µg (CTX), Clorafenicol 30µg (CLO), Tetraciclina 30µg (TET), Tobramicina 15µg (TOB) e Sulfametoxazol Trimetoprim 25µg (SUT).

Para as cepas de Staphylococcus aureus os antibióticos testados foram Cefoxitina 30µg (CFO), Clindamicina 2µg (CLD), Clorafenicol 30µg (CLO), Eritromicina 15 µg (ERI), Gentamicina 10 µg (GEN), Oxacilina 30 µg (OXA), Tetraciclina 30 µg (TET), Tobramicina 15 µg (TOB) e Sulfazotrim 1,25 µg (SUT).

Foi realizado reativação das estirpes através do repique das cepas do BHI ágar

para tubos contendo BHI caldo incubados a 36±1ºC durante 24 horas, em seguida foram

padronizados na escala 0,5 de McFarland a uma suspensão bacteriana com

aproximadamente 10

UFC/mL. Após padronização foram inoculados (superfície) em

placas contendo ágar Mueller-Hinton com auxílio de swabs a suspensão bacteriana, e

acrescentado os discos com os antibióticos de interesse. Então as placas foram incubadas

invertidas a 36±1ºC durante 24 horas, posteriormente realizada a leitura dos halos

presentes em torno dos discos, utilizando-se uma régua. De acordo com o diâmetro do

halo formado pelo antimicrobiano, a amostra foi classificada em sensível, intermediária

ou resistente.

38

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Caracterização bioquímica e molecular de Staphylococcus aureus Para realização das provas bioquímicas foram isoladas colônias de Staphylococcus spp das placas com meio Baider Park Agar. A princípio foram isolados um total 53 colônias, destas apenas 30 colônias apresentaram as características bioquímicas para Staphylococcus spp.

Dos 30 isolados que apresentaram características bioquímicas para Staphylococcus aureus, 66% (20 cepas) obtiveram formato de cocos e coloração gram positiva, 33% (10 cepas) apresentaram cocos gram negativos ou em formato de bacillus gram positivo. Para a prova da catalase 100% das amostras deram positivas e destas 66% (20 cepas) obtiveram coagulase positiva. Dentro do grupo dos staphylococcus coagulase positiva, a espécie S.

aureus é uma das mais preocupantes por ser um agente patogênico relacionado a doenças transmitidas por alimentos (ANDRADE et al., 2011).

O Staphylococcus aureus é uma bactéria gram positiva, agrupadas em cachos ou aglomerados de cocos, encontrada com facilidade no ser humano principalmente na pele e fossas nasais. Porém, apesar de integrar a microbiota do corpo humano são causadoras de diversas patologias que vão desde a problemas cutâneos como gastroenterites. Por esses fatores é tão importante a análise bioquímica e até mesmo molecular desse microrganismo (SALABERRY, 2016).

Após realizadas provas bioquímicas, as 20 cepas coagulase positivas foram submetidas a testes moleculares (PCR) para confirmação da espécie S. aureus através do gene nuc. Dessas, 40% (8 cepas) confirmaram a presença do gene nuc especifico para Staphylococcus aureus onde cinco isolados eram provenientes da matéria-prima de carne de sol e carne de carneiro, um da mistura de todos os ingredientes de carne de sol com queijo de coalho e especiarias e dois da linguiça final do sabor de carneiro e carne de sol com queijos de coalho.

Outros Staphylococcus como as espécies S. hyicus e S. intermedius também tem

como característica bioquímica a coagulase positiva e podem ser confundidas quando

submetidas a testes fenotípicos. Testes genotípicos realizados propuseram uma nova

identificação para as cepas de S. aureus, através do uso da biologia molecular a

identificação do gene nuc, que produzem um termonuclease capaz de degradar DNA e

RNA presente em todos os Staphylococcus aureus (BARBOSA et al., 2019; PARTIDA

et al., 2015).

39

5.2 Detecção de genes produtores de enterotoxinas, resistência a antibióticos e sanitizantes, codificadores de formação de biofilme e tipagem por agr

Das oito cepas de S. aureus identificados, 37,5% (3 cepas) apresentaram genes codificadores de enterotoxinas investigados na pesquisa. Em relação às enterotoxinas clássicas, foi identificado apenas um isolado com o gene sea, entretanto para as enterotoxinas não-clássicas foram identificados dois isolados, com os genes das seg e sei.

Para os genes de resistência 12,5% apresentaram o gene mecA, o restante não apresentou gene mecA e nem mecC. A cepa isolada da matéria prima utilizada para fazer a linguiça, no caso, carne de sol, apresentou o gene sea e mecA. Os outros que apresentaram enterotoxinas não clássicas foram isolados da carne de carneiro.

O Staphylococcus aureus é um microrganismo produtor de enteretoxinas que apresentam ação biológica quando o alimento está contaminado. Essas enterotoxinas tratam-se de um grupo de proteínas extracelulares, hidrossolúveis, compostas por aminoácidos e de estrutura molecular semelhantes que podem causar problema de saúde (CARMO et al., 2014).

Segundo Chaves (2012), os maiores surtos de intoxicação alimentar estão relacionados a enterotoxina A (SEA) e, em seguida, a SED, SEC e SEB. Pesquisas recentes mostram que a SEA e SEB vem principalmente da manipulação dos alimentos e contaminação humana e a SEC e SED estão voltadas a contaminação pelo animal. A identificação desses genes é importante pois indica possível fonte de contaminação e, consequentemente, prevenção.

O sistema dos genes agr (agrI, agrII, agrIII e agrIV) apresentam importante

função biológica, a regulação de expressão de fatores de virulência. Todas as bactérias da

espécie Staphylococcus aureus possuem esse gene agr seja qual for o tipo. O presente

estudo obteve 75% das cepas com agrI e 25% das cepas com o agrIII, como segue na

tabela 4.

40

Tabela 4. Isolados e os seus genes de tipagem por agr, resistência a sanitizantes e formadores de biofilme.

Isolado Origem

A1 Carne de sol agrI icaA e

icaD

- - -

A2 Carne de sol agrI icaA e

icaD

- - -

A11 Carne de sol agrIII icaA e

icaD

- - -

A14 Carne de carneiro agrIII icaA e icaD

- - -

A16 Linguiça de carneiro agrI - - - -

A17 Linguiça de carneiro agrI icaA e icaD

- - -

A18 Mistura carne de sol com queijo

agrI icaD - - -

A19 Linguiça carne de sol com queijo

agrI - - - -

O locus agr é um dos mais importantes para a bactéria S. aureus pois é a central de controle de expressão e regulação da virulência, formação de biofilme e a resistência heterogênea do microrganismo resistente à meticilina (MRSA). Pode regular várias proteínas como leucotoxinas, lipases, α-, β-, γ-hemolisina e toxinas da síndrome do choque tóxico. As pesquisas tem discutido a associação do agrIII e agrIV a regulação do choque toxico. Nesse trabalho podemos evidenciar que dois isolados apresentaram o agrIII, o que torna um fator alarmante pois se trata de um patógeno (MALEKI et al., 2019; TAN et al., 2018).

Outro lócus importante e que foi identificado no trabalho é o ica, onde temos os

genes icaA e icaD. Podemos observar na tabela 4 que a maioria dos isolados apresentam

os dois com exceção da amostra A16 e A19. Esses genes tem papel fundamental na

formação de biofilme, comprovando assim que as Staphylococcus aureus estudados são

formadores de biofilme.

41

Outro gene que é importante para formação de biofilmes é o bap. No presente estudo nenhuma das cepas analisadas apresentaram esse gene. Esse gene é o responsável por sintetizar a proteína BAP que estão envolvidas no processo de adesão e formação de biofilme (SCHIFFER et al., 2019).

Os genes quacA/B e quacC estão relacionados a resistência do microrganismo a sanitizantes, no referido trabalho nenhuma cepa apresentou resistência. O que nos mostra que com a desinfeção adequada do ambiente e das mãos dos manipuladores durante o processamento da linguiça é essencial.

5.3 Gene sodA

Das 16 cepas isoladas, oito apresentaram o gene nuc e as oito cepas restantes foram submetidas à amplificação do gene sodA. Na tabela 5 temos o resultado do gene sodA e a espécie encontrada após o sequenciamento.

Tabela 5. Identificação de espécies pelo sequenciamento do gene sodA

Nome Origem Espécie

A4 Carne de Carneiro Staphylococcus aureus

A5 Carne de Carneiro Macrococcus caseolyticus

A6 Linguiça sabor carne de sol Staphylococcus aureus

A8 Queijo de coalho Staphylococcus aureus

A9 Mistura linguiça de sabor carne de

sol com queijo Staphylococcus saprophyticus A12 Linguiça sabor carneiro com queijo Staphylococcus aureus

A13 Carne bovina Curvularia akaii

A15 Carne de Carneiro Staphylococcus saprophyticus

Podemos observar na tabela 5 que obtivemos mais quatro cepas de Staphylococcus aureus, duas cepas de Staphylococcus saprophyticus, uma cepa de Macrococcus caseolyticus e uma cepa de Curvularia akaii.

O Staphylococcus saprophyticus é uma bactéria esférica, gram positiva,

coagulase-negativo e está relacionado com causas de infecção do trato urinário de

42

mulheres sexualmente ativas. Sua presença em alimentos já foi descrita em queijo minas e peixes, além dos alimentos também foi encontrado em rios poluídos. Sua presença nos chama muito a atenção pois pode se tratar não só de uma contaminação oriunda da manipulação, mas também da água utilizada no processamento da linguiça (MOREIRA et al., 2017).

A utilização de genes além do 16S rRNA, 16S-23S rRNA e o gene da proteína de choque térmica (hsp60) para classificação da espécie Staphylococcus aureus tem crescido cada vez mais, dentre eles temos o gene sodA. Esse gene está associado a enzima Superóxido dismutase que tem ação catalisadora a dismutação do superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio (GHEBREMEDHIN et al., 2008).

Ao final da pesquisa obtivemos que das dezesseis cepas que foram submetidas a identificação molecular 75% (12 cepas) são positivas para Staphylococcus aureus.

5.4 Antibiograma Staphylococcus aureus

De acordo com o gráfico 1 podemos destacar que 88% das cepas são resistentes a oxacilina e 0% a Sulfametoxazol Trimetoprim.

Gráfico 1. Perfil de resistência a antimicrobianos em cepas de Staphylococcus aureus obtidos no processamento de linguiça artesanal

Observou-se que todas as cepas apresentaram resistência a pelo menos um dos antibióticos testados. A cepa que foi isolada da matéria prima, carne de sol, foi a única

11% 11% 11%

22% 22%

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