AVALIAÇÃO DA FUNCIONALIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
DE P(MMA-CO-AA) COM LISINA VIA CROSSLINKING
M. G. MARTINS1, I. F. CAMPOS1, P. V. FINOTELLI2 e J. C. C. S. PINTO1 1 Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa de Engenharia Química/COPPE
2 Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Farmácia
E-mail para contato: mmartins@peq.coppe.ufrj.br
RESUMO – A bioconjugação pode ser realizada por reação do tipo crosslinking entre grupos funcionais terminais específicos e altamente reativos, como é o caso da formação de ligação amida entre um grupamento carboxila, presente em um polímero, e uma amina primária, que compõe um aminoácido. Neste trabalho avalia-se a funcionalização de nanopartículas poliméricas (P(MMA-co-AA)), por meio da formação de ligações peptídicas, com a lisina, por meio do mecanismo de crosslinking. Para tal, foi desenvolvido um planejamento fatorial completo a dois níveis, adotando a técnica de espectroscopia na região de infravermelho (FTIR) para avaliar a formação de ligação amida. As variáveis analisadas foram concentração de EDC, presença ou não de NHS, concentração de lisina e tempo de ativação. O modelo empírico obtido, adotando-se distribuição normal para os dados experimentais e com um intervalo de confiança de 95%, demonstra que as variáveis mais influentes no sistema estudado são a concentração de lisina e o tempo de ativação.
1. INTRODUÇÃO
Polímeros têm sido amplamente utilizados em aplicações médicas devido à boa biocompatibilidade e à versatilidade estrutural (Ramakrishna et al., 2001). Por isso, podem ser empregados como agentes de encapsulamento para o desenvolvimento de sistemas de entrega de fármacos sítio dirigida. A fim de garantir o reconhecimento da partícula por receptores expressos no tipo celular alvo, o polímero pode ser funcionalizado com um marcador específico, como por exemplo, uma proteína.
Em termos gerais, células interagem com o ambiente externo via proteínas transmembranares. Estas proteínas atuam como receptores que são ativados por ligantes (proteínas ou peptídeos específicos), desencadeando uma cascata de reações intracelulares, intermediadas por enzimas que amplificam os sinais de transferência de informações entre os meios intra e extracelulares. Tais conceitos são amplamente utilizados em aplicações de distribuição controlada de fármacos no organismo via biomateriais poliméricos (Griffith, 2000).
Dentre as possíveis abordagens, como técnica de imobilização de fragmentos proteicos, destaca-se o mecanismo de crosslinking. Este consiste no processo de ligar quimicamente, por ligação covalente, duas ou mais moléculas que possuem grupos funcionais terminais específicos (amina primária, carboxila, sulfidrila...) em proteínas ou outras moléculas. A propriedade mais importante de um crosslinker é a reatividade do seu grupo funcional, uma vez que o grupo reativo estabelece o método e o mecanismo empregado para a modificação química a ser aplicada. Moléculas utilizadas para bioconjugação contêm ao menos dois grupos terminais reativos, como encontrados em proteínas e ácidos nucléicos (Handbook).
O mecanismo de bioconjugação mais conhecido consiste na formação de ligação peptídica entre um grupamento carboxila e uma amina primária. Ácidos carboxílicos são reativos à carbodiiminas (EDC), que promovem a ligação direta de carboxilas com aminas primárias, sem fazer parte da ligação amida final (intermediário de “comprimento zero”). EDC reage com grupos carboxílicos, formando um intermediário ativo que é facilmente deslocado por ataque nucleofílico. Ao reagir com uma amina primária, forma-se uma ligação amida, com o grupamento carboxila original, e o EDC é liberado como um derivado de ureia solúvel. A etapa de ativação do grupo carboxílico por EDC é favorecida por ambientes ácidos (pH 3.5-4.5). Além disso, NHS ou sulfo-NHS pode atuar em conjunto com o EDC, aumentando a eficiência do processo, uma vez que se forma o éster NHS que é um intermediário muito mais estável. A Figura 2 apresenta um esquema simplificado de reação peptídica em presença de EDC e NHS. Vale ressaltar que a reação é altamente sensível ao pH do meio e está sujeita a hidrólise dos seus intermediários reativos (Hermanson, 2013; Handbook).
Figura 1 – Mecanismo da reação de crosslinking intermediada por EDC e NHS. (Handbook)
O interesse em combinar proteínas ou peptídeos com sistemas poliméricos tem crescido rapidamente, dada à ampla possibilidade de aplicação de biomateriais injetáveis. Nestes sistemas, o segmento peptídico confere a biocompatibilidade e a atividade seletiva, enquanto a matriz polimérica permite a flexibilidade estrutural do material. (Chimonides et al., 2013)
2. OBJETIVO
O presente trabalho tem por objetivo avaliar a funcionalização de nanopartículas do copolímero P(MMA-co-AA) com o aminoácido lisina. O procedimento de imobilização do aminoácido na matriz polimérica será realizado pelo mecanismo de crosslinking, intermediado por um agente de comprimento zero. A variável de saída do sistema analisado será resultante das análises das amostras por espectroscopia na região de infravermelho (FTIR).
O planejamento experimental aplicado foi o fatorial completo a dois níveis, com réplicas no ponto central. A partir do qual serão desenvolvidos modelos estatísticos que caracterizem a funcionalização das nanopartículas poliméricas, destacando as variáveis mais influentes no sistema.
3. METODOLOGIA
3.1. Planejamento Experimental
As variáveis selecionadas para serem avaliadas quanto à influência no processo de funcionalização por lisina via crosslinking foram: concentração de EDC, presença ou não de NHS, concentração de lisina e tempo de ativação. Os intervalos de variação estão representados na Tabela 1, onde são apresentados o limite inferior (-1), o limite superior (+1) e o ponto central (0). O procedimento experimental realizado foi baseado em um planejamento experimental fatorial completo a dois níveis (24). Assim, foram realizados 16 experimentos com 6 réplicas no ponto central (3
réplicas para cada condição limite de NHS, variável do tipo SIM/NÃO), totalizando um montante de 22 experimentos.
Tabela 1 – Intervalos das variáveis experimentais
Variável Descrição -1 0 +1
I Massa de EDC (mg) 50 65 80
II Presença de NHS SEM - COM
III Massa de lisina (mg) 10 40 70
IV Tempo de ativação (min) 10 65 120
3.2. Procedimento Experimental
O processo de funcionalização das nanopartículas poliméricas com lisina foi baseado no protocolo apresentado por Hermanson (2013). O procedimento de crosslinking realizado compreende
as seguintes etapas:
1) Preparar soluções de EDC e NHS, em tampão fosfato (pH 6,0). 2) Pesar 100 mg de partículas poliméricas em tubo Falcon, de 15 ml.
3) Adicionar as proporções adequadas das soluções de EDC e NHS (se necessário). 4) Quando necessário, completar com tampão para atingir 8 ml de solução.
5) Submeter os tubos à agitação mecânica (20 rpm), pelo tempo de ativação especificado.
6) Filtrar em membrana Amicon (100 KDa), sob centrifugação, a 4000 rpm, por 30 min, para remover o excesso de reagentes e interromper a etapa de ativação.
7) Ressuspender o sólido em 5 ml de tampão fosfato (pH 6,0). 8) Pesar a lisina no tubo Falcon, de 15 ml, e adicionar a suspensão.
9) Submeter os tubos à agitação mecânica (20 rpm), por 2 h (tempo de reação).
10) Filtrar em membrana Amicon (100 KDa), sob centrifugação, a 4000 rpm, por 30 min. 11) Ressuspender o sólido final com 3,0 ml de água destilada.
12) Transferir o produto final para placa de petri e secar em estufa de recirculação.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Caracterização
O copolímero foi caracterizado por FTIR antes (látex) e após a conjugação com lisina. A Figura 2 apresenta, respectivamente, os espectros característicos de amostra de látex, lisina, látex com lisina, e também, das amostras de látex após funcionalização (mínimo, máximo e central). Os espectros referentes a todas as amostras experimentais estão aqui representados apenas por três curvas, uma vez que os espectros foram similares quando na mesma condição de concentração de lisina utilizada no procedimento.
Figura 2 – Espectros de FTIR referentes aos ensaios de funcionalização com lisina.
Com relação ao espectro referente ao látex, o grupamento carbonila é caracterizado pela presença da banda forte em 1723 cm-1, que em conjunto com a banda forte encontrada na região de
1240-1145 cm-1 indica a presença do grupo éster. Os estiramentos e deformações característicos das
ligações C-H foram atribuídos às bandas presentes na região de 2995-2850 cm-1 (região também
característica da hidroxila) e na região de 1435-1387 cm-1. O ácido carboxílico, proveniente do ácido
acrílico que compõe o copolímero, é caracterizado pelas bandas referentes à hidroxila em conjunto com a carbonila.
A banda mais intensa da lisina (banda forte em 1580 cm-1) caracteriza a deformação angular da
ligação N-H da amina primária presente no aminoácido. O espectro da amostra de látex misturada com lisina pode ser visto como branco para as amostras de látex funcionalizado. Assim, é possível observar que a ligação amida (caracterizada pela banda fraca em 1565 cm-1) está presente em todas as
amostras funcionalizadas. Apesar das bandas características de amina e amida estarem presentes em uma região muito próxima do espectro, foi considerado, a princípio, que uma banda não afeta a intensidade relativa da outra.
Como variável de saída, para avaliação estatística de um modelo empírico, foi calculada a intensidade relativa entre bandas que caracterizam apenas a ligação amida formada e apenas o polímero. Foi calculada a razão de intensidades entre a banda referente à ligação N-H de amida secundária (em 1565 cm-1) e a banda referente à ligação C-O do éster (em 1240-1145 cm-1). As razões
de intensidade das bandas caracterizam a variável de saída nomeada IV. Vale ressaltar que quanto maior o valor da variável IV, menor o teor de funcionalização da nanopartícula polimérica, uma vez que a intensidade está definida em percentual de transmitância.
4.2. Análise Estatística
A análise estatística dos dados foi efetuada admitindo-se uma distribuição normal de probabilidades com um intervalo de confiança de 95%. Como o planejamento experimental foi baseado em repetições de experimentos apenas nos pontos centrais, os erros foram avaliados nestes pontos e expandidos para os demais, sendo considerados constantes.
A função objetivo (Equação 1) foi definida a partir do método de máxima verossimilhança, admitindo-se as hipóteses do modelo perfeito e experimento bem feito. Portanto, foi admitindo que os erros do sistema seguem a distribuição normal, as variáveis não estão correlacionadas, as variáveis independentes são isentas de erros e ainda que todos os erros das variáveis dependentes sejam iguais e independentes (Schwaab e Pinto, 2007, 2011).
(1)
sendo ye o valor experimental e yc o valor calculado pela métrica.
A definição do modelo empírico (linear nos parâmetros) se deu a partir de tentativas, levando em conta os efeitos principais e efeitos de sinergia entre as variáveis, partindo-se da expressão genérica apresentada pela Equação 2.
(2)
sendo ai os parâmetros do modelo referentes aos efeitos principais, bij os parâmetros do modelo
referentes aos efeitos secundários, zi e zj as variáveis independentes do modelo e y a variável
dependente do modelo.
O procedimento de estimação de parâmetros foi realizado utilizando-se o software STATISTICA 7, adotando-se as seguintes condições de cálculos: Hooke-Jeeves e Quase-Newton como método de estimação, erro de aproximação de 10-13, número máximo de 100 iterações e 10-7
como critério de convergência.
O modelo empírico avaliado levou em consideração o efeito principal de todas as variáveis independentes e todas as combinações possíveis das variáveis em pares, como efeito de sinergia. No entanto, o modelo final (representado pela Equação 3) considera apenas os parâmetros significativos.
(3)
o que sugere que os dados se adaptam de maneira satisfatória ao modelo obtido. Nota-se que os parâmetros estão vinculados as variáveis z3 e z4, tanto nos termos principais, quanto no termo de sinergia. Este modelo reforça a ideia de que apenas estas variáveis são verdadeiramente importantes no sistema. A presença de um termo de sinergia sugere a existência de um termo quadrático ao modelo.
A Equação 3 pode ser reescrita, como a Equação 4, em função dos parâmetros calculados e dos respectivos erros paramétricos.
(4) A avaliação do modelo quanto à distribuição dos resíduos com relação ao comportamento normal está apresentada na Figura 3 e corrobora a premissa assumida inicialmente de distribuição normal dos dados.
Normal Probability Plot of Residuals
-0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 Residuals -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 E x p e c te d N o rm a l V a lu e
Figura 3 – Distribuição dos resíduos quanto à distribuição normal para o modelo obtido.
Para normalizar a variável de saída IV, facilitando a interpretação final, os sinais dos parâmetros foram invertidos. Assim, O modelo final pode ser expresso em termos das variáveis de interesse conforme a Equação 5.
(5)
5. CONCLUSÃO
A avaliação do teor de funcionalização de nanopartículas poliméricas com lisina pode ser feita pela análise do modelo empírico obtido. Analisando-se o modelo final, nota-se que as variáveis massa de lisina e tempo de ativação afetam o teor de funcionalização de forma direta. Ambas contribuem tanto nos termos principais quanto no termo de sinergia do modelo. Frente aos termos principais, pode-se afirmar que estas variáveis apresentam comportamento diretamente proporcional à variável de saída, ou seja, o aumento na massa de lisina e no tempo de ativação implica em aumento do teor de funcionalização.
O efeito positivo do aumento da massa de lisina com relação ao teor de funcionalização era esperado, uma vez que aumentando a concentração do agente funcionalizante a reação é favorecida. Em contrapartida o efeito do tempo de ativação não era previsível e foi crucial para o entendimento do mecanismo de crosslinking do sistema estudado, visto que na literatura são expostas duas vertentes a respeito do tempo de ativação. Uma defende que maiores tempos de ativação garantem a formação da espécie intermediária ativa, enquanto a outra sugere tempos curtos, dada a possibilidade de degradação do intermediário formado. Portanto o resultado obtido pelo modelo corrobora a primeira vertente.
As variáveis massa de EDC e presença de NHS, variáveis relacionadas a etapa de formação do intermediário ativo, não se apresentaram estatisticamente significativas. Isto implica em efeitos pouco pronunciados dessas variáveis sobre a funcionalização da partícula polimérica. Estas variáveis podem não terem influenciado nos resultados uma vez que estes reagentes foram colocados em proporções molares superiores ao aminoácido.
6. REFERÊNCIAS
CHIMONIDES, G. F. et al. Facile synthesis of polymer-peptide conjugates via direct amino acid coupling chemistry. Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry, v. 51, n. 22, p. 4853– 4859, 2013.
GRIFFITH, L. G. Polymeric biomaterials. Acta Materialia, v. 48, n. 1, p. 263–277, 2000. HANDBOOK, C. T. Crosslinking Technology, Thermo Scientific.
HERMANSON, G. T. Zero-Length Crosslinkers. Bioconjugate Techniques, p. 259–273, 2013.
RAMAKRISHNA, S. et al. Biomedical applications of polymer-composite materials: A review. Composites Science and Technology, v. 61, n. 9, p. 1189–1224, 2001.
SCHWAAB, M.; PINTO, J. C. Análise de Dados Experimentais I: Fundamentos de Estatística e Estimação de Parâmetros. Rio de Janeiro: e-papers, 2007.
SCHWAAB, M.; PINTO, J. C. Análise de Dados Experimentais II: Planejamento de Experimentos. Rio de Janeiro: e-papers, 2011.
