RENORBIO
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Derivados p-Mentânicos: Estudos de Relação
Estrutura-Atividade e Avaliação de Novos
Candidatos a Agentes Antitumorais
LUCIANA NALONE ANDRADE
São Cristóvão - SE
LUCIANA NALONE ANDRADE
Derivados p-Mentânicos: Estudos de Relação
Estrutura-Atividade e Avaliação de Novos
Candidatos a Agentes Antitumorais
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia com sede na Universidade Federal de Pernambuco e ponto focal na Universidade Federal de Sergipe, para a obtenção do grau de Doutor na área de Biotecnologia.
ORIENTADOR:
Professor Dr. Damião Pergentino de Sousa
COORIENTADORA:
Professora Dra. Adriana Andrade Carvalho
São Cristóvão – SE 2015
LUCIANA NALONE ANDRADE
Derivados p-Mentânicos: Estudos de Relação
Estrutura-Atividade e Avaliação de Novos Candidatos
a Agentes Antitumorais
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia com sede na Universidade Federal de Pernambuco e ponto focal na Universidade Federal de Sergipe, para a obtenção do grau de Doutor na área de Biotecnologia.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa
Orientador
_________________________________________
Prof. Dr. Charles dos Santos Estevam Examinador interno (RENORBIO - UFS)
_________________________________________
Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo Examinador externo (UFS)
_________________________________________
Profa. Dra. Brancilene Santos de Araújo Examinadora externa (UFS)
_________________________________________
Profa. Dra. Juliana Cordeiro Cardoso Examinadora externa (UNIT)
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
A553d
Andrade, Luciana Nalone
Derivados p-Mentânicos: estudos de relação estrutura-atividade e avaliação de novos candidatos a agentes antitumorais / Luciana Nalone Andrade; orientador Damião Pergentino de Sousa. – São Cristóvão, 2015.
173 f. : il.
Tese (doutorado em Biotecnologia) – Rede Nordeste de Biotecnologia- RENORBIO, Universidade Federal de Sergipe, 2015.
1. Biotecnologia 2. Câncer. 3. Citotoxicidade. 4. Agentes antineoplásicos. I. De Sousa, Damião Pergentino, orient. II. Título.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Adson e Wanda e às minhas irmãs Juliana e Fabiana, pessoas que amo muito, responsáveis pelo que eu sou e por todo amor e dedicação.
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus, nosso criador, que sempre me mostrou os melhores caminhos e agraciou-me pela excelente saúde mental e física. À minha mãe protetora e fiel de todas as horas, a qual sou devota, Nossa Senhora Auxiliadora, muito obrigada por estar presente em todos os momentos de minha vida!
Meus agradecimentos mais sinceros para minha mãe Wanda Nalone e para meu pai Adson que sempre acreditaram em mim, incentivaram-me e estiveram ao meu lado, me dando palavras de conforto e colaborando com meu bem-estar em todas as horas. A minha amada, querida e admirada irmã Juliana Nalone que nunca mediu esforços para me ajudar, aconselhar-me e que faz parte de todas minhas vitórias, sem você não sei o que eu seria. Muito obrigada minha irmã, você é muito especial para mim. À minha irmã Fabiana obrigada por tudo.
Ao meu namorado Ricardo por ser meu companheiro fiel para todas as horas, por me passar segurança e querer-me muito bem! Obrigada por fazer parte da minha vida meu bem! Tudo é melhor quando estou ao seu lado!
Ao grande professor, pesquisador e orientador Dr. Damião Pergentino de Sousa, por acreditar em mim e pela confiança colocada desde o ingresso na pós-graduação. O senhor foi responsável pela minha base na área acadêmica e é referência pelas minhas vitórias, conhecimento e exemplo de que “querer é poder”. Muito obrigada! À Profa. Dra. Adriana, minha coorientadora, que me aceitou como sua pupila e motivou-me a correr atrás dos meus objetivos, incentivando-me com novas ideias e discussões.
Ao Prof. Dr. Josemar que ao longo da minha graduação e pós-graduação sempre esteve presente em minha vida, incentivando e constantemente passando conhecimento, confiança e acima de tudo, pela nossa amizade.
Ao Prof. Dr. Ricardo Albuquerque e aos membros do Laboratório de Morfologia e Patologia Experimental (LMPE - Unit) que contribuíram muito para a finalização do meu trabalho.
Aos membros do LAPOCE, em especial às alunas de iniciação científica Cecília, Tayane, Melina e Andressa por colaborarem dia a dia fielmente às atividades no laboratório.
Às amigas Tamires e Clara por nossa grande amizade.
Às amigas Bruna, Anuska, Kelly e Amanda que, através do doutorado nos conhecemos e firmamos amizade, espero que vocês estejam sempre presentes em minha vida!
À Universidade Federal de Sergipe por permitir que participasse de seu corpo de pós-graduandos e por disponibilizar sua estrutura física para realização de meus trabalhos. Ao Núcleo de Pós-Graduação, RENORBIO-SE, em especial para Emanuel e Kelly pelo compromisso e apoio.
Aos professores da RENORBIO que, cada um ao seu modo, foi capaz de contribuir para a minha formação, aprimorando meus conhecimentos.
Aos membros da banca pelas considerações que realizaram, enriquecendo meu trabalho.
Andrade, L.N. Derivados p-Mentânicos: Estudos de Relação Estrutura-Atividade e Avaliação de Novos Candidatos a Agentes Antitumorais. 2015. 173p. Tese (Pós-Graduação em Biotecnologia, Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), ponto focal: Universidade Federal de Sergipe - UFS, Sergipe.
RESUMO
O câncer é uma doença de grande incidência, alta mortalidade e de difícil tratamento, havendo, portanto, um constante interesse social na procura por terapias mais eficientes. Nesse sentido, os óleos essenciais e seus constituintes químicos têm se mostrado como potenciais agentes bioativos antitumorais. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade citotóxica de 19 derivados p-mentânicos estruturalmente relacionadas ao álcool perílico frente a 3 linhagens de células tumorais humanas: adenocarcinoma ovariano (OVCAR-8), carcinoma de cólon (HCT-116) e glioblastoma (SF-295) através do ensaio colorimétrico de MTT. Essas substâncias foram avaliadas de acordo com o grau de inibição da proliferação celular (GI%), visando identificar as substâncias mais citotóxicas e as características moleculares que contribuem para a atividade in vitro. Os testes foram realizados em triplicata com concentração única de 25 µg/mL. Os resultados demostraram que todas as substâncias testadas foram menos citotóxicas do que o álcool perílico, com exceção do 1,2-epóxi-perialdeído (EP-1) e 8,9-epóxi-perialdeído (EP-2) (GI = 95,66 a 99,89%), com CI50 variando entre 2,68 a 3,92 e 1,03 a 1,75 µg/mL, respectivamente.
O benzoato de perila foi a substância menos citotóxica, com um valor de (GI = 2,86 a 5,02%). As substâncias (+)-1,2-epóxi-limoneno, (-)-hidróxi-carvona (-HC) e perialdeído apresentaram atividade citotóxica intermediária, com (GI = 58,40 a 94,01%). Diante desses resultados, as características estruturais que podem contribuir para compreender a atividade citotóxica do álcool perílico e seus análogos foram identificadas. Em geral, a substituição de duplas ligações C-C por grupos epóxido somado ao grupo aldeído aumentou a citotoxicidade. A presença e a posição dos grupos cetona e epóxido no esqueleto p-mentano influenciaram na atividade citotóxica. A adição de grupos hidroxila na estrutura química resultou em substâncias menos citotóxicas, como foi o caso do cis-carveol e sobrerol. Como também, a acetilação de tais grupos conduziu a uma diminuição global da citotoxicidade, indicando que a lipofilicidade desempenha um papel importante na diminuição da atividade citotóxica. Além disso, a enantiosseletividade pode desempenhar um papel importante na citotoxicidade de substâncias naturais, como observado para a (-)- e (+)-hidróxi-carvona. Esses resultados demonstram que os diferentes grupos funcionais e as suas posições no esqueleto p-mentano influenciam na atividade citotóxica. Em seguida, foi avaliada a atividade antitumoral in vivo das substâncias com maior citotoxicidade e sem estudos prévios descritos na literatura, EP-1, EP-2 e (-HC) utilizando camundongos transplantados com Sarcoma 180 (S180). Neste ensaio, a administração de EP-1 ou EP-2 (100 ou 200 mg/kg/dia) inibiu o desenvolvimento de tumor sólido em camundongos transplantados com S180. A inibição foi de 33,4 e 56,4% para EP-1 e 38,4 e 58,7% para EP-2 em ambas as doses, respectivamente. Já a (-HC) não apresentou atividade antitumoral in vivo em nenhuma das doses testadas. Não houve alterações nos parâmetros bioquímicos em animais tratados com EP-1 e EP-2. Em relação às análises hematológicas, essas substâncias demonstraram redução no número de leucócitos totais e alterações na contagem diferencial. O mecanismo de ação de EP-1 e EP-2 foram, então, estudados. Nenhuma
das substâncias testadas induziu hemólise. A viabilidade de células HL-60 foi afetada por ambas as substâncias após um período de exposição de 24h, quando analisada por exclusão por azul de tripan. Tanto EP-1 quanto EP-2 reduziram o número de células viáveis associado com um aumento no número de células não viáveis, o que colabora com o aumento do número de células mortas na análise morfológica. A incorporação do brometo de etídio/laranja de acridina, nas células tratadas, sugere citotoxicidade via apoptose e necrose. Logo, diante dos resultados, podemos concluir que EP-2 foi mais potente in vitro comparado a EP-1, entretanto, ambas as substâncias apresentaram atividade citotóxica através dos processos apoptótico e necrótico. Esses dados sugerem que EP-1 e EP-2 apresentam um potencial anticâncer promissor e além disso, modificações estruturais adequadas são possíveis para o desenvolvimento de novos agentes antitumorais.
Andrade, L.N. p-Menthane Derivatives: Relationship Studies Structure-Activity and New Assessment Candidates Antitumor Agents. 2015. 173p. Thesis (Pós-Graduação em Biotecnologia, Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), ponto focal: Universidade Federal de Sergipe - UFS, Sergipe.
ABSTRACT
Cancer is a disease of high incidence, high mortality and difficult to treat, and there is therefore a constant social interest in the search for more effective therapies. In this sense, essential oils and their constituents are promising source of natural products as antitumor substances. Thus, the aim of this study was to evaluate the cytotoxic activity of 19 p-menthane derivatives structurally correlated with perillyl alcohol against three strains of human tumor cells: ovarian adenocarcinoma (OVCAR-8), colon carcinoma (HCT-116) and glioblastoma (SF-295) using the colorimetric MTT assay. The tests were performed in triplicate in a single concentration of 25 µg/ml. The results demonstrated that all substances tested were less cytotoxic than the perillyl alcohol, with the exception of 1,2-perillaldehyde epoxide (EP-1) and 8,9-periallaldehyde epoxide (EP-2) (IG = 95.66 to 99.89%) and IC50 ranging from 2.68 to
3.92 and 1.03 to 1.75 mg/ml, respectively. The perillyl benzoate was the least cytotoxic substance, with a value (GI = 2.86 to 5.02%). The monoterpenes (+)-limonene epoxide, (-)-hydroxy-carvone (-HC) and perillaldehyde had intermediate cytotoxic activity, with (IG = 58.40 to 94.01%). Given these results, the structural characteristics that can contribute to understand the cytotoxicity of perillyl alcohol and its analogs were identified. In general, substitution of C-C double bonds per epoxide groups added to the aldehyde group increased cytotoxicity. The presence and location of ketone and epoxide groups in p-menthane skeleton influence the cytotoxic activity. The addition of hydroxyl groups in the chemical structure resulted in less cytotoxic compounds, as was the case of the cis-carveol and sobrerol. As well, acetylation of such groups led to an overall decrease in cytotoxicity, indicating that lipophilicity plays a major role in the decrease of cytotoxic activity. In addition, the enantioselectivity to perform an important role in the cytotoxicity of natural compounds, as observed for (-)- and (+)-hydroxy-carvone. These results demonstrate that different functional groups and their positions in p-menthane skeleton influence the cytotoxic activity. Next was evaluated the in vivo antitumor activity of the compounds EP-1, EP-2 and (-HC) in Sarcoma 180-bearing mice (S180). In this test, the administration of EP-1 and EP-2 (100 or 200 mg/kg/day) inhibited the development in S180-inoculated mice. The inhibition was 33.4 and 56.4% for EP-1 and 38.4 and 58.7% for EP-2 at both doses, respectively. Already (-HC) (50 or 100 mg/kg/day) showed no antitumor activity in vivo. There were no changes in biochemical parameters in animals treated with EP-1 and EP-2. In relation to hematological analysis, these compounds showed a reduction in the number of total leukocytes and alterations in the differential count, a result expected as due to S180 tumor. The mechanism of action of EP-1 and EP-2 were then studied. None of the compounds tested induced hemolysis. The viability of HL-60 cells was affected by both monoterpenes after an exposure period of 24h, when analyzed by trypan blue exclusion. Both EP-1 and EP-2 reduced the number of viable cells associated with an increase in the number of non-viable cells, which contributes to the increased number of dead cells in the morphological analysis. The incorporation of ethidium
bromide/acridine orange, the treated cells, cytotoxicity suggests apoptosis and necrosis pathway. Therefore, front of results, can conclude that EP-2 was more potent
in vitro compared to EP-1, however, both substances showed cytotoxic activity through
apoptotic and necrotic processes. These data suggest that EP-1 and EP-2 present a potential and promising anticancer potential and moreover, appropriate structural modifications are possible to develop novel anticancer agents.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 20
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 24
2.1. Câncer e sua Formação ... 24
- Ciclo Celular ... 28
- Mecanismo de Morte Celular ... 30
2.2. Tumor Experimental Sarcoma 180 ...35
2.2. Triagem de Novos Fármacos e o Tratamento do Câncer ...36
2.3. Óleos Essenciais, Monoterpenos e suas Atividades Contra o Câncer ...42
3. OBJETIVOS ... 52 3.1. Geral ...52 3.2. Específicos ...52 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 52 4.1. Material ... 52 4.1.1. Aparelhos utilizados ... 53 4.1.2. Reagentes e Solventes ... 53 4.1.3. Métodos ... 54 4.1.3.1. Métodos Cromatográficos ... 54 4.1.3.2. Métodos Espectrométricos ... 54
4.2. Preparação das Substâncias Químicas ... 55
A) Preparação do perialdeído ... 55
B) Preparação do 1,2-epóxi-perialdeído ... 56
C) Preparação do 8,9-epóxi-perialdeído ... 57
D) Preparação do acetato de perila ... 58
E) Preparação do benzoato de perila ... 59
F) Preparação da (-)-hidróxi-carvona ... 60 G) Preparação da (+)-hidróxi-carvona ... 61 H) Preparação do (-)-cis-carveol ... 62 I) Preparação do (+)-epóxi-carveol ... 63 J) Preparação da (-)-epóxi-carvona ... 64 L) Preparação da epóxi-pulegona ... 65 M) Preparação do (+)-1,2-epóxi-limoneno ... 66 N) Preparação do (-)-sobrerol ... 67 O) Preparação da acetóxi-carvotanacetona ... 68 P) Preparação da trans-isopulegona ... 69 4.3. ENSAIOS BIOLÓGICOS ... 70 4.3.1. Material ... 70 4.3.1.1. Animais ... 70 4.3.1.2. Células ... 71
4.3.2. Estudo da Atividade Citotóxica In Vitro ... 71
4.3.2.1. Avaliação da Atividade Citotóxica em Células Tumorais ... 71
4.3.2.1.1. Procedimento Experimental ... 72
4.3.2.1.2. Análise dos Dados ... 72
4.3.3. Estudo da Atividade Antitumoral In Vivo ... 73
4.3.3.1. Manutenção do Tumor Sarcoma 180 em Camundongos ... 73
4.3.3.2. Avaliação do Efeito de EP-1, EP-2 e (-)-HC em Camundongos Transplantados com S180 ... 73
4.3.3.2.1. Procedimento Experimental ... 73
4.3.4. Parâmetros Toxicológicos ... 75
4.3.4.1. Avaliação da Massa Corporal, Ingestão Hídrica e de Alimentos ... 75
4.3.4.2. Avaliação da Massa dos Órgãos ... 76
4.3.4.3. Avaliação dos Parâmetros Bioquímicos ... 76
4.3.4.3.1. Procedimento Experimental ... 76
4.3.4.4. Avaliação dos Parâmetros Hematológicos ... 76
4.3.4.4.1. Procedimento Experimental ... 76
4.3.4.5. Avaliação Histopatológica dos Órgãos ... 77
4.3.4.5.1. Procedimento Experimental ... 77
4.3.5. Estudo do Mecanismo de Ação Citotóxico ... 77
4.3.5.1. Avaliação da Atividade Hemolítica em Eritrócitos de Camundongos Swiss ... 77
4.3.5.1.1. Procedimento Experimental ... 77
4.3.5.1. Estudo do Mecanismo de Ação Citotóxico em Células HL-60 ... 78
4.3.5.2.1. Viabilidade Celular - Exclusão por Azul de Tripan ... 78
4.3.5.2.1.2. Procedimento Experimental ... 78
4.3.5.2.1. Análise Morfológica – Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina ... 79
4.3.5.2.1.1. Procedimento Experimental ... 79
4.3.5.2.1.2. Análise dos Dados ... 79
4.3.5.2.3. Análise Morfológica – Coloração Diferencial por Hematoxilina/Eosina ... 79
4.3.5.2.3.1. Procedimento Experimental ... 80
4.3.5.2.3.3. Análise dos Dados ... 80
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 81
5.1. Etapa Química ... 81
5.1.1. Etapa de Preparação das Substâncias... 81
5.2. Etapa Biológica ... 83
5.2.1. Estudo da Atividade Citotóxica In Vitro ... 83
5.3. Relação Estrutura-Atividade ... 89
5.4. Estudo da Atividade Antitumoral In Vivo ... 93
5.4.1. Avaliação do Efeito das Substâncias EP-1, EP-2 e (-)-HC em Camundongos Transplantados com Tumor Sarcoma 180 ... 93
5.4.2. Parâmetros Toxicológicos ... 97
5.4.2.1. Massa Corporal, Consumo de Alimento e Água ... 97
5.4.2.2. Avaliação da Massa dos Órgãos ... 100
5.4.2.3. Avaliação dos Parâmetros Bioquímicos ... 103
5.4.2.4. Avaliação dos Parâmetros Hematológicos... 107
6. Estudo do Mecanismo de Ação Citotóxico ... 116
6.1. Estudo do Mecanismo de Ação Citotóxico em Células Leucêmicas - HL-60 ... 116
6.2. Atividade Hemolítica ... 116
6.3. Viabilidade celular - Exclusão por Azul de Tripan ... 117
6.4. Análise Morfológica – Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina ... 120
6.5. Análise Morfológica – Coloração Diferencial por Hematoxilina/Eosina ... 123
7. CONCLUSÕES ... 126
8. REFERÊNCIAS ... 127
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DAS CÉLULAS TUMORAIS.. ... 26
FIGURA 2. DISTINÇÃO DAS DIFERENTES ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS NOS PROCESSOS DE
MORTE CELULAR POR APOPTOSE VERSUS NECROSE. ... 33
FIGURA 3.ESTRUTURA QUÍMICA DAS SUBSTÂNCIAS: (A) ISOPRENO E (B) MONOTERPENO.44
FIGURA 4.ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS MONOTERPENOS OXIGENADOS: ... 46
FIGURA 5.ESQUELETO P-MENTÂNICO ... 47
FIGURA 6.ESTRUTURAS QUÍMICAS DAS SUBSTÂNCIAS AVALIADAS. ... 47
FIGURA 7.AVALIAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS EP-1 E EP-2 SOBRE O CRESCIMENTO TUMORAL102
FIGURA 8.HISTOPATOLOGIA DOS RINS DOS DIFERENTES GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 111
FIGURA 9.HISTOPATOLOGIA DOS FÍGADOS DOS DIFERENTES GRUPOS EXPERIMENTAIS 113
FIGURA 10.HISTOPATOLOGIA DOS BAÇOS DOS DIFERENTES GRUPOS EXPERIMENTAIS 114
FIGURA 11.HISTOPATOLOGIA DO TUMOR S180... 115
FIGURA 12.EFEITO DO EP-1 E EP-2 NA VIABILIDADE DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS HL-601157
FIGURA 13. EFEITO DAS SUBSTÂNCIAS EP-1 E EP-2 EM CÉLULAS LEUCÊMICAS ...11530
FIGURA 14. FOTOMICROGRAFIA DAS CÉLULAS HL-60 CORADAS COM
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS E FISIOLÓGICAS QUE
DISTINGUEM NECROSE DE APOPTOSE. ... 34
TABELA 2. DESCRIÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA E POSSÍVEL MECANISMO DE AÇÃO DE
MONOTERPENOS ESTRUTURALMENTE RELACIONADOS. ... 48
TABELA 3.GRAU DE INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR DAS 19 SUBSTÂNCIAS FRENTE A 3
LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS. ... 85
TABELA 4.VALORES DE CI50 E O INTERVALO DE CONFIANÇA DE 95% DAS SUBSTÂNCIAS
EP-1,EP-2 E (-)-HC. ... 86
TABELA 5.CONSUMO DE ÁGUA, RAÇÃO E VARIAÇÃO DA MASSA CORPÓREA DE CAMUNDONGOS
SAUDÁVEIS OU TRANSPLANTADOS COM TUMOR S180 ... 98
TABELA 6.CONSUMO DE ÁGUA, RAÇÃO E VARIAÇÃO DA MASSA CORPÓREA DE CAMUNDONGOS
SAUDÁVEIS OU TRANSPLANTADOS COM TUMOR S180 ... 99
TABELA 7. EFEITO DO EP-1 (100 OU 200 MG/KG/DIA) POR VIA I.P. SOBRE A MASSA DOS
ÓRGÃOS. ... 100
TABELA 8.EFEITO DO EP-2 (100 OU 200 MG/KG/DIA) OU 5-FLUOROURACIL (25 MG/KG/DIA)
POR VIA I.P. SOBRE A MASSA DOS ÓRGÃOS ... 102
TABELA 9. EFEITO DO EP-1 POR VIA I.P. SOBRE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DE
CAMUNDONGOS SAUDÁVEIS OU TRANSPLANTADOS COM TUMOR S180. ... 104
TABELA 10.EFEITO DO EP-2 POR VIA I.P. SOBRE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS ... 105
TABELA 11.EFEITO DO EP-1 POR VIA I.P. SOBRE OS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS . 107
TABELA 12. EFEITO DO EP-2 POR VIA I.P. SOBRE OS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS
...109
TABELA 13.VALORES DE CI50 E O INTERVALO DE CONFIANÇA DAS SUBSTÂNCIAS EP-1,EP-2
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-FU – 5-Fluorouracil µg - Microgramas
µm - Micrômetros
ALT - Alanina aminotranferase
AST - Aspartato aminotranferase
Bax – Proteína pró-apoptótica
Caspases – Proteases aspartato específicas contendo cisteína
CE50 - Concentração efetiva média
CEPA - Comitê de Ética em Pesquisa com Animais
CC - Cromatografia em Coluna
CCDA - Cromatografia em Camada Delgada Analítica
CDK - proteínas quinases dependentes de ciclina
CG/EM - Cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massa
CG-EM - Cromatografia gasosa acoplada a espectro de massa
CI50 - Concentração inibitória média capaz de produzir 50% do efeito máximo
CKI - Inibidores das proteínas-quinase dependentes de ciclina
DFS - Departamento de Fisiologia
DMSO - Dimetilsulfóxido
FPM - Fator promotor de mitose
G0 - Gap 0
G1 - Gap 1
G2 - Gap 2
HBV - Vírus Epstein-Barr
HCT-116 - Linhagem de células tumorais de carcinoma de cólon
HeLa – Carcinoma cervical humano
HepG2 – Hepatoma humano
HL-60 – Linhagem de células tumorais de leucemia promielocítica
HPV - Papiloma vírus humano
IC - Intervalo de confiança
IFN-γ - Interferon-γ
IL-2 - interleucina-2
INCA - Instituto Nacional do Câncer
IV - Infravermelho
ISO - International Standard Organization
IT - Inibição do crescimento tumoral K562 – Leucemia mieloide humana
M - Mitose
MCF-7 – Adenocarcinoma cerebral humano
MMP - Membrana mitocondrial externa
MS - Ministério da Saúde
MTT - 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium
OMS - Organização Mundial de Saúde
OVCAR-8 - Linhagem de células tumorais do ovário humano
P.A. - Para análise
PCC - Cloro cromato de piridina
p21 – Proteína reguladora do ciclo celular
P-388 – Leucemia murina
Rb – Retinoblastoma
RMN 13C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze
RMN 1H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RF - Fator de retenção
SF-295 - Linhagem de células tumorais de glioblastoma
UFPB - Universidade Federal da Paraíba
1. INTRODUÇÃO
Câncer, neoplasia maligna ou tumor maligno são sinônimos usados para denominar uma classe de doenças caracterizada pelo crescimento descontrolado de células. Estas células invadem tecidos e órgãos normais, por extensão direta ou por disseminação à distância através do sangue, linfa ou superfície serosa, espalham-se para outras regiões do corpo e podem levar à morte (ROBINS, 2005).
Nas últimas décadas ocorreu em todo o mundo um expressivo aumento nos casos de câncer e isso se deve principalmente ao fato do aumento da expectativa de vida da população, pois o câncer é uma doença geralmente associada às últimas décadas de vida. Essa doença ganhou destaque tornando-se um grande problema de saúde pública mundial (ACS, 2014).
De acordo com estimativas mundiais do projeto Globocan 2014, da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC, do inglês International Agency for Research on Cancer), da Organização Mundial da Saúde (OMS), houve 14,1 milhões de casos novos de câncer e um total de 8,2 milhões de mortes por câncer, em todo o mundo, em 2014. Essa doença teve uma progressiva ascensão, chamada de transição epidemiológica, como reflexo do envelhecimento da população, resultante do intenso processo de urbanização e das ações de promoção e recuperação da saúde (ALBERT et al., 2010).
No Brasil, o câncer consiste na segunda causa de morte com taxa de mortalidade de 17,1% em 2014, inferior apenas às doenças do sistema cardiovascular (INCA, 2014). A maior taxa de mortalidade por câncer, entre 2001 e 2014, foi registrada entre a faixa de 70 a 79 anos, com 229.315 óbitos em homens e 170.047 em mulheres (INCA, 2014).
As causas do câncer são variadas, podendo ser externas ou internas ao organismo, estando ambas inter-relacionadas. As causas externas relacionam-se ao meio ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e cultural, fatores esses associados ao surgimento de 80% a 90% dos casos. Incluem-se também nos fatores ambientais o local de trabalho quando insalubre e o estilo de vida, levando-se em consideração os hábitos, a alimentação e até mesmo medicamentos utilizados. Nestes ambientes muitas vezes podem ser encontrados contaminantes como radiação ionizante e agentes químicos/xenobióticos. A infecção por alguns tipos de vírus (vírus hepatite B, HBV e papilomavírus, HPV) também podem contribuir para
formação e propagação de câncer (ALMEIDA et al., 2005; KLUG & CUMMUINGS, 1983).
Já as causas internas, geneticamente pré-determinadas, estão ligadas à capacidade do organismo de se defender das agressões externas. Esses fatores causais podem interagir de várias formas, aumentando a probabilidade de células normais transformarem-se em malignas (INCA, 2012). Nesse contexto, os proto-oncogenes são genes responsáveis pelo controle da tradução proteica, divisão e diferenciação celular. Quando alterados eles recebem o nome de oncogenes, desse modo, e essas alterações iniciam a neoplasia. Os oncogenes são genes responsáveis pela perda da função normal da célula e transformação em célula cancerígena. Dessa maneira, as células tumorais multiplicam-se de forma anormal e descontrolada, e, com o acúmulo de células ocorre a para manter a nutrição dessas (LIOTTA & KOHN, 2001). As alterações sofridas no ciclo celular, a multiplicação descontrolada seguida da formação de novos vasos estabelecem assim o tumor. O tumor altera a função normal do tecido e do órgão onde se encontra, causando danos funcionais por uma invasão progressiva de células cancerígenas e destruição dos tecidos vizinhos. As células que formam o tumor podem desprender-se e através dos vasos sanguíneos e da corrente sanguínea essas células transferem-se aos demais órgãos e tecidos, estabelecendo novos tumores e formando assim a metástase (HANAHAN & WEINBERG, 2000).
O mecanismo da carcinogênese inicia-se quando o agente carcinógeno incide sobre uma célula normal induzindo alterações sobre a molécula de DNA. Esse fenômeno em que as células, cujo material genético foi alterado, passam a receber instruções erradas para as suas atividades, é denominado de mutação genética. As alterações podem ocorrer em genes especiais, denominados oncogenes que quando ativados transcrevem proteínas com função regulatória positiva de eventos celulares ligados à estimulação do ciclo celular de duplicação e proliferação, e são responsáveis pela malignização das células normais (CORTNER & WOUDE, 1997). Os produtos de genes supressores de tumor são proteínas com função regulatória negativa de crescimento e sua perda de função também promovem a carcinogênese (PERKINS & STERN, 1997).
Essas células cancerosas são, geralmente, menos especializadas nas suas funções do que as suas correspondentes normais. Conforme as células cancerosas vão substituindo as normais, os tecidos invadidos vão perdendo suas funções. Por
exemplo, a invasão dos pulmões gera alterações respiratórias e a invasão para o cérebro pode gerar dores de cabeça, convulsões, alterações da consciência etc. (KUMMAR et al., 2004).
O tratamento do câncer varia de acordo com o tipo de tecido afetado e a gravidade da doença. Estes tumores podem ser tratados com cirurgia, radioterapia, quimioterapia ou, ainda, com a combinação dessas técnicas. A quimioterapia, diferente da cirurgia e da radioterapia, é um tratamento sistêmico, à base de fármacos que impedem a reprodução celular e, consequentemente, levam as células à morte. Estes fármacos podem ser administrados isoladamente (monoquimioterapia) ou combinados (poliquimioterapia), sendo que a última apresenta resultados mais eficazes, pois consegue maior resposta a cada aplicação, diminuindo o risco de resistência aos fármacos e conseguindo atingir as células em diferentes fases do seu ciclo (CARVALHO et al., 2003). Drogas quimioterápicas usadas no tratamento de tumores malignos apresentam sérios efeitos colaterais, os quais incluem neurotoxicidade, nefrotoxicidade, neuropatia periférica e citopenia (BRUCE, 1993).
Diversos produtos naturais estão disponíveis como agentes quimioterápicos contra câncer (REDDY et al., 2003). Dentre esses, as plantas e seus extratos têm sido reconhecidos pelo potencial anticâncer. Nesse sentido, a elucidação dos componentes químicos ativos presentes nas plantas, bem como de seus mecanismos de ação, vem sendo um dos maiores desafios para a química farmacêutica, a bioquímica e a farmacologia (GEBHARDT, 2000).
Entretanto, o estudo racional e organizado de plantas como fontes de agentes antineoplásicos somente iniciou com os estudos pioneiros de HARTWELL e colaboradores durante o período de 1947 - 1953, quando pela primeira vez, constituintes puros originados de plantas foram caracterizados e associados com a atividade antitumoral do extrato bruto (HARTWELL, 1967).
O produto natural não precisa ser necessariamente o produto final para o uso farmacêutico (KINGSTON, 1996). Essas substâncias podem servir como protótipo para o design e desenvolvimento de uma segunda geração de agentes com características melhoradas, com o aumento da eficácia, estabilidade, melhoramento das propriedades farmacocinéticas e diminuição dos efeitos colaterais (ORTHOLAND & GANESAN, 2004). A obtenção de análogos é um processo comumente utilizado para descobrir os grupamentos essenciais à atividade biológica, através do uso da relação entre a estrutura química e atividade biológica.
Várias propriedades citotóxicas e antitumorais têm sido referidas a espécies de plantas aromáticas (SONBOLI et al., 2010). Essas atividades, em geral, têm sido atribuídas aos óleos essenciais e/ou seus componentes químicos que representam de 1 - 2% da composição desses vegetais (FATURI et al., 2010; DE ALMEIDA et al., 2011).
Os óleos essenciais apresentam-se em misturas de diferentes concentrações, tendo, normalmente uma substância majoritária, que na grande maioria são derivados fenilpropanoides ou de terpenoides, preponderando os últimos. As substâncias terpênicas mais frequentes nos óleos voláteis são os monoterpenos e os sesquiterpenos (CHAPPELL, 1995). Nesse sentido, diversos monoterpenos estruturalmente simples, como por exemplo o álcool perílico, tem demonstrado uma gama de atividades anticancerígenas, desde testes in vitro, em linhagens humanas de células tumorais, quanto em ensaios in vivo em camundongos (YERUVA et al., 2007; CHOW et al., 2002; CLARK et al., 2002, 2003).
Com base no potencial biológico dos óleos essenciais e seus metabólitos individuais e, tendo em vista à grande necessidade de um tratamento mais efetivo contra o câncer, o presente trabalho visa determinar a atividade citotóxica de um conjunto de substâncias estruturalmente relacionadas frente a linhagens de células tumorais. Adicionalmente, foi preparado e avaliado um conjunto de substâncias análogas ao álcool perílico, visando identificar as características estruturais e funcionais que contribuem para a citotoxicidade in vitro. Além disso, objetivou-se investigar a atividade antitumoral in vivo das substâncias mais citotóxicas, como também avaliar o mecanismo de citotoxicidade das moléculas mais bioativas. A relevância dessa investigação é relevante devido ao fato de que, embora existam muitos relatos na literatura demonstrando a atividade citotóxica e antitumoral de substâncias isoladas, poucos correlacionam à relação estrutura-atividade biológica de seus constituintes químicos.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Câncer e sua Formação
O termo câncer vem do latim “cancer”, que significa “caranguejo”, no qual foi empregado em analogia entre a morfologia do crustáceo e o modo de crescimento infiltrante do tumor (DE ALMEIDA, 2005). Representa um conjunto de mais de 100 doenças e é definido como enfermidades complexas de caráter mutacional, proliferativo, de crescimento celular aberrante e descontrolado, em que células em um mesmo microambiente, invadem os tecidos e órgãos adjacentes, podendo migrar para regiões distantes do organismo, evento este conhecido como metástase (KUMAR et
al., 2004; INCA, 2010).
As células cancerígenas possuem defeitos nos mecanismos que governam a proliferação normal. Entre as características do tumor maligno estão à autossuficiência da sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade a inibidores do crescimento, inibição da morte celular não seguida de autólise (apoptose), potencial replicativo ilimitado, angiogênese, poder de invasão e capacidade de causar metástases (HANAHAN & WEINGER, 2000).
A célula neoplásica passa a ser considerada nesta condição, quando ela adquire vantagens metabólicas e capacidades biológicas quando comparadas às células não transformadas: a) perda do controle da proliferação e divisão celular; b) imortalização celular devido à ativação da enzima telomerase; c) alterações cromossômicas (de forma e número); d) perda das propriedades adesivas da membrana plasmática, que permite o reconhecimento célula-célula e a inibição por contato do movimento e crescimento celular; e) perda de função e da capacidade de diferenciação ou especialização; f) capacidade para invadir tecidos vizinhos ou distantes e formar metástases; g) capacidade de induzir a formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese). Observa-se, no entanto, que todos os casos de câncer estão envolvidos com as vias de transmissão de sinais biológicos, no controle positivo e negativo do ciclo celular e da morte celular programada (LIOTTA & KOHN, 2001; RIBEIRO et al., 2003).
A formação do câncer dá-se pelo processo denominado carcinogênese, que geralmente ocorre lentamente, podendo levar vários anos para que uma célula cancerosa origine um tumor detectável. Esse processo passa por três estágios até
chegar à formação tumoral: são os de iniciação, promoção e de progressão (SPANDIDOS, 1985; CHABNER & LONGO, 1996; KUMMAR et al., 2004; SPANDIDOS, 2007).
O primeiro estágio da carcinogênese é o da iniciação. As células sofrem o efeito de um agente carcinogênico, também chamado de agente oncoiniciador, que provoca modificações em alguns de seus genes. Nesta fase as células encontram-se geneticamente alteradas, mas ainda não é possível se detectar um tumor clinicamente. Como exemplo de substâncias químicas carcinogênicas tem sido descrito o sulfato de dimetila, metilnitrossureia, cloreto de vinila, aflatoxinas, dimetilnitrosamina e benzopireno, entre outros agentes não químicos, como: exposição por vírus, hepatite B, Vírus T-linfotóprico humano (HTLV), Papiloma vírus humano (HPV), radiação ionizante (CHABNER & LONGO, 1996; SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; JUNG et al., 2006).
Na fase seguinte, denominada de promoção, as células geneticamente alteradas (iniciadas) sofrem um efeito prolongado dos agentes oncopromotores, induzindo a expressão de proto-oncogenes. A célula iniciada é transformada em célula maligna, de forma lenta e gradual. O terceiro e último estágio é o da progressão e caracteriza-se pela multiplicação descontrolada, sendo um processo irreversível. O tumor maligno já está em fase de desenvolvimento no microambiente favorável, evoluindo até o surgimento das primeiras manifestações clínicas da doença. Os fatores que promovem a iniciação ou progressão da carcinogênese são chamados de carcinógenos. Existe um grande número de agentes que causam lesão e induzem a transformação neoplásica das células, são eles classificados como: carcinógenos químicos, físicos e biológicos (vírus, parasitas e bactérias). O fumo, por exemplo, é um agente carcinógeno completo, pois possui componentes que atuam nos três estágios da carcinogênese. (SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; JUNG et al., 2006; SPANDIDOS, 2007).
O estudo das bases moleculares no desenvolvimento de tumores (tumorigênese) forneceu suporte para o conceito de que o câncer é uma doença causada pelo acúmulo progressivo de diversas alterações no genoma (BAYLIN; OHM, 2006). Geralmente a maioria dos tumores é formada pela transformação gradativa de células normais em células tumorais através de diversas alterações na fisiologia normal da célula, como a autossuficiência na sinalização de fatores de crescimento e insensibilidade a sinais para inibição do crescimento (HANAHAN; WEINBERG, 2000).
HANAHAN & WEINBERG (2002) descreveram as principais características que essa diversidade de células tumorais pode adquirir, definido como “marcas registradas do câncer”, dentre as quais podemos citar: autossuficiência na regulação dos sinais de crescimento celular, resistência a sinais antiproliferativos, evasão da morte celular programada (apoptose), potencial replicativo ilimitado, indução da angiogênese, invasão tecidual e metástases (HANAHAN & WEINBERG, 2000) (Figura 1).
Figura 1. Principais características das células tumorais. (Adaptado de HANAHAN & WEINBERG, 2011).
As neoplasias malignas estão intimamente relacionadas a alterações no genoma. O agente carcinógeno quando incide sobre uma célula normal, causa alterações na molécula de DNA. Essas alterações são denominadas de mutação. Qualquer célula normal pode sofrer alterações no seu material genético. As mutações de maior relevância encontradas no câncer tornam o funcionamento dos oncogenes dominante e o dos genes supressores tumorais recessivos. Normalmente essa alteração é reparada, ou então a célula entra em processo de morte. Na verdade, para que a mutação de fato ocorra, é necessário que o DNA alterado seja replicado e passado para as células-filhas. Na carcinogênese, não apenas uma mutação, mas uma série de eventos acumulados ao longo dos anos é necessária para desencadear esse processo (CORTNER; WOUDE, 1997; HANAHAN; WEINBERG, 2011).
Recentemente, também tem sido discutida a importância crucial do microambiente inflamatório tumoral (MIT), no favorecimento da progressão tumoral através do recrutamento e diferenciação subsequente de linfócitos, macrófagos e células dendríticas. Estas células podem ser ativamente promotoras tumorais, uma vez que tais células contribuem para a indução da angiogênese, proliferação das células tumorais e invasividade (HANAHAN & WEINBERG, 2011).
Nesse contexto, no combate a proliferação de células tumorais bem como ao grau de invasividade, a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia são estratégias terapêuticas clássicas para o tratamento de pacientes com diferentes tipos de câncer. Atualmente são relatados muitos casos de sucesso no tratamento de diversos tipos de tumor, mas ainda não se chegou ao fármaco ideal e as terapias existentes nem sempre alcançam resultados satisfatórios, como a remissão de tumores e a prevenção de metástase, além de induzir muitos efeitos colaterais (INCA, 2014).
Uma característica comum a grande parte dos quimioterápicos antineoplásicos, dos quais 61% são de origem natural (NEWMAN & CRAGG, 2007), é a citotoxicidade, que tem como resultado final, na maioria das vezes, a morte por apoptose das células tumorais. Diferentes alvos, como o DNA, microtúbulos, tubulina, topoisomerase, proteassomo, tirosinas quinase, telomerase, proteínas de checagem do ciclo celular, dentre outros, são capazes de induzir a célula tumoral a entrar em apoptose (BAILLY, 2000; JORDAN, 2002; CHASE & CROSS, 2006; HUWILER & ZANGEMEISTER-WITTKE, 2007).
No Brasil, a estimativa para o ano de 2014, que será válida também para o ano de 2015, aponta para a ocorrência de aproximadamente 576 mil casos novos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. O câncer de pele do tipo não melanoma (182 mil novos casos) será o mais incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (69 mil), mama feminina (57 mil), cólon e reto (33 mil), pulmão (27 mil), estômago (20 mil) e colo do útero (15 mil). Sem considerar os casos de câncer de pele não melanoma, estimam-se 395 mil casos novos de câncer, 204 mil para o sexo masculino e 190 mil para sexo feminino. Em homens, os tipos mais incidentes serão os cânceres de próstata, pulmão, cólon e reto, estômago e cavidade oral; e, nas mulheres, os de mama, cólon e reto, colo do útero, pulmão e glândula tireoide (INCA, 2014).
O desenvolvimento da maioria dos cânceres requer múltiplas etapas que ocorrem ao longo de muitos anos. Assim, alguns tipos de câncer podem ser evitados pela eliminação da exposição aos fatores determinantes. Se o potencial de malignidade for detectado antes de as células tornarem-se malignas, ou numa fase inicial da doença, tem-se uma condição mais favorável para seu tratamento e, consequentemente, para sua cura.
A prevenção e o controle do câncer precisam adquirir o mesmo foco e a mesma atenção que a área de serviços assistenciais, pois o crescente aumento do número de casos novos fará com que não haja recursos suficientes para dar conta das necessidades de diagnóstico, tratamento e acompanhamento. Assim, medidas preventivas devem ser implementadas para reduzir a carga do câncer, como as estratégias para o controle do tabagismo, relacionado ao câncer de pulmão, entre outros; a promoção da alimentação saudável, para a prevenção dos cânceres de estômago e intestino, entre outros; a vacinação para Papiloma vírus humano (HPV) e hepatite, contra o câncer do colo do útero e de fígado (HANAHAN & WEINGERG, 2000; CORTNER & WOUDE, 1997).
- Ciclo Celular
O crescimento e a divisão de células somáticas dependem de uma série complexa de reações bioquímicas que ocorrem em um período de 24 a 48 horas, denominado ciclo celular. O ciclo celular compreende os processos de duplicação do DNA e divisão nuclear (mitose), e dele resulta a produção de uma nova célula. Para iniciar um ciclo, a célula em repouso (fase G0) precisa ser estimulada por fatores de crescimento (exemplos, PDGF, EGF, insulina), hormônios esteroides e citocinas produzidas por elas mesmas ou células ao seu redor. Esses fatores ligam-se aos seus receptores de membrana, deflagrando uma série de reações químicas que causam, em última instância, a ativação de fatores de transcrição (exemplos: c-myc, c-jun, cfos), os quais promovem a síntese de RNA, mensageiros de dezenas de enzimas que promovem a síntese do ácido desoxirribonucleico (DNA), tais como diidrofolato redutase, DNA polimerases e topoisomerases. Essa cascata de eventos químicos e morfológicos ocorre de uma maneira ordenada e sucessiva, fazendo com que a célula avance da fase G0 para as fases G1 – S - G2 e para a mitose (MALUMBRES & BARBACID, 2001).
A execução das reações e dos eventos de cada fase do ciclo celular é mediada por dezenas de fatores, cuja síntese e destruição ocorrem em momentos determinados. Os principais são os seguintes: ciclinas A, B e D, enzimas quinases dependentes de ciclinas: CDK-1, 2, 4 e 6, fosfatases: cdc-25 A, B e C, proteínas inibidoras de CDKs: p21, p27, p57, p16, p18, e fatores de transcrição: c-myc, E2F, Rb e p53. Os complexos formados por CDK/ciclina/inibidor de CDK são inativos e a sua ativação requer eliminação, por degradação, do inibidor de CDK associado a ele (por exemplo: p21, p27), um evento que ocorre durante as transições de fases. A ativação dos complexos CDK-4/ ciclina D, CDK-4/ciclina-6, CDK-2/ ciclina A, CDK-2/ciclina E aumenta a atividade quinase dessas enzimas e provoca a fosforilação progressiva de RB. Isto causa a dissociação do complexo E2F/RB, permitindo que E2F inicie a transcrição de genes da fase S. Mais tarde, a ativação do complexo CDK-1/ciclina B promove a fosforilação de várias proteínas nucleares, a condensação dos cromossomas, a formação do fuso e o início da mitose (MALUMBRES & BARBACID, 2001).
A atividade enzimática do complexo cessa após a degradação da ciclina B, e esse evento marca o fim do ciclo celular (MALUMBRES & BARBACID, 2001). As reações e eventos do ciclo celular são interrompidos em momentos específicos nas transições das fases G0/G1 (ponto de restrição R1), fases G1/S e G2/mitose. Durante esses períodos críticos denominados “pontos de checagem”, a célula decide: se inicia o ciclo (ponto de restrição R1) ou se avança para a fase seguinte, continuando o processo de proliferação, ou se sai do ciclo, iniciando o processo de diferenciação celular, se estiver passando pela mitose, ou ainda, entra em apoptose. Esse mecanismo de checagem é dependente de reações em cascatas mediada por enzimas quinases e fosfatases.
Em resposta à ativação de uma dessas vias, são sintetizadas as enzimas que fazem reparo, recombinação, junção ou permutação de nucleotídeos e que estão envolvidas nos processos de reconhecimento e de correção de erros e falhas no DNA em síntese. São exemplos importantes a GADD45, poli-(ADP-ribose) polimerase (PARP), MSH2 e MLH1. Na maioria das vezes, a ativação das vias de checagem é iniciada pelo fator supressor de tumores p53, que atua na transcrição de dezenas de genes, incluindo o gene da proteína p21. A p21 bloqueia o ciclo celular e inibe a atividade de enzimas CDKs, que são responsáveis pelo controle positivo do ciclo celular. O bloqueio do ciclo celular é transiente e precisamente regulado
(MALUMBRES & BARBACID, 2001; HOEIJMAKERS, 2001; HAHN & WEINBERG, 2002).
Estudos recentes mostraram que a degradação de várias proteínas reguladoras do ciclo celular, em especial as proteínas p21, p27, ciclinas A e B, Rb, E2F, MDM2 e p53, é mediada pelo sistema ubiquitina-proteasoma, caso a decisão seja a proliferação celular; e pela família caspase de enzimas proteases, caso a decisão seja a apoptose. Esse mecanismo de regulação mostrou também que pode ser alterado em células neoplásicas para impedir a deflagração dos sinais que ativam a apoptose.
- Mecanismo de Morte Celular
A morte celular programada ou apoptose é um processo fisiológico de morte celular pelos quais as células que perderam suas funções ou apresentam defeitos são eliminadas do organismo. Durante a embriogênese, a morte por apoptose de células embrionárias precursoras é essencial para a formação final de órgãos e membros. Além disso, a apoptose atua na seleção e depleção de clones de células do sistema imunológico e de células em excesso, deixando em perfeito equilíbrio as populações de células dos tecidos durante a vida adulta dos mamíferos (EARNSHAW et al., 1999). Desta forma, estão implicadas em muitas doenças, aberrações genéticas, que alteram o processo da apoptose, incluindo-se o câncer, doenças autoimunes, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas.
Vários oncogenes que causam, em células malignas, desregulação no seu ciclo celular atuam ora estimulando, ora inibindo a apoptose, dependendo do estágio de desenvolvimento do tumor (EVAN & VOUSDEN, 2001). Mutações oncogênicas, que levam ao aumento da expressão dos genes c-myc, E2F, E1A (proteína viral) e Ras, ou à perda da expressão do gene Rb, desencadeiam a apoptose. Mas esse fenômeno não é aparente em populações de células malignas porque elas contêm mutações que inativam os oncogenes p53 e MDM2, ou mutações que aumentem a expressão de genes Bcl-2, ou ainda, mutações que acarretem a produção excessiva dos fatores de crescimento: IGF-1, PDGF, NGF e IL-3. A ligação desses fatores de crescimento aos seus receptores provoca a ativação da cascata de enzimas, quinases, entre elas, a fosfoinositol-3-quinase (IP3), Ras, Raf e a proteína serina/treonina quinase B/Akt, como também a do fator de transcrição NF-kB. Esses fatores atuam em reações ou vias de sobrevivência e resistência à apoptose (EVAN & VOUSDEN, 2001).
Em vários estudos ficou evidenciado que as células, quando enfrentam situações fisiológicas e patológicas adversas, tais como, infecção por micro-organismos, estresse oxidativo e outras formas moderadas de injúria, somente permanecem vivas se os efeitos pró-apoptóticos gerados nessas situações forem contrabalanceados pelos efeitos anti-apoptóticos, mediados pelas vias de sobrevivência. Esse mecanismo de sinalização dual exerce um papel chave no controle da proliferação e morte celular (EVAN & LITTLEWOOD, 1998).
Assim, para o processo de proliferação ter sucesso, é preciso que a célula ative as duas vias de sinalização: a de sobrevivência, que atua suprimindo a maquinaria da apoptose, e a de proliferação, que desencadeia o crescimento celular. Esta intercomunicação entre ciclo celular e a apoptose é sem dúvida o fator determinante nas variações de sensibilidade à apoptose entre as células tumorais. Este suposto sistema regulador tem servido como base estrutural para unir a genética e a terapia do câncer (CORTNER & WOUDE, 1997).
Segundo CARDONE e colaboradores (1998) a apoptose é caracterizada por eventos morfológicos e bioquímicos que ocorrem de uma forma ordenada na célula em degeneração. Esses eventos são regulados por genes preservados em vários organismos, incluídas leveduras, parasitas, plantas e insetos.
A apoptose é desencadeada por duas vias principais. Na primeira via, o sinal vem do lado externo e por isso é denominada via extrínseca. Na segunda, o sinal vem de dentro da célula, e por isso é denominada via intrínseca. A via extrínseca é iniciada através da ativação de receptores de membrana, denominados receptores de morte celular. A via intrínseca é iniciada pela liberação de fatores mitocondriais. Em ambos os casos, o resultado imediato é a ativação de enzimas proteases da família caspase, que são expressas na forma de pró-enzimas (ou zimógeno).
A ativação das caspases iniciadoras -8, -2 e -10 inicia-se com a ligação das citocinas da família TNF, Fas ou TRAIL aos seus receptores de membrana, identificados pelas siglas: TNFR1, Fas, DR-3, DR-4 ou DR-5 (ASHKENAZI & DIXIT, 1998). Uma vez ativa, a caspase-8 inicia a cascata de ativação das pró-caspases executoras; caspases -3, -6 e -7. A ativação de caspases pela via intrínseca requer a liberação do citocromo c armazenado nas mitocôndrias. A saída de citocromo c é dependente de uma série de eventos elétricos e químicos, sendo os mais estudados: a queda do potencial de transição de permeabilidade iônica, abertura de megaporos e a ruptura pontual de uma região da membrana externa (ADAMS & CORY, 2007).
Esses eventos são modulados pela interação de proteínas inibidoras de apoptose da família Bcl-2 (principais membros: Bcl-2-W, Bcl-xl, MCL-1) e por proteínas indutoras de apoptose da família Bax (principais membros: Bid e Bak), capazes de interagir com elementos estruturais da membrana externa das mitocôndrias, como, por exemplo, as porinas que são poros de transição de permeabilidade para várias moléculas, incluídas a H2O e Ca2+. Esses domínios
provocam a homodimerização de moléculas similares e a formação de poros que permeiam a passagem do citocromo c da mitocôndria para o citosol. Por outro lado, a formação de heterodímeros do tipo Bcl-2/Bax evita a formação dessa estrutura e, consequentemente, a morte celular (ADAMS & CORY, 2007).
Necrose é o conjunto de alterações morfológicas que se seguem à morte celular em um organismo vivo e, é sempre patológica (FERNANDEZ & COTTER, 1994). As membranas das células necróticas perdem a sua integridade, ocorrendo extravasamento de substâncias contidas nas células. Isto tem importância clínica, pois algumas delas são especialmente abundantes em determinados tipos celulares (Figura 2). Estas substâncias entram na corrente circulatória, podendo ser detectadas e interpretadas como evidência de morte celular. Nos casos de infarto agudo do miocárdio, por exemplo, Troponinas (Tn-I e Tn-T) e creatina quinase (CK-MB) acham-se preacham-sentes ou elevadas no sangue periférico, onde podem acham-ser dosadas, constituindo assim importante método diagnóstico (Xu et al., 2004).
Além da apoptose e necrose, as células cancerosas também demonstram ser eficazmente eliminadas por autofagia, necrose e catástrofe mitótica (AMARAVADI; THOMPSON, 2007; LANZ et al., 2013; RAMAKRISHNAN; GABRILOVICH, 2013). A autofagia é uma via de degradação celular, essencial para homeostase do organismo, a qual tem sido implicada na proteção de organismos contra uma variedade de doenças. Ela envolve a degradação seletiva dos componentes celulares, incluindo proteínas de longa duração, agregados de proteínas, organelas citoplasmáticas danificadas e patógenos intracelulares, resultando na reciclagem de nutrientes e na geração de energia (SU, MEI & SINHA, 2013) (Figura 2).
Normalmente, a autofagia e apoptose são ambos os caminhos supressores tumorais. A autofagia tem o papel de facilitar a degradação de moléculas oncogênicas, prevenindo o desenvolvimento do câncer, enquanto a apoptose impede a sobrevivência de células cancerígenas. Consequentemente defeitos ou níveis
inadequados de autofagia ou apoptose podem levar ao câncer (SU, MEI & SINHA, 2013).
NECROSE
Célula normal Inchaço reversível
Inchaço
irreversível Desintegração
APOPTOSE
Célula normal Condensação Fragmentação
Corpos apoptóticos e
fagocíticos
Figura 2. Distinção das diferentes alterações morfológicas nos processos de morte celular por apoptose versus necrose. (www.virtual.unifesp.br/unifesp/bio40/apoptose).
A necrose, diferentemente da apoptose, é caracterizada pela perda de integridade de membrana plasmática, floculação da cromatina, inchaço seguido de lise celular com extravasamento do conteúdo intracelular e desintegração de organelas (Tabela 1). Por outro lado, o processo apoptótico envolve alteração de permeabilidade de membranas, condensação cromatínica, encolhimento celular, formação de corpos apoptóticos sem desintegração de organelas.
Como consequência da necrose ocorre inflamação nos tecidos adjacentes para a eliminação dos tecidos mortos e posterior reparo. Durante este processo inflamatório acumulam-se leucócitos na periferia do tecido lesado, que liberam enzimas úteis na digestão das células necróticas. O aspecto morfológico da necrose resulta da digestão das células necróticas por suas próprias enzimas (autólise) ou de enzimas derivadas dos leucócitos (heterólise).
Tabela 1 – Características morfológicas, bioquímicas e fisiológicas que distinguem necrose de apoptose.
Características NECROSE APOPTOSE
Morfológicas
▪ Perda da integridade da membrana
▪ Lise total da célula ▪ Não há formação de
vesículas
▪ Desintegração das organelas celulares
▪ Não há perda da integridade da membrana
▪ Agregação e marginalização da cromatina
▪ Diminuição do volume citoplasmático e condensação do núcleo
▪ Fragmentação da célula em corpos apoptóticos
▪ Aumento da permeabilidade mitocondrial
Bioquímicas
▪ Perda da regulação da homeostasia iônica ▪ Não requer energia ▪ Digestão aleatória do DNA
▪ Processo altamente regulado, envolvendo ativação enzimática
▪ Dependente de ATP
▪ Digestão não aleatória do DNA
▪ Liberação de vários fatores mitocondriais ▪ Ativação da cascata de caspases ▪ Alterações na assimetria da membrana
plasmática
Fisiológicas
▪ Afeta grupos de células ▪ Iniciada por estímulos não
fisiológicos
▪ Fagocitose por macrófagos ▪ Resposta inflamatória
▪ Afeta células individuais
▪ Induzida por estímulos fisiológicos ▪ Fagocitose por células adjacentes ou por
macrófagos
▪ Sem resposta inflamatória
A necrose ocorre após a morte da célula, razão pela qual a capacidade de diagnosticá-la morfologicamente varia de acordo com o método de observação (ASHKENAZI, 2002). Ao microscópio óptico percebemos alterações citoplasmáticas e alterações nucleares. As alterações citoplasmáticas consistem em aumento da acidofilia, retração e vacuolização. As alterações nucleares consistem em
cariopicnose (retração e aumento da basofilia nucleares), cariorréxis (fragmentação do núcleo) e cariólise (dissolução nuclear) (MEIER et al., 2000).
2.2. Tumor Experimental Sarcoma 180
Sarcoma é um termo de origem grega que significa “crescimento “carnoso”. O Sarcoma de camundongos (S180) foi um dos primeiros tumores experimentais a serem transplantados em animais. Inicialmente este tumor, descoberto em 1914, no Laboratório Crocker nos Estados Unidos, como uma massa sólida na axila direita de um camundongo branco, foi denominado de Tumor de Crocker. Esse tumor foi primariamente classificado como carcinoma mamário, mas após várias transplantações subcutâneas, observou-se que suas características morfológicas e seu comportamento eram característicos de um sarcoma e passou, então, a ser chamado de Sarcoma 180 (QI & XU, 2006).
Com o passar do tempo, estudos demonstraram que suas células não permitem sua caracterização como de origem epitelial e o tumor tinha características de invasão muscular, tecido adiposo, nervos e vasos. Esse tumor pode ser transplantado por inoculações intraperitoneal, intramuscular e subcutânea. Apesar de seu comportamento agressivo local, esse tumor não desenvolve metástase (STEWART et
al., 1959; ZUCKERBERG, 1973).
A redução do crescimento tumoral ou o aumento da expectativa de vida no decorrer do tratamento foram comparados com os grupos não tratados, o que determina a avaliação da atividade antitumoral. Ficou demonstrado que o melhor resultado desses fatores depende do procedimento do tratamento, que deverá ser iniciado até 48 horas após o transplante. Neste período, as células tumorais já teriam iniciado a formação do nódulo tumoral (SCHABEL et al., 1977).
Devido ao grande número de aplicações farmacológicas de substâncias naturais oriundas de plantas, recentes trabalhos têm investigado a atividade antitumoral desses produtos naturais (KIDD, 2000; ALVES et al., 2004). Esses fatores, somados ao limitado efeito dos medicamentos sintéticos em doenças crônicas tem estimulado à pesquisa de plantas medicinais como alternativa terapêutica, com resultados bastante satisfatórios (RATNER & BRYANT, 2004).
A vantagem da utilização de neoplasias transplantáveis, em comparação com as demais, recai sobre o conhecimento prévio da quantidade e das características
iniciais das células tumorais a serem inoculadas e sobre o desenvolvimento rápido da neoplasia, que restringe o tempo de estudo (STEWART et al., 1959). Além disso, na área de cancerologia experimental, os testes morfológicos e histoquímicos têm se tornado de grande importância para a triagem preliminar das mudanças moleculares induzidas por drogas antineoplásicas (QI & XU, 2006).
2.2. Triagem de Novos Fármacos e o Tratamento do Câncer
Os vegetais representam as maiores fontes de substâncias ativas que podem ser usadas na terapêutica, devido à grande diversidade estrutural de metabólitos produzidos e, talvez, a fonte mais antiga de medicamentos para o homem. Na busca de novos medicamentos originados de plantas são envolvidos diversos conhecimentos que vão desde aspectos agronômicos, botânicos, químicos, farmacológicos e toxicológicos (BALUNAS et al., 2005).
De acordo com NEWMAN, CRAGG & SNADER (2003), medicamentos derivados de produtos naturais são capazes de tratar 87% das enfermidades humanas categorizadas, incluindo as indicadas como antibacterianas, anticoagulantes, antiparasitárias, imunossupressoras e anticancerígenas. Esta última classe de medicamentos teve 1/3 do mercado em 2002 representado apenas por dois grupos de quimioterápicos derivados de produtos naturais, sendo que os taxanos e derivados da camptotecina representam cerca de U$ 3 bilhões de dólares (THAYER, 2003; OBERLIES & KROLL, 2004).
Metodologias recentes cada vez mais modernas de isolamento e identificação de substâncias de fontes naturais têm propiciado aumento no número de novas estruturas químicas bioativas para inúmeras indicações terapêuticas. Paralelo a esse progresso, desenvolveram-se métodos de screening biológicos automatizados (High
Throughput Screening - HTS) que permitem testar in vitro milhares de substâncias
frente a alvos biológicos específicos em curto espaço de tempo Metodologias recentes cada vez mais modernas de isolamento e identificação de substâncias de fontes naturais têm propiciado aumento no número de novas estruturas químicas bioativas (BALUNAS & KINGHORN, 2005).
Com o aprimoramento da metodologia de cultura de células foi possível o desenvolvimento de diversas linhagens celulares oriundas de tumores humanos, que possibilitaram o desenvolvimento da metodologia para triagem in vitro. No processo
de descoberta de drogas anticâncer, o screening pré-clínico no Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (US-NCI) em linhagens tumorais humanas in vitro e seleção de testes in vivo ajudam a identificar a maioria das drogas alvos. No próximo estágio de desenvolvimento de drogas, ensaios toxicológicos, de produção e de formulação são realizados antes da droga iniciar uma triagem clínica (LEE, 1999).
Com esse objetivo, o US-NCI desenvolveu um painel de células cancerígenas que, atualmente, conta com 60 linhagens oriundas de oito tipos de tumores sólidos (pulmão, melanoma, mama, rim, cólon, próstata, ovário, cérebro) e do sistema hematopoiético (leucemia). Dessa maneira, essa metodologia permite a avaliação em diversos tipos de células neoplásicas, possibilitando a descoberta de drogas com maior especificidade. Outra vantagem dessa triagem é a rapidez e eficiência do método, que em apenas quatro dias pode avaliar um número elevado de drogas (SKEHAN et al., 1990; RUBINSTEIN et al., 1990).
Os sistemas in vitro, como alternativa aos experimentos animais nas pesquisas toxicológicas, avaliam o grande número de substâncias sintetizadas ou purificadas. Os ensaios de citotoxicidade utilizando células in vitro têm sido usados para determinar a atividade e o mecanismo de ação de produtos naturais antitumorais, além de identificar novos alvos moleculares (NAGLE et al., 2004). Com isso, a análise da função celular é a atividade central da pesquisa científica de novos antitumorais. Os parâmetros analisados são geralmente número de células, integridade da membrana celular ou atividade de certas enzimas celulares. O número celular pode ser medido, por exemplo, pela análise do total de conteúdo de DNA. Análises da integridade da membrana permitem melhor detecção de efeitos citotóxicos e podem ser acessadas por análise da habilidade da célula em reter substâncias, como por exemplo, no teste da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) ou nos ensaios de incorporação do corante vital vermelho neutro. Testes comuns usados para detectar o estado metabólico das células incluem também o MTT (integridade mitocondrial) (HYNES et al., 2006).
Após os ensaios in vitro, ensaios clínicos são desenvolvidos com o objetivo de investigar e encontrar agentes naturais e sintéticos que sejam capazes de prevenir, bloquear ou reverter tanto a fase de iniciação da carcinogênese quanto a progressão de células pré-malignizadas. Estes estudos incluem análises de toxicidade e segurança dose-dependente (Fase 1), eficiência em uma pequena população com alto risco tanto para cânceres específicos quanto para presença de biomarcadores (Fase
