Viabilidade genética de restaurações florestais : diversidade e estrutura genética em Myroxylon peruiferum L.f.

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Viabilidade gen´

etica de restaura¸

c˜

oes florestais: Diversidade e

estrutura gen´

etica em Myroxylon peruiferum L.f.

Campinas

2014

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INSTITUTO DE BIOLOGIA

Kaiser Dias Schwarcz

Viabilidade gen´

etica de restaura¸

c˜

oes florestais: Diversidade e

estrutura gen´

etica em Myroxylon peruiferum L.f.

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Unicamp para obten¸cão do T´ıtulo de Doutor em Genética e Biologia Molecular na área de Genética vegetal e melhoramento.

Orientadora: Dra. Maria Imaculada Zucchi

Co-orientador: Prof. Dr. Ricardo Ribeiro Rodrigues

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE `A VERS ˜AO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO KAISER DIAS SCHWARCZ, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARIA IMACULADA ZUCCHI

Campinas

2014

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A degrada¸cão ecológica e o desflorestamento são processos que se iniciaram há muito tempo e cuja história confunde-se com a da agricultura.

A Mata Atlântica é a segunda maior floresta tropical em ocorrência e importância na América do Sul, possuindo grande diversidade biológica e altos n´ıveis de endemismo. A ocupa¸cão desordenada da Mata Atlântica causou sua redu¸cão a 11,26% de sua área original, com distribui¸cão de forma fragmentada pelo território brasileiro. A destrui¸cão da Mata Atlântica tem resultado na elimina¸cão de muitas popula¸cões e, potencial-mente, na erosão da diversidade genética de diversas espécies. Essa combina¸cão de alto endemismo e forte amea¸ca de extin¸cão, faz com que a Mata Atlântica seja considerada um hotspot para a conserva¸cão.

Nas últimas décadas a recupera¸cão de ecossistemas degradados recebeu a aten¸cão da comunidade cient´ıfica, dando origem ao campo do conhecimento chamado Ecologia da Restaura¸cão, que se dedica aos estudos teóricos dos princ´ıpios, práticas, resultados e conseqüências de projetos de restaura¸cão. O estudo e monitoramento de áreas de restaura¸cão florestal é essencial para melhorar as técnicas de restaura¸cão em ecossis-temas tropicais e subtropicais. Para que uma determinada espécie se perpetue em uma ´

area em processo de restaura¸c˜ao, ´e preciso que a mesma desenvolva todo o seu ciclo de vida e que gerem descendentes capazes de se desenvolver a ponto de substituir as ´

arvores mães quando as mesmas entrarem em senescência. Por isso há a necessidade de se estudar a variabilidade genética de popula¸cões arbóreas dentro de áreas de floresta restaurada, assim como a ocorrência e efetividade do fluxo gênico entre estas áreas e os fragmentos de seu entorno. Neste trabalho, estudamos a variabilidade genética de Myroxylon peruiferum L. f., em duas diferentes áreas de restaura¸cão florestal e em duas ´

areas de remanescentes naturais de Floresta Estacional Semidecidual.

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apo-naturais. A principal diferen¸ca entre áreas naturais e restauradas foi a menor riqueza de alelos endêmicos nestas últimas o que é um efeito de amostragem que favorece a perda de alelos raros. A área de restaura¸cão florestal mais antiga em Cosmópolis apresentou uma estrutura¸cão genética espacial compat´ıvel com a de áreas naturais. O mesmo não ocorreu com a restaura¸cão mais recente de Iracemápolis. Observou-se a ocorrência de estrutura¸cão genética local nas áreas naturais e na área de restaura¸cão mais antiga e ind´ıcios de fluxo gênico entre os áreas nativas e restauradas.

Um estudo adicional do efeito de amostragem sobre as freqüências alélicas demons-trou o fenômeno de perda de alelos com baixa freqüência em eventos de amostragem. O mesmo trabalho indicou que uma amostra de cerca de 30 indiv´ıduos é capaz de repre-sentar adequadamente alelos com freqüências acima de 0,05; sendo este um bom número a se considerar na sele¸cão de matrizes para fornecimento de mudas para restaura¸cão florestal.

(9)

Ecological degradation and deforestation are processes that started long ago and whose history is intertwined with that of agriculture. Atlantic Forest is the second largest rainforest in occurrence and importance in South America, having great biolog-ical diversity and high levels of endemism. Disordered occupation of Atlantic Forest caused its reduction to 11.26% of the original area, with distribution in forest fragments poorly conected across the Brazilian territory. Destruction of the Atlantic Forest has resulted in the elimination of many populations and potentially the erosion of genetic diversity of several species. This combination of high endemism and strong threat of extinction causes the Atlantic Forest to be considered a hotspot for conservation.

In the last decades recovery of degraded ecosystems has received attention from the scientific community giving birth to an new area of knowledge called the Restoration Ecology. The study and monitoring of areas of forest restoration is essential to improve restoration techniques in tropical and subtropical ecosystems. For a given species to perpetuate itself in an area undergoing a restoration process, it needs to develop its whole life cycle and generates progeny capable of developing to the point of replacing mothers trees when they die. Therefore there is a need to study the genetic variabil-ity of tree populations within areas of restored forest, as well as the occurrence and effectiveness of gene flow between these areas and surrounding fragments. We studied the genetic variability of Myroxylon peruiferum L. f., in two different areas of forest restoration and in two areas of natural remnants of semideciduous forest.

Our results indicates that restorations in Cosmopolis and Iracem´apolis conserve ge-netic and allelic diversity (HE) similar to that of natural remnants. The main difference between natural and restored areas was the lowest richness of endemic alleles which is the result of a sampling effect that favors the loss of rare alleles. The area of older forest restoration in Cosmopolis presented a spatial genetic structure consistent with natural

(10)

occurrence of local genetic structure in natural areas and in the area of older restoration and evidence of gene flow between native and restored areas.

An additional study about the effect of sampling size on allele frequencies showed the phenomenon of loss of low frequency alleles in sampling events. The same study found that a sample of about 30 individuals are able to adequately represent alleles with frequencies above 0.05; this is a good number to consider in selecting matrix trees to supply seedlings for forest restoration.

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Resumo vii

Abstract ix

Sum´ario xi

Lista de Figuras xv

Lista de Tabelas xvii

Lista de Abrevia¸c˜oes xix

1 Introdu¸c˜ao 1

1.1 Hist´orico da degrada¸c˜ao ambiental no mundo . . . 1

1.2 Mata Atlˆantica . . . 2

1.3 Consequˆencias da degrada¸c˜ao ambiental . . . 5

1.3.1 Fragmenta¸c˜ao florestal . . . 7

1.3.2 Impedimento do fluxo gˆenico e aumento da endogamia . . . 7

1.3.3 Deriva gen´etica . . . 9

1.3.4 Efeito de Borda . . . 11

1.4 Restaura¸c˜ao florestal . . . 12

1.4.1 Restaura¸c˜ao e Fragmentos florestais . . . 15

1.4.2 Regionalidade . . . 18

1.5 Justificativa: Por que preservar e restaurar a Mata Atlˆantica? Por que este estudo? . . . 20

1.6 Marcadores Moleculares . . . 21

1.6.1 Microssat´elites . . . 21

(12)

2.1 Objetivos Espec´ıficos . . . 25

3 Coleta e extra¸c˜ao de DNA 26 3.1 Introdu¸c˜ao . . . 26

3.2 Metodologia . . . 26

3.2.1 Areas de estudo . . . .´ 26

3.3 Resultados . . . 31

3.3.1 Amostragem das popula¸c˜oes . . . 31

4 Desenvolvimento de bibliotecas de microssat´elites 33 4.1 Introdu¸c˜ao . . . 33

4.2 Objetivos . . . 33

4.3.1 Desenvolvimento de bibliotecas enriquecidas com microssat´elites . . . . 33

5 Padroniza¸cão das amplifica¸cões de regiões microssatélites 42 5.1 Introdu¸cão . . . 42

5.3.1 Genotipagem de locos de microssat´elites nucleares (SSR) em gel de po-liacrilamida . . . 42

5.3.2 Genotipagem de locos de microssat´elites cloroplastidiais (cpSSR) . . . . 43

5.4.1 Padroniza¸cão das rea¸cões de amplifica¸cão de SSR nucleares em M. peruiferum 45 5.4.2 Padroniza¸cão das rea¸cões de amplifica¸cão de SSR cloroplastidiais em M. peruiferum . . . 47

(13)

6.3.1 Amplifica¸c˜ao e genotipagem dos locos microssat´elites . . . 50

6.3.2 An´alise estat´ıstica dos resultados . . . 50

6.4.1 Caracteriza¸c˜ao de SSR em M. peruiferum . . . 52

6.4.2 Caracteriza¸c˜ao de cpSSR em M. peruiferum . . . 56

6.4.3 Compara¸c˜ao de diversidade e estrutura gen´etica entre diferentes faixas de idade . . . 60

6.5 Discuss˜ao . . . 63

7 Identifica¸cão e descri¸cão da estrutura genética local 68 7.1 Introdu¸cão . . . 68

7.3.1 An´alise estat´ıstica dos dados . . . 68

7.4.1 Correla¸c˜ao entre parentesco e distˆancia espacial . . . 72

7.4.2 Estrutura¸cão genética por área de estudo . . . 83

7.5 Discuss˜ao . . . 89

8 Impacto do tamanho amostral nas estimativas de freqüências alélicas e hete-rozigosidade 92 8.1 Objetivos . . . 95 8.2 Metodologia . . . 95 8.3 Resultados . . . 96 8.4 Discussão . . . 102 9 Conclusão 104

(14)

Bibliografia 109

11 Anexo I: Resultados da genotipagem de M. peruiferum por loco e por

(15)

1.1 Extens˜ao do Dom´ınio Mata Atlˆantica . . . 4

1.2 Folhas e frutos de Myroxylon peruiferum . . . 24

3.1 Imagem a´erea das ´areas de estudo . . . 30

4.1 Tipos de repeti¸c˜oes microssat´elites encontradas nas bibliotecas constru´ıdas para M. peruiferum . . . 40

5.1 Gel de padroniza¸c˜ao dos primers de cpSSR em M. peruiferum . . . 44

6.1 Exemplo de gel de genotipagem de locos SSR nucleares em M. peruiferum . . . 52

6.2 Riqueza de alelos privados . . . 54

6.4 Coeficiente de endogamia (f ) por ´area de coleta . . . 56

6.5 Rede de hapl´otipos cloroplastidiais em M. peruiferum . . . 57

6.6 Riqueza de alelos privados por idade . . . 62

6.7 Probabilidade de reten¸c˜ao de alelos raros . . . 65

7.1 Coeficientes de parentesco em fun¸c˜ao da distˆancia: SSR nucleares . . . 74

7.2 Coeficientes de parentesco em fun¸c˜ao da distˆancia: SSR nucleares . . . 75

7.3 Agrupamento das popula¸c˜oes de M. peruiferum para K = 2 . . . 77

7.6 Diferencia¸c˜ao de diferentes grupos gen´eticos feitas por DAPC com agrupamen-tos a priori . . . 78

7.7 Gr´aficos de dispers˜ao dos componentes principais . . . 78

7.8 Discrimina¸c˜ao de diferentes grupos gen´eticos feitas por DAPC sem agrupamen-tos a priori . . . 80

7.9 Coeficientes de parentesco em fun¸c˜ao da distˆancia: SSR cloroplastidiais 1 . . . 81

7.10 Coeficientes de parentesco em fun¸cão da distância: SSR cloroplastidiais 2 . . . 82 7.11 Discrimina¸cão de diferentes grupos genéticos feitas por DAPC na E.E. Caetetus 84

(16)

e na A.R.I.E. Santa Genebra . . . 85

7.13 Localiza¸cão dos clusters genéticos nas áreas de estudo . . . 87

7.15 Coeficiente de endogamia (f ) por cluster gen´etico . . . 88

8.1 Impacto do tamanho amostral sobre freqüências alélicas e HE . . . 97

8.2 Varia¸cão das freqüências alélicas por tamanho amostral . . . 98

8.3 Varia¸c˜ao de HE por tamanho amostral . . . 99

8.4 Varia¸c˜ao de HE multi-loco por tamanho amostral . . . 100

(17)

3.1 Execu¸c˜ao de coletas . . . 32

4.1 Oligonucleot´ıdeos desenhados para amplifica¸c˜ao de microssat´elites nucleares . . 41

5.1 Rea¸c˜ao de PCR para amplifica¸c˜ao de SSR nucleares em M. peruiferum . . . 45

5.2 Programa¸c˜ao para amplifica¸c˜ao de SSR nucleares em M. peruiferum - 1 . . . . 46

5.3 Programa¸c˜ao para amplifica¸c˜ao de SSR nucleares em M. peruiferum - 2 . . . . 46

5.4 Rea¸cão de PCR para amplifica¸cão de microssatélites cloroplastidiais (cpSSR) em M. peruiferum . . . 47

5.5 Programa¸cão de termociclagem para amplifica¸cão de microssatélites cloroplas-tidiais (cpSSR) em M. peruiferum . . . 47

6.1 Resultados da genotipagem de M. peruiferum por popula¸c˜ao . . . 53

6.2 Resultados da genotipagem de M. peruiferum por popula¸c˜ao com Caetetus unificado . . . 54

6.3 Resultados de estrutura¸c˜ao em M. peruiferum . . . 57

6.4 Matriz de ocorrˆencia de hapl´otipos cloroplastidiais . . . 58

6.5 AMOVA de cpSSR em M. peruiferum . . . 59

6.6 Resultados de estrutura¸c˜ao de cloroplastos em M. peruiferum . . . 59

6.7 Resultados da genotipagem de M. peruiferum por cluster . . . 61

6.8 Diversidade genética em espécies arbóreas tropicais . . . 64

7.1 Estutura¸c˜ao gen´etica espacial (EGE) por SSR nucleares . . . 76

7.2 Resultados de estrutura¸c˜ao em M. peruiferum por cluster . . . 83

7.3 Resultados da genotipagem de M. peruiferum por cluster . . . 86

(18)

(19)

µM micromolar; o mesmo que µmol/L.

µg microgramas.

µmol micromol.

θ ´ındice de divergˆencia interpopulacional conforme descrito por Weir & Cockerham (1984).

cluster conjunto de indiv´ıduos de uma espécie cuja seme-lhan¸ca genética entre seus membros é maior que a semelhan¸ca com membros de outros clusters. f ´ındice de fixa¸cão intrapopulacional conforme

de-scrito por Weir & Cockerham (1984); coeficiente de endogamia.

A.R.I.E. Santa Genebra Area de Relevante Interessa Ecol´´ ogico Mata Santa Genebra.

ad indiv´ıduos adultos.

Afa I enzima de restri¸c˜ao obtida de Acidiphilium facilis, anteriormente denoominada Rsa I.

AMOVA an´alise de variˆancia molecular.

Cae mesmo que E.E. Caetetus.

Cae 1 mesmo que Caetetus borda.

Cae 2 mesmo que Caetetus parcela.

Caetetus borda regi˜ao de borda na E.E. Caetetus.

Caetetus parcela parcela permanente do projeto BIOTA/FAPESP na E.E. Caetetus.

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Cos mesmo que Cosm´opolis.

Cosmópolis restaura¸cão florestal no munic´ıpio de Cosmópolis, SP.

cpSSR chloroplast simple sequence repeats; mi-crossat´elites cloroplastidiais.

DA an´alise discriminante.

DAPC an´alise discriminante de componentes principais. dNTP desoxirribonucleot´ıdeos fosfatados.

E.E. Caetetus Esta¸cão Ecológica de Caetetus. EGE estrutura¸cão genética espacial.

GC conte´udo de GC em porcentagem.

HE heterozigosidade esperada em equil´ıbrio de Hardy Weinberg.

HO heterozigosidade observada.

ha hectares.

IC intervalo de confian¸ca.

IPTG isopropil β-D-1-tiogalactopiranos´ıdeo. Ira mesmo que Iracem´apolis.

Iracem´apolis restaura¸c˜ao florestal no munic´ıpio de Iracem´ apo-lis, SP.

(21)

L litro.

M molar; o mesmo que mol/L.

mm milimetro.

P P-valor para testes exatos.

pb pares de bases nitrogenadas.

PCA an´alise de componentes principais.

SP estado de S˜ao Paulo.

SSR simple sequence repeats; microssat´elites nucleares. St. gen mesmo que A.R.I.E. Santa Genebra.

St. Genebra mesmo que A.R.I.E. Santa Genebra.

Ta temperatura de anelamento.

Taq DNA polimerase DNA polimerase de Thermus aquaticus.

TBE solu¸c˜ao tamp˜ao Tris-Borato-EDTA. Tris 89 mM, ´

Acido B´orico 89 mM, EDTA 2 mM.

Tris trisaminometano.

U unidades enzim´aticas.

X-GAL o mesmo que BCIG, 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactopiranos´ıdeo.

(22)

(23)

1.1 Hist´

orico da degrada¸

c˜

ao ambiental no mundo

A degrada¸cão ambiental e o desflorestamento são processos que se iniciaram há muito tempo e cuja história confunde-se com a da agricultura. As primeiras produ¸cões agr´ıco-las, ainda no per´ıodo neol´ıtico, basearam-se no arroteamento de florestas primárias pelo método de abate-queimada. Arbustos e árvores de pequeno porte eram cortados e ao entulho de tronco e folhagens resultante era aplicada a queimada. As cinzas misturadas ao solo serviam como adubo para os alimentos cultivados na área por um per´ıodo de poucos anos. Findado este per´ıodo, a área era deixada em pousio por até 50 anos, nos quais ocorriam a regenera¸cão da mata e da biomassa.

Dentre as áreas pioneiras a submetidas à esta prática de cultivo florestal destacam-se as florestas do Saara, Oriente Médio e Mediterrâneo. Entre 8.000 e 3.000 AEC a técnica de abate-queimada espalhou-se por todas as popula¸cões humanas. Com a explosão populacional nestas áreas que desenvolveram ou adquiriram a tecnologia de agricultura, as áreas de floresta abatida-queimada foram submetidas à per´ıodos de pousio cada vez mais mais curtos e práticas mais intensivas de supressão da vegeta¸cão.

Ao desenvolvimento da agricultura, precedeu ou acompanhou o processo de seden-tariza¸cão das popula¸cões humanas, que passaram a explorar cada vez mais os recursos madeireiros florestais para a contru¸cão de residências e ferramentas. Acredita-se que essas práticas tenham contribu´ıdo para a acelera¸cão de processos de desertifica¸cão causa-dos por mudan¸cas climáticas de causas naturais, em especial no Saara e Oriente Médio. De 2.000 AEC até o ano zero, as florestas de plan´ıcie da Europa Central submetidas `

a estas pr´aticas sofreram intenso processo de desflorestamento que teve continuidade, com menor intensidade, nos s´eculo seguintes.

Em conseqüência destes processos, hoje o continente europeu é caracterizado pela quase completa ausência de florestas primárias. Excessões são as florestas de altitude

(24)

das montanhas em áreas de dif´ıcil acesso e o Parque Nacional Floresta da Bialowieza, na Polônia e Belarus. Esta trata-se de uma reserva da biosfera com área de apenas 1.500 km2 de floresta primária que pertenceu a um extenso complexo de florestas de ca¸ca dos Czares da Rússia e nas quais foram proibidas atividades de extra¸cão há mais de 700 anos.

Desde então desenvolveram-se enormemente os métodos e tecnologias de extra¸cão de recursos florestais e desmatamento para expansão da fronteira agr´ıcola, desconsiderado a busca pela explora¸cão sustentável; o que tem agravado e acelerado enormemente o ritmo do desmatamento de florestas nativas e dificultado sua regenera¸cão ou restaura¸cão (Mazoyer & Roudart, 1998).

Segundo estudo da Embrapa Monitoramento por Satélite sobre a evolu¸cão das flo-restas mundiais, a Europa, sem a Rússia, detinha mais de 7% das florestas do planeta e hoje tem apenas 0,1%. A África possu´ıa quase 11% e agora tem 3,4%. A Ásia já deteve quase um quarto das florestas mundiais (23,6%), agora possui 5,5% e segue des-matando. No sentido inverso, a América do Sul que detinha 18,2% das florestas, agora detém 41,4% e o grande responsável por esses remanescentes, cuja representatividade cresce ano a ano, é o Brasil (Miranda, 2007). Se o desflorestamento mundial prosseguir no ritmo atual, o Brasil - por ser um dos que menos desmatou - deverá deter, em breve, quase metade das florestas primárias do planeta.

1.2 Mata Atlˆ

antica

A Mata Atlântica é a segunda maior floresta tropical em ocorrência e importância na América do Sul (Morellato, 2000) . De acordo com Brown Jr. & Brown (1992), a Mata Atlântica possui grande diversidade biológica, sendo caracterizada por altos n´ıveis de endemismo (50% no total, chegando a 95% em alguns grupos).

(25)

(15% do território nacional), indo do atual Estado do Rio Grande do Norte até o Rio Grande do Sul, estendendo-se, nas regiões sul e sudeste, do litoral brasileiro até a Argentina e o Paraguai (Collins, 1990; Hirota, 2003). A ocupa¸cão desordenada da Mata Atlântica causou sua redu¸cão aos atuais 157.193,37 Km2; 11,26% de sua área original, distribu´ıdos de forma fragmentada pelo território brasileiro (Ribeiro et al., 2009).

Até hoje são exploradas, nesse dom´ınio, inúmeras espécies florestais arbóreas. Se por um lado essa atividade gera emprego e divisas para a economia nacional, grande parte da explora¸cão da flora atlântica acontece de forma predatória e ilegal, estando muitas vezes associada ao tráfico internacional de espécies (Tabarelli et al., 2005). Contribuem ainda para o alto grau de degrada¸cão da Mata Atlântica a expansão da indústria, do turismo e da urbaniza¸cão, causando a supressão de vastas áreas de biodiversidade, com a poss´ıvel perda de espécies conhecidas e ainda desconhecidas pela ciência, influindo na quantidade e qualidade da água de rios e mananciais, na fertilidade do solo e afetando caracter´ısticas do micro-clima.

De acordo com a lei da Mata Atlântica (11.428/06) (IBGE, 1992; Funda¸cão SOS Mata Atlântica & INPE, 2010), considera-se integrante do Dom´ınio Mata Atlântica: Florestas Ombrófilas Densas; Florestas Ombrófilas Mistas, também denominada Mata de Araucária; Florestas Ombrófilas Aberta; Florestas Estacionais Semideciduais; Flo-restas Estacionais Deciduas; bem os manguezais; as vegeta¸cões de restinga, campos de altitude; brejos interioranos e encraves florestais do nordeste (figura 1.2).

Em virtude desta alta cobertura e heterogeneidade das condi¸cões ambientais, a Mata Atlântica é um habitat reconhecido por sua grande diversidade. Estima-se que 1 a 8% das espécies do mundo estejam na Mata Atlântica (Myers et al., 2000), com cerca de 20.000 espécies de plantas, mais de 1.400 de vertebrados terrestres; milhares de espécies de invertebrados (Laurance, 2009) e mais de 8000 espécies endêmicas (Tabarelli et al., 2005). A sua destrui¸cão tem resultado na elimina¸cão de muitas popula¸cões e, potencialmente, na erosão da diversidade genética de diversas espécies. Essa combina¸cão

(26)

de alto endemismo e forte amea¸ca de extin¸cão, faz com que a Mata Atlântica seja considerada um hotspot para a conserva¸cão (Myers et al., 2000).

Figura 1.1: Extensão do Dom´ınio Mata Atlântica conforme Lei Federal 11428/2006, Decreto 6660/2008. Fonte: Funda¸cão SOS Mata Atlântica & INPE (2010).

A floresta atlântica semidec´ıdua é um dos principais tipos de forma¸cões vegetais con-stituintes da Mata Atlântica Brasileira, sendo hoje uma de suas fisionomias remanes-centes mais importantes; estende-se ao longo das regiões central e sudeste do interior do pa´ıs. O clima predominante ao longo de sua distribui¸cão é sazonal com uma esta¸cão seca relativamente intensa, que geralmente se estende de abril a setembro. (Morellato, 2000; Oliveira-Filho & Fontes, 2000).

No Estado de S˜ao Paulo, os ecossistemas florestais que antes cobriam mais de 80% de sua superf´ıcie foram reduzidos, drasticamente, a menos de 5% (CONSEMA, 1985). A introdu¸c˜ao da cultura cafeeira, exigente em clima e solo, foi a principal bandeira de

(27)

desenvolvimento do estado. Com a sua expansão, ocorreu a ocupa¸cão de terras virgens e cobertas por matas. As Florestas Estacionais Semidec´ıduas têm ampla distribui¸cão no interior do Estado de São Paulo, sendo um exemplo claro do processo de fragmenta¸cão, constituindo ilhas de vegeta¸cão em meio a uma matriz dominada pela agricultura e por grandes centros urbanos (Nascimento et al., 1999).

1.3 Consequˆ

encias da degrada¸

c˜

ao ambiental

O processo de degrada¸cão ecológica de florestas causado pela supressão da vegeta¸cão nativa pode ocorrer de duas formas: 1) pela supressão parcial de vegeta¸cão, causando a degrada¸cão do habitat mas sem alterar a continuidade da unidade florestal, ou 2) pela supressão total da vegeta¸cão e substitui¸cão por matriz de uso econômico (pasto, agricultura, ocupa¸cão urbana, etc), ocasionando o desaparecimento de parte ou toda a unidade florestal e gerando o processo de fragmenta¸cão entre os remanescentes florestais. Na grande maioria dos casos, ambos os processos ocorrem em conjunto, mas os efeitos diretos de um e outro podem ser distingüidos.

A degrada¸cão do habitat, devido à supressão da vegeta¸cão, pode causar a perda de espécies ou o desequil´ıbrio ecológico das popula¸cões nativas; assim como altera¸cões climáticas, edafológicas, de disponibilidade h´ıdrica e regime de ventos. Já o isolamento populacional e o efeito de borda são causados mais freqüentemente pelo processo de fragmenta¸cão.

A degrada¸cão do habitat pela supressão parcial da vegeta¸cão ainda que não chegue a causar uma fragmenta¸cão da unidade florestal, traz problemas palpáveis ao ambiente. Em primeiro lugar, podemos citar a supressão direta de popula¸cões, que pode causar a perda de espécies ou o desequil´ıbrio ecológico das popula¸cões nativas; assim como altera¸cões climáticas, edafológicas, de disponibilidade h´ıdrica e regime de ventos.

(28)

Neste processo, algumas espécies são mais visadas que outras; nomeadamente aquelas que fornecem as chamadas ”madeiras de lei”, utilizadas na constru¸cão civil e de mo-biliário, entre outros fins. Ao realizar o extrativismo seletivo dessas espécies, pode-se acabar extinguindo popula¸cões inteiras em amplas áreas de floresta, mesmo que outras espécies sejam pouco afetadas.

Mesmo quando a supressão dessas popula¸cões não é total, a extra¸cão seletiva reduz o tamanho e densidade populacionais, podendo causar a perda de alelos raros pela simples supressão de todos os indiv´ıduos que os possuem. Outro efeito será o favorecimento da endogamia.

Dois mecanismos podem levar, neste caso, à endogamia. Primeiro o menor número de indiv´ıduos totais na popula¸cão. Quando a popula¸cão fica limitada a um número reduzido de indiv´ıduos, há uma menor possibilidade de combina¸cões de genitores (pai-mãe), o que ao longo das gera¸cões subsequentes produzirá descendentes aparentados, frutos de uma base genética estreita. Esse processo é chamado de efeito gargalo ou bottleneck, que voltaremos a discutir mais adiante neste cap´ıtulo ao falarmos de restau-ra¸cões florestais (Nei et al., 1975; Peery et al., 2012).

Considerando F como a probabilidade de autozigose, i.e. a probabilidade de que um indiv´ıduo diplóide carregue um par de alelos idênticos por descendência (descendentes de uma mesma cópia alélica ancestral); e utilizando F como medida de endogamia pop-ulacional, podemos verificar na equa¸cão 1.a que quanto menor o tamanho populacional N, maior será o valor de endogamia F (Hartl & Clark, 1997).

O segundo mecanismo é o isolamento de grupos de indiv´ıduos devido à maior difi-culdade de fluxo de pólen e sementes, como discutiremos na se¸cão seguinte (1.3.2).

1.a 1 − F = 1 − 1 2N t (1 − F0)

(29)

F = Coeficiente de endogamia N = tamanho populacional efetivo

F0 = coeficiente de endogamia na gera¸c˜ao inicial t = gera¸c˜ao

1.3.1 Fragmenta¸c˜ao florestal

Fragmenta¸cão florestal é a substitui¸cão de amplas áreas de floresta nativa por out-ros ecossistemas, deixando uma série de manchas remanescentes ou fragmentos de mata entremeadas por uma matriz de vegeta¸cão diferenciada e/ou de usos diversos. Os frag-mentos florestais remanescentes são definidos como qualquer área de vegeta¸cão natural cont´ınua, interrompidos por barreiras antrópicas ou naturais capazes de diminuir sig-nificativamente o fluxo de animais, pólen e/ou sementes. Esse processo pode alterar os fluxos de vento e radia¸cão ao longo da paisagem, bem como os padrões de migra¸cão e dispersão e o sistema de cruzamento das espécies (Coates & Hamley, 1999; Routley et al., 1999; Saunders et al., 1991).

No processo de fragmenta¸cão também ocorrerá e de forma muito mais intensa o efeito de supressão direta de popula¸cões, ou mesmo de espécies endêmicas por completo, nas ´

areas entre os fragmentos em que a vegeta¸c˜ao for totalmente suprimida e substitu´ıda por uma matriz de usos diversos.

1.3.2 Impedimento do fluxo gˆenico e aumento da endogamia

As a¸cões antrópicas responsáveis pelo desmatamento da Mata Atlântica há muito têm interferido no fluxo gênico entre as popula¸cões vegetais, ao acentuarem a fragmen-ta¸cão geográfica das espécies e de seus habitats. Resultados emp´ıricos revelam que a fragmenta¸cão do habitat tem conseqüências genéticas que, no entanto, são mais vari-adas do que seria esperado através da inferência a partir de modelos simples de genética

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de popula¸cões (Young et al., 1996). A capacidade de dispersão através da matriz varia conforme o organismo em estudo e com o tipo de vegeta¸cão que substituiu a original (Ricketts, 2001), e pode ser tanto prejudicada como facilitada num ambiente formado por mosaicos de habitats (Tscharntke & Brandl, 2004).

A redu¸cão da densidade populacional causada pela supressão seletiva de indiv´ıduos de uma espécie pode causar o aumento da endogamia devido ao baixo número de indi-v´ıduos na popula¸cão ou pela maior dificuldade de fluxo de pólen.

O primeiro caso, é causado pelo menor número de indiv´ıduos totais na popula¸cão, conforme discutido anteriormente. Na segunda situa¸cão, com a altera¸cão da densidade populacional, insetos dispersores de pólen podem ser desencorajados a realizar trajetos de forrageio que exijam a travessia de áreas agora com baixa densidade populacional, for¸cando grupos de polinizadores a permanecerem mais restritos a uma determinada ´

area e, portanto, polinizar indiv´ıduos próximos geograficamente que possivelmente são também próximos por descendência.

Essa situa¸cão pode acarretar uma fragmenta¸cão de fato da popula¸cão, incapacitando ou reduzindo drasticamente o fluxo gênico, isto é, a troca de genes pela dispersão de pólen e sementes através da área de baixa densidade; ainda que a unidade florestal em si não seja fragmentada

Esse efeito da degrada¸cão ecológica, assim como outros, será dependente das car-acter´ısticas biológicas e reprodutivas de cada espécie. O caso da intensifica¸cão da en-dogamia é aplicável à espécies cujo pólen são dispersos por animais, mas não àqueles nos quais é disperso pelo vento (anemofilia). No caso desses últimos, a altera¸cão da densi-dade populacional pode não causar dificuldade ao fluxo de pólen desde que o padrão de ventos na mata não seja alterado. O fluxo de pólen por anemofilia pode, em alguns ca-sos, até mesmo ser facilitado caso a redu¸cão de densidade populacional seja generalizada para todas as espécies da área e desde que a distância entre os indiv´ıduos remanescentes não seja tão grande a ponto de inviabilizar a troca de pólen mesmo quando disperso

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pelo vento.

Essa pequena vantagem porém, não seria suficiente para compensar as desvantagens da perda de diversidade pela supressão direta de alelos e as consequências da mortal-idade devido à altera¸cão das caracter´ısticas abióticas do ambiente. Além disso, cabe ressaltar que a maioria das espécies tropicais é polinizada por animais, o que nos per-mite dizer que a redu¸cão da densidade populacional seja em geral prejudicial ao fluxo gênico e causadora de endogamia.

Em ambientes fragmentados as espécies arbóreas são influenciadas tanto por eventos no n´ıvel das popula¸cões quanto pelo decl´ınio da reprodu¸cão devido à perda de polin-izadores e dispersores de sementes (Aizen & Feinsinger, 1994).

O baixo número relativo de indiv´ıduos em qualquer fragmento leva a um pequeno tamanho efetivo da popula¸cão a menos que um movimento suficiente de pólen e sementes ocorra entre fragmentos (Levey et al., 1994). Se este movimento for impedido pela frag-menta¸cão, ao longo das gera¸cões as popula¸cões se tornarão genética e demograficamente independentes. Essas popula¸cões agora não mais conectadas poderão trocar gametas apenas dentro desse novo grupo populacional mais restrito, o que favorecerá o aumento das taxas de endogamia.

O aumento da endogamia é preocupante visto que reduz o tamanho populacional efetivo (Ne), favorecendo a ocorrência de deriva genética, que pode acarretar perda de diversidade.

1.3.3 Deriva gen´etica

Nos casos em que uma popula¸cão é fragmentada, produzindo duas ou mais popula-¸cões independentes com baixo fluxo gênico entre entre elas (θ < 0,05), quer haja ou não também uma fragmenta¸cão da unidade florestal como um todo; poderemos observar com o tempo o fenômeno de deriva genética.

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Podemos interpretar a constitui¸cão de uma nova gera¸cão de uma popula¸cão natural como um processo de amostragem com repeti¸cão. Alguns indiv´ıduos adultos terão sucesso em passar seus genes à próxima gera¸cão (i.e. serão ”amostrados”), enquanto outros não. Dentre os adultos que obtiverem esse sucesso reprodutivo, alguns serão mais eficientes que outros. Dessa forma, mesmo na ausência de pressão seletiva, cada indiv´ıduo adulto produzirá aleatoriamente quantidades distintas de descendentes.

A probabilidade de que um alelo em particular seja ”amostrado”e a freqüência esper-ada deste alelo na nova gera¸cão serão dependentes de sua freqüência na gera¸cão inicial. No entanto, em popula¸cões finitas, essa amostragem não será perfeita, ocorrendo vari-a¸cões aleatórias nas freqüências alélicas ao longo das gera¸cões. A deriva genética será tanto mais forte quanto menor for o número de genitores amostrados para constituir a gera¸cão seguinte; e quanto menos houver sobreposi¸cão de gera¸cões.

Quando uma popula¸cão natural de uma determinada espécie é fragmentada, gerando duas ou mais popula¸cões independentes com baixo fluxo gênico entre elas, a deriva genética ocorrerá de forma independente em cada uma delas, fazendo com que ao longo das gera¸cões, as freqüências alélicas e genot´ıpicas das popula¸cões se diferenciem entre si. Como em geral, essas novas subpopula¸cões terão tamanho populacional menor que o da popula¸cão original, espera-se que a deriva genética seja particularmente intensificada.

Em popula¸cões muito reduzidas, a for¸ca da deriva pode ser tal que ocorra a fixa¸cão de um alelo; ou seja, que a freqüência de um determinado alelo, variando estocasticamente ao longo das gera¸cões, por acaso aumente até 100%, passando a ser o único alelo presente naquele loco (ou ”gene”) na popula¸cão. Uma vez ocorrida a fixa¸cão, um novo alelo só poderá surgir por muta¸cão ou trazido por um migrante vindo de outra popula¸cão.

O processo de fixa¸cão alélica é portanto uma for¸ca redutora da diversidade genética de uma popula¸cão. No entanto, uma vez que a deriva ocorre de forma independente em cada subpopula¸cão, ainda que ocorra a fixa¸cão alélica em todas elas, é provável que cada uma fixe alelos distintos e que quando consideradas em conjunto, estas popula¸cões

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ainda conservem uma diversidade alélica semelhante a da popula¸cão original única, ainda que o mesmo não ocorra com a diversidade genot´ıpica.

1.3.4 Efeito de Borda

A fragmenta¸cão florestal expõe os organismos que sobrevivem nos fragmentos à condi¸cões de um ecossistema circundante (matriz) distinto e, consequentemente ao efeito de borda.

Efeito de borda é o resultado da intera¸cão entre dois ecossistemas adjacentes sep-arados por uma transi¸cão abrupta. Próximo à borda, os fragmentos florestais exper-imentam altera¸cões em suas condi¸cões bióticas e abióticas influenciadas pela matriz circundante.

Dentre as altera¸cões abióticas, podemos citar a maior incidência de radia¸cão solar, luz e calor, no solo, temperaturas mais elevadas, maior varia¸cão de temperatura ao longo do dia, menor umidade dor ar e do solo, incidência de ventos mais fortes vindos da matriz aberta causando maior queda de árvores, altera¸cão da estrutura do solo, maior susceptibilidade a incêndios e contamina¸cão do solo por fertilizantes e defensivos agr´ıcolas utilizados em matrizes de uso agricultural no entorno.

Como efeitos bióticos temos a altera¸cão na distribui¸cão, riqueza e composi¸cão de espécies devido à diferen¸cas na tolerância às altera¸cões do habitat; e altera¸cão da densi-dade populacional de espécies e da densidade geral de árvores nas regiões de borda. As duas altera¸cões bióticas citadas podem alterar os padrões de ventos na região florestal próxima à borda, assim como o padrão de forrageio de polinizadores, interferindo no fluxo de pólen e de sementes.

Podemos listar ainda como efeito biótico a interferência negativa na germina¸cão de sementes e sobrevivência de plântulas, fases cr´ıticas do desenvolvimento arbóreo que são prejudicadas pelo ambiente alterado em rela¸cão às condi¸cões nas quais as espécies se adaptaram para germinar e se desenvolver. Nas regiões de borda também

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obser-vamos um aumento na herbivoria e danos por pisoteamento, muitas vezes, mas n˜ao exclusivamente, causada por cria¸c˜oes de gado na matriz circundante.

Outro problema significativo ocorrendo no efeito de borda é a penetra¸cão e/ou fa-vorecimento de espécies invasoras que come¸cam a predominar sobre as locais. Essas espécies invasoras podem ser nativas, melhor adaptadas às novas condi¸cões ambientais, ou exóticas, associadas às atividades antrópicas, invadindo a partir da matriz.

1.4 Restaura¸

c˜

ao florestal

A recupera¸cão de ecossistemas degradados é uma prática muito antiga mas apenas nas últimas décadas, particularmente a partir da década de 1970, ela recebeu a aten¸cão da comunidade cient´ıfica, dando origem ao campo do conhecimento chamado Ecologia da Restaura¸cão, que se dedica aos estudos teóricos dos princ´ıpios, práticas, resultados e conseqüências de projetos de restaura¸cão (Palmer et al., 1997).

O primeiro esfor¸co conhecido de restaura¸cão florestal no Brasil data do século XIX, tendo sido realizado na cidade do Rio de Janeiro (Freitas et al., 2006). A Floresta da Tijuca havia sofrido intensa degrada¸cão devido à retirada de madeira para constru¸cão, lenha e carvão para consumo de numerosos engenhos de cana-de-a¸cúcar, bem como da expansão da lavoura cafeeira. Como resultado, o munic´ıpio sofreu grave crise de abastecimento de água resultante da deteriora¸cão das nascentes existentes na floresta.

Para reverter a situa¸c˜ao, o imperador D. Pedro II ordenou o reflorestamento da ´

area com o uso de espécies nativas e exóticas. Esse esfor¸co pioneiro foi bem-sucedido, solucionando o problema de abastecimento e transformando a área na maior floresta urbana do mundo.

Desde então, vários projetos de restaura¸cão foram realizados na Mata Atlântica. Durante este per´ıodo, a restaura¸cão ecológica mostrou grande evolu¸cão a n´ıvel interna-cional. Seus objetivos evolu´ıram da original preocupa¸cão exclusivamente com a prote¸cão

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de recursos abióticos (água e solo), utilizando poucas espécies (sobretudo exóticas) e ig-norando os processos ecológicos responsáveis pela manuten¸cão da floresta; até alcan¸car o atual paradigma de restaurar os processos ecológicos básicos da floresta com o objetivo de conserva¸cão in situ da biodiversidade (Rodrigues et al., 2009).

Inicialmente a restaura¸cão florestal era realizada com a finalidade de preservar re-cursos h´ıdricos ou garantir a preserva¸cão do solo e estabiliza¸cão de encostas. Nesse modelo a restaura¸cão era feita pelo simples plantio da árvores, sem a utiliza¸cão de critérios ecológicos ou preocupa¸cão com critérios sucessionais, com a utiliza¸cão indis-tinta de espécies nativas e exóticas, dando-se preferência às mais conhecidas (Rodrigues & Gandolfi, 1996).

A partir da década de 1980, quando a aplica¸cão de conceitos de sucessão ecológica passou a ser discutida no pa´ıs, um novo modelo de restaura¸cão florestal foi proposto. Passou-se a dar prioridade ao uso de espécies nativas do Brasil e, dentre estas, as de crescimento rápido; baseando-se nas caracter´ısticas sucessionais.

A propor¸cão do número de mudas por espécie passou a ser definida com base nesses grupos sucessionais e os modelos de implanta¸cão também foram alterados, visando a possibilitar a distribui¸cão organizada das mudas no campo, a partir dos grupos suces-sionais (Kageyama & Gandara, 2004). Esse modelo representa uma grande parte dos projetos de restaura¸cão florestal realizados nos últimos anos, especialmente na Mata Atlântica.

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Arvores pioneiras e não-pioneiras passaram a ser plantadas em uma propor¸cão de-terminada, permitindo que a a sombra das espécies pioneiras proporcionasse condi¸cões microecológicas prop´ıcias ao desenvolvimento das espécies não-pioneiras (Budowski, 1965; Kageyama & Castro, 1989).

Essa estratégia no entanto não levava em considera¸cão a forma¸cão vegetacional em que as espécies eram encontradas, levando espécies e distintos biomas e regiões brasileiras a serem utilizadas em restaura¸cões florestais de locais nos quais não eram

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encontradas naturalmente.

Para que uma determinada espécie se perpetue em uma área em processo de restau-ra¸cão, é preciso que a mesma flores¸ca, frutifique, tenha suas sementes dispersas e que essas sementes gerem descendentes capazes de se desenvolver a ponto de substituir as ´

arvores mãe quando as mesmas entrarem em senescência(Begon et al., 2006). Também é importante que sejam restitu´ıdas as intera¸cões ecológicas entre as espécies arbóreas e seus dispersores de sementes(Fenner & Thompson, 2005) e polinizadores(Bawa, 1974), além de suas pragas e doen¸cas locais (Dyer et al., 2007).

O pronto restabelecimento das condi¸cões do solo proporcionado pelo rápido cresci-mento das espécies pioneiras refor¸cou a tendência de uso de grande propor¸cão destas em modelos de reflorestamento (Souza & Batista, 2004).

O foco dessa fase na sucessão florestal sem v´ınculo forte com a diversidade de espécies dentro de cada grupo, trouxe como conseqüência o uso nos projetos de restaura¸cão de um número de espécies significativamente inferior ao naturalmente encontrado em flo-restas tropicais, comprometendo a restaura¸cão dos processos ecológicos que garantiriam a perpetua¸cão da área restaurada e de sua diversidade.

A estratégia de plantios baseados apenas na sucessão florestal, sem utilizar um grande número de espécies não conseguiu atingir a sustentabilidade quando implantada em regiões muito fragmentadas; condi¸cão mais comum dos projetos de restaura¸cão. Na tentativa de corrigir estas imperfei¸cões passou-se à uma nova fase da ecologia da restaura¸cão, em que buscou-se não só copiar a sucessão da floresta como também sua flor´ıstica e estrutura.

Para tanto, os novos projetos de restaura¸cão florestal passaram a apoiar-se sobre estudos ecológicos dos remanescentes florestais presentes no entorno das áreas a serem restauradas. Esses estudos passaram a definir quais espécies deveriam ser utilizada e em que quantidade cada uma deveria estar presente. Como resultado, houve um grande aumento no número de espécies nativas regionais utilizadas nesses projetos (Ruiz-Jaén

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& Aide, 2005) .

A partir da compreensão de que as comunidades naturais são sistemas abertos, sofrendo a a¸cão e sendo limitados por fatores internos e externos muitas vezes impre-vis´ıveis, concluiu-se que basear-se exclusivamente em um levantamento fitossociológico para caracterizar um ambiente pode levar ao erro de retratar as caracter´ısticas estru-turais de um único momento da história natural daquele fragmento estudado (Parker & Pickett, 1999; Choi, 2004; Aronson & Van Andel, 2005). Aceita-se hoje a idéia de ausência de um único ponto de equil´ıbrio: em uma comunidade natural, o ”cl´ımax”está em constante mudan¸ca, e os sistemas naturais poderiam apresentar comunidades cl´ımax com diferentes caracter´ısticas, inclusive flor´ısticas e estruturais.

Esse entendimento levou ao abando do paradigma de restaura¸cão florestal baseada na cópia de uma comunidade final pré-definida pelo restaurador. Passou-se a dar mais ênfase à restaura¸cão dos processos ecológicos que levem à constru¸cão de comunidade vegetais. A identifica¸cão da metodologia mais adequada de restaura¸cão de uma dada ´

area depende de um diagnóstico apropriado do próprio local a ser restaurado e do entorno imediato e regional (Rodrigues et al., 2009). Esta fase representa o estado atual da atividade da restaura¸cão ecológica na Mata Atlântica em larga escala.

1.4.1 Restaura¸c˜ao e Fragmentos florestais

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Areas de restaura¸cão florestal implantadas em local isolado de outras florestas po-dem assumir na paisagem um papel correspondente ao dos fragmentos de remanescentes florestais. Assim como estes últimos, aquelas áreas constituem por¸cões de florestas de-scont´ınuas envoltas em uma matriz diferenciada que as separa de outros fragmentos. Essa caracter´ıstica faz com que as áreas de restaura¸cão florestal estejam sujeitas a muitos desafios comuns aos dos remanescentes de floresta naturais. A fim de mini-mizar os problemas decorrentes desse isolamento, é preciso fazer um planejamento da implanta¸cão e manejo de áreas de restaura¸cão florestal que leve em conta os conceitos

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de genética de popula¸cões. Para isso, o estudo de áreas naturais fragmentadas, por estarem sujeitas a este mesmo desafio de supera¸cão do isolamento geográfico, pode nos fornecer importantes ensinamentos.

Quando um grupo muito pequeno de imigrantes funda uma nova subpopula¸cão, a deriva genética que sucede essa funda¸cão dá origem ao que é chamado de efeito fundador (Mayr, 1954, 1963; Kolbe et al., 2012). O efeito fundador dá origem a uma popula¸cão com reduzida variabilidade genética, pequeno tamanho efetivo, alto coeficiente de en-dogamia e reduzido número de alelos.

Quando uma subpopula¸cão vegetal dentro de um fragmento florestal perde sua ca-pacidade de trocar genes com os fragmentos circundantes (através de fluxo de pólen e sementes), os indiv´ıduos remanescentes de uma determinada espécie neste fragmento, agem como fundadores daquela nova subpopula¸cão agora isolada de seu entorno. Se este número for muito pequeno ocorrerá o efeito fundador. A principal causa do efeito fundador é um baixo número de genótipos na popula¸cão inicial. Ou seja, uma base genética estreita nesta popula¸cão.

Da mesma forma, em restaura¸c˜oes florestais uma base gen´etica estreita pode levar `

a ocorrência de efeito fundador. Ademais, mesmo que um número suficiente de gen´ oti-pos da espécie seja utilizado no processo de restaura¸cão, é preciso garantir que estes sobreviverão até a idade adulta e participarão da gênese da gera¸cão seguinte. Uma alta mortalidade, que provoque grande perda de genótipos produzirá um efeito gargalo (bottleneck) que pode ter conseqüências semelhantes ao do efeito fundador.

O bottleneck é muito semelhante ao efeito fundador. De fato, a diferen¸ca entre os dois efeitos é histórica. Enquanto o efeito fundador ocorre na coloniza¸cão de novas áreas por um número reduzido de indiv´ıduos de uma espécie anteriormente ausente no local; o bottleneck é causado pela redu¸cão do tamanho populacional em uma área em que a espécie estava anteriormente representada por uma grande popula¸cão. As consequências de ambos os efeitos serão, a partir da´ı, iguais para as gera¸cões subsequentes.

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Ressalte-se também que muitos programas de restaura¸cão florestal visam aumentar a conectividade entre os fragmentos de vegeta¸cão nativa, incluindo áreas naturais pro-tegidas, através da constru¸cão de corredores ecológicos. Nestes projetos é primordial que se garanta uma alta diversidade genética das espécies utilizadas e um efetivo fluxo gênico entre os fragmentos; pois caso contrário estes corredores ecológicos serão pouco funcionais.

A ”reconstru¸cão”de uma cobertura vegetal restaurada conectando dois fragmentos florestais, naturais ou não, pode ser por si só efetiva para permitir o o tráfego de animais e, conseqüentemente, a dispersão de sementes de algumas espécies zoocóricas. Mas o fluxo de pólen por zoofilia entre os fragmentos pode não ser adequadamente restaurado caso o corredor ecológico care¸ca de uma adequada diversidade de espécies. É importante que os animais polinizadores encontrem recursos adequados ao longo do corredor que os incentive a fazer a travessia, estabelecendo um fluxo gênico direto ou por stepping stone.

Na fase inicial de restaura¸cões, toda a área em processo de restaura¸cão poderá estar sujeita à altera¸cões caracter´ıstica de efeito de borda. Isso porque à princ´ıpio, a restaura¸cão será implantada em uma área em que parte ou toda a vegeta¸cão original foi suprimida, permitindo a ocorrência de altera¸cões nos padrões de radia¸cão solar, temperatura, umidade, ventos, estrutura de solo, entre outros; além das altera¸cões bióticas como espécies invasoras, herbivoria e extin¸cão de polinizadores.

Fica claro portanto que muitos dos mesmos desafios da conserva¸cão de remanes-centes naturais fragmentados são encontrados no processo de implanta¸cão e manejo de restaura¸cões florestais; ao mesmo tempo que ambas as unidades florestais desempen-harão fun¸cões semelhantes de conectividade da paisagem, conserva¸cão da biodiversidade e diversidade genética, prote¸cão de recursos naturais e presta¸cão de servi¸cos ambien-tais. Resulta dessas considera¸cões a necessidade de se estudar a variabilidade genética de popula¸cões arbóreas dentro de áreas de floresta restaurada, assim como a ocorrência

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e efetividade do fluxo gˆenico entre estas ´areas e os fragmentos de seu entorno.

1.4.2 Regionalidade

Nas pondera¸cões sobre como incluir de forma adequada os conhecimentos de genética de popula¸cão em programas de restaura¸cão ecológica, uma das questões muito discutidas é a importância da regionalidade. Ao planejar e executar um projeto de restaura¸cão em uma área degradada deve-se procurar utilizar genótipos locais obtidos da coleta de sementes e/ou plântulas de fragmentos naturais próximos, ou devo utilizar uma mistura genótipos de diferentes áreas para obter o máximo de diversidade genética? Para respondermos essa pergunta, devemos considerar três fatores:

Valor adaptativo e Depress˜ao exogˆamica ..

Diversos estudos têm demonstrado que a pressão exercida pelas condi¸cões ambientais sobre as popula¸cões naturais pode provocar a sele¸cão de genótipos melhor adaptados a essas condi¸cões, culminando com a forma¸cão de ecótipos, que embora perten¸cam a uma mesma espécie, são de forma geral melhor adaptadas às suas condi¸cões de origem (Linhart & Grant, 1996; Lesica & Allendorf, 1999; McKay et al., 2005). Assim sendo, caso um ecótipo seja introduzido em uma área para cujas condi¸cões ambientais ele não está adaptado, suas chances de sobrevivência a longo prazo serão reduzidas.

Pior ainda, caso sejam capazes de sobreviver no curto prazo e frutificar, esse ecótipo pode, nas gera¸cões seguintes, causar uma ”polui¸cão genética”(Saltonstall, 2002) dissem-inando alelos com baixo valor adaptativo para a popula¸cão nativa existente na própria ´

area ou em fragmentos adjacentes. A prole subsequente sofrerá de depressão exogâmica, que pode ser causada tanto pela quebra de coadapta¸cões de diferentes genes (mecanismo intr´ınseco) quanto pela má adapta¸cão do genótipo da prole para as condi¸cões ambien-tais locais (mecanismo extr´ınseco). Evidências apontam que a depressão exogâmica de causa extr´ınseca é mais frequente que a de causa intr´ınseca.

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Invas˜ao cr´ıptica ..

Por outro lado, é poss´ıvel que a um ecótipo não local possua um ou mais alelos melhor adaptados à condi¸cões ambientais das áreas a serem restauradas, podendo passar a ocupar o habitat da popula¸cão nativa, suplantando-a com o passar do tempo. Esse efeito é conhecido como ”invasão cr´ıptica”e pode provocar a redu¸cão da diversidade genética global da popula¸cão ao favorecer a maior representa¸cão do genótipo exótico sobre os restantes.

O ecótipo exótico, ainda que apresente melhor adapta¸cão às condi¸cões locais, pode nas gera¸cões futuras produzir prole com depressão exogâmica de causa intr´ınseca, em-bora como dito anteriormente, esses casos pare¸cam ser incomuns.

Sele¸c˜ao de gen´otipos ..

As popula¸cões vegetais adaptam-se ao seu ambiente ao serem submetidas à pressão de sele¸cão natural deste (Pregitzer et al., 2010). Neste processo, os alelos mais adaptados `

as condi¸cões locais tendem a favorecer o desenvolvimento e o sucesso reprodutivo do indiv´ıduos que os possuem. Isso faz com que ao longo de sucessivas gera¸cões, esses alelos vantajosos se tornem mais frequentes na popula¸cão, enquanto alelos menos vantajosos tornam-se menos frequentes, podendo mesmo desaparecer na popula¸cão.

O processo de sele¸cão natural produz popula¸cões bem adaptadas as condi¸cões do ambiente local. No entanto, caso ocorra uma altera¸cão drástica do ambiente, seja nas caracter´ısticas do solo, clima ou disponibilidade h´ıdrica, as condi¸cões originais para as quais as popula¸cões estavam bem adaptadas deixarão de existir e os indiv´ıduos passarão a ser submetidos a novas condi¸cões adversas.

Viani et al. (2011) mostraram que há uma diferen¸ca significativa entre a consti-tui¸cão qu´ımica de solos de cerradão e floresta estacional semidecidual. Os solos de floresta estacional semidecidual possuem menores concentra¸cões de alum´ınio e maior pH, matéria orgânica, macronutrientes e capacidade de troca iônica que os solos de

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cerradão. No mesmo trabalho, foi mostrado ainda que espécies de floresta semidecidual têm menores taxas de sobrevivência e piores parâmetros de crescimento nos primeiros meses de desenvolvimento quando cultivados no solo mais pobre do ceradão.

Estrutura f´ısica e composi¸cão qu´ımica do solo, condi¸cões climáticas e disponibili-dade h´ıdrica são exatamente condi¸cões que são alteradas em áreas antropizadas onde a cobertura florestal foi parcial ou totalmente removida. Nestes casos, a escolha apenas de árvores matrizes de matas próximas para fornecer sementes pode não ser o ideal para garantir a sobrevivência das mudas e o sucesso da restaura¸cão florestal nos primeiros anos. Incluir mudas ou sementes de popula¸cões submetidas a condi¸cões ambientais semelhantes pode ser uma alternativa para garantir maiores chances de sucesso a longo prazo.

1.5 Justificativa: Por que preservar e restaurar a Mata Atlˆ

an-tica? Por que este estudo?

A destrui¸cão da Mata Atlântica brasileira é um dos mais alarmantes problemas de conserva¸cão ecológica do mundo (Mori et al., 1981; Terborgh, 1992; Viana et al., 1997). O esfor¸co integrado de conserva¸cão e restaura¸cão da Mata Atlântica deve necessaria-mente passar por uma padroniza¸cão e atualiza¸cão do conhecimento cient´ıfico e emp´ırico acumulado nesses temas (Rodrigues et al., 2009). Para tanto se fazem necessários es-tudos de acompanhamento da sustentabilidade a longo prazo das áreas de restaura¸cão florestal.

Segundo Souza e Batista (Souza & Batista, 2004), ”o estudo e monitoramento de ´

areas de restaura¸cão florestal é essencial para melhorar as técnicas de restaura¸cão em ecossistemas tropicais e subtropicais”. A maioria dos estudo feitos até o final da década de 1990 se restringiram a analisar o crescimento de espécies nos primeiros anos do restabelecimento florestal. Até hoje ainda há uma demanda não atendida por programas

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de monitoramento adequados nos ecossistemas brasileiros (Engel & Parrotta, 2001; Leopold et al., 2001).

A constata¸cão da diversidade genética como uma das bases principais da conserva¸cão ambiental tem definido uma nova demanda nos projetos de restaura¸cão, que além da restaura¸cão da diversidade flor´ıstica necessitam também equacionar a restaura¸cão da diversidade genética dessas comunidades (Kageyama & Gandara, 2004; Rodrigues et al., 2009).

1.6 Marcadores Moleculares

As tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitem caracterizar os marcadores moleculares, definidos como todo e qualquer fenótipo molecular prove-niente de um gene expresso ou de um segmento espec´ıfico de DNA (assim como de prote´ınas ou RNA); constituindo importantes ferramentas em estudos populacionais, pois podem fornecer informa¸cões relevantes sobre a composi¸cão das popula¸cões, como variabilidade genética e grau de parentesco entre indiv´ıduos, e sobre a estrutura genética dessas popula¸cões, representada pelo grau de diferencia¸cão genética entre elas (Avise, 1994; Ferreira & Grattapaglia, 1995).

A sequência de nucleot´ıdeos e a fun¸cão de um marcador molecular podem ou não ser conhecidas. Técnicas que utilizam a genotipagem de marcadores moleculares per-mitem fazer distin¸cão diretamente em n´ıvel de DNA e ainda contribuem para avaliar a variabilidade genética dentro do conjunto gênico de espécies cultivadas e não cultivadas.

1.6.1 Microssat´elites

Microssatélites, ou sequências simples repetidas (SSR), são compostos por sequˆ en-cias de um a seis pares de base repetidos em tandem, abundantes e dispersos por todo o genoma dos organismos eucarióticos. Uma vez que os SSR são marcadores

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codom-inantes, i.e. permitem a identifica¸cão de ambos os alelos e estimativa da freqüência de heterozigotos, os locos espec´ıficos são usados freqüentemente para o fingerprinting de DNA, teste de paternidade, para a constru¸cão de mapas de liga¸cão e os estudos genéticos populacionais (Hayden & Sharp, 2001).

Os marcadores moleculares SSR apresentam caracter´ısticas altamente desejáveis para o estudo de diversidade e estrutura genéticas de popula¸cões: 1) são marcadores codominantes, ou seja, ambos os alelos de um indiv´ıduo heterozigoto são visualizados no gel; 2) estão ampla e uniformemente distribu´ıdos pelo genoma dos eucariotos; 3) são altamente multialélicos (McCouch et al., 1997); 4) são amplificados via PCR, o que facilita sua obten¸cão mesmo com poucas quantidades de DNA; 5) e, uma vez de-senvolvidos, os primers que amplificam tais regiões do genoma, podem ser facilmente compartilhados entre laboratórios. Todas essas caracter´ısticas tornam os microsatélites marcadores eficientes nas análises de diversidade genética de popula¸cões (Powell et al., 1995; Rajora et al., 2000).

A distribui¸cão, a frequência e as classes de microssatélites variam entre as diferentes classes de organismos. As repeti¸cões mais abundantes são os dinucleot´ıdeos, sendo que, em plantas, os motivos mais comuns são AT/TA, enquanto em humanos e muito mam´ıferos os motivos CA são mais frequentes (Schlötterer & Tautz, 1992). Os motivos dos microssatélites podem ser classificados como: perfeitos, ou seja, sem interrup¸cão (ATATATATATATAT); imperfeitos, quando interrompidas por nucleot´ıdeos fora do mo-tivo, (ATATATATATGGATATATAT); compostos, quando dois ou mais motivos estão adjacentes, (ATATATATATCACACACACACA) (Oliveira et al., 2006). Os motivos são em sua maioria dinucleot´ıdeos ou trinucleot´ıdeos; tetranucleot´ıdeos e pentanucleot´ıdeos são mais raros.

Esses marcadores são encontrados preferencialmente em regiões não codificadoras, mas, em menor frequência bem menor, também são encontrados nas regiões codificado-ras (Schlötterer & Tautz, 1992). Devido a esta distribui¸cão preferencial nas regiões

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não codificadoras, os microssatélites podem ser considerados marcadores seletivamente neutros, o que é muito importante para estudos em genética de popula¸cões naturais. O alto polimorfismo desses marcadores é uma vantagem em estudos de fluxo gênico, padrões de diferencia¸cão e n´ıveis de endogamia entre popula¸cões (Kashyap et al., 2006).

1.7 Esp´

ecie

Para a execu¸cão deste estudo foi escolhida uma espécie arbórea nativa da Mata Atlântica do estado de São Paulo; Myroxylon peruiferum L.f., conhecida popularmente como cabreúva. A escolha dessa espécie se baseou nos seguinte critérios: (1) a espécie deveria ser nativa da Mata Atlântica de São Paulo; e (2) estar presente na áreas de restaura¸cão florestal e remanescentes florestais dispon´ıveis para estudo.

Myroxylon peruiferum L.f. (Fabaceae - Leguminosae: Papilionoideae) é uma espécie brasileira nativa, presente em quase todo o pa´ıs, principalmente na floresta semidec´ı-dua. É dec´ıdua, heliófita, de cruzamento misto (Silvestre et al., comunica¸cão direta), ocorrendo tanto no interior da mata primária densa como nas forma¸cões secundárias. Sua s´ındrome de dispersão de sementes é anemocórica e supõe-se que a dispersão de sementes ocorra em distâncias curtas devido ao tamanho e peso elevado das mesmas. A poliniza¸cão foi descrita como sendo realizada por ornitofilia ou melitofilia (Lorenzi, 2002; Yamamoto, 2001; Yamamoto et al., 2007). Pode apresentar brotamento vegetativo a partir de suas ra´ızes.

Desta espécie é extra´ıdo o bálsamo-do-Peru, utilizado na medicina popular como analgésico para infeçcões do trato urinário, tosse, bronquite diabetes e contra a micobac-téria gram negativa Helicobacter pylori, além de ser usado pela indústria cosmética e de perfumaria. Este bálsamo é constitu´ıdo por uma mistura de ácido benzóico e cinâmico, monoterpenos, sesquiterpenos, alcoóis e derivados de fenilpronanóides. De seu tronco foram extra´ıdos isoflavonas, flavanona, isoflavonóides, dentre outras substâncias.

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De suas folhas foram isoladas as substâncias 3’,4’,7-trimetoxi-isoflavona (cabreuvina) e o 6-hidróxi-4’,7-dimetoxiisoflavona e o germacreno D; as quais apresentaram atividade frente à Mycobacterium tuberculosis, M. avium e M. kansasii (Carvalho et al., 2008). Também há registro de atividade de extrato de M. peruiferum contra Streptococcus pyogenes, Shigella sonnei e Staphylococcus aureus (Ohsaki et al., 1999; Gon¸calves et al., 2005).

Figura 1.2: Folhas e frutos de Myroxylon peruiferum. No detalhe, representa¸c˜ao art´ıstica do fruto verde de cabre´uva.

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Os objetivos deste projeto foram descrever a variabilidade genética de M. peruiferum em popula¸cões naturais e de áreas de restaura¸cão ambiental no estado de São Paulo utilizando marcadores microssatélites nucleares (SSR) e cloroplastidiais (cpSSR).

2.1 Objetivos Espec´ıficos

I Desenvolver uma biblioteca genˆomica enriquecida, isolar e caracterizar locos de microssat´elites (SSR) nucleares em M. peruiferum.

II Descrever a variabilidade e estrutura¸cão genética de M. peruiferum em popula¸cões naturais e de áreas de restaura¸cão florestal no estado de São Paulo, utilizando marcadores microssatélites nucleares (SSR) e citoplasmáticos (cpSSR).

III Identificar padrões de estrutura¸cão genética espacial e local.

IV Avaliar, utilizando simula¸cão computacional, o impacto do tamanho amostral sobre as estimativas de freqüências alélicas e diversidade genética.

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3.1 Introdu¸

c˜

ao

Neste trabalho, estudamos a variabilidade genética de Myroxylon peruiferum L. f., em duas diferentes áreas de restaura¸cão florestal e em duas áreas de remanescentes naturais de Floresta Estacional Semidecidual. A primeira etapa do trabalho foi a coleta de amostras foliares de indiv´ıduos adultos e jovens em cada uma das áreas de estudo.

3.2 Metodologia

3.2.1 Areas de estudo´

As coletas foram realizadas em duas áreas de restaura¸cão florestal, restauradas com o plantio de espécies da Floresta Estacional Semidecidual; e três áreas de remanescentes florestais naturais, num total de cinco (5) popula¸cões a priori.

A Esta¸cão Ecológica de Caetetus (E.E. Caetetus) é um dos últimos remanes-centes significativos de Floresta Estacional Semidecidual no planalto ocidental do Es-tado de São Paulo (IBGE, 1992), sendo o que possui melhor estado de conserva¸cão, representando assim o melhor referencial poss´ıvel de uma área não antropizada na região. Com área cont´ınua de 2.178,84 ha, desempenha um importante papel de deten-tora de uma amostra representativa da flora regional (figura 3.1 A). Administrada pelo Instituto Florestal, órgão da Secretaria de Meio Ambiente do Estado de São Paulo. A Esta¸cão Ecológica dos Caetetus localiza-se na região Centro-Oeste do Estado de São Paulo, a sudoeste da cidade de Gália, próximo ao Km 186 da rodovia vicinal SP 331 (Gália/Gar¸ca - Ourinhos), entre as coordenadas geográficas 22o 41’_{a 22}o

46’_{Sul e 49}o 10’ a 49o16’ _{Oeste, (Tabanez, 2005).}

A temperatura média anual gira em torno de 22o C. Sua altitude média é 530 metros e apresenta pluviosidade média anual em torno de 1.480 mm (Durigan et al., 2000).

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Conforme o histórico patrimonial e demais informa¸cões apresentadas no documento do Plano de Manejo para a área (Tabanez, 2005), esta unidade de conserva¸cão foi criada pelo Decreto Estadual n◦26.718, de 6 de fevereiro de 1987, sendo objeto de um programa institucional que visava ao estabelecimento de novas categorias de manejo de unidades de conserva¸cão da natureza, em consonância com a prote¸cão de importantes por¸cões territoriais de propriedade do governo do estado, que abrigavam ecossistemas complexos e frágeis.

Com a institui¸cão da categoria de Esta¸cão Ecológica desse importante remanes-cente florestal, em substitui¸cão à Reserva Florestal, possibilitou-se o conhecimento e a preserva¸cão efetiva dessa amostra significativa de Floresta Estacional Semidecidual inte-riorana, através da realiza¸cão de pesquisas básicas e aplicadas em ecologia, da prote¸cão do meio ambiente natural e do desenvolvimento da educa¸cão conservacionista.

De acordo com (Kronka et al., 2005), a região administrativa de Mar´ılia, onde está situada a Esta¸cão Ecológica dos Caetetus, está entre as regiões que apresentaram as maiores redu¸cões (11,38%) da cobertura vegetal nativa no per´ıodo entre 1990/02 e 2000/2001, sendo que atualmente, os ecossistemas naturais encontram-se quase total-mente dizimados na região. No entanto, a Esta¸cão Ecológica de Caetetus constitui um fragmento florestal relativamente extenso e com trechos muito bem preservados, armazenando várias espécies arbóreas amea¸cadas de extin¸cão pela agressividade do ex-trativismo nos demais remanescentes desse tipo florestal do estado nos últimos anos, como o guarantã (Esenbeckia leiocarpa), a peroba-rosa (Aspidosperma polyneuron) e a cabreúva (Myroxylon peruiferum), entre outras. Também é capaz de abrigar muitas es-pécies de animais, algumas inclusive também com forte amea¸ca de extin¸cão, destacando-se o mico-leão-preto (Leonthopithecus chrysopygus).

na E.E. Caetetus, foram estabelecidos dois pontos de coleta; um no interior da mata, na área do projeto de parcelas pemanentes desenvolvido pelo Laboratório de Ecologia e Restaura¸cão Florestal (LERF) da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

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(ESALQ/USP), e o segundo ponto na região próxima à borda da mata. O objetivo foi verificar a estrutura¸cão genética espacial dentro de uma mata cont´ınua bem preservada. A Área de Relevante Interesse Ecológico Mata de Santa Genebra (A.R.I.E. Santa Genebra), com 251,77 ha de área e nove quilômetros de per´ımetro, é o maior remanescente de Mata Atlântica do munic´ıpio de Campinas, e a segunda maior floresta urbana do Brasil, ficando atrás apenas da Floresta da Tijuca, no Rio de Janeiro (figura 3.1 B). A altitude média é de 670 m e a temperatura média anual de 21,6◦C (FJPO -Funda¸cão José Pedro de Oliveira, 2010).

Localizada entre as coordenadas 22◦ 49’ 20”Sul e 47◦ 06’ 40”Oeste, a A.R.I.E. Santa Genebra está inserida no Distrito de Barão de Geraldo, ao norte do munic´ıpio de Camp-inas (SP) e possui uma de suas faces em divisa com o munic´ıpio de Paul´ınia. Em 1983 a área foi tombada pelo Conselho de Defesa do Patrimônio Histórico, Art´ıstico, Arque-ológico e Tur´ıstico do Estado de São Paulo (CONDEPHAAT) e em 1985 foi declarada A.R.I.E., uma Unidade de Conserva¸cão de Uso Sustentável, cujo objetivo é compati-bilizar a conserva¸cão da natureza com o uso sustentável de parcela dos seus recursos naturais. Em 1992, o CONDEPACC (Conselho de Defesa do Patrimônio Art´ıstico e Cultural de Campinas) tombou a área como patrimônio natural do munic´ıpio, visando minimizar problemas relacionados à incêndios criminosos, extra¸cão de madeira, ca¸ca, especula¸cão imobiliária e loteamentos clandestinos.

A Mata de Santa Genebra possui um entorno diversificado, com cultivos agr´ıcolas, bairros residenciais (Bosque de Barão), condom´ınios fechados em situa¸cão de irregular-idade e duas rodovias de fluxo intenso que tangenciam a mata (SP 332 e SP 138-146). Diante das diversas pressões, impactos e da atual situa¸cão de isolamento do fragmento da MSG, é cada vez mais evidente a necessidade de interven¸cões e a¸cões de manejo para uma devida preserva¸cão deste importante remanescente de Mata Atlântica.

A Mata de Santa Genebra é considerada uma Floresta Estacional Semidecidual (cerca de 85% de sua área), com alguns trechos ocupados por Floresta Hidrófila ou