Avaliação microbiológica de carne de codorniz

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Avaliação Microbiológica de Carne de Codorniz

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar

Maria da Conceição Costa Mota

Orientador

Professora Doutora Maria da Conceição Medeiros de Castro Fontes

Coorientador

Professora Doutora Alexandra Sofia Miguéns Fidalgo Esteves

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Avaliação Microbiológica de Carne de Codorniz

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar

Maria da Conceição Costa Mota

Orientador

Professora Doutora Maria da Conceição Medeiros de Castro Fontes

Coorientador

Professora Doutora Alexandra Sofia Miguéns Fidalgo Esteves

I

Aos meus pais por todo o amor e por estarem presentes em todos os momentos da minha vida!

II

Agradecimentos

A realização deste trabalho não teria sido possível sem a cooperação de muitas pessoas e às quais quero expressar o meu profundo agradecimento.

À Professora Doutora Maria da Conceição Fontes e à Professora Doutora Alexandra Esteves professoras e orientadoras, por terem permitido que eu fizesse parte deste trabalho. O meu muito obrigado pela ajuda prestada na realização do trabalho experimental, pelo conhecimento, disponibilidade e compreensão.

Pela preciosa colaboração na análise estatística dos dados agradeço à Professora Doutora Ana Cláudia Coelho.

À D. Ana, à D. Fátima e ao Sr. Felisberto por todo o grande apoio que me deram ao longo da realização deste projeto, por todas as ajudas no laboratório e pela sua simpatia.

A todos os meus amigos que sempre me apoiaram e sempre tiveram uma palavra amiga nos maus momentos, não querendo excluir nenhum mas um muito obrigado à Rute Machado, à Efigénia Lebres, à Iolanda Teixeira, à Sílvia Silva, à Maria Piteira, à Cláudia Machado, à Francisca, à Raquel à Beatriz. Por todos vos foi possível chegar aqui sem desistir.

A todos os meus colegas de Mestrado e de trabalho que acompanharam todo o meu processo de formação e com quem passei bons momentos durante estes anos.

A todas a outras pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a elaboração deste trabalho.

Por último (mas os últimos são sempre os primeiros) à minha família, principalmente aos meus pais, o meu mais sincero agradecimento. Por todos os valores que me transmitiram, educação, conselhos, e por toda a paciência e grande amizade com que sempre me ouviram. Ao meu irmão, ao meu sobrinho e cunhada por todo o apoio, a todos vós que me acompanham nesta caminhada o meu muito obrigado!

III

Índice

Dedicatória………I

Agradecimentos………...II

Índice de Quadros e Tabelas………...………V

Índice de abreviaturas………..VII

Resumo………...………….IX

Abstract………....X

I. INTRODUÇÃO ... 1

II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 3

II.1. HISTÓRIA DA CODORNIZ ... 3

II.2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA ... 3

II.3. A PRODUÇÃO E CONSUMO DE CARNE DE AVES EM PORTUGAL ... 4

II.4. OPERAÇÕES DE ABATE DAS AVES ... 5

II.4.1. Produção. ... 5

II.4.2.Transporte. ... 5

II.4.3. Receção e Dependura. ... 6

II.4.4. Insensibilização/ Atordoamento. ... 6

II.4.5. Sangria. ... 6

II.4.6. Escaldão. ... 7

II.4.7. Depena. ... 7

II.4.8. Corte e separação da cabeça. ... 8

II.4.9. Corte das patas. ... 8

II.4.10. Evisceração. ... 8

II.4.11. Lavagem final. ... 9

II.4.12. Corte e separação do pescoço. ... 9

II.4.13. Marca de identificação e salubridade. ... 9

II.4.14. Arrefecimento. ... 9

II.4.15. Conservação. ... 10

II.5. Microbiologia das aves ... 10

IV

II.5.1.1. Bactérias do ácido lático (BAL) ... 12

II.5.1.2. Fungos ... 12

II.5.1.3. Enterobacteriaceae……….…...13

II.5.1.4. Microrganismos mesófilos totais………..……….……….……….13

II.5.1.5. Pseudomonas spp………...………...14

II.5.2. Microbiota patogénica ... 14

II.5.2.1. Salmonella spp. ... 14

II.5.2.2. Escherichia coli ... 15

II.5.2.3. Staphylococcus coagulase positiva ... 16

II.5.2.4. Campylobacter enteropatogénico ... 17

II.5.2.5. Listeria monocytogenes ... 18

III. OBJETIVOS ... 19

IV. TRABALHO EXPERIMENTAL ... 20

IV.1. MATERIAL E MÉTODOS ... 20

IV.1.1. Amostragem ... 20

IV.1.2. Determinações microbiológicas ... 20

IV.1.2.1. Microrganismos deteriorativos ... 20

IV.1.2.1.1. Preparação da amostra ... 20

IV.1.2.1.2. Contagem de bactérias do ácido láctico (BAL) ... 21

IV.1.2.1.3. Contagem de fungos (bolores e leveduras) ... 21

IV.1.2.1.4. Contagem de Enterobacteriaceae ... 21

IV.1.2.1.5. Contagem de microrganismos mesófilos totais (aeróbios totais a 30º C) ... 22

IV.1.2.1.5. Contagem de Pseudomonas spp. ... 22

IV.1.2.2. Microrganismos patogénicos ... 23

IV.1.2.2.1. Preparação da amostra ... 23

IV.1.2.2.2. Pesquisa de Salmonella sp. ... 23

IV.1.2.2.3. Pesquisa e contagem de E. coli ... 24

IV.1.2.2.4. Pesquisa e contagem de Staphylococcus coagulase positiva ... 24

IV.1.2.2.5. Pesquisa de Campylobacter enteropatogénico ... 25

IV.1.2.2.6. Pesquisa e contagem de Listeria monocytogenes ... 26

IV.2. ANÁLISE DE DADOS ... 26

IV.2.1. Resultados…………...……….………...…28

IV.2.1.1. Microrganismos patogénicos ... 36

IV.2.1.2. Comparação das contagens intragrupos para os diferentes microrganismos.. 40

IV.3.DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ... 41

V. CONCLUSÕES ... 49

VI. Referências bibliográficas………..….51

V

Índice de quadros e tabelas

Quadro 1- Contagem (log ufc/g) de Bactérias do ácido láctico, Bolores, Enterobacteriaceae, Microrganismos mesófilos, Pseudomonas spp., E. coli e Staphylococcus coagulase positiva, em codornizes adquiridas em diferentes estabelecimentos de Vila Real.

Quadro 2- Percentagem de amostras consideradas satisfatórias, aceitáveis e não satisfatórias segundo os critérios microbiológicos utilizados para cada microrganismo deteriorativo.

Quadro 3- Contagem de bactérias do ácido lático (log ufc/g) em codornizes, adquiridas em estabelecimentos de Vila Real, considerando o matadouro, o número de dias pós-abate e o tipo de estabelecimento.

Quadro 4- Contagem de Fungos (log ufc/g) em codornizes, adquiridas em estabelecimentos de Vila Real, considerando o matadouro, o número de dias pós-abate e o tipo de estabelecimento. Quadro 5- Contagem de Enterobacteriaceae (log ufc/g) em codornizes, adquiridas em estabelecimentos de Vila Real, considerando o matadouro, o número de dias pós-abate e o tipo de estabelecimento.

Quadro 6- Contagem de microrganismos mesófilos (log ufc/g) em codornizes, adquiridas em estabelecimentos de Vila Real, considerando o matadouro, o número de dias pós-abate e o tipo de estabelecimento.

Quadro 7- Contagem de Pseudomonas spp. (log ufc/g) em codornizes, adquiridas em estabelecimentos de Vila Real, considerando o matadouro, o número de dias pós-abate e o tipo de estabelecimento.

Quadro 8- Contagem de E. coli (log ufc/g) em codornizes, adquiridas em estabelecimentos de Vila Real, considerando o matadouro, o número de dias pós-abate e o tipo de estabelecimento. Quadro 9- Contagem de Staphylococcus coagulase positiva (log ufc/g) em codornizes, adquiridas em estabelecimentos de Vila Real, considerando o matadouro, o número de dias pós-abate e o tipo de estabelecimento.

Quadro 10- Percentagem de amostras em que a pesquisa de Salmonella spp., E. coli, Staphylococcus coagulase positiva, Campylobacter enteropatogénico e Listeria monocytogenes, em codornizes, adquiridas em diferentes estabelecimentos de Vila Real, foi positiva.

Quadro 11- Variáveis associadas com um valor ≥ ao considerado satisfatório para as bactérias do ácido lático na análise univariada (P<0,05) (OR: razão de risco; a: intervalo de confiança). Quadro 12- Variáveis associadas com um valor ≥ ao considerado satisfatório para os fungos na análise univariada (P<0,05) (OR: razão de risco; a: intervalo de confiança).

Quadro 13- Variáveis associadas com um valor ≥ ao considerado satisfatório para os microrganismos mesófilos na análise univariada (P<0,05) (OR: razão de risco; a: intervalo de confiança).

Quadro 14- Variáveis associadas com um valor ≥ ao considerado satisfatório para as Pseudomonas spp. na análise univariada (P<0,05) (OR: razão de risco; a: intervalo de confiança).

VI Quadro 15- Separação estatística das médias das contagens de BAL, Fungos, Enterobacteriaceae, Microrganismos mesófilos, Pseudomonas spp., E. coli e Staphylococcus coagulase positiva dentro de cada variável (matadouros e tipo de estabelecimento de venda ao público e nº de dias pós abate).

VII

Índice de Abreviaturas

Aceit.- Aceitável

APT- Água Peptonada Tamponada aW- Atividade da Água

BAL- Bactérias do Ácido Lático BHI- Brain Heart Infusion BPA- Baird Parker Agar

CFC- Cetrimide, Fucidin, Cephaloridine CGA- Cloramphenicol Glucose Agar DP- Desvio padrão

EHEC- E. coli Enterohemorrágica EIEC- E. coli Enteroinvasiva EPEC- E. coli Enteropatogénica ETEC- E. coli Enterotoxigénica

FAO- Food and Agriculture Organization g- Grama

GS- Grandes superficies Hz- Hertz

ICMSF- International Commission on Microbiological Specification for Food INE- Instituto Nacional de Estatística

IC- Intervalo de confiança log- logaritmo

MADRP- Ministério da Agricultura Desenvolvimento Rural e das Pescas mA- Miliamperes

mg- Miligrama

VIII

ml- mililitros

MRS- Man Rogosa Sharpe NaCl- Cloreto de Sódio Nº- Número

N. Sat.- Não satisfatório OR- Razão de risco P- Probabilidade

PCA- Plate Count Agar PS- Pequenas superfícies Reg.- Regulamento

RVS- Rappaport-Vassilidis (RV) Enrichment Broth Sat.- Satisfatório

TBX- Tryptone-Bile-Glucuronic medium TSI- Triple Sugar Iron

TSYA- Tryptone Soya Agar

ufc- Unidades Formadoras de Colonia WHO- World health Organization

XLD- Xylose, Lysine, Deoxycholate Agar ºC- Graus Celcius

%- Percentagem

2

IX

Resumo

Segundo a FAO, o consumo de carne de ave aumentou mundialmente nas últimas décadas. A carne é um substrato de excelência para o desenvolvimento microbiano, devido essencialmente à sua elevada atividade de água e aos seus componentes de baixo peso molecular (hidratos de carbono, lactatos e aminoácidos). Pode albergar quer microrganismos patogénicos, quer microrganismos responsáveis pela sua decomposição. A carne de aves, é um alimento frequentemente associado à transmissão de variados microrganismos patogénicos para o Homem, nomeadamente:

Salmonella spp., Campylobacter spp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Escherichia coli. As operações de abate como a depena e a evisceração são importantes

fontes de contaminação das carcaças de aves mas, um aumento muito considerável de contaminação ocorre durante os procedimentos de preparação, conservação e distribuição das carnes.

Este trabalho teve como objetivo a avaliação das características microbiológicas de carcaças de codornizes obtidas em vários estabelecimentos de venda direta ao consumidor, a deteção de microrganismos patogénicos e ainda verificar existência de associações entre as variáveis em estudo e os níveis de contagens para os diferentes microrganismos considerados. Para tal foram analisadas codornizes refrigeradas, num total de 80 amostras, obtidas em grandes e pequenas superfícies comerciais de venda direta ao público, na cidade de Vila Real. Recolheram-se informações relativas ao matadouro e número de dias pós-abate. Como resultados deste estudo, e no que se refere às contagens de microrganismos deteriorativos, verificamos que para a maioria das amostras os valores eram considerados satisfatórios ou aceitáveis, no entanto os valores de contagens para Enterobacteriaceae apresentaram uma percentagem de amostras consideradas não satisfatórias muito elevado 83,78%. Relativamente aos microrganismos patogénicos, verificamos que E. coli foi detetada em 77,5% das amostras, Listeria monocytogenes em 41,25%, Salmonella spp. em 38,75%,

Staphylococcus coagulase positivo em 23,75% e Campylobacter enteropatogénico em

11,25%.

Palavras-Chave: Codorniz, avaliação microbiológica, microrganismos patogénicos, microrganismos deteriorativos.

X

Abstract

According to FAO, poultry meat consumption increased globally in the last decades. Meat is considered a substrate of excellence, primarily due to its high water activity and its low molecular weight components (carbohydrates, lactates and amino acids). Meat can host either pathogenic microorganisms or spoilage microorganisms. Poultry it is often associated with the transmission of a variety of pathogenic microorganisms for humans, namely: Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Listeria

monocytogenes, and Escherichia coli. Slaughter operations such as defeathering and

evisceration are important contamination sources of poultry carcasses, substantial contamination increase occurs during the procedures of meat preparation, conservation and distribution.

This essay aimed the assessment of the microbiological characteristics of quail’s carcasses obtained at several consumer direct selling establishments, the detection of pathogenic microorganisms and also verify the existence of combination among the variables under study and the counting levels among the distinct microorganisms considered. Refrigerated quails were analyzed to this end, in a total of 80 samples, obtained at small and large commercial surfaces, of consumer direct sale, at Vila Real.. Information concerning the slaughterhouse and number of days post-slaughtering was gathered. As result of this study and regarding the counting of deteriorative microorganisms it was verified that at the majority of the samples the values were considered satisfactory or acceptable, however, the values of counts for

Enterobacteriaceae showed a very high percentage of samples considered

unsatisfactory 83,78%. Relatively to pathogenic microorganisms we verified that E.

coli was detected at 77,5% of the samples, Listeria monocytogenes at 41,25%, Salmonella spp. at 38,75%, Staphylococcus coagulase-positive at 23,75% and

enteropathogenic Campylobacter at 11,25%.

Key-Words: Quail, microbiological assessment, pathogenic microorganisms and spoilage microorganisms.

1

I. Introdução

O consumo de carne a nível mundial continua elevado, contudo existem hábitos distintos quanto ao tipo de carne que se consome. Exemplo disto é o aumento do consumo de carne de aves face ao de carnes vermelhas (Varnam e Sutherland, 1998; MADRP, 2007). Segundo a FAO, o consumo de carne de ave aumentou mundialmente nas últimas décadas (Goksoy et al., 2004). O fator determinante para esta alteração inicialmente era económico, uma vez que os métodos de exploração intensiva na indústria avícola e o recente desenvolvimento da tecnologia de abate, permitiram produzir carne de aves de capoeira a preços consideravelmente mais baixos comparativamente a carnes de outras espécies (Varnam e Sutherland, 1998; Goksoy et

al., 2004).

A carne de ave pode ser obtida de animais destinados à produção de carne, como é o caso do frango, peru, pato e codorniz ou provirem de animais refugados de outras actividades, como as galinhas poedeiras quando acabam o seu ciclo de produção de ovos (Varnam e Sutherland, 1998).

Os matadouros privados muitas vezes ligados a explorações avícolas, direcionaram o seu desenvolvimento tecnológico no sentido de uma mais completa mecanização e automatização das operações de abate, permitindo desta forma o aumento da cadência de abate e a diminuição do número de magarefes (Moreno, 2006).

Os animais produtores de carne consideram-se importantes reservatórios de microrganismos patogénicos (Varnam e Sutherland, 1998). A qualidade higio-sanitária da carne de aves decresceu consideravelmente com a passagem da produção da forma tradicional para a produção intensiva. Em explorações intensivas, o elevado número de aves e a sua proximidade, facilitam a passagem de microrganismos patogénicos para o Homem, dificultando as medidas de controlo e prevenção (Moreno, 2006).

A carne é um alimento que pode apresentar-se muito contaminado, tanto com microrganismos patogénicos de origem entérica, como com microrganismos responsáveis pela decomposição, sendo os últimos a causa mais frequente da sua alteração. A carne de aves, é provavelmente o alimento que com maior frequência é responsável pela transmissão de variados microrganismos patogénicos para o Homem, tais como: Salmonella spp., Campylobacter spp., Staphylococcus aureus, Clostridium

2 Aeromonas hydrophila, Shigella spp., Streptococcus spp., Clostridium botulinum e Bacillus cereus (Moreno, 2006).

Os microrganismos são introduzidos pelas aves nos matadouros, disseminando-se pelas instalações, equipamentos e utensílios e deste modo entram na cadeia alimentar (Goksoy et al., 2004; Moreno, 2006). As contaminações cruzadas durante as operações de abate são responsáveis pela sua disseminação levando a que o seu teor nas carnes frescas e produtos cárneos possa ser suficiente para provocar nos consumidores gastroenterites e outras manifestações de doenças de origem alimentar (Varnam e Sutherland, 1998; Berrang et al.,,2000). A contaminação das carcaças está dependente de dois fatores, por um lado da higiene do matadouro e dos seus processos e por outro do estatuto higio-sanitário das aves destinadas ao abate (Rostagno et al., 2006).

As operações de abate, que têm sido consideradas as maiores fontes de contaminação das carcaças de aves são a depena, a evisceração e o arrefecimento em tanques de água, (Sarlin et al., 1998), dado serem frequentes as contaminações cruzada durante estas operações (Nde et al., 2007). As patas e penas sujas com fezes permitem a introdução dos microrganismos no matadouro (Buhr et al., 2000).

Dos fatores que mais contribuem para a contaminação da carne de aves destacam-se a presença de Campylobacter spp. na pele e tubo gastrintestinal dos animais (Berrang et al., 2002) e a presença de Salmonella spp. no papo e moela, uma vez que a sua rutura contribui para a contaminação das carcaças (Smith e Berrang, 2006; Smith et al., 2007). A estes fatores associa-se o difícil controlo dos microrganismos durante as operações de abate (Goksoy et al., 2004). Deste modo as operações de abate, a conservação e a manipulação da carne de aves até ao consumidor devem ser efetuadas de modo a que se limite a contaminação por microrganismos e também se iniba ou reduza a sua multiplicação (Berrang et al., 2000).

Na Europa, os operadores das empresas do setor alimentar não podem utilizar nenhuma substância além de água potável para removerem qualquer eventual contaminação da superfície dos produtos de origem animal (Reg. (CE) nº853/2004) A constatação dos frequentes riscos microbiológicos e químicos dos géneros alimentícios, nomeadamente os de origem animal, para a saúde pública, levou a Comunidade Europeia a criar o Regulamento (CE) nº852/2004, que estabelece as regras gerais de higiene dos géneros alimentícios e o Regulamento (CE) nº853/2004, que estabelece as regras específicas de higiene aplicáveis aos géneros alimentícios de origem animal, com o objectivo de garantir uma elevada proteção do consumidor em matéria de segurança dos géneros alimentícios.

3

II. Revisão Bibliográfica

II.1. História da Codorniz

A codorniz é o mais pequeno dos galináceos, sendo a sua carne e ovos bastante apreciados desde há muito na gastronomia portuguesa. Os primeiros dados históricos relativamente à proveniência da codorniz selvagem europeia datam do século XII. Relativamente à criação das mesmas para produção de carne e ovos, esta terá surgido no início do século XX, mais precisamente em 1910, uma vez que até então esta ave era apenas apreciada pelo seu canto. Após vários cruzamentos entre espécies selvagens conseguiu-se obter a espécie Coturnix coturnix japonica, ou seja a codorniz doméstica,

que devido às suas excelentes características rapidamente se expandiu pela Europa (Vitorino, 2005).

II.2. Classificação Taxonómica

 A codorniz pertence, à ordem dos Galliformes, à família Phasianidae, ao género Coturnix. As espécies que são comercialmente exploradas são (Romero e Chavarro, 2007):

 Coturnix coturnix coturnix: é a codorniz selvagem que habita na Europa e Ásia, emigrando no inverno para África, Arábia e Índia. Trata-se de uma ave que é citada nos textos bíblicos como o maná do povo Hebraico. É uma ave destinada à produção de carne devido ao seu maior peso corporal.

 Coturnix coturnix japonica: é a codorniz japonesa que habita na ilha de

Sakhaline, no arquipélago do Japão. No século XIX foi introduzida na Europa e Estados Unidos como ave de investigação e decorativa, alcançando depois importância na indústria avícola, tendo como principal finalidade a produção de ovos, devido à sua alta produtividade e multiplicação.

4

II.3. A produção e consumo de carne de aves em Portugal

A disponibilidade da carne de codorniz pode, em pouco tempo, tornar-se uma fonte importante de proteína para o consumo humano, devido a fatores como o baixo investimento inicial, a sua alta resistência a doenças e o pequeno consumo de ração, estimulando deste modo a produção destas aves (Silva et al., 2007).

Segundo Dalmau (2002) citado por Silva e colaboradores (2007), a qualidade da carne de codornizes é reconhecida desde os povos mais antigos, pelo seu alto conteúdo em proteínas e pequena quantidade de gordura, aliado ao seu rápido ciclo de crescimento (em média 35 dias para atingir a idade adulta), proporcionando uma carne muito tenra, com preparação gastronómica fácil e rápida, tornando-se uma carne superior às outras.

No período 2003-2005, em Portugal, o setor da carne das aves representou cerca de 12,5% do valor da produção animal. Em 2005, o total de carne de aves produzida atingiu as 296 000 toneladas, valor superior ao ano de 2003 com 270 000 toneladas registadas. No seio deste setor, a carne de frango representa mais de 95% do seu valor económico. Em 2003 existiam em Portugal 227 640 explorações de aves, as quais possuíam 35 434 100 animais, sendo 19.251 865 para produção de carne. A produção de carne de aves centra-se, na sua quase totalidade (86.5%) na Beira Litoral e no Ribatejo e Oeste (50% e 36%, respetivamente) (MADRP, 2007).

Em 2010 o volume total de produção de animais de capoeira teve um aumento de 1,5% comparativamente a 2009, com 339 mil toneladas produzidas. Comparativamente à produção total de “outras carnes”, que inclui caça, pombos, coelhos e codornizes, registou um decréscimo de 1,3%, devido essencialmente aos menores volumes de produção de carne de coelho (-1,3%) e de codorniz (-1,2%) relativamente ao ano de 2009 (INE, 2011). Já no ano de 2011 a tendência da produção de “outras carnes” manteve-se com um decréscimo de 5,3%, na sua produção facto que se deve essencialmente ao menor volume da produção de coelho que registou no ano de 2011 um decréscimo de 8% relativamente a 2010, no entanto a produção de codorniz, não seguiu a mesma tendência tendo-se registado um aumento de cerca de 21% na sua produção. No ano de 2012, a produção de codorniz sofreu uma redução de 5,6%. Segundo o INE, em 2011, foram abatidas sob inspeção 9 309 379 codornizes, correspondendo a 1451 toneladas, em 2012 o número aumentou para 9 769 109,

5

correspondendo no entanto a um menor número de toneladas (1370) (INE, 2012 e 2013).

O consumo de carne entre 2009 e 2011 diminuiu 5% devido ao decréscimo do consumo das carnes de bovino e suíno, no entanto, a carne de animais de capoeira manteve-se estável devido essencialmente ao seu preço mais acessível, registando um consumo médio de 35 kg, por habitante por ano (INE, 2012).

II.4. Operações de abate das aves

II.4.1. Produção:

Durante a fase de produção pode ocorrer a contaminação das aves com microrganismos patogénicos, particularmente Salmonella spp. e Campylobacter spp., que embora possam não provocar sinais de doença, são posteriormente introduzidos no matadouro pelas aves. As medidas preventivas aplicadas nesta fase reduzem a contaminação microbiana, embora não a eliminem por completo. É ao nível da produção que se geram mais riscos, sendo possível controlá-los e não eliminá-los (Moreno, 2006).

II.4.2Transporte:

Durante o transporte existe um elevado stresse, levando a um aumento da contaminação fecal externa das aves, bem como da transmissão, colonização e eliminação de Salmonella spp. (Rostagno et al., 2006). O stresse leva a uma diminuição da resistência às infeções pelo que os microrganismos patogénicos intestinais podem difundir-se e atingir rapidamente órgãos vitais como o coração e o fígado (Moreno, 2006). A contaminação fecal externa ocorre durante o transporte e o repouso no matadouro, dado que as aves defecam e as fezes vão contaminar as jaulas e as penas das aves situadas por baixo. De modo a reduzir esta contaminação é conveniente que as aves tenham um período de jejum de algumas horas antes do transporte (Buhr et al., 2000). Os veículos e equipamentos de transporte depois de vazios e antes de serem reutilizados, devem ser lavados e desinfetados (Reg. (CE) nº 853/2004).

6

II.4.3 Receção e Pendura:

Os operadores dos matadouros não devem aceitar animais nas suas instalações a menos que o tenham solicitado e recebido as informações pertinentes em matéria de segurança alimentar contida nos registos mantidos na exploração de proveniência, de acordo com o Regulamento (CE) nº 852/2004.

O abate inicia-se com a pendura das aves nos ganchos da linha de abate. A dor e o desconforto provocados pela dependura são responsáveis pela violência do batimento das asas, o que por sua vez está na origem de fraturas ósseas e luxações que se repercutem na qualidade da carne (Moreno, 2006). Os matadouros são locais propícios à contaminação por via aérea, que permite aos microrganismos entrar e alojar-se nas superfícies de trabalho, equipamento e nas próprias mãos dos manipuladores (Lues et

al., 2007). Existe uma elevada prevalência de microrganismos de origem aerógena na

zona de receção e sangria, devido ao excessivo bater de asas e movimento das aves. À medida que nos aproximamos da zona de expedição, esta quantidade diminui, ou seja à medida que passamos da zona suja para a zona limpa (Lues et al., 2007).

II.4.4. Insensibilização/ Atordoamento:

Tem por objectivo proteger os animais da dor e garantir uma adequada sangria, (Fehlhaber e Janetschke, 1995). A insensibilização é alcançada com o recurso a choque elétrico, as aves são suspensas pelas patas e a cabeça é introduzida num tanque (deve possuir a profundidade e dimensão adequadas ao tipo de ave) de água eletrificado onde recebem uma descarga eléctrica que as atravessa e insensibiliza (Moreno, 2006). O eléctrodo imerso na água deve ser do comprimento do tanque sendo os requisitos elétricos para o equipamento de atordoamento em tanque de imersão, para codornizes, de 45 mA, sendo a frequência < 200 Hz (Reg. CE nº 1099/2009).

II.4.5. Sangria:

Imediatamente a seguir à insensibilização deve-se realizar a sangria, através do corte dos principais vasos sanguíneos do pescoço (artérias carótidas), de modo a que ocorra imediatamente a morte cerebral. Durante a sangria os animais não devem apresentar movimentos respiratórios nem batimento das asas (Moreno, 2006). Esta etapa deve ser realizada durante o intervalo de tempo necessário (1,5 a 2 minutos) para

7

que as aves fiquem corretamente sangradas antes de entrarem no tanque de escaldão, de modo a evitar a conspurcação da água do escaldão (Fehlhaber e Janetschke, 1995; Moreno, 2006). A secção dos vasos pode ser feita manualmente ou por meio de uma faca automática, sendo neste caso conveniente que um operador esteja atrás da faca automática para poder atuar prontamente sempre que haja uma falha na mesma. Depois de cada ave as facas não são limpas e desinfectadas, o que pode dar origem a contaminações cruzadas entre as aves (Moreno, 2006).

II.4.6 Escaldão:

O escaldão tem por objetivo facilitar a remoção das penas. Esta etapa dá-se por imersão em tanques de água quente e a temperatura depende da espécie abatida. Para frangos (broilers) recomendam-se temperaturas de escaldão de 59 a 60ºC com um tempo aproximado de 1 a 2 minutos. Para as aves que seguem para venda direta recomenda-se temperaturas mais suaves (50 a 54ºC) (Fehlhaber e Janetschke, 1995). Em matadouros de codornizes que abatem 4 500 animais por hora recomenda-se uma temperatura de 51,5ºC com um tempo de permanência de 45 segundos, devendo ocorrer ajustes em função da cadência de abate. A água arrasta a contaminação fecal externa das aves. Calcula-se que cada ave transfira 109 _{microrganismos viáveis para a água do}

escaldão. O efeito de lavagem da água do escaldão pode reduzir o número de microrganismos da superfície das carcaças, se a água for continuamente renovada e mantida à temperatura desejada (Goksoy et al., 2004). O escaldão tende a ser seletivo para mesófilos termorresistentes e microrganismos esporulados e serve como meio de contaminação cruzada (Goksoy et al., 2004). A água do escaldão não é substituída entre carcaças procedendo-se à sua renovação constante, o que lhe confere um elevado potencial para a disseminação de Salmonella spp. entre as aves que são processadas sucessivamente (Nde et al., 2007).

II.4.7. Depena:

Tem por finalidade eliminar as penas das aves, sendo realizada após o escaldão e mecanicamente. As aves penduradas na linha de abate atravessam a máquina, que possui de ambos os lados os discos depenadores com dedos de borracha, localizados a várias alturas para atingirem as diferentes partes do corpo dos animais (Moreno, 2006). Esta operação não é muito higiénica, sendo considerada uma das principais responsáveis

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por contaminação cruzada (Goksoy et al., 2004; Nde et al., 2007). Ocorre um aumento da contaminação por Campylobacter spp. em frangos após a depena, devido à ação peristáltica dos dedos da depenadora quando contactam com as carcaças e provocam a expulsão de fezes pela cloaca. A limpeza das depenadoras entre carcaças é impraticável, deste modo é comum a contaminação de carcaças livres de Salmonella spp. por carcaças portadoras desta bactéria processadas anteriormente (Nde et al., 2007).

II.4.8. Corte e separação da cabeça:

A seguir à depena é feita a separação da cabeça através de um dispositivo que as arranca por tração. Esta operação pode estar na origem de contaminações cruzadas da pele do pescoço (Moreno, 2006).

II.4.9. Corte das patas:

O corte das patas é feito ao nível da articulação do tarso, tendo o cuidado de regular bem a altura dos discos de modo a não lesionar ou cortar as superfícies articulares, esta operação tem uma reduzida influência na contaminação da carcaça, sendo no entanto conveniente uma limpeza e desinfeção adequada do equipamento (Moreno, 2006).

II.4.10. Evisceração:

Nesta operação separam-se o intestino com gordura intestinal, a cloaca, o esófago, a traqueia, o coração, o fígado, o baço, o estômago e nas aves adultas também os genitais (Fehlhaber e Janetschke, 1995). Na evisceração a saída do conteúdo intestinal pela cloaca, devido ao corte ou ruptura do intestino, pode contribuir para a contaminação da carcaça (Moreno, 2006). Tanto o colón como a cloaca são órgãos que apresentam uma elevada quantidade de Campylobacter spp., de tal modo que será de esperar que a saída dos seus conteúdos durante este processo seja uma fonte de contaminação tanto para a pele como para a carne, aumentando a contagem deste microrganismo nas carcaças (Berrang et al., 2000).

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II.4.11. Lavagem final:

A lavagem final deve incluir as superfícies externas e internas da carcaça, sendo a sua finalidade reduzir os microrganismos e melhorar a apresentação devido ao arrasto dos restos de sangue e outras sujidades. Quando praticada corretamente, a lavagem durante e depois da evisceração tem a capacidade de reduzir 10 vezes a contaminação microbiana das carcaças (Moreno, 2006).

II.4.12. Corte e separação do pescoço:

Esta operação tem pouca incidência na contaminação da carcaça, porém não se deve descurar os cuidados de limpeza e desinfeção dos equipamentos (Moreno, 2006).

II.4.13. Marca de identificação e salubridade:

De acordo com o Regulamento (CE) nº 853/2004, os operadores das empresas do setor alimentar devem assegurar que os produtos de origem animal possuem uma marca de identificação e de salubridade aposta em conformidade com os requisitos pertinentes no referido regulamento.

II.4.14. Arrefecimento:

No final das operações de abate, as carcaças de ave e as miudezas comestíveis devem ser submetidas rapidamente à ação do frio, até que seja alcançada a temperatura de 4ºC no centro térmico da carne. O Regulamento (CE) nº 853/2004 não estipula o intervalo de tempo em que se deve realizar, apenas obriga a que após a inspeção e a evisceração, os animais abatidos devem ser limpos e refrigerados até atingirem a temperatura referida, assim que possível. A técnica que utiliza água fria pode ser feita por imersão ou pulverização. Na Europa, as carcaças com destino à refrigeração são arrefecidas em ar frio, enquanto as que vão ser congeladas são arrefecidas por imersão em água fria (Moreno, 2006).

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II.4.15. Conservação:

Após o arrefecimento, as carcaças devem ser conservadas em câmaras frigoríficas a temperaturas próximas de 0ºC, devendo assegurar-se que esta não ultrapassa os 4ºC durante o período de conservação (Moreno, 2006).

II.5. Microbiologia das aves

As condições para a criação de aves diferem significativamente em todo o mundo, variando desde pequenas explorações com apenas algumas aves até grandes explorações especializadas, com um grande número de animais. Com o aumento do tamanho das explorações e consequente aumento do investimento, aumenta a preocupação com as doenças das aves nos complexos avícolas, levando à implementação de controlos mais rigorosos de modo a alcançar taxas de crescimento mais rápidas com baixos custos. Com a diminuição do número de explorações mas com o aumento da sua dimensão, existe uma oportunidade crescente de estabelecer programas de controlo para a redução de microrganismos patogénicos de interesse para a saúde humana, bem como para a das aves. Por exemplo em países Escandinavos, foi implementado a longo prazo em explorações programas para minimizar a prevalência de Salmonella em aves, bem como em carne crua de aves. Existem programas similares em outros países, incluindo Portugal, que permitiram a redução significativa da prevalência de Salmonelas em carne de aves (ICMSF, 2011).

Os produtos avícolas frescos e congelados são considerados importantes fontes de doença para o homem. A carne crua de aves é altamente perecível mesmo sob as melhores condições de conservação salvo quando congelada. O aumento na temperatura de armazenamento leva a um aumento do metabolismo e do crescimento microbiano (ICMSF, 2011).

Em carnes de aves frescas, os perigos de maior importância são Salmonella spp. e Campylobacter spp. Surtos devido a estes microrganismos ocorrem normalmente devido a confeção inadequada dos produtos ou recontaminação (FAO/ WHO, 2002).

Salmonella spp. e Campylobacter spp. estão presentes em aves vivas e na exploração, o

controle dos fatores que contribuem para a transmissão de agentes patogénicos, influencia largamente a sua prevalência em carcaças de aves e em humanos, uma vez que nenhuma medida de controlo pode eliminar estes microrganismos durante o processo de abate e refrigeração. Os tipos de microrganismos presentes em carcaças de

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aves refletem os que estão presentes nas aves vivas antes do abate, sugerindo deste modo que não são adquiridos nos matadouros (ICMSF, 2011).

Embora haja poucos estudos realizados em codornizes tivemos acesso ao estudo de Vashin e Stoyanchev (2005) que detetaram Campylobacter spp. em 16,1% das codornizes analizadas e ao estudo de Rahimi e Tajbakhsh (2008) em que detetaram

Campylobacter spp. em 68,4% das aves analisadas.

Factores que influenciam a deterioração

Existem quatro fatores que influenciam a taxa de multiplicação bacteriana bem como o tipo de deterioração da carne de aves em refrigeração (ICMSF, 2011):

 Número e tipo de bactérias psicotroficas;

 pH do tecido das aves;

 Temperatura de armazenamento;

 Tipo de embalagens, tais como embalagens em atmosfera modificada ou a vácuo.

A aplicação efetiva das boas práticas de higiene é um dos principais factores que afeta o número e o tipo de bactérias na carne crua. É por isso necessário a conceção e utilização de equipamentos de fácil limpeza e manutenção. O ambiente e os equipamentos envolvidos no processamento devem ser limpos e desinfetados em intervalos de tempo que permitam manter os níveis de bactérias deteriorativas baixos (ICMSF, 2011).

O pH dos tecidos da carne de aves não deve ser alterado, mas sim mantido, uma vez que é um importante fator que influencia o tempo de vida de prateleira destes produtos (ICMSF, 2011).

A temperatura de armazenamento é controlável, uma redução abaixo dos 4ºC apresenta efeitos benéficos na qualidade da carne. Quanto mais próximo do ponto de congelação se aproximar a temperatura, maior será a vida útil destes produtos (ICMSF, 2011).

O tipo de embalagem também influencia a velocidade de crescimento da microbiota que pode causar deterioração, daí a vida útil da carne crua de aves ser maior quando embalada a vácuo ou em atmosfera modificada contendo dióxido de carbono, quando comparado com as embalagens que contêm peliculas permeáveis ao oxigénio. (ICMSF, 2011).

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II.5.1. Microbiota deteriorativa

II.5.1.1. Bactérias do ácido lático (BAL)

O termo “bactérias do ácido lático” descreve um grupo de microrganismos procariotas com capacidade de produção de ácido lático como produto final da fermentação de hidratos de carbono (Stamer, 1979). As bactérias que estão incluídas neste grupo são bacilos ou cocos gram positivos, imóveis (ou raramente móveis) que não formam endosporos. São microrganismos com metabolismo estritamente fermentativo (Stamer, 1979; Kandler, 1983; Wood e Holzapfel, 1995). Embora sejam aerotolerantes, são um grupo de bactérias típico de habitats não aeróbios, sendo muito exigentes do ponto de vista nutritivo, suportando valores de pH muito baixos (3,8), embora a sua tolerância à acidez seja uma característica variável entre estirpes. As BAL estão presentes em ambientes diversos (alimentos e bebidas fermentadas, plantas, frutos, solo, águas residuais) fazendo também parte da microflora dos tratos respiratório, intestinal e genital do homem e de animais (Wood e Holzapfel, 1995; Chambel, 2001).

II.5.1.2. Fungos

Os fungos são células eucariotas sem clorofila que se reproduzem por esporos, existindo neste grupo organismos de forma e dimensões muito variadas, sendo conhecidos geralmente por leveduras, bolores e cogumelos (Freitas, 2000). Pertencem ao Reino Fungi distinguindo-se dos outros organismos eucariotas por serem quimiorganoheterotróficos e, também por apresentarem parede celular rígida que é composta por quitina e glucano e uma membrana celular em que o ergosterol substitui o colesterol (Murray et al., 2005). Os fungos leveduriformes, designados frequentemente por leveduras, são fungos unicelulares. Os outros, que constituem a maioria, são fungos filamentosos ou pluricelulares (Murray et al., 2005). Encontram-se descritas cerca de 100.000 espécies de fungos, que desempenham um papel importante na vida do Homem. São dos principais microrganismos responsáveis pela decomposição da matéria orgânica, interferindo no ciclo do carbono, do azoto e de outros nutrientes da

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biosfera. São capazes de deteriorar produtos e bens de consumo tais como alimentos, tecidos, cabedais, metais e madeira (Freitas, 2000).

Os fungo são capazes de sobreviver a situações extremas tais como temperaturas que variam entre os - 5 e os 60ºC, pH entre 1 e 9 e com baixas concentrações de oxigénio, embora cada espécie possua condições especificas ideais para o seu desenvolvimento (Chao et al., 2002). Para a maioria das espécies, a temperatura de desenvolvimento situa-se entre os 20 e 24ºC e não se multiplicam acima dos 29ºC (Çolakoglu, 2001). Quanto à humidade relativa, necessitam de pelo menos 50%, mas geralmente necessitam de mais de 65% (Gallo, 1985).

II.5.1.3. Enterobacteriaceae

As bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae habitam uma grande variedade de locais que incluem o aparelho gastrintestinal humano e de outros animais e vários locais do meio ambiente (árvores, plantas, culturas, solo, água e alimentos) (Goldman e Green, 2009). Alguns destes microrganismos são agentes de zoonose. Os membros desta família são bacilos gram-negativos, oxidase negativos, fermentam a glicose e a maior parte reduz os nitritos a nitratos, são ornitina descarboxilase positiva, utilizam o citrato, fermentam a L-arabinose, L-ramnose, rafinose e D-xilose (Janda e Abbott, 2005). Normalmente as espécies que colonizam o homem podem provocar infeções endógenas. As espécies Salmonella spp., Shigella spp., e Yersinia

enterocolitica são sempre agentes patogénicos do aparelho gastrintestinal. As espécies

de Enterobacteriaceae clinicamente relevantes podem ser divididas em 2 grupos, as bactérias patogénicas oportunistas que são as mais comuns (E. coli., Klebsiella spp.,

Proteus spp., Enterobacter spp., Serratia spp. e Citrobacter spp.) e as bactérias

patogénicas obrigatórias (Salmonella spp., Shigella spp. Yersinia pestis, Y.

enterocolitica e Y. pseudotuberculosis) (PNCI e ONSA, 2004).

II.5.1.4. Mesófilos totais

Os microrganismos mesófilos incluem-se num grupo capaz de se desenvolver e multiplicar a temperaturas entre os 20 e os 45ºC, sendo a temperatura ótima de multiplicação de 32ºC. Este é um grupo de microrganismos muito importante, uma vez

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que inclui a maioria dos microrganismos deteriorativos e patogénicos (Franco e Landgraf, 1996). A contagem destes microrganismos é considerada um bom indicador da qualidade microbiológica dos produtos, sendo utilizada para avaliar as condições de higiene durante o processamento dos mesmos. Contagens muito elevadas destes microrganismos, podem indicar que a matéria-prima se encontrava excessivamente contaminada, ou que esta permaneceu em temperaturas excessivas, não sendo refrigerada devidamente. Pode indicar também uma manipulação inadequada e inadequada limpeza e desinfeção dos equipamentos (Teixeira et al., 2000).

II.5.1.5. Pseudomonas spp.

São bacilos gram-negativos aeróbios estritos, catalase positivos, geralmente oxidase positivos, não esporulados e móveis através de flagelos polares. São bactérias comuns no solo e na água, com capacidade de contaminar e deteriorar alimentos ricos em proteínas. Algumas bactérias apresentam temperatura ótima de desenvolvimento entre os 20ºC e os 25ºC, sendo destruídas a 55ºC. A propriedade fisiológica mais notável destas bactérias prende-se com o facto de poderem utilizar uma ampla faixa de compostos orgânicos como fonte de carbono e energia. Pseudomonas são um género predominante em carnes de aves e após refrigeração 90 a 95% da microbiota é de

Pseudomonas (Valsechi, 2006).

II.5.2. Microbiota patogénica

II.5.2.1. Salmonella spp.

O género Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae. A maioria é móvel devido à presença de flagelos peritricos, sendo excepção S. pullorum e S.

gallinarum, que não apresentam mobilidade (Franco e Landgraf, 2003). As bactérias

pertencentes a este género caracterizam-se por serem bacilos de gram-negativo, anaeróbios facultativos, não formam esporos, produzem gás a partir da glicose (exceto

S. typhi), reduzindo o nitrato a nitrito e são capazes de utilizar o citrato como única

fonte de carbono (Hayes, 1993). Apresentam um pH ótimo de desenvolvimento de 6,5 a 7,5 (Valsechi, 2006). A temperatura de multiplicação de Salmonella situa-se entre 7ºC e 49,5ºC, sendo 37ºC a temperatura ótima de multiplicação, na qual um alimento

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contaminado, num período de 4 horas pode-se tornar num produto capaz de causar infeção alimentar (Germano e Germano, 2003). São destruídas a uma temperatura de 60ºC durante 5 minutos (Valsechi, 2006).

Este género compreende cerca de 2000 serotipos (Hayes, 1993). O género

Salmonella apresenta duas espécies, S. bongori e S.enterica incluindo esta seis

subespécies. Os serotipos mais comuns pertencem à subespécie S. enterica. O trato gastrintestinal é o habitat natural de Salmonella que contrariamente a Escherichia coli, pode sobreviver desde semanas a anos na água e no solo (LeMinor, 1981). Qualquer alimento contaminado por matéria fecal, incluindo frutas frescas, legumes e marisco, pode servir como uma fonte de infeção por Salmonella, no entanto a carne, o leite crú e os ovos são os mais frequentemente envolvidos (Janda e Abbott, 2005). Os seres humanos podem disseminar Salmonella para outros seres humanos. Portadores assintomáticos e pessoas doentes, excretam Salmonella pelas fezes podendo contaminar as mãos, as quais se estiverem envolvidas na preparação de alimentos funcionam como veículo de contaminação destes. Se o alimento for armazenado em local não refrigerado por algumas horas, pode ocorrer a multiplicação da bactéria, atingindo número suficiente para poder causar doença a potenciais consumidores (Pelczar et al., 1997). Apresenta um período de incubação de 6 a 48 horas tendo uma duração de 2 a 5 dias, com sintomas que vão desde febre, diarreia mucosa, ocasionalmente com sangue, a dores abdominais, náuseas e vómitos. A dose infecciosa e de 105 a 106 ufc/mg (Valsechi, 2006).

II.5.2.2. Escherichia coli

Trata-se de bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, não esporulados, capazes de fermentar a lactose com formação de gás a 35ºC. São geralmente móveis devido a flagelos perítricos. Apresentam uma temperatura ótima de multiplicação situada entre 35 e 37ºC e um pH ótimo entre 6,5 e 7,5, (Valsechi, 2006). A maioria das estirpes de Escherichia coli são comensais e encontram-se no trato intestinal dos mamíferos e de outros animais de sangue quente (Goldman e Green, 2009). Os principais grupos patogénicos incluem: E. coli Enteropatogénica (EPEC), E. coli Enterotoxigénica (ETEC), E. coli Enteroinvasiva (EIEC) e E. coli Enterohemorrágica (EHEC), onde se inclui a conhecida E. coli O157: H7. Os sintomas provocados por

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estas bactérias surgem ao fim de 1 a 3 ou 4 dias, tendo um período de incubação que vai de 6 a 36 horas. A diarreia intensa e aquosa, náuseas, vómitos, dores abdominais e fezes sanguinolentas são sintomas comuns da intoxicação por E. coli. Apresenta uma dose infecciosa de 106 a 108 ufc/mg (Valsechi, 2006).

Escherichia coli pode fazer o seu percurso na cadeia alimentar através da

contaminação fecal das carcaças dos animais durante o abate, devido a manipulação inadequada e posteriormente devido a armazenamento ou confeção inadequada do produto, bem como através da adubação fecal de culturas agrícolas (Venkateswaran et

al., 1996). Alguns dos alimentos mais associados a intoxicações por E. coli são:

hambúrguer, leite crú (Hoffmann, 2001).

As doenças causadas por bactérias coliformes são transmitidas quase exclusivamente pela contaminação fecal de água e alimentos. Este grupo de bactérias é utilizado como indicador de contaminação fecal. Escherichia coli é considerada como proveniente exclusivamente de origem fecal.

II.5.2.3. Staphylococcus coagulase positiva

Staphylococcus são cocos gram-positivos anaeróbios facultativos, catalase

positivos que tendem a formar aglomerados semelhantes a cachos de uvas. O género inclui várias espécies, algumas das quais frequentemente associadas a uma ampla variedade de infeções de caráter oportunista, tanto em seres humanos como em animais, destacando-se as espécies: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus haemoliticus. Apresentam-se divididos

em duas categorias os coagulase positiva e os coagulase negativa, sendo Staphylococcus

aureus (coagulase positiva) a espécie com maior probabilidade de envolvimento em

infeções humanas (Martins, 2000). São bactérias mesófilas que apresentam uma faixa de temperatura de multiplicação entre 7ºC e 47,8ºC, e as suas toxinas são produzidas entre 10ºC e 46ºC, com a temperatura ótima entre 40ºC e 45ºC (Franco e Landgraf, 2003). Staphylococcus aureus multiplica-se numa faixa de pH entre 4,0 e 9,8, sendo o pH ótimo entre 6,0 e 7,0. Relativamente à actividade de Água (aW), Staphylococcus, são os únicos que se multiplicam em valores inferiores aos normalmente considerados

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mínimos (0,86) para as bactérias não-halóficas. Em condições ideais esta bactéria pode-se depode-senvolver em valores de atividade de água de 0,83 (Franco e Landgraf, 2003).

Os alimentos podem ser contaminados com Staphylococcus aureus através de práticas de higiene inadequadas em qualquer etapa do processamento (ICMSF, 1978). O período médio de incubação desta doença é de 2 a 4 horas, o início dos sintomas é geralmente rápido e de natureza aguda, variando com o grau de suscetibilidade dos indivíduos, concentração de toxinas no alimento e quantidade de alimento consumida. Os principais sintomas são náuseas, vómitos, cólicas abdominais e diarreia, geralmente não há febre. Em casos mais graves pode ocorrer cefaleia e prostração. Na maior parte dos casos a recuperação ocorre em 24 a 48 horas (Germano e Germano, 2003). Os surtos de intoxicação alimentar são provocados por alimentos que permanecem neste intervalo (40 a 45ºC) de temperatura por tempo variável, e de acordo com o nível de inóculo. De um modo geral, quanto mais baixa for a temperatura, maior será o tempo necessário para a produção de enterotoxinas, em condições ótimas estas atingem concentrações capazes de provocar toxinfeção alimentar entre 4 e 6 horas (Franco e Landgraf, 2003).

Durante muito tempo Staphylococcus aureus foi considerada a única espécie do género Staphylococcus capaz de produzir enterotoxinas, bem como de produzir coagulase, até serem identificadas outras espécies produtoras de coagulase: S. hiycus e

S. intermedius. Alguns surtos de intoxicação foram atribuídos a estas duas espécies

(Silva e Gandra, 2004). Staphylococcus aureus causa intoxicação devido à ingestão do alimento contendo a toxina pré-formada, ou seja o agente que provoca doença não é a bactéria em si mas as várias toxinas por ela formadas conhecidas por enterotoxinas (Franco e Landgraf, 2003). Os principais alimentos envolvidos em intoxicações são o pescado, leite cru, produtos lacteos, principalmente queijos, produtos cárneos, massas, produtos de confeitaria, preparações à base de frango, ovos e outros, especialmente muito manipulados. São necessárias de 105 a 108 células por grama de alimento para produzir toxina que pode causar doença alimentar (Hoffmann, 2001).

II.5.2.4. Campylobacter enteropatogénico

Campylobacter jejuni é um bastonete gram-negativo, microaerófilo, termófilo

(Forsythe, 2002), apresentando uma faixa de temperatura de desenvolvimento situada entre os 30 e 47ºC e uma temperatura ótima de desenvolvimento entre os 42 e 45ºC. O

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pH ótimo para o seu desenvolvimento situa-se entre 6,5 e 7,5, não se desenvolvendo em valores de pH inferiores a 4,9 e superiores a 9,5, com uma aW superior a 0,97. A percentagem máxima de cloreto de sódio no meio para o seu desenvolvimento e de 2,0% (Hoffmann, 2001). É reconhecido como das principais causas de gastrenterite no mundo desenvolvido (Forsythe, 2002). Várias espécies de animais (animais de sangue quente) são portadoras assintomáticas de C. jejuni, entre as quais aves domésticas, suínos, ovinos, roedores e pássaros. As vias de infeção passam pela ingestão de água, leite cru, carne contaminada, ovos, moluscos crus, mexilhões e ostras. O frango constitui a maior fonte potencial de Campylobacter infecciosos (Forsythe, 2002; Hofmann, 2001). A campilobacteriose apresenta um período de incubação entre 48 a 120 horas, com uma dose infecciosa de 5×102 células por grama de alimento. Os sintomas de intoxicação por este microrganismo variam desde diarreia abundante (às vezes sanguinolenta), dores abdominais, enxaquecas, fraqueza e febre (Hoffmann, 2001).

II.5.2.5. Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes é uma bactéria gram-positiva, ubiquitária tendo sido

encontrada em vários ambientes como solo, vegetação, fezes de animais e humanos, água e esgotos. Trata-se de um bacilo microaerófilo, não esporolado, que apresenta mobilidade devido a flagelos perítricos. Apresente uma particular resistência a stresses ambientais, podendo sobreviver a muitos métodos de preservação dos alimentos (Forsythe, 2002). Pode multiplicar-se a temperaturas baixas (3ºC), o que permite a multiplicação em ambientes refrigerados, apresentando no entanto uma temperatura ótima de multiplicação situada entre os 25 e 30ºC. Listeria monocytogenes multiplica-se numa faixa de pH entre os 4,3 e 9,6 situando-se o pH ótimo entre 7,0 e 7,5 e a aW mínima para desenvolvimento é de 0,83 (Hoffmann, 2001). Já se encontrou Listeria

monocytogenes numa variedade de alimentos, quer sejam crus ou processados (leite cru

e produtos derivados, como o queijo mole, gelado, carne, incluindo aves e produtos derivados, vegetais e pescado) (Forsythe, 2002).

Apresenta um período de incubação que vai desde os 8 dias até 3 meses, provocando desde sintomas similares à gripe até meningite, podendo provocar aborto em mulheres grávidas. Apresentando uma taxa de mortalidade de 30% nos infetados (Hoffmann, 2001).

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III. Objetivos

Este trabalho teve como objetivo geral a avaliação das características microbiológicas de carcaças de codornizes obtidas em vários estabelecimentos de venda direta ao consumidor.

Constituem ainda objetivos deste estudo:

- Avaliar a contaminação microbiológica das carcaças de codornizes, comparando com valores de referência estabelecidos;

- Detetar a presença de microrganismos patogénicos;

- Verificar a existência de associações entre as variáveis em estudo (Matadouro, tipo de estabelecimento e número de dias pós-abate) e os níveis de contagens para os diferentes microrganismos.

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IV. Trabalho Experimental

IV.1. Material e Métodos

IV.1.1. Amostragem

No sentido de avaliarmos as características microbiológicas de codornizes, estas foram obtidas em 4 superfícies comerciais de venda direta ao público, na cidade de Vila Real. As superfícies comerciais foram selecionadas tendo em conta a sua dimensão, sendo consideradas 2 grandes superfícies e outras 2 pequenas superfícies. Foram ainda recolhidas informações relativas ao matadouro e número de dias após abate.

Foram analisadas codornizes refrigeradas, num total de 80 amostras sendo provenientes 20 de cada ponto de recolha. As colheitas efetuaram-se durante o período de Dezembro de 2012 e Março de 2013. As amostras foram transportadas desde o local de aquisição até ao laboratório em refrigeração, a uma temperatura de ± 4ºC. O intervalo de tempo entre a recolha e o processamento das amostras nunca excedeu as duas horas.

IV.1.2. Determinações microbiológicas

IV.1.2.1. Microrganismos deteriorativos

IV.1.2.1.1. Preparação da amostra

Efetuou-se a colheita e pesagem asséticas de 10 g de amostra, a qual foi diluída em 90 ml de solução de triptona sal (triptona a 0,3% e NaCl a 0,85% esterilizada a 121ºC durante 15 minutos), e homogeneizada num aparelho de “Stomacher” durante 90 segundos. Efetuaram-se diluições decimais sucessivas em 9 ml da mesma solução. As

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diluições efetuadas foram utilizadas na contagem de BAL (Bactérias do Ácido Lático); fungos (bolores e leveduras); Enterobacteriaceae; de microrganismos mesófilos totais;

Pseudomonas spp. e Staphylococcus coagulase positiva.

IV.1.2.1.2. Contagem de bactérias do ácido láctico (BAL)

A contagem de BAL foi efetuada em MRS (Man Rogosa Sharpe) Agar (Biokar BK089HA) por incorporação em dupla camada, de 1 ml de cada diluição decimal. As placas foram incubadas a 30ºC durante 72 horas, após o que se procedeu à contagem de colónias. Os resultados foram expressos em log do número de unidades formadoras de colónia por grama (log ufc/g). Esta determinação foi efetuada de acordo com a Norma Francesa V 04-503 de 1988.

IV.1.2.1.3. Contagem de fungos (bolores e leveduras)

A contagem de fungos foi efetuada em meio de CGA (Chloramphenicol Glucose Agar) (Liofilchem 610070), por sementeira à superfície de 0,1 ml da suspensão-mãe e das respetivas diluições decimais. Após incubação a 25ºC, 72 a 120 horas, foram contadas as colónias, os resultados foram expressos em log ufc/g. Esta determinação foi efectuada com base na Norma ISO 13681 de 1995.

IV.1.2.1.4.Contagem de Enterobacteriaceae

A sementeira foi feita por incorporação de 1 ml da suspensão-mãe e das respetivas diluições decimais em meio de cultura seletivo VRBG (Violet Red Bile Glucose) Agar (Biokar BK011HA), com dupla camada. As placas foram incubadas a 37ºC durante 24 horas. Efetuou-se a contagem das colónias típicas de coloração púrpura (cor rosa a vermelho, com ou sem halos de precipitação, ou colónias mucóides sem cor definida), retirando-se 5 para agar nutritivo, incubadas a 30ºC durante 24 horas, e

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posteriormente sujeitas a confirmação bioquímica pela prova da oxidase (negativa) e capacidade de fermentação da glucose em meio Glucose Agar (Harrigan e McCence, 1979). Após a contagem de colónias, e em função dos resultados dos testes bioquímicos de confirmação, os resultados foram expressos em log ufc/g. Esta determinação foi efetuada de acordo com a Norma ISO 5552 de 1997.

IV.1.2.1.5. Contagem de microrganismos mesófilos totais (aeróbios totais a 30º C)

A contagem de microrganismos mesófilos totais foi efetuada em meio de PCA (Plate Count Agar) (Liofilchem 610040), após sementeira por incorporação de 1 ml da suspensão-mãe e das respetivas diluições decimais. Após a sementeira as placas foram incubadas a 30ºC, durante 72 horas, foram contadas as colónias e os resultados foram expressos em log ufc/g. Esta determinação foi efetuada de acordo com a Norma ISO 4833 de 1991.

IV.1.2.1.6. Contagem de Pseudomonas spp.

A sementeira foi feita por incorporação de 1 ml da suspensão-mãe e das respetivas diluições decimais, em meio de cultura selectivo CFC (Cetrimide, Fucidin, Cephaloridine) Agar (Liofilchem 610071) e suplemento seletivo CFC (BIOKAR BS02200). Após incubação das placas a 30ºC durante 48 horas, procedeu-se à contagem das colónias, das quais 5 foram repicadas para agar nutritivo e incubadas a 30ºC durante 24 horas, tendo sido posteriormente sujeitas a confirmação bioquímica pela prova da oxidade (positiva) e pelo crescimento em aerobiose em meio de Kligler (Kligler Iron Agar) (Liofilchem 610023). Os resultados foram expressos em log ufc/g. Esta determinação foi efetuada de acordo com a Norma Francesa V 04-504 de 1998.

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IV.1.2.2.Microrganismos patogénicos

IV.1.2.2.1. Preparação da amostra

Para a pesquisa de Salmonella spp. e Listeria spp. procedeu-se à colheita de 2 aliquotas de 25 g de amostra, que foram colocada num pré- enriquecimento de APT (Água Peptonada Tamponada) (OXOID CM0509) e UVM I (Listeria Enrichment Broth) (Biokar 113HA) respetivamente e homogeneizadas.

Para a pesquisa de Campylobacter enteropatogénico procedeu-se à colheita de 10 g de amostra, homogeneizando num caldo de Preston (Nutrient broth, Liofilchem 610037) com suplemento (Campylobacter growth supplement, Liofilchem 81050 e

Campylobacter preston supplement, Liofilchem 81004) e sangue de ovino 5%.

Efetuou-se a colheita de 25 g de amostra homogeneizadas em 225 ml de solução de triptona sal (triptona a 0,3% e NaCl a 0,85% esterilizada a 121ºC durante 15 minutos), para a posterior contagem de Listeria spp. e E. coli.

Para pesquisa de Staphylococcus coagulase positiva procedeu-se como referido para os microrganismos deteriorativos.

IV.1.2.2.2. Pesquisa de Salmonella spp.

Para a pesquisa de Salmonella spp. efetuou-se o pré-enriquecimento em APT (água peptonada tamponada) (OXOID CM0509) e incubação durante 22±2h a 37±1ºC. Após incubação, transferiu-se 0,1 ml e 1 ml para os meios RVS broth (Rappaport- vassilidis (RV) Enrichement Broth) (OXOID CM669) e MKTT broth (Muller- Kauffman tetrathionate Novobiocin broth) (Liofilchem 610045) respetivamente, sendo as amostras incubadas a 41,5±1ºC e 37±1ºC (respetivamente), durante um período de 22±2h. Procedeu-se ao isolamento através de sementeira por esgotamento, em placas de XLD (Xylose Lysine Deoxycholate agar) (Liofilchem 610060) e Hecktoen (Heckten Enteric agar) (Liofilchem 610021), com suplemento de novobiocina (1,25 e 1,87 ml/L

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respectivamente), que foram a incubar a 37±1ºC durante 22±2h. Repicaram-se cinco colónias características (vermelhas com centro negras) para Agar Nutritivo, sendo as placas incubadas a 37ºC durante 24 horas. Posteriormente procedeu-se à confirmação através de testes bioquímicos TSI (Triple Sugar Iron) (DIFCO 0265-01) e Ureia (Anexos- Quadro 2). Esta determinação foi efetuada de acordo com a ISO 6579: 2002.

IV.1.2.2.3. Pesquisa e contagem de E. coli

A sementeira foi feita por incorporação, de 1ml da suspensão-mãe e das respetivas diluições decimais em meio de cultura seletivo TBX (Tryptone-bile-gulucuronic médium) (Biokar BK146HA), tendo sido incubadas a 44ºC durante 24 horas. Contaram-se as colónias características (azuis ou azuis- esverdeadas). Esta determinação foi efetuada de acordo com a ISO 16649-2 de 1997.

IV.1.2.2.4. Pesquisa e contagem de Staphylococcus coagulase positiva

A contagem de Staphylococcus foi efetuada em meio de BPA (Baird-Parker Agar) (Liofilchem 610004) enriquecido com solução de gema de ovo com telurito (Biokar BS060), por sementeira em superfície de 0,1 ml de cada diluição decimal. As placas após sementeira foram incubadas a 37ºC durante 24-48 horas.

As colónias que apresentavam um fenótipo característico (negras, convexas, brilhantes de diâmetro compreendido entre 5 e 2 mm, rodeadas de um precipitado branco e de um halo transparente) e não característico (semelhantes às colónias características, mas sem halo transparente) foram enumeradas posteriormente. De cada placa foram selecionadas cinco colónias características e cinco não características e repicadas para BHI (Brain-Heart Infusion) (Liofilchem 610008), sendo posteriormente incubadas a 37ºC durante 24 horas, tendo sido confirmadas quanto à produção de coagulase utilizando plasma de coelho (Biokar BR0208).

Devido à possibilidade da existência de amostras nas quais não fosse possível fazer a contagem de colónias após diluição, efetuou-se a pesquisa de Staphylococcus em