Avaliação morfológica em podócitos de pacientes com podocitopatias

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde

Crislaine Aparecida da Silva

Avaliação morfológica em podócitos de pacientes com

Podocitopatias

Uberaba

2019

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Crislaine Aparecida da Silva

Avaliação morfológica em podócitos de pacientes com Podocitopatias

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, área de concentração Patologia Investigativa, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor.

Orientadora: Prof. Dra. Juliana Reis Machado e Silva

Co-orientadora: Profa. Dra. Marlene Antônia dos Reis

Uberaba 2019

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Crislaine Aparecida da Silva

Avaliação morfológica em podócitos de pacientes com Podocitopatias

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, área de concentração Patologia Investigativa, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor.

Orientadora: Prof. Dra. Juliana Reis Machado e Silva

Co-orientadora: Profa. Dra. Marlene Antônia dos Reis

Banca examinadora:

________________________________________________

Profa. Dra. Juliana Reis Machado e Silva - Orientadora _________________________________________________

Prof. Dr. Vicente de Paula Antunes Teixeira

__________________________________________________ Profa. Dra. Helenice Gobbi

__________________________________________________ Profa. Dra. Flávia Aparecida Oliveira

__________________________________________________ Prof. Dr. Lúcio Roberto Cançado Castellano

Uberaba 2019

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Wilson Aparecido da Silva e

Adriana Andrelina de Souza Silva que

sempre estiveram ao meu lado apoiando

todas as minhas decisões, incentivando e

provendo toda a ajuda necessária para que

eu concluísse mais essa etapa. Minha eterna

gratidão e amor por vocês!

(6)

AGRADECIMENTOS

Agradeço imensamente minha orientadora Prof

a

_{. Dr}

a

_{. Juliana Reis Machado e}

Silva por toda a formação que tive. Agradeço por todas as oportunidades que

recebi, pelo exemplo de pesquisadora e por todo o incentivo que precisei para

ver além do que meus olhos poderiam enxergar. Serei eternamente grata, pois

sem seus ensinamentos eu jamais teria chegado até aqui!

Agradeço também a Prof

a

_{. Dr}

a

_{. Marlene Antônia dos Reis pela Co-orientação}

desse trabalho, pela confiança em mim ao trabalhar com o material de biópsia

renal e por todo o treinamento didático que recebi. Obrigada pelas

oportunidades, apoio e incentivo constantes

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AGRADECIMENTOS

À toda forma de energia positiva que me guia nessa jornada terrena.

À minha família e aos amigos de longa data pelo constante apoio e compreensão pelas eventuais ausências.

À Liliane Silvano Araújo pelo companheirismo em mais essa etapa. Obrigada pela paciência, pela ajuda constante, pela amizade fortalecida, pelos momentos de alegrias, além da colaboração na realização deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Marcos Vinícius da Silva pelos ensinamentos, ajuda e amizade.

Aos professores e amigos da disciplina de Patologia Geral: Alberto, Aline, Aloísio, Edson, Laura, Lenaldo, Lourimar, Mara, Maria Helena, Rosana, Vandair e Vicente pelo convívio e troca de experiência.

Aos técnicos Alberto e Lívia pela contribuição na microscopia eletrônica.

Aos amigos da pós graduação: Ana Luísa, Bianca, Carlos, Laura Aguiar, Maria Luíza e Mariana Oliveira pela amizade e apoio diário.

As alunas de Iniciação científica e TCC pelo aprendizado e oportunidade de orientação.

Aos colaboradores deste trabalho.

Ao professor Fernando Silva Ramalho do departamento de Patologia e Medicina Legal da USP de Ribeirão Preto por ter fornecido amostras de casos para o grupo controle.

Aos funcionários da pós-graduação, André e Tuânia, pela prontidão sempre.

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A Universidade Federal do Triângulo Mineiro por toda minha formação desde a graduação, por me permitir usufruir sua estrutura física e humana e por hoje me acolher como profissional.

A disciplina de Patologia Geral por prover o local e estrutura para a realização deste trabalho.

Aos órgãos de fomento, CAPES, FUNEPU, EBSERH-HC e principalmente ao Serviço de Nefropatologia pelo auxílio financeiro para realização desse trabalho.

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“Ela é sozinha, porém, mais importante que todas

vós, pois foi ela que eu reguei. Foi ela que pus sob a

redoma. Foi ela que abriguei com o para-vento. Foi

por ela que matei as larvas (exceto duas ou três, por

causa das borboletas). Foi ela que eu escutei se

queixar ou se gabar, ou mesmo calar-se algumas

vezes, já que ela é a minha rosa...”

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Tese de Doutorado Crislaine Aparecida da Silva

RESUMO

Introdução: Glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF) e doença de lesões mínimas (DLM) estão entre as principais causas de síndrome nefrótica idiopática. A lesão podocitária é resultado do desequilíbrio entre respostas adaptativas que mantêm a homeostase, autofagia, e disfunção celular que pode culminar em morte celular, por necrose ou apoptose. Diante disso, foi realizada uma análise in situ das alterações morfológicas relacionadas à morte celular e a autofagia em casos de biópsias renais de pacientes adultos com diagnóstico de GESF e DLM. Métodos: Foram selecionadas 49 biópsias renais, 22 casos de GESF e 27 casos DLM. A expressão in situ da proteína do gene supressor do tumor de Wilms 1 (WT1), da proteína associada ao microtúbulo 1 de cadeia leve (LC3) e da proteína caspase-3 foram quantificadas por imuno-histoquímica. O apagamento dos pedicelos e as alterações morfológicas relacionadas às evidências de morte podocitária e autofagia foram analisados no microscópio eletrônico de transmissão. Resultados: houve redução da densidade de podócitos imunomarcados por WT1 nos casos com GESF e DLM em relação aos casos controle. A largura do pedicelo em GESF foi significante maior quando comparada com DLM e se correlacionou com a proteinúria. A densidade de podócitos imunomarcados por LC3 e o número de autofagossomos em podócitos/ pedicelos foi maior no grupo DLM em relação ao grupo GESF. Além disso, o número de autofagossomos se correlacionou positivamente com a taxa de filtração glomerular estimada nos casos de DLM. Houve maior densidade de podócitos imunomarcados por caspase 3 nos casos de GESF e DLM em relação ao grupo controle e foi encontrado maior número de podócitos com evidências de necrose em casos de GESF quando comparados aos de DLM. Conclusão: podócitos de pacientes com diagnóstico de GESF apresentam mais alterações morfológicas e funcionais resultantes de maior número de lesões e menos adaptações celulares.

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ABSTRACT

Introduction: Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) and minimal change disease (MCD) are among the main causes of idiopathic nephrotic syndrome. Podocyte injury results from the imbalance between adaptive responses that maintain homeostasis and cellular dysfunction that can culminate in cell death. Therefore, an in situ analysis was performed to detect morphological changes related to cell death and autophagy in renal biopsies from adult patients with podocytopathies. Methods: A total of 49 renal biopsies from patients diagnosed with FSGS (n = 22) and MCD (n = 27) were selected. In situ expression of Wilms Tumor 1 protein (WT1), light chain microtubule 1-associated protein (LC3) and caspase-3 protein were evaluated by immunohistochemistry. The foot process effacement and morphological alterations related to podocyte cell death and autophagy were analyzed with transmission electron microscopy. Results: A reduction in the density of WT1-labeled podocytes was observed for FSGS and MCD cases as compared to controls. Foot process width in FSGS was significantly larger compared to MCD and correlated with proteinuria. A density of LC3-labeled podocytes and the number of autophagosomes in podocytes/ pedicels were higher in the DLM group than in the GESF group. In addition, the number of autophagosomes correlated positively with the estimated glomerular filtration rate in cases of DLM. The density of caspase-3-labeled podocytes in FSGS and MCD was higher than control group, and a higher number of podocytes with an evidence of necrosis was detected in FSGS cases than in MCD cases. Conclusion: Podocytes from patients diagnosed with FSGS showed more morphological and functional alterations resulting from a larger number of lesions and reduced cell adaptation.

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LISTA DE ABREVIATURAS

Atg: proteínas relacionadas a autofagia BFG: barreira de filtração glomerular DLM: doença de lesões mínimas

GESF: glomeruloesclerose segmentar e focal IF: Imunofluorescência

IL-13: Interleucina 13

LC3: proteínas da cadeia leve 3 associadas a microtúbulos MBG: membrana basal glomerular

MET: microscopia eletrônica de transmissão ML: microscopia de luz

uPAR: receptor do ativador do plasminogênio do tipo uroquinase WT1: gene supressor do Tumor de Wilms

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Tese de Doutorado Crislaine Aparecida da Silva SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 13 1.1 RIM ... 13 1.1.1 Glomérulo ... 13 1.1.1.1 Doenças glomerulares ... 14 1.2 PODÓCITOS ... 15 1.3 PODOCITOPATIAS ... 17

1.4 ALTERAÇÕES CELULARES RELACIONADAS AOS PODÓCITOS ... 19

1.4.1 Autofagia ... 19 1.4.2 Morte celular ... 20 1.4.2.1 Apoptose ... 22 1.4.2.2 Necrose ... 23 2 HIPÓTESE ... 26 3 JUSTIFICATIVA ... 26 4 OBJETIVO GERAL ... 28 5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 28 6 RESULTADOS ... 30 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 65 8 CONCLUSÃO ... 66 REFERÊNCIAS ... 67

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1 INTRODUÇÃO

1.1 RIM

Os rins são órgãos fundamentais na manutenção da homeostase corporal e têm como funções o balanço entre o transporte de água e solutos, excreção de resíduos metabólicos, conservação de nutrientes e regulação do equilíbrio ácido-base. Funcionalmente, o rim é dividido em córtex externo e uma medula renal interna, sendo essa última dividida em uma série de cones, chamados pirâmides renais, que se abrem para os cálices renais. Os cálices principais juntam-se para formar a pelve renal que é uma extensão da extremidade superior do ureter. As colunas renais se estendem do córtex para a medula entre as pirâmides renais.

No córtex encontram-se os néfrons que são unidades funcionais básicas do rim, responsáveis pela formação da urina, sendo que cada rim contém aproximadamente 1,2 milhão de néfrons. Cada néfron é subdividido em uma unidade de filtração chamada corpúsculo renal ou glomérulo e um compartimento segmentado de reabsorção tubular dividido em túbulo contorcido proximal que recebe o filtrado glomerular e é responsável pela absorção e excreção das substâncias, alça de Henle onde há a retenção de água e túbulo contorcido distal onde são feitas as trocas iônicas, ou seja, absorção de sódio e secreção de potássio. Os túbulos contorcidos distais se abrem no ducto coletor, que é responsável por receber o material produzido nos néfrons (urina) e transportá-lo para a pelve renal (KAYE; GOLDBERG, 1982). Os rins podem sofrer diferentes tipos de lesões em diferentes compartimentos, tais como glomerulopatias, lesões túbulo-intersticial ou vasculites (TRYGGVASON; PATRAKKA; WARTIOVAARA, 2006).

1.1.1 Glomérulo

O glomérulo, a unidade filtrante do rim, é um feixe especializado de capilares composto por um conjunto de quatro células diferentes: células endoteliais glomerulares, células epiteliais viscerais denominadas podócitos, células mesangiais e células epiteliais parietais que compõem a cápsula de Bowman (POLLAK; QUAGGIN; HOENIG; DWORKIN, 2014).

O glomérulo é formado a partir da artéria renal que é ramo da artéria aorta abdominal. A artéria renal entra no rim no hilo renal e se subdivide ao nível dos cálices menores em artérias interlobares, que cursam ao redor das bordas das pirâmides medulares. As artérias interlobares se ramificam nas artérias arqueadas que correm de maneira

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arqueada ao longo da fronteira entre o córtex e a medula externa. Os vasos arqueados dão origem, tipicamente em ângulos retos, às artérias interlobulares que correm para a superfície do rim. Por fim às artérias interlobulares, dão origem a arteríola aferente que imediatamente se ramifica no elaborado tufo capilar glomerular que termina na arteríola eferente. Dessa forma, o sangue entra e sai do glomérulo pelas arteríolas aferentes e eferentes, respectivamente (CHADE, 2013).

Esses capilares são envoltos pela cápsula de Bowman e são os únicos leitos capilares no corpo que não são cercados por tecido intersticial. A rede de capilares é sustentada pela matriz mesangial, produzida pelas células mesangiais, composta por um grupo diverso de proteínas, incluindo colágenos do tipo VI e V, proteoglicanos de sulfato de heparano e fibras elásticas, incluindo fibronectina, laminina, entactina e fibrilina-1 (POLLAK; QUAGGIN; HOENIG; DWORKIN, 2014).

Forçado pela pressão intracapilar, o plasma é filtrado por meio da barreira de filtração glomerular (BFG) que é um filtro físico e eletrostático, pois é altamente seletivo ao tamanho molecular e a carga elétrica. A BFG é composta pelo endotélio capilar fenestrado, pela membrana basal glomerular (MBG) e pelos podócitos (SCOTT; QUAGGIN, 2015).

1.1.1.1 Doenças glomerulares

As doenças glomerulares, denominadas glomerulopatias, são doenças que se iniciam nos glomérulos e estão entre as principais causas de doença renal crônica terminal dialítica no mundo (WEENING; RONCO; REMUZZI, 2013). Elas podem ser divididas em doenças glomerulares primárias e doenças glomerulares secundárias. As doenças glomerulares primárias são doenças cuja a causa se restringe ao rim, não havendo lesão em mais nenhuma outra parte do organismo e são diagnosticadas na biópsia renal. Já as doenças glomerulares secundárias se desenvolvem quando há uma doença de base que acomete várias partes do corpo, incluindo, entre elas, os glomérulos e é diagnosticada clinicamente na presença de doença sistêmica e comprometimento renal associado (MAHMUD; KUMAR; IRUM; FARMAN ALI, 2015).

O desenvolvimento da doença glomerular envolve uma interação complexa de fatores genéticos, epigenéticos e ambientais e a lesão glomerular pode ser causada por vários tipos de injúria nos componentes do glomérulo. As doenças glomerulares são divididas em padrões histológicos diferentes de acordo com o compartimento glomerular acometido, podendo ser: lesão epitelial que é lesão nos podócitos, lesão endotelial que é

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lesão na célula do capilar glomerular, lesão mesangial que é lesão nas células que produzem a matriz mesangial, alterações da MBG, alterações da matriz mesangial e glomeruloesclerose crônica que é o aumento de matriz mesangial, ou seja esclerose, em mais de 50% dos glomérulos da amostra. Além disso, as glomerulopatias cursam com síndromes clínicas distintas como síndrome nefrótica, síndrome nefrítica, hematúria e proteinúria assintomáticas e insuficiência renal crônica. A síndrome nefrótica é definada nos adultos por proteinúria alta (≥3 a 3,5g/24h), hipoalbuminemia (albumina sérica <2,5 mg/dl) e edema, complicando com hiperlipidemia (colesterol total > 350 mg/dl) (KODNER, 2016). Já a síndrome nefrítica é caracterizada por início súbito de hematúria, proteinúria, oligúria, hipertensão arterial sistêmica e diminuição da função renal. Casos de hematúria e proteinúria assintomáticas correspondem a presença de hemácias ou de proteína na urina, respectivamente, sem outras alterações urinárias. Por fim, a insuficiência renal crônica reflete ritmo de filtraçao glomerular menor que 60 ml/min/1,73m2 (WEENING; RONCO; REMUZZI, 2013).

1.2 PODÓCITOS

Os podócitos (ou células epiteliais viscerais) são células que revestem a superfície externa dos capilares glomerulares e sua diferenciação coincide com a expressão progressiva de marcadores de maturidade, incluindo o gene supressor do tumor de Wilms 1 (WT1), que embora inicialmente descoberto como um gene supressor de tumores, é essencial para a nefrogênese normal pois há uma alta expressão desse gene no rim em desenvolvimento (PRITCHARD-JONES; FLEMING; DAVIDSON; BICKMORE et al., 1990) e embriões de camundongos deficientes em WT1 sofrem agenesia renal completa (KREIDBERG; SARIOLA; LORING; MAEDA et al., 1993). Em animais adultos normais, WT1 é restritamente expresso em podócitos, sugerindo papel para este gene na manutenção da diferenciação dos podócitos (PELLETIER; SCHALLING; BUCKLER; ROGERS et al., 1991) e na sua homeostase uma vez que mutações ou deleções desse gene em podócitos levam a cicatrizes glomerulares em seres humanos e camundongos (CHAU; BROWNSTEIN; MJOSENG; LEE et al., 2011). Com isso, essa proteína pode ser utilizada como marcador de podócitos diferenciados tanto em estudos em cultura celular como in situ (KIM; GOYAL; KURNIT; WHARRAM et al., 2001).

A arquitetura celular dos podócitos consiste em um corpo celular que emite longos processos primários que se interdigitam entre si, formando os chamados pedicelos que envolvem os capilares glomerulares e contêm um citoesqueleto à base de actina

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(PAVENSTÄDT; KRIZ; KRETZLER, 2003). Cada pedicelo forma uma junção célula-célula com seu pedicelo vizinho, chamada diafragma slit que é uma rede de proteínas que forma uma estrutura importante para conectar os pedicelos adjacentes e formar uma barreira de filtração envolvida na manutenção da função renal normal (HUBER; BENZING, 2005). Os pedicelos também formam uma barreira com carga negativa voltada para o espaço urinário que gera um repelente eletrostático e ajuda a manter a seletividade da BFGM, (KERJASCHKI; SHARKEY; FARQUHAR, 1984).

Para manter a integridade da BFG, os podócitos desempenham funções importantes como regulação da permeabilidade seletiva (TRYGGVASON; WARTIOVAARA, 2001), manutenção da integridade estrutural do glomérulo (KRIZ; HACKENTHAL; NOBILING; SAKAI et al., 1994), remodelação da MBG (ST JOHN; ABRAHAMSON, 2001), endocitose de proteínas filtradas (INA; KITAMURA; TATSUKAWA; TAKAYAMA et al., 2002), secreção do fator de crescimento endotelial vascular necessário para o funcionamento adequado da célula endotelial (SHANKLAND, 2006) e produção de fator de crescimento derivado de plaquetas, que possui propriedades tróficas para células mesangiais vizinhas (VAN ROEYEN; EITNER; BOOR; MOELLER

et al., 2011).

Os podócitos ancoram-se à MBG por meio de uma série de complexos de adesão focal e receptores da superfície celular. A MBG é uma matriz densa de vários componentes extracelulares, incluindo colágeno IV e laminina. Ela fornece uma base para interconectar as células endoteliais e os podócitos para formar a BFG eficaz cuja integridade e função dependem da adesão célula a célula e de célula a matriz (MENON; CHUANG; HE, 2012). A adesão dos podócitos à MBG ocorre por meio de vários receptores, incluindo integrinas, sindecanos e distroglicanos, todos os quais interagem com a actina para garantir estrutura da BFG. O complexo de adesão mais importante é o heterodímero α3β1 integrina (LENNON; RANDLES; HUMPHRIES, 2014).

Como os podócitos são células complexas e pós mitótica, ou seja terminalmente diferençadas, diante de qualquer agressão podocitária a única maneira de responder ao estresse é promover grandes mudanças na sua forma que levam perda da interdigitação dos pedicelos chamada de apagamento dos pedicelos (KRIZ; SHIRATO; NAGATA; LEHIR et al., 2013). O apagamento dos pedicelos é resultado de disfunção no complexo de ligação entre a MBG e o pedicelo, o que leva a um rearranjo no seu citoesqueleto de actina (LENNON; RANDLES; HUMPHRIES, 2014). O apagamento ocorre em duas fases: primeiro, há a perda do seu padrão interdigitante, com retração das projeções e

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substituição do diafragma slit por junções do tipo ocludentes entre os pedicelos alargados. Na segunda fase, há o completo apagamento com maior retração dos pedicelos formando amplas projeções achatadas em forma de disco que cobrem a MBG. Nesse estágio, um rearranjo proeminente do citoesqueleto é encontrado, o que leva à formação de um "tapete" de conteúdo do citoesqueleto celular próximo a MBG (SHANKLAND, 2006).

Lesões nos podócitos levam ao desenvolvimento das doenças denominadas podocitopatias. Dentre as glomerulopatias primárias estão a glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF) e a doença de lesões mínimas (DLM) (BÜSCHER; WEBER, 2012), que clinicamente se manifestam como síndrome nefrótica (KODNER, 2016).

1.3 PODOCITOPATIAS

A GESF e a DLM estão entre as principais causas de síndrome nefrótica idiopática e morfologicamente apresentam em comum, o apagamento dos pedicelos (FOGO; LUSCO; NAJAFIAN; ALPERS, 2015a; b).

A GESF pode acometer tanto crianças quanto adultos, porém se tornou uma das causas mais comuns de doença glomerular idiopática em adultos em vários países, inclusive no Brasil (BAHIENSE-OLIVEIRA; SALDANHA; MOTA; PENNA et al., 2004; BRADEN; MULHERN; O'SHEA; NASH et al., 2000; MALAFRONTE; MASTROIANNI-KIRSZTAJN; BETÔNICO; ROMÃO et al., 2006; POLITO; DE MOURA; KIRSZTAJN, 2010; SIMON; RAMEE; BOULAHROUZ; STANESCU et al., 2004), sendo que as taxas de incidência anuais mundial variam de 0,2 a 1,1/100.000 habitantes por ano (MCGROGAN; FRANSSEN; DE VRIES, 2011). Essa entidade também pode progredir para doença renal crônica e está entre as causas mais comuns de doença renal terminal (HAAS; SPARGO; COVENTRY, 1995; KITIYAKARA; EGGERS; KOPP, 2004).

Clinicamente apresenta evolução desfavorável, pois habitualmente não responde a corticoterapia e progride para insuficiência renal em intervalo de tempo variável (CRAVEDI; KOPP; REMUZZI, 2013). Em adultos, cursa com proteinúria na faixa nefrótica (3,5g/24h) em mais de 70% dos casos e de 50 a 60% dos casos podem cursar com hematúria e com hipertensão arterial sistêmica (JEFFERSON; NELSON; NAJAFIAN; SHANKLAND, 2011). Morfologicamente na microscopia de luz (ML) é possível observar aumento de matriz mesangial de forma segmentar, ou seja esclerose glomerular segmentar em parte do glomérulo de caráter focal, acometendo menos de 50% dos glomérulos da amostra. Na microscopia de imunofluorescência (IF) geralmente não

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há depósito de imunocomplexos, no entanto pode haver depósitos em áreas de esclerose de IgM e C3. Já na microscopia eletrônica de transmissão (MET) é observado extenso apagamento dos pedicelos (FOGO; LUSCO; NAJAFIAN; ALPERS, 2015a).

Sua fisiopatologia vem sendo amplamente estudada nos últimos anos e já tem sido correlacionada a diversos distúrbios renais hemodinâmicos, genéticos (hereditários ou não) e fatores circulantes (forma idiopática) porém o efeito sobre os podócitos é semelhante em todas as formas (ROSENBERG; KOPP, 2017). Como os podócitos são células altamente diferenciadas ou terminais, eles são incapazes de sofrer reparo por divisão celular. Sendo assim são incapazes de se recuperarem a partir de uma lesão inicialmente grave. A morte celular resultante e/ou o destacamento dos podócitos da MBG leva a uma podocitopenia, ou seja, redução do número dessas células (CHENG; HARRIS, 2010). Os podócitos remanescentes não são suficientes para evitar o desnudamento da MBG e essa área desnuda tem a capacidade de se aderir ao epitélio parietal formando sinéquias, obliteração dos capilares e posteriormente esclerose (JEFFERSON; SHANKLAND, 2014). Algumas proteínas foram associadas a danos renais e proteinúria e dentre elas o receptor do ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (uPAR) foi proposto como participante na patogênese da GESF (CARA-FUENTES; WEI; SEGARRA; ISHIMOTO et al., 2014; WEI; EL HINDI; LI; FORNONI

et al., 2011; WEI; TRACHTMAN; LI; DONG et al., 2012). Foi observado em modelos

animais de proteinúria, maior expressão glomerular de upar (WEI; MÖLLER; ALTINTAS; LI et al., 2008) e em biópsias renais de pacientes com GESF adultos (DA SILVA; ARAÚJO; DOS REIS MONTEIRO; DE MORAIS PEREIRA et al., 2019; PEREIRA; DA SILVA; MONTEIRO; ARAÚJO et al., 2019) e pediátricos, maior expressão in situ de upar em podócitos em relação a biópsias de casos controle.

A DLM é a principal causa de síndrome nefrótica em crianças. Na faixa etária adulta pode acometer aproximadamente 11-16% dos cados de síndrome nefrótica, sendo a terceira causa mais comum, após nefropatia membranosa e GESF (BRADEN; MULHERN; O'SHEA; NASH et al., 2000; HAAS; MEEHAN; KARRISON; SPARGO, 1997; RIVERA; LÓPEZ-GÓMEZ; PÉREZ-GARCÍA; GLOMERULONEPHRITIS, 2004). A maioria dos pacientes responde com remissão completa à terapia com glicocorticoides. No entanto recaídas são bastante frequentes, em torno de 10 a 25% dos casos, e dependência a terapia pode ser observada em 25 a 30%. Enquanto hematúria, hipertensão e insuficiência renal são pouco frequentes em crianças, essas características podem ser observadas na DLM em adultos. Hipertensão apresenta-se em 42,9% e a

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hematúria em 28,9% dos casos de DLM em adultos, além de proteinúria nefrótica (WALDMAN; CREW; VALERI; BUSCH et al., 2007).

Na biópsia renal não há alterações na ML e não cursa com depósitos de imunocomplexos na IF. A única alteração morfológica encontrada é o extenso apagamento dos pedicelos na MET (FOGO; LUSCO; NAJAFIAN; ALPERS, 2015b).

A causa subjacente da DLM ainda não é clara, mas geralmente é antecedida por uma infecção ou reação alérgica. Foi postulado que um fator circulante de origem imune produzido por células T anormais seja o responsável por alterar a permeabilidade glomerular uma vez a DLM pode ocorrer em concomitância com linfoma de Hodgkin que é uma neoplasia linfoide, responde a medicamentos que suprimem a imunidade mediada por células, não cursa com deposição humoral nos glomérulos (Imunoglobulinas e complemento) e a remissão da doença pode seguir a infecção pelo sarampo, que causa imunossupressão mediada por células (SHALHOUB, 1974). Estudos mostraram um desequilíbrio nas subpopulações de células T durante a fase ativa da doença, com uma prevalência de células TCD8+ circulantes que agravam o dano renal em modelos de camundongos com síndrome nefrótica (WANG; WANG; TAY; HARRIS, 2001) e uma prevalência de um perfil de citocina de células T tipo 2 em pacientes com DLM (VAN DEN BERG; WEENING, 2004). Dentre as citocinas desse perfil de resposta imune, a interleucina 13 (IL-13) foi correlacionada com a patogênese da DLM em modelo animal transgênico para IL-13 que apresentou regulação negativa de nefrina, podocina e distroglicano e regulação positiva simultânea de B7-1 nos glomérulos e consequentemente apagamento dos pedicelos (LAI; WEI; TAN; TAN et al., 2007). Certamente nenhuma citocina isolada pode ser considerada responsável pela patogênese da DLM, mas pode desempenhar um papel importante em uma rede complexa com múltiplos fatores celulares e circulantes (BERTELLI; BONANNI; DI DONATO; CIONI

et al., 2016).

As alterações podocitárias nas podocitopatias são resultado do desequilíbrio entre respostas adaptativas, autofagia, que mantêm a homeostase e disfunção celular, que podem culminar em morte celular (NAGATA, 2016).

1.4 ALTERAÇÕES CELULARES RELACIONADAS AOS PODÓCITOS

1.4.1 Autofagia

A autofagia é um processo catabólico altamente conservado induzido sob várias condições de estresse celular que equilibra a produção de organelas celulares e a

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destruição de estruturas intracelulares indesejadas ou danificadas. Com isso, a autofagia tem principalmente funções citoprotetoras e precisa ser fortemente regulada para responder corretamente aos diferentes estímulos, conferindo assim adaptação ao microambiente em constante mudança (DIKIC; ELAZAR, 2018). Diante disso, a autofagia é um mecanismo de reparo celular de suma importância para células terminalmente diferenciadas como os podócitos (SATO; KITAMURA; ADACHI; SASAKI et al., 2006).

O processo da autofagia se dá em várias etapas, sendo estas: iniciação, nucleação de membrana e formação do fagóforo, expansão do fagóforo e formação do autofagossomo, fusão com o lisossomo e degradação. Esse mecanismo é regulado por múltiplas proteínas denominadas proteínas relacionadas à autofagia (ATGs), sendo que um conjunto de proteínas chave para autofagia é a família que compreende proteínas da cadeia leve 3 (LC3) associadas a microtúbulos (HANSEN; RUBINSZTEIN; WALKER, 2018).

Uma etapa importante para o estabelecimento do processo de autofagia é a formação do autofagossomo, que é uma vesícula de membrana dupla que encapsula proteínas malformadas, proteínas de longa duração e organelas que depois se funde com lisossomos para degradação. As proteínas da família LC3 são responsáveis pela formação dos autofagossomos, são processadas proteoliticamente e ligadas a membranas autofagossômicas, onde participam do reconhecimento e recrutamento das estruturas a serem processadas no fagóforo, interagindo com vários receptores de autofagia ou receptores ligados a essas estruturas. Além disso, o próprio LC3 pode ser degradado pela autofagia, indicando que é um substrato autofágico (TANIDA; UENO; KOMINAMI, 2008). Sendo assim, detectar LC3 in situ pode ser um método para monitorar processos relacionados à autofagia. Outro método para avaliar autofagia in situ é a MET, pois a presença de vacúolos autofágicos é uma característica morfológica importante das células com atividade autofágica (KLIONSKY; ABDELMOHSEN; ABE; ABEDIN et al., 2016). A desregulação da autofagia leva ao desenvolvimento de várias doenças como neoplasia, neurodegeneração, diabetes, envelhecimento, doenças cardíacas e renais (GOLSTEIN; KROEMER, 2007). No caso das doenças renais, em especial nas podocitopatias, acredita-se que essa desregulação seja a responsável pela alteração podocitária (BRAUN; BECKER; BRINKKOETTER, 2016).

(23)

A morte celular é definida como degeneração irreversível das funções celulares vitais, principalmente produção de ATP e preservação da homeostase, culminando na perda da integridade celular, ou seja, permeabilização permanente da membrana plasmática ou fragmentação celular (GALLUZZI; VITALE; AARONSON; ABRAMS et

al., 2018).

A morte celular pode ocorrer em resposta a diferentes estímulos, sendo o estresse oxidativo o principal gatilho. Pode haver dois tipos de morte celular, a morte celular passiva ou a morte celular regulada (TANG; KANG; BERGHE; VANDENABEELE et

al., 2019). A morte celular passiva ocorre a partir do desaparecimento instantâneo e

catastrófico de células frente a estímulos físicos (altas pressões, temperaturas ou forças osmóticas), químicos (variações extremas de pH) ou mecânicos (forças de cisalhamento). A morte celular regulada resulta da ativação de cascatas de sinalização fortemente estruturadas e mecanismos efetores molecularmente definidos, sendo esse tipo de morte celular uma morte celular programada, que é dividida em vários modos que são iniciados e propagados por mecanismos moleculares que exibem um grau considerável de interconectividade. Além disso, cada tipo de morte celular regulada pode apresentar morfologicamente diferentes características que variam de totalmente necrótico a totalmente apoptótico e um perfil imunomodulador que varia de anti-inflamatório a pró-inflamatório (GALLUZZI; VITALE; AARONSON; ABRAMS et al., 2018). A perda de controle dos mecanismos de tipos únicos ou mistos de morte celular contribui para instalação de doenças humanas (SINGH; LETAI; SAROSIEK, 2019).

Juntamente com os mecanismos pelos quais as células mortas e seus fragmentos são descartados, as manifestações morfológicas de morte celular têm sido historicamente empregados para classificar a morte celular em três formas diferentes: a morte celular do tipo I corresponde a apoptose e é caracterizada por pequena ou nenhuma modificação ultra estrutural das organelas citoplasmáticas, formação de bolhas apoptóticas, formação de corpo apoptótico e manutenção da integridade da membrana plasmática até os estágios finais do processo e fagocitose por fagócitos residentes. A morte celular do tipo II é definida como morte celular dependente de autofagia, com a formação de vesículas autofágicas em larga escala, podendo causar morte celular em circunstâncias específicas, no entanto, é sabido que a autofagia promove a sobrevivência celular. A morte celular do tipo III, a necrose, é caracterizada morfologicamente por um ganho no volume celular (oncose), edema das organelas, ruptura da membrana plasmática e subsequente perda de conteúdo intracelular e é considerada um tipo não programado de morte celular

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(KROEMER; GALLUZZI; VANDENABEELE; ABRAMS et al., 2009;

SCHWEICHEL; MERKER, 1973).

1.4.2.1 Apoptose

Os mecanismos moleculares que regulam a apoptose são divididos em dois subtipos principais. Sendo assim há apoptose desencadeada pela via extrínseca e a desencadeada pela via intrínseca.

A apoptose desencadeada pela via extrínseca é iniciada por perturbações do microambiente extracelular e é mediada por receptores de membrana, especialmente por receptores de morte celular (ASHKENAZI; DIXIT, 1998), como por exemplo, o receptor de morte na superfície celular FAS (STRASSER; JOST; NAGATA, 2009) e o membro da superfamília do receptor de TNF 1A (AGGARWAL; GUPTA; KIM, 2012). A ligação do receptor de morte com seu ligante permite a montagem de um complexo multiproteico dinâmico na cauda intracelular do receptor, chamado complexo de sinalização indutor de morte que é responsável pela ativação da caspase iniciadora 8 (CHANG; XING; CAPACIO; PETER et al., 2003).

A apoptose desencadeada pela via intrínseca pode ser induzida por uma variedade de perturbações microambientais, como retirada do fator de crescimento, dano ao DNA, estresse do retículo endoplasmático, sobrecarga de espécies reativas de oxigênio, estresse de replicação e defeitos mitóticos, e é resultante da permeabilização da membrana externa mitocondrial que é rigidamente controlada pela família de proteínas BCL (CZABOTAR; LESSENE; STRASSER; ADAMS, 2014). Essa família de proteínas é composta por proteínas reguladoras de apoptose, por exemplo BAX, proteínas antagonistas de BCL2, por exemplo BAK e proteínas antiapoptóticas, por exemplo BCL2 e BCLX (PIHÁN; CARRERAS-SUREDA; HETZ, 2017). Os membros pró-apoptóticos da família de proteínas BCL2 são ativados transcricionalmente ou pós-traducionalmente, pois ao passo que organelas ou compartimentos celulares específicos sofrem perturbações da homeostase, operam de fato como transdutores celulares de sinalização de estresse (BOUILLET; PURTON; GODFREY; ZHANG et al., 2002). A permeabilização da membrana da mitocôndria leva à liberação de proteínas que ativam a caspase iniciadora 9 (CHIPUK; BOUCHIER-HAYES; GREEN, 2006).

As caspases iniciadoras de ambas as vias de apoptose, são capazes de ativar caspases efetoras de apoptose (caspase 3, caspase 6 e caspase 7), que são classificadas

(25)

como caspases efetoras comuns. Essas caspases têm a função de clivagem de substratos e destruição de estruturas subcelulares (AGGARWAL; GUPTA; KIM, 2012).

Não existem muitos métodos para detecção de apoptose em material parafinizado. Contudo, a detecção de caspases 3 tem sido empregada com uma opção para detecção de apoptose in situ, pois a ativação das caspases executoras é característica da apoptose (HUPPERTZ; FRANK; KAUFMANN, 1999; JERUC; VIZJAK; ROZMAN; FERLUGA, 2006).

1.4.2.2 Necrose

A necrose é considerada um tipo de morte celular não programada. Não há consenso sobre as alterações bioquímicas que podem ser usadas para identificar necrose, isso porque os fenômenos causadores da necrose não são bem claros, assim como seus efeitos. Esses fenômenos incluem alterações mitocondriais que levam a produção de espécies reativas de oxigênio, estresse oxidativo por óxido nítrico ou compostos semelhantes (NICOTERA; BERNASSOLA; MELINO, 1999) e permeabilização da membrana mitocondrial controlada pela ciclofilina D (KROEMER; GALLUZZI; BRENNER, 2007). Também incluem alterações lisossômicas como permeabilização da membrana lisossomal por espécies reativas de oxigênio (TERMAN; GUSTAFSSON; BRUNK, 2006) e alterações nucleares como hiperativação de NAD+

ADP-ribosiltransferase que leva a hidrólise de NAD+_{(XU; HUANG; LIU; HAN, 2006). Outro}

fenômeno é o aumento da concentração citosólica de cálcio não ligada a calmodulina ativa que resulta em sobrecarga e ativação mitocondrial proteases não-caspases (ARTAL-SANZ; TAVERNARAKIS, 2005).

De acordo com as possíveis vias bioquímicas relacionadas ao processo de necrose, para haver esse tipo de morte celular há uma sequência de sinais precoces de disfunção mitocondrial que incluem produção de espécies reativas de oxigênio pelas mitocôndrias e edema mitocondrial, depleção de ATP (EGUCHI; SHIMIZU; TSUJIMOTO, 1997), falha da homeostase do cálcio, agrupamento perinuclear de organelas, ativação de proteases, lise da membrana lisossômica e finalmente lise de membrana plasmática. No entanto, essa sequência cronológica parece ser mais didática, pois ainda não está claro como esses fatos se interrelacionam. Isoladamente, cada um desses eventos é específico da necrose e ainda alguns podem também estar presentes na apoptose (KIM; HE; LEMASTERS, 2003). Com isso, a morte celular necrótica ainda é amplamente identificada pela ausência de marcadores apoptóticos ou autofágicos, principalmente

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quando as células sofrem permeabilização precoce da membrana plasmática (KROEMER; GALLUZZI; VANDENABEELE; ABRAMS et al., 2009).

As características morfológicas da necrose incluem oncose que é aumento do volume celular e rompimento da membrana plasmática que culmina na perda de eletrondensidade no citoplasma (KROEMER; GALLUZZI; VANDENABEELE; ABRAMS et al., 2009). Essas alterações morfológicas podem ser visualizadas na MET em podócitos, como foi observado em uma amostra de biópsia renal de transplante de um paciente com insuficiência renal aguda grave secundária a rejeição mediada por anticorpos, que demonstrou oncose e lise da membrana plasmática nessas células (LIAPIS; ROMAGNANI; ANDERS, 2013).

Sendo assim, a proposta do nosso estudo está voltada para melhor compreensão das alterações morfológicas dos podócitos relacionadas às podocitopatias, uma vez que essas alterações podocitárias são resultado do desequilíbrio entre as respostas adaptativas e disfunção celular. A análise dos padrões de lesões e adaptações em ambas as doenças possibilitará maior entendimento dos mecanismos envolvidos nessas lesões podocitárias.

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2 HIPÓTESE

Pacientes com GESF apresentam diminuição do número de podócitos devido a maior ocorrência de morte celular e ao menor número de podócitos em autofagia, quando comparado com pacientes com DLM.

3 JUSTIFICATIVA

As podocitopatias, GESF e DLM, são doenças glomerulares comuns que estão entre as principais causas de síndrome nefrótica idiopática. Essas duas doenças são classificadas como podocitopatias por ter o podócito como célula alvo.

Pouco se sabe sobre como ocorre a lesão podocitária e como dá-se a evolução para morte dos podócitos. Acredita-se que as alterações podocitárias são resultado do desequilíbrio entre as respostas adaptativas que mantêm a homeostase e disfunção celular, que pode culminar em morte celular e contribuir para formação de áreas de esclerose. Contudo, até o momento, os mecanismos e as repercussões visualizadas nas alterações morfológicas ainda não foram elucidados.

Os podócitos são células terminalmente diferenciadas e diante de uma lesão celular a resposta é a perda de sua citoarquitetura e polaridade, levando ao apagamento dos pedicelos, lesão morfológica elementar tanto na GESF quanto na DLM.

Dessa forma, estudar marcadores de evidências de morte ou adaptação celular, juntamente a alterações ultraestruturais relacionadas a apoptose, necrose ou autofagia, podem auxiliar na elucidação de mecanismos de lesão podocitária, bem como representar as lesões relacionadas as estas duas entidades, que apresentam características morfológicas comuns, porém prognósticos distintos.

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4 OBJETIVO GERAL

Avaliar morfologicamente podócitos em biópsias renais de pacientes adultos com Podocitopatias (Glomeruloesclerose Segmentar e Focal e Doenças de Lesões Mínimas) realizadas no Serviço de Nefropatologia da Disciplina de Patologia Geral da UFTM, entre os anos de 1996 a 2018.

5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

I. Descrever os aspectos clínicos e epidemiológicos dos pacientes diagnosticados com Podocitopatias;

II. Comparar o número de podócitos imunomarcados por WT1, por LC3 e por caspase-3 entre os casos de GESF e DLM;

III. Mensurar o apagamento dos pedicelos, por meio da microscopia eletrônica de transmissão;

IV. Quantificar o número de autofagossomos, por meio da microscopia eletrônica de transmissão;

V. Avaliar as alterações de morte celular em podócitos, por meio da microscopia eletrônica de transmissão;

VI. Correlacionar os achados morfológicos com a taxa de filtração glomerular estimada;

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6 RESULTADOS

ARTIGO 1

TÍTULO: Focal and Segmental Glomerulosclerosis and Membranous Nephropathy

overlapping in a patient with Nephrotic Syndrome: a case report

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ARTIGO 2

TÍTULO: In situ morphological and functional assessments of podocytes in patients

with Focal Segmental Glomerulosclerosis and Minimal Change Disease

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In situ morphological and functional assessments of podocytes in patients with Focal

Segmental Glomerulosclerosis and Minimal Change Disease

Crislaine Aparecida da Silva1_{, Maria Luíza Gonçalves dos Reis Monteiro}1_{, Liliane}

Silvano Araújo1, Monise Gini Urzedo1, Lenaldo Branco Rocha1, Marlene Antônia dos Reis1, *Juliana Reis Machado1.

1_{Department of Pathology, Genetics and Evolution, Discipline of General Pathology,}

Institute of Biological and Natural Sciences of Federal University of Triangulo Mineiro, Praça Manoel Terra, 330, Nossa Senhora da Abadia, Zip Code: 38025-015, Uberaba, Minas Gerais, Brazil

*_{Corresponding author}

Juliana Reis Machado, PhD Professor General Pathology

Praça Manoel Terra, 330, Nossa Senhora da Abadia, Zip Code: 38025-015, Uberaba, Minas Gerais, Brazil

e-mail address: juliana.patologiageral@gmail.com Fone: 55 (34) 3700-6452

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ABSTRACT

Introduction: Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) and minimal change disease (MCD) are among the main causes of idiopathic nephrotic syndrome. Podocyte injury results from the imbalance between adaptive responses that maintain homeostasis and cellular dysfunction that can culminate in cell death. Therefore, an in situ analysis was performed to detect morphological changes related to cell death and autophagy in renal biopsies from adult patients with podocytopathies. Methods: A total of 49 renal biopsies from patients diagnosed with FSGS (n = 22) and MCD (n = 27) were selected. In situ expression of Wilms Tumor 1 protein (WT1), light chain microtubule 1-associated protein (LC3) and caspase-3 protein were evaluated by immunohistochemistry. The foot process effacement and morphological alterations related to podocyte cell death and autophagy were analyzed with transmission electron microscopy. Results: A reduction in the density of WT1-labeled podocytes was observed for FSGS and MCD cases as compared to controls. Foot process width in FSGS was significantly larger compared to MCD and correlated with proteinuria. A density of LC3-labeled podocytes and the number of autophagosomes in podocytes/ pedicels were higher in the MCD group than in the GESF group. In addition, the number of autophagosomes correlated positively with the estimated glomerular filtration rate in cases of MCD. The density of caspase-3-labeled podocytes in FSGS and MCD was higher than control group, and a higher number of podocytes with an evidence of necrosis was detected in FSGS cases than in MCD cases. Conclusion: Podocytes from patients diagnosed with FSGS showed more morphological and functional alterations resulting from a larger number of lesions and reduced cell adaptation.

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BACKGROUND

Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) and minimal change disease (MCD) are among the main causes of idiopathic nephrotic syndrome, termed as podocytopathies. These conditions show diffused foot processes effacement under electron microscopy (1, 2).

Podocytes (visceral epithelial cells) are terminally differentiated cells lining the outer surface of glomerular capillaries, and their differentiation coincides with the progressive expression of maturity markers, including the Wilms tumor suppressor gene 1 (WT1) (3). These cells appear to have an intrinsic system that could withstand tension but they may be undergo damage when the stresses exceed this capacity. Thus, podocyte injury is a result of the imbalance between the adaptive responses that maintain homeostasis and cellular dysfunction, leading to cell death (4).

To maintain homeostasis, podocytes have a high rate of autophagy, which is related to the formation of autophagosomes (5). Proteins that are important for the formation of the autophagosome include light chain microtubule 1-associated protein (LC3), a member of the autophagy-related protein family 8 encoded by the MAP1LC3 gene, which is required for the elongation and maturation of the autophagosome (6).

So, considering the research line of our group that has been looking for possible biomarkers, morphological alterations and mechanisms of lesions that may allow differentiation of the diagnosis of MCD from that of FSGS when sclerosis lesions are not sampled in renal biopsies (7-10), we propose to analyze in situ morphological and functional alterations related to apoptosis, necrosis and autophagy in renal biopsies of adult patients with FSGS and MCD.

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METHODS

Patients

A total of 49 cases of idiopathic podocytopathies in adults, including patients with FSGS (n = 22) and MCD (n = 27), were selected from from the Nephropathology Service of the General Pathology Discipline of the Federal University of Triângulo Mineiro Uberaba, Minas Gerais, Brazil. FSGS group was defined by the presence of segmental and focal sclerosis (mesangial matrix increase) in light microscopy (LM) and foot process effacement in transmission electron microscopy (TEM). MCD group was defined by the absence of lesions in LM and foot process effacement as the only alteration in TEM analysis. All cases that presented morphological alterations compatible with other entities were excluded from this study. The control group (n = 18) was composed of autopsy kidneys from patients whose death was not related to renal or infectious diseases. This study was approved by the Ethics and Research Committee of the Federal University of Triângulo Mineiro with the number 2.949.713.

Renal histopathology

The kidney samples were evaluated by LM, immunofluorescence, TEM, and immunohistochemistry. For LM, the gluteraldehyde-fixed fragment was dehydrated in graduated alcohols, diaphanized in xylol, embedded in paraffin and submitted to serial cuts of 2μm thickness. The paraffin material slides were stained with hematoxylin and eosin, Sirius Red, periodic acid silver methenamine stain and Masson's trichrome. For direct immunofluorescence the fragment was frozen in liquid nitrogen and sectioned with 2μm thickness sections. The frozen material slides were screened for IgA, IgG and IgM immunoglobulins, kappa and lambda light chains, C1q and C3 complement fractions, and

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fibrinogen by fluorescein isothiocyanate conjugated antibodies (Dako, Copenhagen, Denmark). For TEM, the sample was fixed with Karnovsky 2.5% + ruthenium red 0.2% and post-fixed in osmium tetroxide 2%, then dehydrated in graded alcohols and acetone solutions and embedded in Epon 812 resin. Ultrathin 60-nm-thick sections were cut and placed onto nickel grids and were subsequently contrasted with lead citrate 1% and uranyl acetate 3% and examined under an EM-900 transmission electron microscope (Zeiss, Germany).

Immunohistochemistry for WT1, LC3, and caspase 3

Sequential histological sections of 2 µm of paraffin-embedded fragments were subjected to immunohistochemistry which was performed manually using the Novolink non-biotinylated polymer system (Novolink Polymer Detection System Kit, BL, UK).

Table 1 – Immunohistochemistry specifications

Primary antibody Supplier Clone Antigen retrieval buffer Concentration

Monoclonal mouse anti-human Wilms’ tumor 1

Dako M3561 Citrate pH 6.0 1:500

Monoclonal mouse anti-human LC3

BIORBYT 166AT1234 Citrate pH 6.0 1:1200

Monoclonal rabbit anti-human Caspase 3

NSJBIO RM250 Citrate pH 6.0 1:1000

Immunostaining quantification

Immunostained podocytes in glomeruli were counted as positive cells. All glomeruli without sclerosis of each sample were analyzed. Digital images of each glomerulus were captured using the AxionCam ICc5 (Zeiss, Germany) digital camera attached to the light microscope on the 40x objective lens. All immunostained brownish-colored podocytes were quantified in each glomerulus and the area of each glomerulus

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was measured. The result was expressed in cell density per glomerular area (11).

Transmission electron microscopy

In TEM were evaluated the foot process width, the number of autophagosomes in podocytes / pedicels and evidence of necrosis in podocytes.

Two glomeruli from each patient were evaluated and the images of all glomerular loops all available podocytes were captured at an amplification of 7000. Image analysis was performed with ImageJ 1.5 and the system was calibrated using the scale bar on the electron micrographs.

To measure the foot process width, the glomerular basement membrane (GBM) was traced and measured in the image analysis program, and the number of pedicels along the measured GBM was manually counted and expressed as the number of foot processes per µm GBM length. A foot process was defined as any epithelial segment connected to the basement membrane between two pores or filtering slits. From each image, the average foot process width was calculated by dividing the total number of pedicels by the length of GBM (12), and a correction factor π/4 was used to correct for presumed random variation in the angle of the section relative to the long axis of the podocyte (13). For each patient, the average foot process width was expressed in nanometers.

The number of podocytes in each case, the number of autophagosomes and the number of podocytes with evidence of necrosis were counted in each image without repeating fields. Autophagosomes were identified as vesicles containing undigested cytoplasmic material (14, 15). Evidence of necrosis in podocytes were oncosis (increased cell volume), nuclear edema (increased nuclear volume with decreased electrodensity) and cell lysis (cytoplasmic membrane rupture and loss of intracytoplasmic content) (16).

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Statistical analysis

Statistical analysis was performed using the GraphPad Prism software version 7.0. Normality was tested by the Shapiro Wilk test. In case of normal distribution and similar variances was used ANOVA test (F), followed by the Tukey’s post-test or Student t test (t). In cases of non-normal distribution, was used the Kruskal-Wallis test (H), followed by Dunn’s post-test or Mann-Whitney test (U). The chi-square test (χ2) was used for the analysis of associations. Correlations were assessed with the Pearson’s (r) and Spearman’s (rS) tests. Differences were considered significant when p < 0.05.

RESULTS

Epidemiological and clinical-laboratory analysis of patients

Of the 49 cases of podocytopathies studied in adults, the majority were male (53.06%) and white (71.43%), with a mean age of 35.4 ± 13.0 years. Among patients with FSGS, 13 (59.1%) were male and 15 (68.2%) were white, and the mean age was 35.1 ± 2.5 years. Of all patients with MCD, 13 (63.6%) were male and 20 (74.1%) were white, while their mean age was 35.6 ± 13.4 years. In the control group, 9 (50.0%) patients were males and 9 (50.0%) were females, and the mean age was 42.8 ± 13.2 years.

Patients from both groups had nephrotic proteinuria, with a mean value of 6.3 ± 4.9 g/24 h in FSGS group and 4.4 ± 4.2 g/24 h in MCD group. The mean serum albumin level was 2.6 ± 0.9 mg/dL in patients with FSGS and 2.7 ± 0.8 mg/dL in those with MCD. The mean serum creatinine level was 1.5 ± 1.0 mg/dL and 1.0 ± 0.5 mg/dL and the average estimated glomerular filtration rate (eGFR) was 72.9 ± 39.9 mL/min/1.73m2 and 88.4 ± 28.4 mL/min/1.73m2_{in FSGS and MCD groups, respectively. Hematuria was}

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systemic arterial hypertension was present in 16 (72.7%) patients in the FSGS group and in 7 (25.9%) patients in the MCD group.

Morphological analysis of patient biopsies

At least 10 glomeruli per patient were evaluated in LM and in TEM analysis, at least two glomeruli were evaluated per patient and an average of 12.8 ± 5.4 podocytes and 15.8 ± 5.6 glomerular loops were observed with a length of 12552.6 ± 1314.8 nm (Table 2).

Table 2 - Morphological analysis

Control (n=18) FSGS (n=22) MCD (n= 27) Number of WT1-labeled podocytes Mean ± SD 28.3±4.7 18.0±7.8 18.6±6.4 Median (Min-Max) 28.0 (19.0-38.0) 17.0 (7.0-37.0) 17.5 (9.0-34.0) Number of evaluated podocytes in TEM Mean ± SD 11.1±4.5 13.6±5.7 Median (Min-Max) 10.5 (5.0-19.0) 12.0 (4.0-25.0)

Number of glomerular loops in TEM

Mean ± SD 15.0±5.2 16.2±5.9

Median (Min-Max) 15.0 (6.0-23.0) 16.0 (5.0-25.0)

Length of glomerular loops in TEM (nm) Mean ± SD 12944.4±998.4 12280.0±1458.3 Median (Min-Max) 13000.0 (11000.0-14000.0) 12000.0 (11000.0-18000.0)

Foot process widht (nm)

Mean ± SD 2503.0±1506.5 1488.9±793.4 Median (Min-Max) 2739.2 (493.0-5550.3) 1327.6 (521.2-3011.8) n: Number of cases

WT1: Antibody anti-human Wilms’ tumor 1 protein SD: Standard deviation

Min: Minimum Max: Maximum

TEM: Transmission electronic microscopy nm: Nanometer

Previous results from our group have shown that podocytes have increased expression of urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) in situ in biopsies from

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adult (10) and pediatric (9) patients with morphological lesions compatible with FSGS. From these findings, we evaluated the possible causes of cellular injury in podocytopathies. As these diseases progress with changes in podocytes, we evaluated the number of podocytes using the expression of WT1 and observed a significant reduction in the density of podocytes both in FSGS and MCD cases as compared to controls (Figure 1A and 1B, p = 0.0430, F = 0.1014, Table 2). We also evaluated the functionality of podocytes by measuring their width and observed that foot processes width is greater in FSGS group than in MCD (Figure 1C and 1D, p = 0.0235, U = 133.5, Table 3).

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Figure 1 - Morphological evaluation of podocytes in renal biopsies of patients with FSGS and MCD

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(a) Density of WT1-labeled podocytes in three groups. ANOVA test followed by Tukey’s multiple comparison test . The bars represent the mean and the vertical lines represent the standard error of the mean. b) WT1-labeled podocytes in the control, FSGS, and MCD groups (arrows). c) Difference in the foot process width between FSGS and MCD groups showing the extensive foot process effacement in FSGS group. Mann-Whitney test. The horizontal lines represent the medians, bars represent the 25-75% percentiles, and the vertical lines represent the 10-90% percentiles. d) TEM showing more foot process effacement in a case of FSGS and more foot process preserved in a case of MCD. Δ: Significant difference between FSGS and control group

*: Significant difference between MCD and control group Φ: Significant difference between FSGS and MCD group

Podocytes of FSGS patients show more lesions and less cellular adaptation than those of MCD patients

As FSGS group showed a functional reduction in podocytes, we used LM and TEM to find evidences of lesions and cellular adaptations in podocytes. Glomeruli of FSGS patients showed lower density of LC3-labeled podocytes, evidence of autophagy when compared to the control group and the MCD group (Figure 2A and 2B, p = 0.0162, H = 8.243, Table 3). In addition, a larger number of autophagosomes was observed in podocytes and pedicels of patients with MCD than in those with FSGS (Figure 2C and 2D, p = 0.0156, t = 2.522, Table 3), showing that autophagy is less prevalent in podocytes of FSGS cases.

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Figure 2 - Evidence of podocyte autophagy in renal biopsy of patients with FSGS and MCD

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(a) Density of LC3-labeled podocytes in three groups. ANOVA test followed by Tukey’s multiple comparison test. The bars represent the mean and the vertical lines represent the standard error of the mean. b) LC3-labeled podocytes in the control, FSGS, and MCD groups (arrows). c) Difference in the number of autophagosomes between FSGS and MCD groups is reflective of higher autophagy in MCD group. Student’s t-test. The bars represent the mean and the vertical lines represent the standard error of the mean. d) TEM showing autophagosomes characterized as a multivesicle bodies containing undigested cytoplasmic material in podocytes (arrows) and pedicels (arrow head).

Δ: Significant difference between FSGS and control group Φ: Significant difference between FSGS and MCD group

After the analysis of podocyte viability through autophagy, the possible mechanisms underlying cell death in podocytes were evaluated. A higher density of caspase-3-labeled podocytes were observed in glomeruli of patients from the GESF group and from the MCD group compared to the control group (Figure 3A and 3B, p < 0.0001, F = 23.69, Table 3). Thus, apoptosis-mediated death of podocytes occurs in both podocytopathies. However, a higher number of podocytes with evidence of necrosis such as nuclear edema and cell lysis was observed in FSGS cases than in MCD cases (Figure 3C and 3D, p = 0.00043, Table 3). Cell lysis, a morphological characteristic of necrosis, was absent in all MCD cases.

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Table 3 – Podocytes lesions and adaptations analysis in renal biopsies of patients with FSGS and MCD

Control (n=18) FSGS (n=22) MCD (n= 27)

Autophagy evidences

Number of LC3-labeled podocytes

Mean ± SD 25.6±12.4 14.5±4.0 15.8±5.5 Median (Min-Max) 20.0 (15.0-52.0) 14.0 (10.0-24.0) 16.0 (9.0-27.0) Number of autophagosomes in TEM Mean ± SD 54.0±25.6 79.2±40.3 Median (Min-Max) 55.0 (10.0-92.0) 80.0 (20.0-150.0)

Number of autophagic vesicles in TEM

Mean ± SD 2.9±2.7 4.4±3.4

Median (Min-Max) 2.0 (0.0-10.0) 4.0 (0.0-11.0) Apoptosis evidences

Number of Caspase 3-labeled podocytes

Mean ± SD 2.4±0.9 7.6±2.9 6.9±1.4

Median (Min-Max) 2.0 (1.0-4.0) 8.0 (3.0-12.0) 7.0 (5.0-10.0) Necrosis evidences

Number of podocytes with oncosis in TEM

Mean ± SD 0.3±0.6 0.6±1.0

Median (Min-Max) 0.0 (0.0-2.0) 0.0 (0.0-4.0)

Number of podocytes with nuclear edema nuclear in TEM

Mean ± SD 0.3±0.8 0.1±0.3

Median (Min-Max) 0.0 (0.0-3.0) 0.0 (0.0-1.0)

Number of podocytes with cell lysis in TEM Mean ± SD 0.3±1.0 0.0±0.0 Median (Min-Max) 0.0 (0.0-4.0) 0.0 (0.0-0.0) n: Number of cases LC3: Antibody anti-human LC3 SD: Standard deviation Min: Minimum Max: Maximum

TEM: Transmission electronic microscopy Caspase 3: Antibody anti-human Caspase 3

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Figure 3 - Evidence of cell death in renal biopsy of patients with FSGS and MCD (a) Density of podocytes labeled with caspase-3 in three groups. ANOVA test followed by Tukey’s multiple comparison test. The bars represent the mean and the vertical lines

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represent the standard error of the mean. b) Caspase 3-labeled podocytes in the control, FSGS, and MCD groups (arrows). c) Morphological evidence of necrosis in podocytes from FSGS and MCD group, indicating a higher number of podocytes with nuclear edema and cell lysis in FSGS cases. Chi-square test. d) TEM illustrating podocytes (arrows) with morphological alterations compatible with necrosis.

Δ: Significant difference between FSGS and control group *: Significant difference between MCD and control group

Assessment of Podocyte Function

As podocytes from FSGS group showed morphological changes and those from MCD group exhibited better cell adaptation properties, we evaluated the correlation between morphological alterations and relevant clinical data in patients with podocytopathies. A significant positive correlation was detected between eGFR and density of LC3-labeled podocytes in MCD cases (Figure 4B, p = 0.0025, r = 0.7011), which was not observed in FSGS cases (Figure 4A, p = 0.8079, r = 0.0748). Patients with FSGS showed positive and significant correlation between proteinuria levels and foot process width (Figure 4C, p = 0.0371, rS = 0.5129) that was absent in patients from MCD group. This result indicates that proteinuria exhibits a direct relationship with the extension of foot process effacement in FSGS group.

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Figure 4 - Assessment of Podocyte Function

Correlation between the estimated glomerular filtration rate and density of LC3-labeled podocytes in (a) FSGS and (b) MCD group. Correlation between proteinuria and foot process width in (c) FSGS and (d) MCD group.

r: Pearson's correlation coefficient rS: Spearman’s correlation coefficient

DISCUSSION

The podocytopathies FSGS and MCD are common glomerular diseases that are among the main causes of nephrotic syndrome. A podocyte is a primarily damaged cell (17), and the extent of damage may vary (18, 19).

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One way to evaluate podocyte loss is through the analysis of specific podocyte markers such as WT1, which is related to the maintenance of podocyte differentiation (20). We investigated whether there exists any differences in the density of podocytes in renal biopsies of patients with FSGS and MCD through immunostaining for WT1. As a result, we found a significant reduction in the density of WT1-labeled podocytes both in FSGS and MCD cases as compared to controls, but there was no difference between the two podocytopathies. Some animal model studies have demonstrated the relationship between reduction in WT1-labeled podocytes and glomerulosclerosis (21, 22). However, we have previously shown that there is no difference in the density of WT1-labeled podocytes in biopsies of pediatric patients with FSGS and MCD (9). Unlike other studies, we excluded glomeruli that presented sclerosis. Alternatively, the mechanisms of podocyte injury may be cause phenotypic modifications of the podocyte, resulting in reduced expression of markers in situ, such as WT1, in both podocytopathies.

The common ultrastructural findings between FSGS and MCD is the foot process effacement (1, 2) resulting from change in the binding complex between GBM and the pedicel, leading to a disorder in actin cytoskeleton (23). To measure podocyte lesion, the extension of foot process effacement was assessed by the evaluation of mean foot process width which was higher in FSGS cases than in MCD cases. Thus, a more diffused foot process effacement was noted in patients with FSGS. This observation has been demonstrated in a quantitative study, wherein the mean foot process width was higher in FSGS cases than in MCD cases (12), and adults with FSGS had more diffused foot process effacement (24).

The difference in foot process effacement between FSGS and MCD cases, suggests that podocyte damage in these diseases occurs owing to different mechanisms, which is reinforced by the difference in the expression of some podocyte proteins (8, 25).