Efeito dos sólidos suspensos totais na água e dos substratos artificiais sobre o cultivo superintensivo de Litopenaeus vannmei com bioflocos

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA. Efeito dos sólidos suspensos totais na água e dos substratos artificiais sobre o cultivo superintensivo de Litopenaeus vannamei com bioflocos. Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para obtenção do título de Doutor em Aquicultura Orientador: Dr. Edemar Roberto Andreatta. Rodrigo Schveitzer. Florianópolis 2012.

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(3) Efeito dos sólidos suspensos totais na água e dos substratos artificiais sobre o cultivo superintensivo de Litopenaeus vannamei com bioflocos Por RODRIGO SCHVEITZER Esta tese foi julgada adequada para a obtenção do título de DOUTOR EM AQUICULTURA e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Aquicultura. _____________________________________ Prof. Evoy Zaniboni Filho, Dr. Coordenador do Curso Banca Examinadora: __________________________________________ Dr. Edemar Roberto Andreatta – Orientador __________________________________________ Dr. Eduardo Luis Cupertino Ballester __________________________________________ Dr. Eudes de Souza Correia __________________________________________ Dr. Luis Alejandro Vinatea Arana __________________________________________ Dr. Roberto Bianchini Derner.

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(5) A minha esposa, Renata, por iluminar minha vida. Aos meus pais, Carmen e José Lino, pelo amor incondicional, apoio constante, encorajamento e ensinamentos de vida..

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(7) AGRADECIMENTOS A minha amada, Renata, por seu amor e paciência nos momentos de ausência; Aos meus pais, Carmen e José Lino; e aos meus irmãos, Ana e Fabrício, pelo amor e carinho; Ao Rafael Arantes, amigo de luta. Sem sua ajuda intelectual, na construção da sala experimental e na execução dos experimentos, a tese não seria realizada; Ao meu orientador Edemar R. Andreatta, por todos os anos de amizade, orientação e ensinamentos; Ao professor e amigo Walter Quadros Seiffert, por sempre incentivar a irmos adiante e pelo apoio à realização deste trabalho; Ao Dr. Tzachi Samocha, pela oportunidade de estagiar na Texas A&M University; A CAPES, pela bolsa de doutorado no Brasil e de doutorado sanduíche nos EUA; Ao LCM-UFSC, FAPESC e Departamento de Aquicultura, pelo apoio financeiro para a realização dos estudos; Aos amigos que colaboraram na execução dos experimentos: Manecas, Dadi, Lucas, Caio, Felipe (alemão), Carlos e Frank; Aos amigos da UNIVALI, por abrirem as portas do laboratório e garantir a qualidade nas análises químicas: Patrícia, Tiago e Maycon; Ao Felipe e Gabriela, por todo o suporte com as análises hematoimunológicas; Aos professores e funcionários do LCM: Luis, Roberto, Katt, José Luiz, Felipe, João, Carlos Manoel, Carlos, Davi, Wilson, Dimas, Paulo e Andréia. Obrigado pelo apoio; Ao Carlito, sempre disposto a facilitar a vida dos alunos e fazer possível o impossível; Ao professor Luis Vinatea, por disponibilizar a bolsa de doutorado sanduíche de seu projeto; Aos amigos do Texas: Tim, Sky, Rachel, Nathan, Mike, Anthony, Cristine e Lee, por sua hospitalidade. Ao Tim, por todo apoio em Corpus, pelas conversas e cervejas providenciais. Ao Dariano, “colorado sofredor”, companheiro de horas árduas de trabalho no Texas; Aos membros da banca: Dr. Roberto B. Derner, Dr. Luis Vinatea, Dr. Eduardo Luis Cupertino Ballester e Dr. Eudes de Souza Correia, pelas valiosas sugestões e críticas que ajudaram a aprimorar o trabalho; A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho e que não foram citadas..

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(9) RESUMO A finalidade deste trabalho foi contribuir para o conhecimento e domínio do sistema de cultivo de camarões com bioflocos. No primeiro experimento, foi examinado o efeito de diferentes concentrações de sólidos suspensos totais (SST) sobre a atividade microbiana, a qualidade de água e os índices de produção no cultivo superintensivo de Litopenaeus vannamei com bioflocos. Os camarões foram cultivados em tanques com três concentrações de SST: até 200 mg L-1, entre 400-600 mg L-1 e de 800-1000 mg L-1. A redução dos SST para 200 mg L-1 diminuiu o tempo de residência celular bacteriana e removeu parcialmente as bactérias nitrificantes, fazendo com que o controle da amônia fosse realizado principalmente pelas bactérias heterotróficas. Esse manejo aumentou a demanda de oxigênio e promoveu maior variabilidade da amônia e nitrito. No cultivo com SST acima de 400 mg L-1, o controle da amônia e nitrito foi realizado principalmente pelas bactérias nitrificantes, que promoveram maior estabilidade dos parâmetros de qualidade de água. A sobrevivência e a produtividade do cultivo foram menores quando os SST estiveram acima de 800 mg L-1. Os resultados mostraram que concentrações de SST entre 400 e 600 mg L-1 são mais indicadas para o cultivo de L. vannamei. O objetivo do segundo experimento foi determinar o efeito da presença dos substratos artificiais sobre a atividade microbiana, a qualidade de água e os índices de produção no cultivo de L. vannamei com bioflocos. Os camarões foram cultivados em densidade de 238 e 473 camarões m-3, na presença ou ausência de substratos artificiais. Os resultados mostram que a presença dos substratos melhorou os índices de produção do cultivo. Sem atividade biológica significativa, os substratos não afetaram a qualidade de água e não foram fonte de alimento natural. Nesse caso, serviram apenas para aumentar a área superficial do tanque e reduzir a densidade relativa de estocagem, condição suficiente para melhorar os índices de produção. Em tanques com maior biomassa de camarões, a presença dos substratos teve impacto positivo mais significativo sobre os índices de produção. Palavras-chave: Litopenaeus vannamei, camarões, bioflocos, sólidos suspensos totais, substratos artificiais..

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(11) ABSTRACT The purpose of this paper is to contribute to the knowledge and domain of shrimp culture using Biofloc Technology. The first experiment examined the effect of different concentrations of total suspended solids (TSS) on microbial activity, water quality, and production yields in super-intensive culture of Litopenaeus vannamei with bioflocs. Shrimp were cultured in tanks with three different TSS concentrations: up to 200 mg L-1, between 400-600 L-1, and between 800-1000 L-1. Reduction of TSS to concentrations close to 200 mg L-1 decreased the time of bacterial cell residence and partially removed nitrifying bacteria, which only allowed ammonia control mainly by heterotrophic bacteria. This increased oxygen demand and promoted higher variability of ammonia and nitrite concentrations. In tanks with TSS concentrations over 400 mg L-1, ammonia and nitrite control was mainly accomplished by nitrifiers that promoted more stability of water quality parameters. Both survival and final biomass were lower in tanks with TSS concentrations maintained above 800 mg L-1. The results showed that TSS concentration between 400 and 600 mg L-1 are more appropriate to L. vannamei culture. The second experiment was intended to determine the effect of artificial substrate on microbial activity, water quality, and production yields in culture of L. vannamei with bioflocs. Shrimp were cultured in 238 and 473 shrimp m-3, in the presence or absence of artificial substrates. The results show that the presence of substrates improved shrimp performance. Without significant biological activity, substrates did not affect water quality or served as natural food source. In that case, substrates only increased the superficial area of the tank and reduced the relative stocking density, which was sufficient to improve the production rate. In tanks with higher shrimp biomass, the presence of substrates had a more significant positive impact on shrimp performance. Keywords: Litopenaeus vannamei, shrimp, bioflocs, total suspended solids, artificial substrate.

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(13) LISTA DE FIGURAS Capítulo 1 Fig. 1. Viveiro semi-intensivo de cultivo de camarões - Fazenda Camarões, Bahia (Foto: Rodrigo Schveitzer); B: tanque de cultivo intensivo de camarões com bioflocos revestido com geomembrana e alta taxa de aeração (Foto: Rodrigo Schveitzer); C e D: visão externa e interna de estufa para cultivo superintensivo de camarões com bioflocos - Texas Agrilife Research Mariculture Laboratory, Texas, EUA (Foto: Rodrigo Schveitzer); E: bioflocos sedimentados em cone de Imhoff (Foto: Rodrigo Schveitzer); F: substratos artificiais em tanques de cultivo superintensivo de camarões com bioflocos Waddel Mariculture Center, South Caroline, EUA (Foto: Dr. Craig L. Browdy). ...........................................................................................27 Capítulo 2 Fig.1. (A) Sólidos suspensos totais - SST, (B) turbidez, (C) sólidos sedimentáveis - SS e (D) transparência da água em tanques de L. vannamei cultivado em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3. Valores são médias ± dp em cada dia de cultivo, T400-600 com 3 réplicas, T200 e T800-1000 com 4 réplicas. ......................................................................................49 Fig. 2. (A) pH, (B) alcalinidade e (C) ortofosfato em tanques de L. vannamei cultivado em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3. Valores são médias ± dp em cada semana de cultivo, T400-600 com 3 réplicas, T200 e T8001000 com 4 réplicas...............................................................................55 Fig. 3. (A) Amônia, (B) nitrito, (C) nitrato e (D) relação carbono:nitrogênio (C:N) da mistura ração + melaço em tanques de L. vannamei cultivado em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3. Valores são médias ± dp em cada semana de cultivo, T400-600 com 3 réplicas, T200 e T8001000 com 4 réplicas. Relação C:N calculada de acordo com Avnimelech (2009), foi considerado 50% de carbono na ração; 57,3% de carboidrato e 3,0% de proteína no melaço em pó. Para o cálculo do percentual de C do melaço, foi considerado 40% de C sobre o percentual de carboidrato total (Ebeling et al., 2006)...............57.

(14) Fig. 4. (A) Clorofila-a (cla-a), (B) produção primária bruta – PPB, (C) produção líquida do ecossistema – PLE, (D) respiração da coluna d’água (bioflocos) e (E) taxa de nitrificação em tanques de L. vannamei cultivado em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3. Valores são médias ± dp em cada semana de cultivo, T400-600 com 3 réplicas, T200 e T8001000 com 4 réplicas.. ............................................................................ 59 Fig. 5. Grau de oclusão das brânquias em tanques de L. vannamei cultivado em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3. Valores são médias ± dp para cada tratamento, T400-600 com 3 réplicas (n = 192 camarões), T200 (n= 244 camarões) e T800-1000 (n = 254 camarões) com 4 réplicas. A ANOVA unifatorial (P < 0,05) foi aplicada sobre as médias dos tratamentos para cada grau de oclusão branquial. Letras diferentes sobre o grau de oclusão indicam diferença significativa entre tratamentos pelo teste de Tukey (P < 0,05)........................................... 63 Capítulo 3 Fig. 1. (A) Produção primária bruta - PPB, (B) produção líquida do ecossistema - PLE, (C) respiração da água e (D) taxa de nitrificação associada com os substratos artificiais em tanques de L. vannamei com bioflocos durante 34 dias de cultivo. Valores são médias ± dp em cada semana de cultivo, n = 3. Garrafas de DBO com água dos tanques do D238+S foram incubadas com e sem a presença de substratos artificiais. Por problemas nas análises, a taxa de nitrificação é apresentada a partir da segunda semana. ANOVA unifatorial com medidas repetidas foi aplicada nos parâmetros. Não houve diferença significativa (P < 0,05) na atividade microbiana entre garrafas incubadas com e sem os substratos, ou seja, não houve atividade microbiana significativa associada com os substratos artificiais. Diferença significativa na atividade microbiana ocorreu apenas entre as semanas (P < 0,05)....................................................... 97 Fig. 2. (A) Produção primária bruta - PPB, (B) produção líquida do ecossistema - PLE, (C) respiração da água e (D) taxa de nitrificação associada com os substratos artificiais em tanques de L. vannamei com bioflocos durante 34 dias de cultivo. Valores são médias ± dp em cada semana de cultivo, n = 3. Garrafas de DBO com água dos tanques do D473+S foram incubadas com e sem a presença de.

(15) substratos artificiais. ANOVA unifatorial com medidas repetidas foi aplicada nos parâmetros. Não houve diferença significativa (P < 0,05) na atividade microbiana entre garrafas incubadas com e sem os substratos, ou seja, não houve atividade microbiana significativa associada com os substratos artificiais. Diferença significativa na atividade microbiana ocorreu apenas entre as semanas (P < 0,05), com exceção da taxa de nitrificação..................................................... 98.

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(17) LISTA DE TABELAS Capítulo 2 Tabela 1. Sólidos suspensos totais (SST), turbidez, sólidos sedimentáveis (SS), transparência da água, sólidos suspensos voláteis (SSV) e fixos (SSF) em tanques de L. vannamei cultivado em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3.. .......................................................................................47 Tabela 2. Análise da correlação (r) entre sólidos suspensos totais (SST) x turbidez e sólidos suspensos totais (SST) x sólidos sedimentáveis (SS) em tanques de L. vannamei cultivado em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3.. .......................................................................................51 Tabela 3. Variáveis físicas e químicas da água em tanques de L. vannamei cultivado em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3.. .....................................................53 Tabela 4. Parâmetros associados à operação do sistema de cultivo de L. vannamei mantidos em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3.. .....................................................61 Tabela 5. Índices de produção em tanques de L. vannamei cultivado em três concentrações de SST durante 44 dias em densidade de 459 camarões m-3. † .....................................................................................64 Capítulo 3 Tabela 1. Quantidade de matéria seca e clorofila-a no perifiton em tanques de L. vannamei cultivados durante 34 dias em densidades de 238 e 473 camarões m-3 com substratos artificiais. ...............................99 Tabela 2. Parâmetros de qualidade de água e clorofila-a em tanques de L. vannamei cultivados por 34 dias em densidades de 238 e 473 camarões m-3 com e sem a adição de substratos artificiais para cada densidade.............................................................................101 Tabela 3. Índices de produção em tanques de L. vannamei cultivado por 34 dias em densidade de 238 e 473 camarões m-3 com e sem a adição de substratos artificiais para cada densidade.†.........................104.

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(19) SUMÁRIO CAPÍTULO 1 ........................................................................................ 23 INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................... 23 1. INTRODUÇÃO ................................................................................ 24 2. O CULTIVO DE CAMARÕES COM BIOFLOCOS....................... 26 3. JUSTIFICATIVA.............................................................................. 30 4. OBJETIVOS ..................................................................................... 31 4.1 Objetivo geral..................................................................................31 4.2 Objetivos específicos.......................................................................31 5. FORMATAÇÃO DOS ARTIGOS.................................................... 31 CAPÍTULO 2 ........................................................................................ 33 Cultivo superintensivo de Litopenaeus vannamei com bioflocos sob diferentes concentrações de sólidos suspensos totais e seus efeitos sobre a atividade microbiana, a qualidade de água e os índices de produção................................................................................................ 33 Resumo.................................................................................................. 34 1. Introdução ......................................................................................... 35 2. Materiais e métodos .......................................................................... 37 2.1 Material biológico ...........................................................................37 2.2 Delineamento experimental, unidades experimentais e manejo do sistema...................................................................................................38 2.3 Variáveis de qualidade de água .......................................................40 2.4 Clorofila-a e atividade microbiana ..................................................41 2.5 Parâmetros associados à operação do sistema de cultivo ................42 2.6 Análise centesimal dos bioflocos ....................................................42 2.7 Parâmetros hemato-imunológicos e análise das brânquias..............43 2.8 Índices de produção.........................................................................44 2.9 Análise estatística............................................................................44.

(20) 3. Resultados......................................................................................... 45 3.1 Sólidos suspensos totais, turbidez, sólidos sedimentáveis e transparência da água............................................................................ 46 3.2 Variáveis físicas e químicas da água............................................... 51 3.3 Clorofila-a (cla-a) e atividade microbiana ...................................... 57 3.4 Parâmetros associados à operação do sistema de cultivo................ 60 3.5 Análise centesimal dos bioflocos.................................................... 61 3.6 Parâmetros hemato-imunológicos e análise das brânquias ............. 62 3.7 Índices de produção ........................................................................ 63 4. Discussão .......................................................................................... 64 4.1 Sólidos suspensos totais, turbidez, sólidos sedimentáveis e transparência da água............................................................................ 64 4.2 Variáveis físicas e químicas da água, clorofila-a e atividade microbiana ............................................................................................ 66 4.3 Parâmetros associados à operação do sistema................................. 72 4.4 Análise centesimal dos bioflocos.................................................... 72 4.5 Parâmetros hemato-imunológicos e análise das brânquias ............. 73 4.6 Índices de produção ........................................................................ 74 5. Conclusões ........................................................................................ 76 Agradecimentos .................................................................................... 76 Referências............................................................................................ 77 CAPÍTULO 3........................................................................................ 85 Uso de substratos artificiais no cultivo de Litopenaeus vannamei com bioflocos em diferentes densidades de estocagem: efeitos sobre a atividade microbiana, a qualidade de água e os índices de produção................................................................................................ 85 Resumo ................................................................................................. 86 1. Introdução ......................................................................................... 87.

(21) 2. Materiais e métodos .......................................................................... 89 2.1 Material biológico ...........................................................................89 2.2 Delineamento experimental, unidades experimentais e manejo do sistema...................................................................................................90 2.3 Variáveis de qualidade de água .......................................................92 2.4 Clorofila-a na água e atividade microbiana na água e no substrato ................................................................................................93 2.5 Amostragem e análise do perifiton no substrato (matéria seca e cla-a)......................................................................................................94 2.6 Índices de produção.........................................................................94 2.7 Análise estatística............................................................................95 3. Resultados ......................................................................................... 96 3.1 Atividade microbiana (água e substrato), matéria seca e cla-a nos substratos...............................................................................................96 3.2 Parâmetros de qualidade de água e clorofila-a na água...................99 3.3 Índices de produção.......................................................................103 4. Discussão......................................................................................... 106 Agradecimentos................................................................................... 117 Referências.......................................................................................... 117 6. CONCLUSÕES GERAIS ............................................................... 126 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................... 128 8. REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO GERAL.............................. 129.

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(23) 23. CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO GERAL.

(24) 24. 1. INTRODUÇÃO Com uma taxa de crescimento médio de 6,6% ao ano, a aquicultura continua sendo o setor de produção animal que mais cresce no mundo (FAO, 2010). Em 2008, a produção mundial de pescados oriundos da aquicultura, incluindo peixes, crustáceos, moluscos e outros organismos aquáticos usados para consumo humano, alcançou 52,5 milhões de toneladas. Do total de pescados produzidos, 9,5% correspondeu à produção de crustáceos, que entre 2000 e 2008, cresceu a uma taxa anual média de quase 15%. Segundo os dados da FAO (2010), essa alta taxa de crescimento na produção de crustáceos esteve fortemente associada ao incremento no cultivo do camarão marinho Litopenaeus vannamei na China, Tailândia e Indonésia. O crescimento na produção de camarões nos países asiáticos, mesmo após o surgimento das doenças virais, está associado às mudanças realizadas na forma de cultivo. Alterações nas instalações e técnicas de cultivo foram necessárias para possibilitar a produção mesmo em áreas afetadas por doenças. A troca da espécie cultivada, antes Penaeus monodom e agora L. vannamei, foi uma das estratégias usadas pelos países produtores. Além disso, a aplicação de conceitos rígidos de biosseguridade no cultivo, redução da troca de água, aumento na densidade de estocagem, uso de larvas geneticamente selecionadas e livres de doenças específicas (Specific Pathogen Free - SPF), uso de tanques menores revestidos com geomembranas e aumento na taxa de aeração no cultivo foram outras mudanças que acompanharam a evolução do modelo de cultivo desses países (CHAMBERLAIN, 2010; NUNES; MADRID; ANDRADE, 2011). Ao contrário do bom momento por que passa a carcinicultura mundial, o cultivo de camarões no Brasil, já sob a égide de L. vannamei, vem confrontando desafios que tem afetado seu crescimento (ROCHA, 2007). Segundo esse autor, quando se compara o desempenho do setor entre 1997 e 2003 com o de 2003 a 2006, verifica-se que no primeiro período a produção cresceu de 3.600 t para 90.190 t; no segundo período, entretanto, ocorreu uma redução significativa na produção (-27,93%), recuando para 65.000 t. Entre 2007 e 2010, a produção de L. vannamei saiu de 65.000 t para 80.000 t (ROCHA, 2011). Os motivos para o limitado desempenho da carcinicultura nacional têm sido associados à desvalorização do dólar, queda de preços do camarão no mercado internacional e às manifestações de enfermidades virais como o vírus da mionecrose infecciosa (infectious myonecrosis virus - IMNV) e.

(25) 25. o vírus da mancha branca (white spot virus - WSV) (ROCHA, 2007; NUNES; MADRID; ANDRADE, 2011). Nos países da América do Sul e Central, o cultivo de camarões é tradicionalmente realizado em viveiros de terra e próximo de regiões costeiras (CHAMBERLAIN, 2010). Para assegurar a qualidade ambiental dos cultivos, a renovação da água dos viveiros tem sido a estratégia mais usada nas fazendas, entretanto, essa prática pode trazer riscos tanto para os cultivos quanto para o ambiente adjacente. Enquanto a água que é bombeada para os tanques pode servir como vetor de doenças (LIGHTNER, 2003), a água descartada do processo, além de poluir o ambiente costeiro (PÁEZ-OSUNA, 2001), pode ser uma fonte potencial de contaminação biológica para os ambientes naturais (HOROWITZ; HOROWITZ, 2002). Viveiros de terra ocupando grandes áreas e o controle da qualidade ambiental no cultivo realizado através da troca de água compõem o modelo de produção semi-intensivo de camarões adotado no Brasil (Figura 1A). Por não favorecer a adoção de medidas de biosseguridade, esse modelo de cultivo tem dificultado a implementação de medidas eficazes contra as doenças virais que atingem as fazendas. Atualmente, a exclusão viral, uma das medidas que fazem parte do conceito de biosseguridade, é aceita como a única ferramenta eficaz na prevenção dessas enfermidades em crustáceos (ALDAY-SANZ, 2010; NUNES; MADRID; ANDRADE, 2011). Entretanto, a exemplo dos países asiáticos, a aplicação de conceitos de biosseguridade em fazendas de engorda exige adaptações nas instalações e métodos de cultivo (MORIARTY; DECAMP, 2009; FEGAN; CLIFFORD, 2001). Diante das perdas econômicas que vêm sofrendo a carcinicultura mundial nos últimos anos devido às doenças virais e as críticas sofridas pelo setor com relação à questão ambiental, o desenvolvimento de novos modelos de cultivo que possam assegurar a sustentabilidade da atividade em longo prazo tornou-se fundamental e vem sendo objeto de pesquisas. Centros de pesquisas de diferentes países têm trabalhado no desenvolvimento de novas técnicas de cultivo que possibilitem maior biosseguridade e o uso mais racional da água. Nessa busca por novos modelos de produção, o sistema de cultivo com bioflocos tem sido apontado por pesquisadores como uma alternativa viável aos sistemas tradicionais, pois ocupa menor área de cultivo, usa menor volume de água e é mais biosseguro (HARGREAVES, 2006; SAMOCHA et al., 2007)..

(26) 26. 2. O CULTIVO DE CAMARÕES COM BIOFLOCOS Embora os camarões tolerem certo nível de intensificação no cultivo, o aumento da biomassa de camarões nos sistemas intensivos compromete a qualidade da água devido ao acúmulo de compostos tóxicos (AVNIMELECH, 2006). O controle da qualidade da água em sistemas intensivos com baixa renovação de água pode ser feito reciclando a água através de filtros biológicos externos ou através do tratamento da água no próprio tanque de cultivo, por meio de comunidades de algas e bactérias que se desenvolvem naturalmente na água (sistema de cultivo com bioflocos). A tecnologia de cultivo com bioflocos, Biofloc Technology BFT (CRAB et al., 2007), foi desenvolvida para controlar o acúmulo de compostos nitrogenados (amônia e nitrito) que podem ser tóxicos para os organismos cultivados (AVNIMELECH, 2004). Nesse sistema de cultivo, a absorção de nitrogênio pelas microalgas e a nitrificação pelas bactérias quimioautotróficas são os principais processos de ciclagem do nitrogênio (HARGREAVES, 1998). As bactérias heterotróficas também podem atuar como importantes agentes na retirada do nitrogênio inorgânico presente na água, mas esse processo vai depender da relação carbono:nitrogênio (C:N) do substrato orgânico disponível para as bactérias (GOLDMAN; CARON; DENNET, 1987). Essa divisão de competências entre as bactérias e microalgas no controle dos compostos nitrogenados torna o cultivo com bioflocos um sistema híbrido, onde diferentes grupos de micro-organismos vão interferir no metabolismo trófico (HARGREAVES, 2006). As principais características desse sistema de cultivo são alta densidade de estocagem, intensa aeração, baixa ou nenhuma renovação de água e elevada entrada de matéria orgânica (BROWDY et al., 2001). O cultivo com bioflocos tem sido realizado tanto em tanques de cultivo intensivo em ambiente aberto (TAW, 2010) quanto em ambientes isolados por estufas, onde os camarões são cultivados em densidades elevadas (SAMOCHA et al., 2011) (Figuras 1 B, C e D)..

(27) 27. A. B. C. D. E. F. Fig.1. A: Viveiro semi-intensivo de cultivo de camarões - Fazenda Camarões, Bahia (Foto: Rodrigo Schveitzer); B: tanque de cultivo intensivo de camarões com bioflocos revestido com geomembrana e alta taxa de aeração (Foto: Rodrigo Schveitzer); C e D: visão externa e interna de estufa para cultivo superintensivo de camarões com bioflocos - Texas Agrilife Research Mariculture Laboratory, Texas, EUA (Foto: Rodrigo Schveitzer); E: bioflocos sedimentados em cone de Imhoff (Foto: Rodrigo Schveitzer); F: substratos artificiais em tanques de cultivo superintensivo de camarões com bioflocos Waddel Mariculture Center, South Caroline, EUA (Foto: Dr. Craig L. Browdy).. Além de auxiliarem no controle da qualidade de água, os bioflocos formados (Fig. 1E) a partir dos resíduos gerados no tanque servem de alimento para os camarões (TACON et al., 2002; BURFORD et al., 2004). Esses bioflocos, que são agregados amorfos compostos por.

(28) 28. microalgas, bactérias, agregados de matéria orgânica particulada, protozoários e metazoários (CRAB et al., 2007) são fonte importante de nutrientes e suplementam a dieta das espécies cultivadas (VELASCO; LAWRENCE; NEILL, 1998; MCINTOSH, 2000; BROWDY et al., 2001; SAMOCHA; PATNAIK; GANDY, 2004). Aliado à redução do impacto ambiental aos ambientes adjacentes, o menor volume de água usado nos cultivos com bioflocos aumenta a biosseguridade do sistema já que diminui o risco de infecção microbiana através do uso de águas contaminadas (HOROWITZ; HOROWITZ, 2002). Pesquisas relatam o gasto de 160 L de água para produzir um kg de camarão no cultivo com bioflocos (OTOSHI et al., 2006a) contra 9.000 a 64.000 L nos sistemas convencionais (HOPKINS et al., 1993). Embora o sistema de cultivo com bioflocos venha sendo aplicado em alguns países, o fato de ser uma tecnologia nova faz com que existam ainda muitos aspectos a serem estudados. Nesse contexto, a definição do nível ideal de sólidos suspensos totais na água para o manejo do cultivo e o uso de substratos artificiais ainda não foram avaliados. Os bioflocos formados durante o cultivo são parte integrante do sistema de produção e uma das formas usada para quantificá-los é através da análise de sólidos suspensos totais - SST (AVNIMELECH, 2009), medida que determina a quantidade de material particulado presente na água (SCHRYVER et al., 2008). No cultivo com bioflocos a concentração de SST tende a ser alta, além das trocas de água reduzidas, a elevada entrada de matéria orgânica e as altas taxas de crescimento das bactérias heterotróficas (VAN WYK, 2006) contribuem para a elevação dos sólidos. Ebeling, Timmons e Bisogni (2006) afirmam que diferentemente dos sistemas intensivos usados na aquicultura, onde a liberação da amônia é o fator limitante depois do oxigênio, no cultivo com bioflocos os SST passam a ser, depois do oxigênio, o segundo fator limitante para aumentar a produtividade. Dessa forma, algum grau de remoção de sólidos é essencial para a manutenção do sistema estável e mais saudável para os organismos cultivados (VAN WYK, 2006). Diferentes pesquisadores têm alertado sobre a necessidade de definir limites de operação adequados para os sólidos no cultivo com bioflocos. As consequências de altas concentrações de sólidos são associadas a problemas de qualidade de água, mudança na composição de organismos que compõem os flocos e efeitos negativos sobre a saúde e o desempenho dos organismos cultivados (CRAB et al., 2007; EBELING; TIMMONS; BISOGNI, 2006; HARGREAVES, 2006; VAN WYK, 2006)..

(29) 29. O uso de substratos artificiais (Figura 1F) é uma das estratégias de manejo empregadas no cultivo de organismos aquáticos para reduzir custos operacionais e aumentar produtividade. Telas de polietileno e polipropileno, bambus, garrafas plásticas e produtos comerciais (AquamatsTM) vêm sendo usados como substratos em tanques de cultivo. Em experimentos com pós-larvas e juvenis de camarões marinhos, o uso de substratos é frequentemente associado ao melhor desempenho dos camarões (ARNOLD et al., 2009; ARNOLD et al., 2006; BALLESTER et al., 2007; BRATVOLD; BROWDY, 2001; MOSS; MOSS, 2004; OTOSHI et al., 2006a; THOMPSON et al., 2002; VIAU et al., 2012; ZHANG, 2011). No cultivo intensivo de camarões, os substratos têm sido usados na tentativa de mitigar os efeitos negativos do aumento na densidade de estocagem (ARNOLD et al., 2006). Abdussamad e Thampy (1994) sugerem que os substratos proporcionam superfície adicional para os camarões, que reduz a competição por espaço e as interações comportamentais negativas como o canibalismo. Além dos efeitos sugeridos sobre o comportamento dos camarões, o perifiton que cresce sobre os substratos auxilia no controle da qualidade de água (ARNOLD et al., 2009; AZIM et al., 2004; BRATVOLD; BROWDY, 2001; THOMPSON et al., 2002; VIAU et al., 2012) e serve de alimento natural para as espécies cultivadas (ABREU et al., 2007; ARNOLD et al., 2009; ARNOLD et al., 2006; BALLESTER et al., 2007; BURFORD et al., 2004; MOSS; MOSS, 2004; OTOSHI et al., 2006b; THOMPSON et al., 2002). Embora o uso dos substratos seja considerado benéfico para o cultivo de camarões, alguns trabalhos mostram que a sua presença nos tanques de cultivo não afetou o desempenho dos animais cultivados (KUMLU; EROLDOGAN; SAGLAMTIMUR, 2001; SAMOCHA; LAWRENCE; BIEDENBACH, 1993; SANDIFER; HOPKINS; STOKES, 1987) ou a qualidade de água (AUDELO-NARANJO et al., 2010; SAMOCHA; LAWRENCE; BIEDENBACH, 1993). Considerando a diversidade de condições experimentais em que os substratos têm sido testados, é possível que fatores como espécie cultivada, sistema de cultivo, densidade/biomassa de estocagem, quantidade de substrato, idade e origem das larvas possam interferir nos mecanismos de atuação dos substratos e nos seus efeitos sobre o cultivo. As pesquisas mostram que os substratos artificiais podem melhorar os índices zootécnicos e a qualidade de água no cultivo de camarões. Entretanto, nos cultivos superintensivos com bioflocos os microorganismos em suspensão na água são responsáveis pela ciclagem dos nutrientes, e as elevadas biomassas estocadas podem comprometer a.

(30) 30. eficiência dos substratos. Não foram encontradas pesquisas que avaliaram o papel dos substratos no cultivo com bioflocos e estudos com substratos em biomassas elevadas de camarões são escassos. 3. JUSTIFICATIVA Atualmente, o uso de tecnologias de produção mais limpas tornou-se uma exigência devido ao agravamento dos problemas ambientais associados às atividades produtivas. Na carcinicultura, além da questão ambiental, há ainda o risco sanitário associado ao uso indiscriminado da água nos cultivos, especialmente em regiões acometidas por doenças onde existe a possibilidade contaminação das fazendas. O sistema de cultivo com bioflocos surge como uma alternativa promissora aos sistemas tradicionais de cultivo de camarões, pois utiliza menores volumes de água e é biosseguro. Apesar de suas prerrogativas e de apresentar grandes perspectivas de aplicação, o seu uso em escala comercial é ainda limitado. Por ser um sistema de cultivo complexo e relativamente recente na aquicultura, informações importantes sobre o seu funcionamento precisam ser determinadas. Da mesma forma que para os sistemas convencionais de cultivo, onde existem procedimentos de manejo a serem seguidos para que o cultivo seja bem sucedido, é necessário determinar padrões de manejo para os cultivos com bioflocos. A avaliação de práticas de manejo mais adequadas e o estabelecimento de níveis críticos para parâmetros considerados limitantes ao desempenho do sistema são passos necessários para a consolidação dessa tecnologia. Considerando a natureza desse sistema de cultivo, onde a manutenção de sólidos suspensos na coluna d’água (bioflocos) é parte integrante do sistema, é importante que estratégias de manejo sejam determinadas a fim de estabelecer valores críticos para esse parâmetro. Da mesma maneira, apesar das pesquisas mostrarem os benefícios com o uso de substratos artificiais no cultivo de camarões, é necessário determinar a sua eficácia no cultivo com bioflocos, que apresenta características que podem interferir no seu desempenho. Os resultados obtidos a partir dessa pesquisa contribuem para o entendimento desses dois temas que são importantes para o manejo no cultivo com bioflocos e ainda não haviam sido investigados. Levando em conta o cenário atual da carcinicultura brasileira com relação às doenças, e a necessidade de informações que ajudem a consolidar novos modelos de produção alinhados com as demandas ambientais e sanitárias vigentes, as.

(31) 31. pesquisas desenvolvidas neste trabalho trazem informações de importante aplicabilidade. 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo geral Contribuir para o conhecimento e domínio do sistema de cultivo superintensivo de camarões com bioflocos com vistas à maior segurança e aumento da produtividade. 4.2 Objetivos específicos a) Determinar o efeito de diferentes concentrações de sólidos suspensos totais sobre a atividade microbiana, a qualidade de água e os índices de produção no cultivo superintensivo de L. vannamei com bioflocos (capítulo 2); b) Determinar o efeito da presença dos substratos artificiais sobre a atividade microbiana e a qualidade de água no cultivo de camarões com bioflocos (capítulo 3); c) Determinar o efeito da presença dos substratos artificiais sobre o desempenho de L. vannamei no cultivo com bioflocos e a relação desses efeitos com a densidade/biomassa de camarões (capítulo 3). 5. FORMATAÇÃO DOS ARTIGOS A tese está dividida em três capítulos. O primeiro é referente à introdução geral e os demais correspondem a dois artigos. O primeiro artigo está formatado segundo as normas da revista “Aquaculture” e o segundo de acordo com a revista “Aquacultural Engineering”..

(32) 32.

(33) 33. CAPÍTULO 2. Cultivo superintensivo de Litopenaeus vannamei com bioflocos sob diferentes concentrações de sólidos suspensos totais e seus efeitos sobre a atividade microbiana, a qualidade de água e os índices de produção. Rodrigo Schveitzer a,*, Rafael Arantes a, Patrícia F. S. Costódio b, Carlos M. E. Santo a, Luis Vinatea Arana a, Walter Quadros Seiffert a, Edemar Roberto Andreatta a a. Laboratório de Camarões Marinhos, Departamento de Aquicultura, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, SC, 88061-600, Brasil. b. Laboratório de Oceanografia Química, Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e do Mar, Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI), Itajaí, SC, 88302-202, Brasil *. Autor para correspondência: Laboratório de Camarões Marinhos, Servidão dos Coroas s/n (fundos), Barra da Lagoa, 88061-600, Florianópolis, SC, Brasil. Tel.:+55 48 37214118. E-mail: rschveitzer@hotmail.com (R. Schveitzer).. * Artigo formatado de acordo com as normas da revista “Aquaculture”.

(34) 34. Resumo Uma das formas usada para quantificar os bioflocos nos tanques de cultivo é a análise de sólidos suspensos totais (SST). Pesquisas que determinem níveis adequados de SST nos cultivos de camarões com bioflocos são escassas e apresentam limitações. O objetivo deste trabalho foi determinar o efeito de diferentes concentrações de sólidos suspensos totais sobre a atividade microbiana, a qualidade de água e os índices de produção no cultivo superintensivo de Litopenaeus vannamei com bioflocos. O experimento consistiu de três tratamentos caracterizados por diferentes concentrações de SST. T200: SST até 200 mg L-1, T400-600: SST entre 400 e 600 mg L-1, T800-1000: SST entre 800 e 1.000 mg L-1. As unidades experimentais foram tanques de 850 L e em cada unidade foi acoplado um tanque de decantação (40 L) para controlar os SST. Camarões de 6,8 g (Specific Pathogen Free) foram estocados em densidade de 459 camarões m-3 e cultivados durante 44 dias. Os resultados mostram que algum grau de remoção dos SST é benéfico para o sistema, mas concentrações muito baixas podem dificultar o manejo do cultivo. A redução dos SST para concentrações próximas de 200 mg L-1 diminuiu o tempo de residência celular bacteriana e removeu parcialmente as bactérias nitrificantes. Dessa forma, foi necessário aumentar a relação carbono:nitrogênio do substrato orgânico para controlar a amônia através da sua assimilação em biomassa bacteriana heterotrófica. A maior produção de bactérias heterotróficas no T200 aumentou a demanda de oxigênio dissolvido e esteve associada à maior variabilidade da amônia e nitrito. No cultivo com concentrações de SST acima de 400 mg L-1, o controle da amônia e nitrito foi realizado principalmente pelas bactérias nitrificantes, que promoveram maior estabilidade desses parâmetros e do oxigênio dissolvido. Outras variáveis de qualidade de água e de operação do sistema foram influenciadas pelo manejo dos sólidos e são discutidas. Diferenças na quantidade e na qualidade nutricional dos bioflocos não foram suficientes para afetar o ganho de peso dos camarões. Entretanto, a sobrevivência dos camarões e a produtividade do cultivo foram menores quando a concentração de SST esteve acima de 800 mg L-1. A análise das brânquias e a menor sobrevivência dos camarões no T8001000 revelou a intolerância dos camarões a ambientes com concentrações de sólidos acima de 800 mg L-1. Os resultados mostram que concentrações de SST entre 400 e 600 mg L-1 são mais indicadas para o cultivo superintensivo de L. vannamei, pois reúnem aspectos mais propícios à produtividade e estabilidade do sistema..

(35) 35. Palavras-chave: camarões, sólidos suspensos intensificação, nutrientes, micro-organismos.. totais,. biofloco,. 1. Introdução Embora os conceitos que suportam o sistema de cultivo conhecido como Biofloc Technology (BFT) estejam presentes em sistemas de produção que recebem outras denominações (Hargreaves, 2006), aqui optou-se por usar o termo proposto por Avnimelech (2007) cultivo com bioflocos. Resumidamente, o cultivo com bioflocos é um sistema de produção onde densas comunidades microbianas são manipuladas para controlar a amônia liberada principalmente pelos organismos cultivados. A amônia pode ser absorvida por microalgas, bactérias heterotróficas ou transformada por bactérias nitrificantes (Ebeling et al., 2006b). O crescimento desses organismos acontece principalmente na forma de flocos microbianos (bioflocos) que podem servir de alimento para as espécies cultivadas (Schryver et al., 2008). Além das algas e bactérias, agregados de matéria orgânica, protozoários, rotíferos e nematóides compõem os bioflocos (Avnimelech, 2009; Hargreaves, 2006). As principais características desse sistema de cultivo são alta densidade de estocagem, intensa aeração, baixa ou nenhuma renovação de água e elevada entrada de matéria orgânica (Browdy et al., 2001). Os bioflocos formados durante o cultivo são parte integrante do sistema de produção. Uma das formas usada para quantificá-los é através da análise de sólidos suspensos totais (Avnimelech, 2009), medida que determina a quantidade de material particulado presente na água (Schryver et al., 2008). Nos cultivos com bioflocos, a concentração de sólidos suspensos tende a ser alta, além das trocas de água reduzidas, a elevada entrada de matéria orgânica e as altas taxas de crescimento das bactérias heterotróficas (Van Wyk, 2006) contribuem para a elevação dos sólidos. Ebeling et al. (2006a) afirmam que diferentemente dos sistemas intensivos usados na aquicultura, onde a liberação da amônia é o fator limitante depois do oxigênio, nos cultivos com bioflocos os sólidos em suspensão passam a ser, após o oxigênio, o segundo fator limitante para aumentar a produtividade. Dessa forma, algum grau de remoção de sólidos é essencial para a manutenção do sistema estável e mais saudável para os organismos cultivados (Van Wyk, 2006). Diferentes pesquisadores têm alertado sobre a necessidade de definir limites de operação adequados para os sólidos no cultivo com bioflocos. As consequências de altas concentrações de sólidos são.

(36) 36. associadas a problemas de qualidade de água, mudança na composição de organismos que compões os flocos e efeitos negativos sobre a saúde e o desempenho dos organismos cultivados (Crab et al., 2007; Ebeling et al., 2006b; Hargreaves, 2006; Van Wyk, 2006). Recentemente, Vinatea et al. (2010) observaram que altos valores de sólidos suspensos voláteis (SSV) estão associados com redução no crescimento e pior conversão alimentar no cultivo superintensivo de Litopenaeus vannamei. Da mesma forma, Ray et al. (2010) relatam que o uso de decantadores durante o cultivo superintensivo de L. vannamei reduz a concentração de sólidos e melhora a qualidade de água e os índices zootécnicos. Em relação à qualidade de água, Van Wyk (2006) explica que o rápido crescimento das bactérias no cultivo com bioflocos leva a altas concentrações de sólidos na água dos tanques, as quais estão associadas com elevada demanda bioquímica de oxigênio, alta concentração de CO2 e baixo pH, tornando-se difícil manter condições ótimas de cultivo para os camarões. Atwood et al. (2004) já observaram os efeitos benéficos da remoção de sólidos da água. Esses autores testaram diferentes meios filtrantes em cultivos superintensivos de camarões e observaram que a filtração do excesso de partículas orgânicas na água estabilizou o pH e o oxigênio dissolvido. Além do ajuste da relação carbono:nitrogênio (C:N) do substrato orgânico, Van Wyk (2006) cita que a taxa de remoção de sólidos também pode interferir sobre qual componente da biota (grupos de bactérias/microalgas) será mais atuante no controle dos compostos nitrogenados. Da mesma forma, Ebeling et al. (2006b) mostram que em cultivos com alta relação C:N, a produção de bactérias heterotróficas é elevada e o uso de decantadores para reduzir os sólidos em suspensão pode remover as bactérias nitrificantes do sistema devido a sua menor taxa de crescimento. Portanto, a manutenção de baixas concentrações de sólidos na água dos tanques de cultivo pode remover as bactérias nitrificantes e comprometer o controle da amônia (Ebeling et al., 2006c). Valores elevados de sólidos também podem estar associados a problemas para a saúde da espécie cultivada. Avnimelech (2006) e Hargreaves (2006) relataram que pode haver diferentes tolerâncias das espécies à turbidez. Tanto os peixes quanto os camarões podem ter suas brânquias obstruídas pelo excesso de partículas na água, o que aumentaria a sensibilidade dos organismos à hipoxia. Segundo os autores, o efeito de elevadas concentrações de sólidos suspensos totais sobre peixes e camarões não é conhecido e concentrações mínimas e máximas de sólidos precisam ser estabelecidas para uma operação adequada..

(37) 37. Embora alguns trabalhos tenham observado os benefícios da remoção dos sólidos suspensos para o sistema (Ray et al., 2011; Ray et al., 2010; Vinatea et al., 2010), nenhum avaliou a exposição dos camarões por longos períodos sob concentrações controladas de sólidos. Nesses trabalhos, foram observadas relações entre o aumento ou a diminuição dos sólidos e a resposta do sistema em relação a essas mudanças. O efeito de se manter concentrações constantes de sólidos sobre a atividade microbiana e a qualidade de água ainda não foi estudado. Ainda, estudos testando uma ampla faixa de sólidos suspensos totais não foram realizados. Os trabalhos publicados sobre o tema mostram uma grande amplitude entre as faixas de sólidos que os cultivos com bioflocos têm sido operado. Valores de SST para cultivos intensivos e superintensivos de camarões têm variado de 150 mg L-1 até 1.300 mg L-1 (Atwood et al., 2004; Avnimelech, 2007; Burford et al., 2003; Ebeling et al., 2004; Ebeling et al., 2006a; Hopkins et al., 1993; Neal et al., 2010; Otoshi et al., 2009; Ray et al., 2010; Vinatea et al., 2010), demonstrando que ainda não existe um padrão definido para este parâmetro como ocorre com outras variáveis de qualidade de água. A proposta do presente estudo foi determinar o efeito de diferentes concentrações de sólidos suspensos totais sobre a atividade microbiana, a qualidade de água e os índices de produção no cultivo superintensivo de L. vannamei com bioflocos. 2. Materiais e métodos 2.1 Material biológico O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Camarões Marinhos da Universidade Federal de Santa Catarina, região Sul do Brasil. Pós-larvas (PLs10) Specific Pathogen Free (SpeedLine SPF) de L. vannamei foram adquiridas de um laboratório comercial (Aquatec Ltda, Canguaretama, RN, Brasil). As PLs foram cultivadas em um tanque circular de 50 m2 até atingirem peso médio de 0,16 g. A densidade de cultivo foi de 1.200 PLs m-2 (1.500 PLs m-3) e a salinidade da água de ~ 35. A água do cultivo foi preparada com a adição da microalga Chaetoceros muelleri. Durante o cultivo, melaço em pó foi adicionado ao tanque para manter a concentração de amônia em no máximo 1 mg L-1. O cálculo da quantidade de melaço seguiu a metodologia descrita em Avnimelech (1999). O teor proteico da ração usada variou de 45 a 40% de proteína bruta. Não houve renovação de água durante o cultivo..

(38) 38. Posteriormente, os camarões foram transferidos para um tanque circular de 50 m2 (tanque matriz) equipado com tanque de decantação de sólidos, sistema de aquecimento e aeração. Os camarões foram cultivados até ~ 7,0 g em densidade de 480 camarões m-2 (600 camarões m-3) (sistema de cultivo com bioflocos sem renovação de água). A preparação da água para receber os camarões durou oito dias e foi feita adicionando uma mistura de melaço em pó e ração (35% de proteína bruta) com uma relação carbono:nitrogênio (C:N) final de 12:1. A relação C:N foi calculada de acordo com Avnimelech (2009) considerando 50% de carbono na ração; 57,3% de carboidrato e 3,0% de proteína no melaço em pó. Para o cálculo do percentual de C do melaço foi considerado 40% de C sobre o percentual de carboidrato total (Ebeling et al., 2006). O equivalente a 25% do volume do tanque foi preenchido com a água oriunda do cultivo das PLs. A ração usada no cultivo teve percentual de proteína bruta variando entre 40 e 35%. Melaço em pó foi utilizado por 14 dias para fertilizar a água e auxiliar no controle da amônia, hidróxido de cálcio foi usado para manter a alcalinidade acima de 120 mg L-1. A concentração de amônia (Namônia total) foi mantida abaixo de 1 mg L-1, o oxigênio dissolvido acima de 6 mg L-1, os sólidos suspensos totais em ~ 400 mg L-1 e a salinidade da água em ~ 32. 2.2 Delineamento experimental, unidades experimentais e manejo do sistema O experimento consistiu em cultivar os camarões sob diferentes concentrações de sólidos suspensos totais (SST) na água. Foram estabelecidas três concentrações de SST para cada tratamento (variável independente): Tratamento T200: SST mantido em até 200 mg L-1; Tratamento T400-600: SST mantido entre 400 e 600 mg L-1; Tratamento T800-1000: SST mantido entre 800 e 1.000 mg L-1. As unidades experimentais foram distribuídas aleatoriamente em um delineamento experimental unifatorial, inteiramente casualizado, com quatro repetições, totalizando 12 unidades experimentais (3 x 4). As unidades experimentais consistiram de tanques circulares de fibra de vidro com volume de 850 L e área de fundo de 1,0 m2. Um anel central de aeração (Aero-tubeTM) serviu para manter os sólidos em suspensão e a concentração de oxigênio em níveis adequados. A temperatura da água foi controlada por termostatos (29,0 - 30,0 ºC) e mantida por aquecedores de 1.000 W. Os tanques foram mantidos em uma sala isolada e receberam somente iluminação artificial. Cada tanque.

(39) 39. foi equipado com uma lâmpada de vapor metálico de 400 W e a intensidade luminosa, medida na superfície da água, foi mantida em ~ 9.500 lux (12/12 horas), similar a encontrada em cultivos superintensivos de camarões em estufas: 150 umol de fótons m-2 s-1 (Vinatea et al., 2010) e 13.000 lux (Tzachi Samocha, Texas AgriLife Laboratory, comunicação pessoal). As unidades foram povoadas com camarões oriundos do tanque matriz (item 2.1); durante a transferência dos camarões para os tanques experimentais foi realizada uma seleção por peso para diminuir a variabilidade de tamanho entre os animais. No total, 390 juvenis de L. vannamei com peso médio de 6,8 g foram estocados em cada tanque, representando uma densidade de 459 camarões m-3 (390 camarões m-2). A água usada nas unidades experimentais foi bombeada do tanque matriz um dia antes do povoamento dos camarões. Devido à concentração de SST no tanque matriz estar em ~ 400 mg L-1 no dia da transferência, foi necessário fazer o ajuste dos SST de acordo com os tratamentos. No T200, a remoção dos SST foi realizada por decantação nos próprios tanques experimentais, no T800-1000 foram adicionados os sólidos concentrados no tanque matriz. Os sólidos do tanque matriz foram concentrados em um tanque de decantação e o processo foi feito em etapas para evitar a queda de oxigênio nos sólidos concentrados. Durante o experimento, a concentração de SST nos tanques experimentais foi controlada através de tanques de decantação de sólidos com alimentação central, adaptado de Ray et al. (2010), com volume de 40 L e formato cilíndrico com fundo cônico. A frequência de operação dos decantadores esteve de acordo com a necessidade de remoção de sólidos em cada tratamento, a vazão de operação variou entre 54 e 72 L por hora. Os sólidos eram removidos dos decantadores diariamente, separados com o auxílio de um filtro geotextil (bag) com porosidade de 1,0 µm e quantificados. A água livre de sólidos foi reaproveitada no cultivo. A ração dos camarões (Guabi Potimar - 35% proteína bruta) foi fornecida a lanço três vezes ao dia e entre 5 e 10% da ração foi colocada em bandejas de checagem para avaliar o consumo e realizar os ajustes na quantidade oferecida. As bandejas foram confeccionadas de acordo com Wasielesky et al. (2006) e a sua checagem era feita duas horas após a alimentação. O limite máximo de concentração de amônia total (NAT) estabelecido foi de 1 mg L-1 e seu aumento foi controlado com adição de melaço de cana de açúcar em pó (57,3% de carboidrato; 3,0% de proteína) de acordo com Avnimelech (1999). Para o T200, após o aumento na concentração de amônia acima dos níveis pré-estabelecidos.

(40) 40. já nos primeiros dias de cultivo, a adição de melaço passou a ser constante e a quantidade foi estabelecida considerando uma perda teórica entre 50 e 75% do N da ração (Avnimelech, 1999, Ebeling et al., 2006b). A adição de hidróxido de cálcio no T400-600 e T800-1000 serviu para manter a alcalinidade acima de 120 mg L-1 e o pH superior a 7. A água não foi renovada durante o cultivo, houve apenas a reposição devido à perda por evaporação (adição de água doce). 2.3 Variáveis de qualidade de água O oxigênio dissolvido e a temperatura da água foram medidos duas vezes ao dia (oxímetro YSI 55). Como medida de segurança, durante as aplicações de melaço no T200 o consumo de oxigênio foi acompanhado a cada 15 minutos para garantir que os níveis de oxigênio não atingissem níveis letais para os camarões. O pH (pHmetro YSI modelo100), a turbidez (turbidímetro, princípio nefelométrico), a transparência da água (disco de Secchi), os sólidos suspensos totais (APHA, 1998 – 2540 D), os sólidos voláteis e fixos (APHA, 1998 – 2540 E) e os sólidos sedimentáveis (cone de Imhoff) foram analisados diariamente. Na análise dos sólidos suspensos totais (SST) foram utilizados microfiltros de fibra de vidro com porosidade de 0,6 µm (GF6 Macherey-Nagel) e para a análise do SST do lodo removido dos decantadores, as amostras foram diluídas em água destilada (90% de água e 10% de amostra). Os sólidos suspensos eram deixados sedimentar por 15 minutos para a leitura dos sólidos sedimentáveis em cone de Imhoff (Eaton et al., 1995, adaptado por Avnimelech, 2007). A salinidade da água (salinômetro digital YSI 30) foi monitorada duas vezes na semana e a alcalinidade (APHA, 1998 – 2320 B) três vezes por semana. A amônia (amônia total), nitrito, nitrato e ortofosfato foram analisados semanalmente no Laboratório de Oceanografia Química da Universidade do Vale do Itajaí. As amostras eram resfriadas e transportadas em recipiente fechado; o tempo entre a coleta e análise era de 2 horas. Para as análises, foi utilizado um espectrofotômetro Shimadzu UV-160A. As amostras foram previamente filtradas com microfiltros de acetato celulose com porosidade de 0,45 µm (Sartorius). As análises foram realizadas de acordo com Strickland e Parsons (1972) seguindo as orientações em APHA (1998)..

(41) 41. 2.4 Clorofila-a e atividade microbiana A concentração de clorofila-a (cla-a) foi usada como medida da biomassa fitoplanctônica. As análises foram feitas semanalmente em espectrofotômetro HACH – DR 5000 e seguiram a metodologia 10200 H da APHA (1998). A atividade microbiana na água dos tanques foi monitorada semanalmente de acordo com as metodologias propostas por Bratvold e Browdy (1998) e Vinatea et al. (2010). Produção primária bruta (PPB), produção líquida do ecossistema (PLE) e respiração da coluna d’água (bioflocos) foram medidas pelo método das garrafas clara e escura (Strickland, 1960) e os cálculos de acordo com Dodds e Cole (2007) e Staehr et al. (2011): Produção primária bruta (mg O2/L/h) = (O2 final da garrafa clara - O2 final da garrafa escura) / tempo (h) Produção líquida do ecossistema (mg O2/L/h) = (O2 final da garrafa clara – O2 inicial da garrafa clara) / tempo (h) Respiração (mg O2/L/h) = (O2 inicial da garrafa escura - O2 final da garrafa escura) / tempo (h) As análises foram realizadas incubando garrafas de DBO (300 ml) transparentes (produção primária) e escuras (respiração), todas as garrafas foram incubadas em duplicatas. As garrafas claras foram incubadas nos tanques do T200, 5 cm abaixo do nível da água. As garrafas escuras foram incubadas em um tanque separado mantido com a mesma temperatura dos tanques experimentais (entre 29,5 e 30,0 ºC). Para manter os flocos em suspensão no interior das garrafas durante a incubação, as garrafas foram agitadas manualmente a cada 20 minutos. A concentração inicial e final de oxigênio foi medida com oxímetro YSI 5100 através de sonda específica com auto-agitação para a medição de DBO. O tempo de incubação das garrafas variou entre 60 e 90 minutos. Para evitar a superestimação da taxa de respiração nos tanques do T200, o melaço era adicionado nos tanques com pelo menos três horas de intervalo das coletas das amostras de água. A taxa de nitrificação foi avaliada uma vez por semana usando o mesmo procedimento descrito para a produção primária e respiração e seguiu a metodologia proposta por Bratvold e Browdy (1998). As amostras, analisadas em duplicatas, foram enriquecidas com cloreto de.

(42) 42. amônio (2,5 mg L-1 de N-amoniacal) e incubadas na ausência e presença de 2,2 mg L-1 do inibidor N-allylthiourea (Sigma-Aldrich, 1-Alil-2Tiouréia 98%) (APHA, 2005). A taxa de nitrificação é expressa como % de respiração inibida, que é a diferença entre a concentração de oxigênio dissolvido na garrafa sem e com inibidor. 2.5 Parâmetros associados à operação do sistema de cultivo O tempo médio de residência celular (θc) e tempo de detenção hidráulica (θs), adaptados de Metcalf e Eddy (1991), e a quantidade de lodo removida em cada tratamento foram determinados pelas seguintes fórmulas: θc (dias) = [SSV médio do tratamento (g L-1) x Volume do tanque (L)] / SSV removido por dia (g dia-1). Onde: SSV removido por dia (g dia-1) = Total de SSV removidos (g) / dias de cultivo; Total de SSV removidos (g) = Volume total de lodo removido (L) x SSV do lodo removido (g L-1) θs (dias) = Volume do tanque (L) / Água adicionada por dia (L/dia). Onde: Água adicionada por dia (L/dia) = Volume total de água adicionado (L) / dias de cultivo Quantidade de lodo removida (g) = Volume total de lodo removido (L) x SST do lodo removido (g L-1) O θc também foi calculado semanalmente para o T200. Para isso, foram computadas as médias semanais de SSV e o SSV removido dos tanques em cada semana avaliada. 2.6 Análise centesimal dos bioflocos A análise centesimal dos bioflocos foi realizada no início e fim do experimento. A análise inicial, feita dois dias antes do início do experimento, consistiu de uma amostragem em triplicata no tanque matriz. As amostras no final do experimento foram realizadas no último dia de cultivo em cada unidade experimental. O procedimento de coleta e análise dos sólidos (bioflocos) consistiu em concentrá-los no decantador, depois as amostras foram centrifugadas em 6.000 rpm por 10 minutos e colocadas para secar em estufa a 42º C até peso constante. Todas as análises foram realizadas no Laboratório de Análises do.

(43) 43. Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos - UFSC e seguiram a metodologia da AOAC (2005). 2.7 Parâmetros hemato-imunológicos e análise das brânquias A análise dos parâmetros hemato-imunológicos dos camarões foi realizada no início (amostras coletadas no tanque matriz no dia do povoamento das unidades experimentais) e fim do experimento (um dia antes da despesca). Na análise inicial, foram coletados três pools com cinco camarões cada e na análise final foram dois pools com cinco camarões cada. Dos camarões coletados, um volume de 300 µL de hemolinfa foi obtido do sinus ventral com seringas estéreis de 1 mL, acopladas a agulhas 21G e previamente resfriadas a 4 °C para evitar a coagulação. Uma amostra de 10 µL da hemolinfa coletada foi fixada em 4% de formol/MAS (27 mM citrato de sódio, 336 mM NaCl, 115 mM glicose, 9 mM EDTA, pH 7,0) para contagem total de hemócitos (THC) e o restante da amostra foi deixado coagular a 4 °C. O coágulo foi congelado (-20 ºC) e descongelado (3x) para permitir a ruptura celular e liberação do conteúdo dos grânulos, centrifugado sob refrigeração de 4 °C repetidamente (2.000 x g por 10 min) e o sobrenadante ou soro aliquotado foi estocado a -20 oC para análises posteriores. A contagem total de hemócitos (THC) foi estimada em câmara de Neubauer e a concentração de proteínas totais do soro pelo método de Bradford (1976), utilizando soro albumina bovina (22%) como padrão. A atividade da enzima fenoloxidase (PO) foi determinada por colorimetria pela formação do pigmento DOPA-cromo, após a oxidação do substrato enzimático L-diidroxifenilalanina (L-DOPA, Sigma), em triplicata, seguindo metodologia de Söderhäll e Häll (1984). O grau de oclusão das brânquias foi analisado na primeira semana do cultivo e depois em intervalos de 15 dias. Aproximadamente 15 camarões foram analisados em cada amostragem. Segundo Clifford e Cook (2002), o sinal mais visível do comprometimento das brânquias é a mudança na coloração do tecido branquial. Utilizando a análise visual, Hopkins et al. (1993) estabeleceram três graus para classificar o grau de oclusão das brânquias dos camarões. No presente estudo, foi estabelecida uma metodologia que consistiu em dividir a câmara branquial dos camarões em quatro regiões onde cada uma ocupou 25% da área total. A partir dessa divisão, foram adotados os seguintes critérios de avaliação das brânquias – Limpa: nenhuma partícula visível; Pouco: qualquer nível de obstrução em até 25% da área; Médio:.