UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
INSTITUTO METR ´
OPOLE DIGITAL
PROGRAMA DE P ´
OS-GRADUAC
¸ ˜
AO EM BIOINFORM´
ATICA
DOUTORADO EM BIOINFORM´
ATICA
Clovis Ferreira dos Reis
An´
alise Baseada em Biologia de Sistemas de
Dados Transcricionais de C´
elulas Progenitoras
Neurais Humanas Tratadas com Chumbo
Natal - RN
2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
INSTITUTO METR ´
OPOLE DIGITAL
PROGRAMA DE P ´
OS-GRADUAC
¸ ˜
AO EM BIOINFORM´
ATICA
DOUTORADO EM BIOINFORM´
ATICA
Clovis Ferreira dos Reis
An´
alise Baseada em Biologia de Sistemas de Dados
Transcricionais de C´
elulas Progenitoras Neurais Humanas
Tratadas com Chumbo
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin – UFRN
Coorientador: Prof
a
. Dr
a
. Rita Maria Cunha de Almeida – UFRGS
Natal - RN
2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
INSTITUTO METR ´
OPOLE DIGITAL
PROGRAMA DE P ´
OS-GRADUAC
¸ ˜
AO EM BIOINFORM´
ATICA
DOUTORADO EM BIOINFORM´
ATICA
An´
alise Baseada em Biologia de Sistemas de Dados
Transcricionais de C´
elulas Progenitoras Neurais Humanas
Tratadas com Chumbo
Tese apresentada ao Programa de P´
os-gradua¸c˜
ao
em BioInform´
atica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte por Clovis Ferreira dos Reis como
parte dos requisitos para a obten¸c˜
ao do t´ıtulo de
Doutor em BioInform´
atica.
´
Area de concentra¸
c˜
ao: Bioinform´
atica
Linha de Pesquisa: Genˆ
omica
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Juliani S. Dalmolin
Coorientadora: Prof
a.
Dr
a.
Rita Maria C. de
Almeida
Natal, RN
2019
Reis, Clovis Ferreira dos.
Análise baseada em biologia de sistemas de dados
transcricionais de células progenitoras neurais humanas tratadas
com chumbo / Clovis Ferreira dos Reis. - 2019.
112f.: il.
Tese (Doutorado)-Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
Instituto Metrópole Digital, Programa de Pós-Graduação em
Bioinformática, Natal, 2019.
Orientador: Dr. Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin.
Coorientadora: Dra. Rita Maria Cunha de Almeida.
1. Exposição ao chumbo Tese. 2. Análise de transcriptoma
Tese. 3. Inferência de redes Tese. 4. Visualização de redes
-Tese. 5. Transcriptogramer - -Tese. I. Dalmolin, Rodrigo Juliani
Siqueira. II. Almeida, Rita Maria Cunha de. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 004:577
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Agradecimentos
Aos colegas do BioME pela convivˆ
encia;
Aos professores pelo conhecimento;
Aos colegas de pesquisa Iara, Raffael, Diego e Danilo pela colabora¸c˜
ao;
Aos orientadores Rodrigo e Rita pela inspira¸c˜
ao;
Aos meus irm˜
aos Jeane, Maristela, Celso, Jairo e Milene pelo afeto;
`
A Ivana, mesmo `
a distancia, pela companhia;
Aos meus filhos Junior, Victor e Larissa pelo meu legado;
Aos meus pais Euclydes e Maria das Gra¸cas pela existˆ
encia; e
Sum´
ario
Lista de ilustra¸
c˜
oes
. . . .
7
Lista de tabelas
. . . .
8
Introdu¸
c˜
ao
13
1
CONSIDERAC
¸ ˜
OES SOBRE O CHUMBO . . . 13
1.1
O chumbo como uma quest˜
ao de sa´
ude p´
ublica . . . 13
1.2
Efeitos neurot´
oxicos do chumbo . . . 15
1.3
O impacto sistˆ
emico do envenenamento por chumbo . . . 18
2
DIFERENCIAC
¸ ˜
AO CELULAR
. . . 20
2.1
Caracterizando a diferencia¸
c˜
ao neuronal em um transcriptoma . . . 21
3
AN ´
ALISE DO TRANSCRIPTOGRAMA . . . 24
3.1
O pacote transcriptogramer . . . 24
Justificativa
30
Objetivos
31
Artigo
33
Discuss˜
ao
44
Conclus˜
ao
53
REFERˆ
ENCIAS
. . . 54
APˆ
ENDICE A – MATERIAL SUPLEMENTAR DO ARTIGO . . . . 61
Lista de ilustra¸c˜
oes
Figura 1 – N´
umero de casos de intoxica¸c˜
ao por chumbo em crian¸cas (USA) . . . .
15
Figura 2 – Resumo de vias metab´
olicas afetadas pelo c´
alcio . . . .
18
Figura 3 – Modelo esquem´
atico dos efeitos induzidos na c´
elula . . . .
19
Figura 4 – Modelo esquem´
atico da diferencia¸c˜
ao neuronal.
. . . .
21
Figura 5 – Matriz PPI de exemplo. . . .
25
Figura 6 – Exemplo de ordenamento. . . .
25
Figura 7 – Exemplo de janela deslizante
. . . .
26
Figura 8 – Representa¸c˜
ao gr´
afica das m´
edias de DE . . . .
27
Figura 9 – Determina¸c˜
ao dos clusteres funcionais
. . . .
28
Figura 10 – Representa¸c˜
ao gr´
afica dos clusteres funcionais . . . .
28
Figura 11 – Rede hier´
arquica de termos de GO . . . .
29
Figura 12 – Intera¸c˜
ao Delta1/NOTCH1 . . . .
46
Lista de tabelas
Tabela 1 – Exemplo de enriquecimento de ontologias. . . .
29
Lista de S´ımbolos e Abrevia¸c˜
oes
A.C.
–
Antes de Cristo
CaM
–
Calmodulina
cAMP
–
Cyclic AMP
CaMK
–
CaM-kinases
CDC
–
US Center of Disease Control
CFM
–
Cost Function Minimizing
CNS
–
Sistema nervoso central (Central Nervous System)
DE
–
Express˜
ao Diferencial
EDTA
–
Acido etilenodiamino tetra-ac´
´
etico (Ethylenediamine tetraacetic acid)
ESC
–
Embryonic Stem Cells
ES-NP cells
–
Human embryonic-derived neural progenitor cells
Glu
–
Glutamato
GO
–
Gene Ontology
hCG
–
Gonadotrofina coriˆ
onica
Hb
–
Hemoglobina
HPT
–
Hipot´
alamo, Pituit´
aria, Test´ıculos
NGF
–
Nerve Growth Factor
NMDAR
–
Receptor N–methyl–D–aspartato
NPCs
–
C´
elulas progenitoras neurais humanas
PKC
–
Prote´ına Quinase C
PPI
–
Intera¸c˜
ao prote´ına prote´ına
T1
–
Time-Interval 1
T2
–
Time-Interval 2
Resumo
As consequˆ
encias do envenenamento por chumbo s˜
ao diversas e importantes na sa´
ude
humana uma vez que este metal pesado pode interagir com muitos sistemas orgˆ
anicos,
afetando principalmente o sistema nervoso, com implica¸c˜
oes graves e irrevers´ıveis do
neurodesenvolvimento, consolida¸c˜
ao de mem´
oria e processos de aprendizagem em crian¸cas.
Sua intera¸c˜
ao com componentes celulares d´
a-se de muitas formas, afetando prote´ınas de
liga¸c˜
ao a ´ıons, prote´ınas de sinaliza¸c˜
ao de transdu¸c˜
ao, canais iˆ
onicos transmembrana e
fatores de transcri¸c˜
ao. Apesar da sintomatologia da intoxica¸c˜
ao por chumbo j´
a ser bastante
conhecida, pouco ainda se sabe sobre seus efeitos sistˆ
emicos e sobre o seu impacto global
na modula¸c˜
ao da transcri¸c˜
ao de c´
elulas neuronais. A fim de investigar tais efeitos sob uma
´
otica de biologia de sistemas, aplicamos o pipeline do pacote transcriptogramer
R/Biocon-ductor com a finalidade de avaliar o perfil transcricional de c´
elulas progenitoras neurais
humanas (NPCs) tratadas com acetato de chumbo 30µM por 26 dias. Dotado de um
m´
etodo n˜
ao supervisionado, o algoritmo do transcriptogramer ´
e projetado para identificar,
em experimentos do tipo caso-controle, grupos de genes funcionalmente associados e
difer-encialmente expressos. Tal pipeline foi capaz de identificar onze clusteres diferdifer-encialmente
expressos entre os dias 3 e 11 do tratamento com chumbo. Destes, sete apresentaram
uma regula¸c˜
ao negativa de diversos sistemas celulares envolvidos na diferencia¸c˜
ao celular,
como organiza¸c˜
ao do citoesqueleto, RNA e bioss´ıntese de prote´ınas, caracterizados por
redes grandes e fortemente conectadas. Os quatro clusteres positivamente regulados
apresentaram n´
os esparsos e pouco conectados, principalmente relacionados a transcri¸c˜
ao,
transporte transmembrana e transdu¸c˜
ao de sinal. J´
a no per´ıodo subsequente, envolvendo
os dias 12 a 26 de tratamento, foi poss´ıvel observar uma altera¸c˜
ao maci¸ca do perfil de
transcri¸c˜
ao celular com interferˆ
encia em todas as camadas da regula¸c˜
ao da express˜
ao gˆ
enica.
Desta forma, nossos resultados sugerem que o chumbo induz modifica¸c˜
oes transcricionais
significativas nas NPCs que podem ser correlacionadas a danos e/ou adapta¸c˜
oes de diversos
sistemas, todos decorrentes da intoxica¸c˜
ao por este metal pesado, influenciando, assim, o
resultado final da diferencia¸c˜
ao das c´
elulas ES-NP.
Palavras-chaves:
exposi¸c˜
ao ao chumbo, transcriptogramer, RNA-Seq, an´
alise de
tran-scriptoma, time series, inferˆ
encia de redes, data integration, visualiza¸c˜
ao de redes.
Abstract
The consequences of lead poisoning are diverse and relevant to human health. Reaching all
organ systems, it mainly affects the nervous system, with severe and irreversible implications
of neurodevelopment, memory consolidation, and learning processes in children. They
interact with cellular components in many ways, affecting ion-binding proteins, transduction
signaling proteins, transmembrane ion channels, and transcription factors. If in one hand,
the symptoms of lead poisoning are well known, on the other hand, we have a lack of the
systemic effects and its impact on neuronal cell transcription modulation. In order to
investigate such effects from a systems biology perspective, we applied the transcriptogramer
R/Bioconductor package pipeline to evaluate the transcriptional profile of lead
acetate-treated human neural progenitor cells (NPCs) 30µM for 26 days. The transcriptogramer
algorithm is designed to identify functionally associated and differentially expressed gene
groups in case-control experiments in an unsupervised way. It was able to identify eleven
differentially expressed clusters between days 3 and 11 of the lead treatment. Of these,
seven presented negative regulation of several cellular systems involved in cell differentiation,
such as cytoskeleton organization, RNA and protein biosynthesis, characterized by large
and tightly connected networks. The four clusters that were positively regulated presented
sparse and poorly connected nodes, mainly related to transcription, transmembrane
transport, and signal transduction. In the subsequent period, involving days 12 to 26 of
treatment, it was possible to observe a massive alteration of the cellular transcription
profile with interference in all layers of gene expression regulation. Thus, our results
suggest that lead induces significant transcriptional modifications in NPCs which can be
correlated to damage and/or adaptations of various systems, all resulting from intoxication
by this heavy metal, thus influencing the result of ES-NP cell differentiation.
Key words:
lead (Pb) exposure, transcriptogramer, RNA-Seq, transcriptome analysis,
time series, network inference, data integration, network visualization.
13
1 Considera¸c˜
oes sobre o chumbo
O chumbo ´
e, provavelmente, um dos primeiros minerais que o homem veio a utilizar em
metalurgia, sendo o artefato mais antigo feito com este material datado em 4300–4000 A.C.
[1]. De s´ımbolo qu´ımico
P b, n´umero atˆomico 82 e massa atˆomica igual a 207,2 daltons ´e
classificado como metal pesado. ´
E o metal est´
avel de maior n´
umero atˆ
omico e o s´
etimo metal
mais denso, com densidade de 11, 34g/cm
3, atr´
as da platina, tungstˆ
enio, ouro, urˆ
anio, merc´
urio
e pal´
adio, sendo entre estes o mais abundante. Apresenta valˆ
encia vari´
avel, podendo assumir
as valˆ
encias 2 e 4 (P b
2+e
P b
4+, respectivamente).
Possui as seguintes caracter´ısticas f´ısico-qu´ımicas:
– Maleabilidade, podendo ser facilmente reduzido a lˆ
aminas finas;
– Ductibilidade, podendo deformar-se sem romper-se sob press˜
ao cisalhante;
– Baixa condutividade el´
etrica;
– Baixo ponto de fus˜
ao, tornando-se l´ıquido a 327,4
oC e;
– Altamente resistente `
a corros˜
ao.
Tais caracter´ısticas o tornam um material muito vers´
atil e de f´
acil manipula¸c˜
ao, fato este
que, aliado ao seu baixo custo de produ¸c˜
ao e abundˆ
ancia, o tornam um insumo importante
em diversas ´
areas econˆ
omicas, sendo o quinto metal mais consumido pela ind´
ustria, superado
apenas pelo ferro, cobre, alum´ınio e o zinco [2]. Devido `
as suas caracter´ısticas isolantes e
de resistˆ
encia `
a oxida¸c˜
ao, ´
e largamente empregado na ind´
ustria el´
etrica, em acumuladores de
energia (baterias) e em forros para cabos el´
etricos. Possuindo elevada densidade, se presta
muito bem ao revestimento de ambientes como isolante ac´
ustico e eletromagn´
etico, assim
como blindagem contra radia¸c˜
oes de alta energia. Seu baixo ponto de fus˜
ao e capacidade
de associa¸c˜
ao com outros metais, permite o seu uso em soldas, fus´ıveis, ligas met´
alicas e na
tipografia tradicional. ´
E utilizado na ind´
ustria de tintas, vidros e cerˆ
amicas na composi¸c˜
ao de
diversos pigmentos, sendo os mais comuns os brancos, na forma de carbonatos e sulfatos de
chumbo, e o amarelo, na forma de cromato de chumbo. Al´
em disso, por ser um metal t´
oxico,
tamb´
em ´
e muito empregado como moluscicida na pintura de cascos de navios, como bactericida,
em especial para bact´
erias gram-positivas, e como fungicida. Desta forma, percebe-se que o
chumbo ´
e um metal muito presente em nosso dia-a-dia, apesar de sua severa toxicidade[2, 3].
1.1
O chumbo como uma quest˜
ao de sa´
ude p´
ublica
Cientes dos efeitos t´
oxicos e nocivos do chumbo sobre o organismo, autoridades ao redor
Considera¸
c˜
oes sobre o chumbo
14
contamina¸c˜
ao ambiental. A gest˜
ao de res´ıduos contaminados e a proibi¸c˜
ao do uso de aditivos `
a
base do metal nos combust´ıveis s˜
ao exemplos de medidas adotadas. Como consequˆ
encia, o uso
indiscriminado de chumbo foi reduzido significativamente nos pa´ıses industrializados. Entretanto,
alguns pa´ıses em desenvolvimento possuem, ainda hoje, legisla¸c˜
ao bastante permissiva ou
inexistente no tocante ao uso do elemento e controle de seus rejeitos. ´
E comum a utiliza¸c˜
ao de
chumbo em diversos produtos oriundos de tais pa´ıses, especialmente como compostos utilizados
em pl´
asticos, tintas, equipamentos eletrˆ
onicos e baterias.
Desta forma, ainda existe uma ampla gama de fontes de exposi¸c˜
ao ao chumbo, onde se
pode citar:
• Poeira de tinta de casas antigas;
• ´Agua proveniente de encanamentos
anti-gos;
• Cerˆamicas de baixa temperatura;
• Joias;
• Brinquedos;
• Rejeitos de mineradoras;
• Fundi¸c˜oes;
• Empresas de reciclagem de baterias de
autom´
oveis;
• Cosm´eticos;
• Medicamentos;
• Alimentos contaminados; etc.
Alguns grupos populacionais tamb´
em s˜
ao especialmente suscet´ıveis `
a contamina¸c˜
ao por
chumbo, devido `
as suas atividades, padr˜
oes comportamentais ou caracter´ısticas biol´
ogicas, onde
se destacam as crian¸cas, grupos ocupacionais, cujo trabalho os aproxima de fontes de chumbo
e popula¸c˜
oes desfavorecidas economicamente, cuja desnutri¸c˜
ao pode acelerar a absor¸c˜
ao do
metal [4].
Dentre todos os grupos de risco, o que mais causa preocupa¸c˜
ao ´
e o das crian¸cas, uma
vez que as altera¸c˜
oes neurol´
ogicas causadas durante o desenvolvimento do sistema nervoso
central (do inglˆ
es Central Nervous System – CNS) podem ser consideradas irrevers´ıveis [5].
Organiza¸c˜
oes mundiais como as Na¸c˜
oes Unidas e a World Health Organization, encontram-se
empenhadas na completa elimina¸c˜
ao do uso de chumbo como pigmento de tintas, considerado
hoje uma das principais causas da intoxica¸c˜
ao por chumbo em crian¸cas [6]. Apesar destes
esfor¸cos, dados recentes ainda mostram n´ıveis elevados de contamina¸c˜
ao confirmada em
crian¸cas com idade inferior a 72 meses nos Estados Unidos, pa´ıs que pode ser considerado
como padr˜
ao na regulamenta¸c˜
ao do uso do metal (Figura 1).
Uma vez que n˜
ao h´
a nenhuma fun¸c˜
ao conhecida desempenhada pelo chumbo na fisiologia
humana, nenhum n´ıvel de contamina¸c˜
ao pode ser considerado seguro. O n´ıvel m´
aximo para
“desencadeamento de a¸c˜
oes de combate `
a intoxica¸c˜
ao” ´
e de 5
µg/dL de sangue [8].
No Brasil, apesar de existir legisla¸c˜
ao sobre o uso e manuseio de rejeitos de produtos
contaminados por chumbo, esta encontra-se fragmentada dentro de diversas portarias e
resolu¸c˜
oes de ´
org˜
aos p´
ublicos, que tamb´
em tratam de contamina¸c˜
ao por diversos outros metais
Considera¸
c˜
oes sobre o chumbo
15
Figura 1 – N´
umero de casos confirmados de intoxica¸c˜
ao por chumbo em crian¸cas com
idade inferior a 72 meses ocorridos nos Estados Unidos entre os anos de 2012 e
2017. As linhas coloridas indicam os diferentes n´ıveis de contamina¸c˜
ao
medidos em
µg/dL de sangue.
Fonte: US Center of Disease Control (CDC) [7]
e substˆ
ancias t´
oxicas, n˜
ao existindo nem mesmo um n´ıvel m´
aximo de contamina¸c˜
ao por chumbo
que seja oficialmente aceito [9, 10, 11]. Tamb´
em n˜
ao h´
a dados oficiais sobre intoxica¸c˜
ao
por chumbo. As a¸c˜
oes de combate `
a contamina¸c˜
ao s˜
ao tomadas sob demanda e os casos
reportados em estudos s˜
ao, em sua maioria, decorrentes de acidentes ambientais ou da iniciativa
de institui¸c˜
oes de pesquisa [12, 13, 14].
1.2
Efeitos neurot´
oxicos do chumbo
O chumbo ´
e uma neurotoxina de efeito acumulativo e excre¸c˜
ao lenta, capaz de causar
danos irrevers´ıveis a diversos sistemas biol´
ogicos, depositando-se em tecidos como ossos, dentes
e sangue, com efeitos especialmente danosos ao sistema nervoso [5]. Quando armazenado em
ossos e dentes, pode ali permanecer por d´
ecadas, sendo paulatinamente liberado na corrente
sangu´ınea anos ap´
os os epis´
odios de intoxica¸c˜
ao. Adota-se internacionalmente o valor de
5µg/dL de sangue total como n´ıvel m´aximo aceit´avel para intoxica¸c˜ao por chumbo.
Uma vez inalado ou ingerido, ele ´
e rapidamente transportado `
a corrente sangu´ınea onde
ir´
a ligar-se `
a membrana e prote´ınas intracelulares de eritr´
ocitos. Apenas cerca de 3% de todo
chumbo absorvido permanecer´
a dilu´ıdo no plasma sangu´ıneo, permanecendo `
a disposi¸c˜
ao para
ser absorvido pelos demais tecidos do organismo [15, 16].
Este metal pesado pode acumular-se dentro das c´
elulas intoxicadas, tanto de forma
aguda como crˆ
onica, associando-se a prote´ınas celulares e formando estruturas intracelulares
denominadas corpos de inclus˜
ao (do inglˆ
es inclusion bodies). Tais estruturas podem ser
particularmente observadas nos tecidos renal e cerebral [17, 18, 19, 20]. Afetando diversos
Considera¸
c˜
oes sobre o chumbo
16
dos primeiros sintomas a aparecer em pessoas envenenadas por chumbo s˜
ao as c´
olicas, n´
auseas
e vˆ
omitos. No sistema renal, pode causar nefrite tubulointersticial. No sistema cardiovascular,
tem sido associado a les˜
oes card´ıacas, anormalidades eletrocardiogr´
aficas e aumento na press˜
ao
sangu´ınea. No sistema musculoesquel´
etico prejudica o desenvolvimento de ossos e dentes.
Estudos associam a esterilidade masculina a desordens no eixo HPT (Hipot´
alamo, Pituit´
aria,
Test´ıculos) causando, de forma ainda pouco conhecida, a redu¸c˜
ao da espermiogˆ
enese [21].
Tamb´
em atribui-se como prov´
avel causa da esterilidade feminina a natural afinidade que o
chumbo possui com a gonadotrofina coriˆ
onica (hCG ), ligando-se diretamente a ela, quando ir´
a
causar sua altera¸c˜
ao conformacional e consequente inativa¸c˜
ao [22]. Outro mecanismo bastante
conhecido d´
a-se pela substitui¸c˜
ao do ´ıon
Zn
2+por
P b
2+na prote´ına ALAD, impossibilitando
a s´ıntese Heme e, consequentemente, da hemoglobina (Hb), causando anemia no paciente
intoxicado [23].
Os efeitos da intoxica¸c˜
ao por
P b
2+s˜
ao particularmente danosos quando tal exposi¸c˜
ao
ocorre durante o desenvolvimento do CNS, j´
a que nestas condi¸c˜
oes tal sistema apresenta
uma maior capacidade de absor¸c˜
ao de nutrientes e micronutrientes. Associado a desordens
cognitivas graves em crian¸cas, s˜
ao comuns os casos de pacientes intoxicados que apresentam
dificuldade de aprendizado e de consolida¸c˜
ao da mem´
oria [23, 24, 25]. Mesmo quando em
baixas concentra¸c˜
oes, problemas como altera¸c˜
oes comportamentais, diminui¸c˜
ao da capacidade
intelectual e de concentra¸c˜
ao foram reportados[26].
1.2.1
Causas da severa toxicidade do chumbo
Atribui-se a severa toxicidade do chumbo a sua capacidade de mimetizar ´ıons de
Zn
2+e
Ca
2+. Estes dois metais participam de centenas de processos biol´
ogicos fundamentais `
a vida.
Desta forma, a sua substitui¸c˜
ao por chumbo acaba por causar um efeito t´
oxico generalizado
e sistˆ
emico, afetando in´
umeros componentes celulares com os quais tais ´ıons interagem e
interferindo em todas cascatas de sinaliza¸c˜
ao por eles reguladas.
O papel do
Zn
2+O zinco atua de forma direta ou indireta em in´
umeros sistemas celulares, que envolvem
desde divis˜
ao celular, s´ıntese de DNA e s´ıntese proteica at´
e a regula¸c˜
ao do sistema imunol´
ogico.
´
E associado a muitas patogˆ
eneses neuronais, tais como a doen¸ca de Alzheimer, doen¸ca de
Parkinson, esclerose lateral amiotr´
ofica, depress˜
ao e esquizofrenia, dentre outras [27, 28, 29].
Possui papel importante na sinaliza¸c˜
ao de
Ca
2+, uma vez que atua como bloqueador dos canais
de c´
alcio dependentes de voltagem [30]. Encontrado de forma abundante em tecido nervoso,
pode ser vinculado a terminais pr´
e-sin´
apticos, em especial em neurˆ
onios glutamat´
ergicos, onde
regula a excitabilidade neuronal e a plasticidade sin´
aptica. Tamb´
em ´
e associado a processos de
diferencia¸c˜
ao neuronal e diferencia¸c˜
ao morfol´
ogica de neurˆ
onios [27, 28, 29, 31].
Considera¸
c˜
oes sobre o chumbo
17
Desempenha papel fundamental na estabiliza¸c˜
ao da estrutura terci´
aria de uma fam´ılia de
prote´ınas denominadas zinc-fingers, compostas por dom´ınios compactos contendo
α h´elices
e folhas
β, cujas dobras e conforma¸c˜ao s˜ao mantidas pelo Zn
2+. Codificadas por cerca de
3% do genoma humano, estas prote´ınas participam de in´
umeros processos metab´
olicos, como
reconhecimento de DNA, empacotamento de RNA, ativa¸c˜
ao da transcri¸c˜
ao, montagem e
folding de prote´ınas, regula¸c˜
ao de apoptose, liga¸c˜
ao de lip´ıdios, etc. [23].
O papel do
Ca
2+Assim como o zinco, o c´
alcio participa direta ou indiretamente de quase todos os processos
metab´
olicos humanos, atuando como fator de regula¸c˜
ao na atua¸c˜
ao de diversas enzimas e
prote´ınas.
Uma das principais prote´ınas afetadas pelo c´
alcio ´
e a calmodulina (CaM), respons´
avel pela
modula¸c˜
ao de mais de 40 outras prote´ınas. Possuindo quatro s´ıtios de liga¸c˜
ao ao
Ca
2+, tem
sua conforma¸c˜
ao alterada em fun¸c˜
ao da abundˆ
ancia momentˆ
anea daquele ´ıon, permitindo
sua intera¸c˜
ao com grupos diferentes de prote´ınas[32]. Abundante no CNS de mam´ıferos, ´
e
geralmente encontrada em locais envolvidos com a neurotransmiss˜
ao, como nas membranas
p´
os-sin´
apticas, pr´
oximo `
a prote´ınas de densidade p´
os-sin´
aptica (do inglˆ
es postsynaptic density
– PSD) e a ves´ıculas sin´
apticas [33]. Dentre suas diferentes fun¸c˜
oes, pode-se destacar sua
participa¸c˜
ao no metabolismo de nucleot´ıdeos c´ıclicos, na regula¸c˜
ao de bombas
Ca
2+, transporte
de ´ıons, fosforila¸c˜
ao e desfosforila¸c˜
ao de prote´ınas, montagem e desmontagem de microt´
ubulos,
s´ıntese de neurotransmissores, em especial a noradrenalina e serotonina, al´
em da libera¸c˜
ao de
neurotransmissores.
Al´
em da CaM, outras prote´ınas dependentes de c´
alcio podem ser listadas como importantes
para o perfeito funcionamento do CNS. A prote´ına Quinase C (PKC) pode ser associada a
fun¸c˜
oes de controle do citoesqueleto de actina, de dinˆ
amica de crescimento de microt´
ubulos, no
controle da plasticidade sin´
aptica, onde regula os n´ıveis de receptores NMDAR p´
os-sin´
apticos,
podendo ser assim correlacionada de forma direta ou indireta a diversas fun¸c˜
oes de aprendizado
e cognitivas [34]. As CaM-kinases (CaMK) tˆ
em papel fundamental no desenvolvimento e
funcionamento do neurˆ
onio, seja pela sua fun¸c˜
ao na modula¸c˜
ao de microt´
ubulos, seja na sua
atua¸c˜
ao como fator ativo na potencializa¸c˜
ao sin´
aptica durante o aprendizado [35]. Por fim,
o AMP c´ıclico (do inglˆ
es Cyclic AMP – cAMP) pode tamb´
em ser citado, j´
a que participa
ativamente das cascatas de sinaliza¸c˜
ao que implicar˜
ao nos processos de crescimento axonal,
intera¸c˜
ao entre astr´
ocitos e neurˆ
onios, e na libera¸c˜
ao de neurotransmissores [33, 23]. Um
resumo das principais vias metab´
olicas envolvidas e suas respectivas fun¸c˜
oes relacionadas ao
CNS podem ser vistas na Figura 2.
Considera¸
c˜
oes sobre o chumbo
18
Figura 2 – Resumo de algumas vias metab´
olicas afetadas pelo c´
alcio e principais fun¸c˜
oes
do sistema nervoso central envolvidas.
1.3
O impacto sistˆemico do envenenamento por chumbo
Uma vez introduzido no organismo, o chumbo ir´
a causar impacto em diversos sistemas
metab´
olicos e em diferentes n´ıveis dentro de cada um destes sistemas, perturbando ou
im-pedindo o funcionamento de muitas prote´ınas e enzimas, bem como alterando todo equil´ıbrio
homeost´
atico iˆ
onico, podendo interferir nos seguintes processos, dentre outros:
• Diminuir a frequˆencia de abertura de canais associados a receptores de acetilcolina;
• Interferir em canais de c´alcio dependentes de voltagem, impedindo o seu correto
fun-cionamento e dificultando a entrada de c´
alcio no neurˆ
onio;
• Substituir ´ıons Ca
2+em metaloprote´ınas e receptores ionotr´
opicos, causando sua perda
de fun¸c˜
ao, impedindo a transdu¸c˜
ao c´
alcio-dependente e interrompendo cascatas de
sinaliza¸c˜
ao;
• Substituir o zinco como ligante nos zinc-fingers, alterando sua estrutura e interferindo
nos processos celulares por eles regulados;
Considera¸
c˜
oes sobre o chumbo
19
• Substitui o Zn
2+em receptores NMDAR em vias glutamat´
ergicas, conhecidos por serem
fortemente modulados por este ´ıon, causando inibi¸c˜
ao destes receptores e impedindo a
entrada dos ´ıons
Ca
2+;
• Causar estresse oxidativo, etc. [23]
Como consequˆ
encia, uma diversa gama de sistemas metab´
olicos acabam por ser
compro-metidos, afetando processos neuronais que envolvem desde a express˜
ao gˆ
enica at´
e a libera¸c˜
ao
de neurotransmissores, com consequˆ
encias diretas sobre a capacidade de aten¸c˜
ao, mem´
oria e
aprendizado.
Desta forma, o chumbo acaba por interferir, direta ou indiretamente, em in´
umeros processos
celulares e afeta de forma sistˆ
emica e global processos fundamentais ao bom funcionamento
das c´
elulas. Um modelo esquem´
atico das poss´ıveis intera¸c˜
oes do chumbo com os diversos
sistemas celulares pode ser visto na Figura 3.
SP1 Núcleo Aminolevulinato Desidratase Sintese Heme Mitocondria Calmodulina Proliferação Celular Anemia 5-Nucleotidase Metaloproteínas Estresse Oxidativo Reparo de DNA Estresse Oxidativo Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1 Protamina P2 Mime
tiza ions de calci
o
Proteina Quinase C
Mime tiza ions de calci
o Proteção e Concensação da Cromatina Canais de Cálcio Despolarização de Membrana
O
Adenilato Ciclase Neurotransmissores e hormôniosO O
Pb
2+ Legenda: Estimulação Inibição Ligação EGR-1 Diferenciação Celular Glutationa Glutationa Reductase Glutationa Peroxidase Glutataiona Sintetase Perda de Função Receptores ionotrópicos Ft Transcrição Zinc Fingers Transdução Cálcio DependenteFigura 3 – Modelo esquem´
atico dos efeitos induzidos na c´
elula pela intoxica¸c˜
ao por
20
2 Diferencia¸c˜
ao celular
O processo de diferencia¸c˜
ao celular ocorre em diversas fases sucessivas, onde c´
elulas
n˜
ao especialistas diferenciam-se em c´
elulas cada vez mais especializadas, que ir˜
ao formar os
diferentes tecidos encontrados em organismos complexos. O primeiro tipo de c´
elulas nesta
cadeia de diferencia¸c˜
ao s˜
ao as c´
elulas-tronco totipotentes, as quais podem se diferenciar
em qualquer outro tipo de c´
elulas, incluindo-se a´ı c´
elulas de tecidos extraembrion´
arios. S˜
ao
normalmente encontradas em tecidos embrion´
arios at´
e a fase de m´
orula e ir˜
ao diferenciar-se
em duas linhagens: trofectoderma e as c´
elulas-tronco pluripotentes. Estas ´
ultimas possuem o
potencial para diferenciarem-se em qualquer c´
elula fetal ou adulta.
Quando isoladas, podem ser adaptadas e propagadas in vitro neste estado n˜
ao diferenciado,
recebendo o nome de c´
elulas tronco embrion´
arias (do inglˆ
es embryonic stem cells - ESC).
Atrav´
es de protocolos adequados, tais c´
elulas podem ser diferenciadas em c´
elulas da endoderme,
mesoderme ou ectoderme, para, a seguir, tornarem-se c´
elulas progenitoras de tecidos espec´ıficos,
passando a ser classificadas como c´
elulas multipotentes, capazes de se diferenciar em um
n´
umero limitado de c´
elulas espec´ıficas.
As c´
elulas-tronco neurais s˜
ao um exemplo deste tipo de c´
elulas, sendo capazes de dar
origem a muitos, se n˜
ao todos, os tipos de c´
elulas gliais e neuronais do CNS [36]. Caso um
conjunto espec´ıfico de genes seja ativado neste momento, tais c´
elulas sofrem nova diferencia¸c˜
ao,
tornando-se c´
elulas progenitoras neurais (NPCs), perdendo a capacidade de diferenciarem-se
em c´
elulas da glia, podendo apenas se transformarem nos diversos tipos de neurˆ
onios. A Figura
4 ilustra todo este processo. As NPCs podem ser caracterizadas com base em sua localiza¸c˜
ao
Diferencia¸
c˜
ao celular
21
Figura 4 – Modelo esquem´
atico da diferencia¸c˜
ao neuronal a partir de c´
elulas-tronco
pluripotentes. Uma c´
elula pluripotente se especializa, diferenciando-se em uma
c´
elula-tronco neural multipotente, que possui a capacidade de diferenciar-se
em c´
elulas progenitoras gliais e neurais. Aquelas poder˜
ao se diferenciar em
diversos tipos de c´
elulas que ir˜
ao compor a glia e estas ´
ultimas poder˜
ao
diferenciar-se nos diversos tipos de neurˆ
onios. Os nomes em vermelho sobre a
c´
elula progenitora neural e sobre o neurˆ
onio indicam alguns dos genes que s˜
ao
caracteristicamente expressos nestes respectivos est´
agios da diferencia¸c˜
ao
celular.
2.1
Caracterizando a diferencia¸c˜
ao neuronal em um transcriptoma
A melhor forma de caracterizar a diferencia¸c˜
ao de NPCs em neurˆ
onios a partir de dados
tran-scricionais ´
e pela identifica¸c˜
ao do perfil de express˜
ao de genes espec´ıficos e caracter´ısticos destas
diversas fases, que atuar˜
ao como marcadores de tipo de especializa¸c˜
ao [37, 38]. Marcadores,
no caso em quest˜
ao, podem ser definidos como sendo genes que, devido `
as suas caracter´ısticas
de express˜
ao em fases espec´ıficas do desenvolvimento celular, podem ser utilizados para realizar
a an´
alise fenot´ıpica do est´
agio de diferencia¸c˜
ao celular. Assim, no presente trabalho, foram
empregados dois tipos distintos de marcadores: marcadores para NPCs e marcadores neuronais.
2.1.1
Genes marcadores de NPCs
Musashi1 (MSI1)
O MSI1 ´
e um gene cujos valores de express˜
ao se apresentam enriquecidos nas fases iniciais
do desenvolvimento do CNS. Sua elevada taxa de transcri¸c˜
ao ocorre durante o desenvolvimento
Diferencia¸
c˜
ao celular
22
e astr´
ocitos, mas nunca em neurˆ
onios ou oligodendr´
ocitos. Podem ainda ser encontrados
tra¸cos de sua express˜
ao em neurˆ
onios jovens, mas que v˜
ao desaparecendo conforme ocorre sua
matura¸c˜
ao [39].
Nestina (NES)
Inicialmente identificada em c´
elulas tronco neuroepiteliais de ratos, a Nestina ´
e um indicador
importante da neuroplasticidade das c´
elulas. A express˜
ao dos genes produtores de Nestina ´
e
encontrada em elevados n´ıveis em c´
elulas da glia radial, neurolem´
ocitos (c´
elulas de Schwann),
c´
elulas da crista neural, precursores de oligodendr´
ocitos, c´
elulas gliais de retina (c´
elulas de
M¨
uller) e NPCs, dentre outras c´
elulas em diferencia¸c˜
ao [40].
NOTCH1
Notch1 ´
e um gene que pode ser correlacionado `
a diferencia¸c˜
ao celular em diversos tecidos
cerebrais. Sua deficiˆ
encia durante os est´
agios iniciais de desenvolvimento do CNS pode levar `
a
falha de diferencia¸c˜
ao e `
a apoptose celular, especialmente em c´
elulas da glia. Existem ind´ıcios
que sugerem que muitos mecanismos de diferencia¸c˜
ao de c´
elulas tronco neurais, incluindo-se a´ı
as NPCs, s˜
ao controlados pelas rotas de sinaliza¸c˜
ao do Notch1 [41].
SOX1
Sox1 ´
e um membro da fam´ılia de fatores de transcri¸c˜
ao SoxB1 e sua express˜
ao est´
a
correlacionada aos passos iniciais da neurogˆ
enese. A express˜
ao for¸cada deste gene, provocada
in vitro, mostra expressivo aumento na taxa de gera¸c˜
ao de c´
elulas da neuroectoderme e de
neurˆ
onios [42].
2.1.2
Genes marcadores neuronais
Tirosina Hidroxilase (TH)
A TH ´
e uma enzima considerada cr´ıtica para o funcionamento de diversos tipos de neurˆ
onios,
como neurˆ
onios adren´
ergicos, noradren´
ergicos e, principalmente, neurˆ
onios dopamin´
ergicos.
Essencial na convers˜
ao da L-Tyrosina em L-DOPA, onde atua como catalizador, ´
e elemento
indispens´
avel na cascata que produzir´
a a dopamina, noradrenalina e adrenalina, sendo assim
elemento fundamental na caracteriza¸c˜
ao de atividade neuronal. Baixos n´ıveis de produ¸c˜
ao de
TH est˜
ao relacionadas a doen¸cas do CNS, especialmente o mal de Parkinson [43].
NEUROD6
Membro da subfam´ılia NEUROD, pertencente ao grupo dos fatores de transcri¸c˜
ao
Diferencia¸
c˜
ao celular
23
Seus elevados n´ıveis de express˜
ao est˜
ao associados ao desenvolvimento de neurˆ
onios maduros a
partir de neurˆ
onios imaturos, em especial os dopamin´
ergicos [44].
Doublecortina (DCX)
A doublecortina (DCX) ´
e uma fosfoprote´ına necess´
aria ao desenvolvimento dos microt´
ubulos.
´
E associada `
a diferencia¸c˜
ao neuronal, sendo expressa por ocasi˜
ao da migra¸c˜
ao de neurˆ
onios
no sistema nervoso central durante o seu desenvolvimento. ´
E considerada um marcador de
neurogˆ
enese, particularmente relacionada `
a gera¸c˜
ao de novos neurˆ
onios no gyrus dentatus do
hipocampo [45, 46].
RBFOX3
Codificada pelo gene RBFOX3, a Proteina Neuronal Nuclear (NeuN) ´
e comumente
encon-trada nos n´
ucleos e citoplasma perinuclear da maioria dos neurˆ
onios do CNS de mam´ıferos.
´
E frequentemente utilizada como um marcador neuronal devido a esta sua propriedade
lo-calizacional. Anticorpos monoclonais `
a prote´ına NeuN tˆ
em sido utilizados ativamente na
determina¸c˜
ao da existˆ
encia de diferencia¸c˜
ao neuronal e na avalia¸c˜
ao do estado funcional de
neurˆ
onios [47].
GAD1 e GAD2
Estes genes s˜
ao respons´
aveis pela codifica¸c˜
ao das formas 1 e 2 da descarboxilase do ´
acido
glutˆ
amico. Estas enzimas catalizam a produ¸c˜
ao de ´
acido gama-aminobut´ırico a partir do ´
acido
L-glutˆ
amico. Tamb´
em conhecidos como GAD67 e GAD65, respectivamente, estes genes, al´
em de
desempenhar fun¸c˜
oes no pˆ
ancreas, relacionando-os ao diabetes do tipo 1 (insulinodependente),
s˜
ao considerado marcadores de diferencia¸c˜
ao celular de neurˆ
onios GABA´
ergicos, estando sua
express˜
ao intimamente correlacionada com os n´ıveis de express˜
ao da TH neste tipo de neurˆ
onio
[48].
24
3 An´
alise do transcriptograma
3.1
O pacote transcriptogramer
Para realizar uma an´
alise sistˆ
emica do transcriptoma foi utilizado o pacote transcriptogramer
do R, desenvolvido pelo nosso grupo de trabalho. Ele presta-se a realizar uma an´
alise de
transcriptomas baseada em biologia de sistemas, que, em ´
ultima an´
alise, permite a identifica¸c˜
ao
de grupos funcionais de genes diferencialmente expressos em experimentos do tipo
caso-controle, pois provˆ
e ferramentas para cria¸c˜
ao de transcriptogramas, an´
alise topol´
ogica dos
dados, an´
alise de express˜
ao diferencial e de enriquecimento de ontologia de genes (GO) [49, 50].
O m´
etodo utiliza uma rede de intera¸c˜
ao prote´ına-prote´ına (PPI) extra´ıda do STRINGdb,
ordenada unidimensionalmente de acordo com a probabilidade de intera¸c˜
ao entre os diferentes
pares de prote´ınas.
3.1.1
Sequencia ordenada de genes
Conforme o m´
etodo descrito em [50], de posse da rede PPI, cria-se uma matriz sim´
etrica de
intera¸c˜
ao prote´ına-prote´ına de
N
× N elementos, onde posi¸c˜oes contendo o valor 1 representam
a intera¸c˜
ao entre duas prote´ınas quaisquer e 0 a inexistˆ
encia de intera¸c˜
ao, como pode ser visto
no exemplo da Figura 5(a). Calcula-se, ent˜
ao, o custo
E desta matriz aleat´oria utilizando-se
a equa¸c˜
ao 3.1, onde
d
ijrepresenta a distˆ
ancia dos diferentes pares de pontos da matriz em
rela¸c˜
ao `
a diagonal principal. Valores elevados de
d
ijrepresentam prote´ınas que interagem, mas
encontram-se em posi¸c˜
oes distantes na matriz. Assim, o desejado ´
e reorganizar as prote´ınas de
forma que esta nova ordem possua o menor custo, garantindo que prote´ınas com algum tipo
de intera¸c˜
ao encontrem-se o mais pr´
oximo poss´ıvel. Para tanto, o algoritmo Cost Function
Minimizing (CFM) toma duas prote´ınas aleatoriamente, troca-as de posi¸c˜
ao ( Figura 5(b)
) e calcula o novo custo
E
0. Caso este seja menor que o valor inicial, a mudan¸ca ´
e aceita.
Caso contr´
ario ela ´
e rejeitada. Nova troca aleat´
oria ´
e realizada at´
e que o valor de
E tenha se
estabilizado (Figura 5(c)).
E =
NX
i NX
jd
ij{|M
i,j− M
i+1,j| + |M
i,j− M
i−1,j| + |M
i,j− M
i,j+1| + |M
i,j− M
i,j−1|}
(3.1)
A Figura 6 representa uma matriz PPI de S. cerevisiae [50] antes e ap´
os o ordenamento.
Os clusteres observados pr´
oximos `
a diagonal principal assinalam regi˜
oes onde existem grande
intera¸c˜
ao entre prote´ınas vizinhas. Ao t´
ermino deste procedimento, obt´
em-se uma lista de
genes/prote´ınas, ordenadas pela similaridade de processos biol´
ogicos dos quais participam. Tal
An´
alise do transcriptograma
25
(a) Ordem aleat´
oria
(b) Troca aleat´
oria de posi¸
c˜
ao
(c) Ordenado
Figura 5 – Matriz PPI de exemplo. As letras representam prote´ınas e os n´
umeros 1
representam as intera¸c˜
oes entre elas. Prote´ınas que n˜
ao interagem entre si
recebem o valor 0 na c´
elula correspondente da matriz de adjacˆ
encia (omitido
na figura para fins de clareza). (a) Estado inicial da matriz em uma ordem
aleat´
oria qualquer. Neste estado ´
e calculado o custo inicial
E da matriz,
segundo a equa¸c˜
ao 3.1. (b) As prote´ınas B e J s˜
ao aleatoriamente escolhidas e
tem suas posi¸c˜
oes trocadas, sendo o novo custo
E
0calculado. (c) Estado final
do processo, onde
E se estabiliza em um valor m´ınimo.
(a) Matriz PPI em ordem aleat´
oria
(b) Matriz PPI ordenada
Figura 6 – (a) Exemplo de matriz PPI em uma ordem aleat´
oria. (b) A mesma matriz
ap´
os a aplica¸c˜
ao do algoritmo de ordena¸c˜
ao Cost Function Minimizing (CFM)
(figura adaptada de [50])
3.1.2
Express˜
ao diferencial (DE)
O pacote transcriptogramer realiza o c´
aculo da express˜
ao diferencial utilizando-se das
funcionalidades do pacote limma (Linear Models for Microarray Data [51]). Este ´
ultimo faz
An´
alise do transcriptograma
26
ou microarray, do tipo caso-controle com m´
ultiplas amostras. Em suma, o transcriptogramer
fornece ao pacote limma os valores de express˜
ao das diversas amostras dispon´ıveis e um vetor
l´
ogico, onde tais amostras s˜
ao identificadas como sendo caso ou controle, e obt´
em como
resultado valores de DE dos diversos genes/prote´ınas e um p-valor associado.
3.1.3
Valores m´
edios de express˜
ao – Janela deslizante
De posse da lista ordenada de prote´ınas e de seus valores de express˜
ao diferencial (microarray
ou RNA-seq) entre caso-controle, aplica-se uma janela deslizante de raio
R arbitr´ario, conforme
ilustrado na Figura 7(a). Os valores de express˜
ao diferencial encontrados sob a janela tem a
sua m´
edia calculada e esta passa a representar o valor de DE da posi¸c˜
ao central da janela.
Assim, tal valor pode ser interpretado como a DE de uma regi˜
ao do interatoma que envolve
um n´
umero de prote´ınas cont´ıguas igual a 2R + 1, j´a que prote´ınas encontradas em posi¸c˜oes
vizinhas tem afinidade funcional, garantida pelo ordenamento pr´
evio. A Figura 7(b) ilustra
a situa¸c˜
ao final do processo envolvendo a janela deslizante e a Figura 8, sua representa¸c˜
ao
gr´
afica.
Apesar de n˜
ao haver um tamanho determinado para o raio
R, o uso de valores entre 70 e
120 tem se mostrado adequado.
(a) Lista ordenada de prote´ınas e seus respectivos valores de express˜
ao
(b) Resultado final ap´
os a aplica¸
c˜
ao da janela deslizante
Figura 7 – Exemplo de lista ordenada de prote´ınas, com respectivos valores de express˜
ao
diferencial (DE), onde ser´
a aplicada uma janela deslizante de raio igual a 2.
(a) Os valores sob a janela tem sua m´
edia calculada e esta passa a ser o valor
de referˆ
encia de DE da posi¸c˜
ao central da janela. A janela ´
e ent˜
ao deslocada
para a direita e o processo se repete. (b) Situa¸c˜
ao final ap´
os a janela percorrer
An´
alise do transcriptograma
27
Figura 8 – Exemplo de representa¸c˜
ao gr´
afica das m´
edias de DE ap´
os o processo de janela
deslizante. O eixo dos X representa as posi¸c˜
oes da lista ordenada de prote´ınas.
O eixo dos Y representa os valores de DE dentro das diferentes janelas. A
linha horizontal preta representa os valores de express˜
ao de referˆ
encia do
controle e a linha cinza os valores m´
edios de express˜
ao do caso.
3.1.4
Clusteriza¸c˜
ao
De forma semelhante ao processo utilizado na obten¸c˜
ao dos valores m´
edios de DE por janela
deslizante, os clusteres funcionais considerados significativos s˜
ao obtidos pela utiliza¸c˜
ao de uma
janela de mesmo raio que ir´
a deslizar por sobre os p-valores obtidos do pacote limma. Um
cluster ir´
a crescer sempre que dentro da janela houver pelo menos dois p-valores menores que
um limiar predeterminado, sendo os limites de tal cluster estendido at´
e a posi¸c˜
ao do segundo
p-valor considerado significativo. A Figura 9 ilustra o processo onde uma janela deslizante de
raio 2 encontra dois p-valores menores que 0,01 nas posi¸c˜
oes 5 e 7 do ordenamento, estendendo
o cluster 1 at´
e aquela ´
ultima posi¸c˜
ao. A Figura 10 ilustra a representa¸c˜
ao gr´
afica dos clusteres
por sobre o gr´
afico de m´
edias de DE.
An´
alise do transcriptograma
28
Figura 9 – Exemplo de lista ordenada de prote´ınas, com respectivos p-valores de DE,
onde ser´
a aplicada uma janela deslizante de raio igual a 2 para determina¸c˜
ao
de clusteres significativos.
Figura 10 – Exemplo de representa¸c˜
ao gr´
afica das m´
edias de DE e dos clusteres funcionais
considerados significativos, identificados por cores.
3.1.5
Enriquecimento dos clusteres por gene ontology (GO)
O enriquecimento de GOs presentes dentro de cada cluster ´
e realizado tomando-se a rela¸c˜
ao
de genes/prote´ınas que participam de cada um dos clusteres identificados, apresentando-as ao
pacote topGO [52]. Como resultado, obt´
em-se uma lista de ontologias que foram consideradas
relevantes. A Tabela 1 ilustra um exemplo de resultado de algumas GOs consideradas relevantes
em um hipot´
etico cluster 3, onde podem ser identificados os ID das GOs, a descri¸c˜
ao de cada
termo e a significˆ
ancia do enriquecimento, representada pelo p-valor.
An´
alise do transcriptograma
29
Cluster
GO.ID
Term
Annotated
Significant
Expected
pValue
3
GO:0006811
ion transport
1299
46
17.73
2.93e-05
GO:0051259
protein complex oligomerization
445
17
6.07
1.83e-05
GO:0055085
transmembrane transport
1229
42
16.77
3.32e-04
Tabela 1 – Exemplo de enriquecimento de ontologias.
13.1.6
Rede hier´
arquica de termos de GO
A fim de facilitar a interpreta¸c˜
ao das GOs enriquecidas, desenvolvemos uma ferramenta
que constr´
oi um dendrograma contendo a hierarquia das ontologias de um determinado cluster.
Para tanto, ele calcula o ´ındice Jaccard de cada par de GOs criando uma matriz de adjacˆ
encia
utilizada na constru¸c˜
ao daquele dendrograma. Um exemplo desta rede hier´
arquica pode ser visto
na Figura 11. Esta fun¸c˜
ao estar´
a dispon´ıvel em vers˜
oes futuras do pacote transcriptogramer.
Figura 11 – Exemplo de uma rede hier´
arquica de termos de GO. Os tamanhos dos n´
os s˜
ao
proporcionais ao n´
umeros de genes associados `
a GO. As cores dos n´
os
representam a raz˜
ao normalizada entre o n´
umero de genes enriquecidos
presentes na GO pelo n´
umero total de genes associados a ela.
1
A coluna Cluster informa o identificador do cluster ao qual as GOs pertencem. A coluna GO.ID
mostra o identificador da GO que apresentou enriquecimento. A coluna Term exibe a descri¸
c˜
ao da GO.
A coluna Annotated informa o total de genes est˜
ao anotados na GO. A coluna Significant informa
a quantidade de genes pertencentes ao cluster que foram identificados na GO. A coluna Expected
informa a quantidade m´
axima de genes que seria esperada em uma distribui¸
c˜
ao aleat´
oria. E a coluna
30
Justificativa
O chumbo ´
e um insumo praticamente indispens´
avel `
a vida moderna. Seus efeitos nocivos
graves, cujos sintomas j´
a s˜
ao bem conhecidos, causam sequelas muitas vezes irrevers´ıveis `
a
sa´
ude humana, em especial ao sistema nervoso central, onde a exposi¸c˜
ao precoce em crian¸cas
leva a disfun¸c˜
oes neuronais permanentes com consequente defasagem no desenvolvimento
intelectual, aprendizagem e processos envolvendo mem´
oria. Ao longo de anos, diversos estudos
toxicol´
ogicos na ´
area foram levados a cabo e foram identificadas uma s´
erie de prote´ınas capazes
de interagir com o chumbo, cujas associa¸c˜
oes explicam alguns dos muitos sintomas observados.
Por´
em as an´
alises de tais intera¸c˜
oes ocorrem, via de regra, de forma estanque e isolada.
Apesar dos esfor¸cos e avan¸cos, nota-se que tais intera¸c˜
oes carecem de um olhar mais
abrangente, onde a funcionalidade de diversos componentes celulares possa ser observada como
um conjunto integrado. Assim, uma an´
alise sistˆ
emica dos efeitos do chumbo sobre a atividade
neuronal faz-se necess´
aria para um melhor entendimento da influˆ
encia deste metal pesado nas
diversas vias metab´
olicas e redes de intera¸c˜
ao, de forma que se possa ter uma compreens˜
ao
hol´ıstica dos processos envolvidos e da sintomatologia decorrente.
31
Objetivos
Objetivo geral
– Analisar o perfil transcricional de c´
elulas progenitoras neurais humanas (NPCs) tratadas
com acetato de chumbo, de forma a identificar, sob uma ´
otica sistˆ
emica, as poss´ıveis
consequˆ
encias da exposi¸c˜
ao ao chumbo de c´
elulas neurais em desenvolvimento.
Objetivos espec´ıficos
– Identificar marcadores que permitam caracterizar a diferencia¸c˜
ao de c´
elulas neuronais
nas amostras selecionadas;
– Identificar, em um esquema caso/controle, grupos diferencialmente expressos,
clusterizando-os por similaridade funcional, pela utiliza¸c˜
ao do pacote R/Bioconductor transcriptogramer ;
– Caracterizar as redes de intera¸c˜
ao prote´ına-prote´ına moduladas, baseadas nas anota¸c˜
oes
do Gene Ontology ;
– Analisar os padr˜
oes de express˜
ao diferencial encontrados, correlacionando-os com
Artigo:
Systems Biology-Based Analysis Indicates
Global Transcriptional Impairment in
Lead-Treated Human Neural Progenitor Cells
Autores: Clovis F. Reis, Iara Souza, Diego Arthur D. Morais, Raffael A. Oliveira, Danilo O.
Imparato, Rita M. De Almeida e Rodrigo J. Dalmolin
Artigo publicado em 10 de Setembro de 2019
Frontiers in Genetics
1 September 2019 | Volume 10 | Article 791
ORIGINAL RESEARCH
doi: 10.3389/fgene.2019.00791published: 10 September 2019
Frontiers in Genetics | www.frontiersin.org
Edited by:
Argyris Papantonis, University Medical Center Göttingen, Germany
Reviewed by:
Chiara Piubelli, Ospedale Sacro Cuore Don Calabria, Italy Marco Vanoni, University of Milano-Bicocca, Italy *Correspondence: Rodrigo J. S. Dalmolin rodrigo.dalmolin@imd.urfn.br
†These authors have contributed
equally to this work
Specialty section:
This article was submitted to Systems Biology, a section of the journal Frontiers in Genetics
Received: 26 March 2019 Accepted: 26 July 2019 Published: 10 September 2019 Citation:
Reis CF, de Souza ID, Morais DAA, Oliveira RAC, Imparato DO, de Almeida RMC and Dalmolin RJS (2019) Systems Biology-Based Analysis Indicates Global Transcriptional Impairment in Lead-Treated Human Neural Progenitor Cells. Front. Genet. 10:791. doi: 10.3389/fgene.201900791.
Systems Biology-Based Analysis
Indicates Global Transcriptional
Impairment in Lead-Treated Human
Neural Progenitor Cells
Clovis F. Reis
1†, Iara D. de Souza
1†, Diego A. A. Morais
1, Raffael A. C. Oliveira
1,
Danilo O. Imparato
1, Rita M. C. de Almeida
2and Rodrigo J. S. Dalmolin
1,3*
1 Bioinformatics Multidisciplinary Environment — IMD, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil, 2 Institute of
Physics and National Institute of Science and Technology: Complex Systems, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil, 3 Department of Biochemistry — CB, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
Lead poisoning effects are wide and include nervous system impairment, peculiarly
during development, leading to neural damage. Lead interaction with calcium and
zinc-containing metalloproteins broadly affects cellular metabolism since these proteins are
related to intracellular ion balance, activation of signaling transduction cascades, and gene
expression regulation. In spite of lead being recognized as a neurotoxin, there are gaps in
knowledge about the global effect of lead in modulating the transcription of entire cellular
systems in neural cells. In order to investigate the effects of lead poisoning in a systemic
perspective, we applied the transcriptogram methodology in an RNA-seq dataset of
human embryonic-derived neural progenitor cells (ES-NP cells) treated with 30 μM lead
acetate for 26 days. We observed early downregulation of several cellular systems involved
with cell differentiation, such as cytoskeleton organization, RNA, and protein biosynthesis.
The downregulated cellular systems presented big and tightly connected networks. For
long treatment times (12 to 26 days), it was possible to observe a massive impairment in
cell transcription profile. Taking the enriched terms together, we observed interference in
all layers of gene expression regulation, from chromatin remodeling to vesicle transport.
Considering that ES-NP cells are progenitor cells that can originate other neural cell
types, our results suggest that lead-induced gene expression disturbance might impair
cells’ ability to differentiate, therefore influencing ES-NP cells’ fate.
Keywords: lead exposure, lead poisoning, transcriptogramer, RNA-seq, transcriptome analysis, network inference, data integration, network visualization
