UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Centro de Desenvolvimento Tecnológico
TESE
Caracterização molecular de isolados de Mycobacterium bovis de rebanhos de diferentes
regiões do Brasil
Daniela Fernandes Ramos
Pelotas, 2012
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS NÚCLEO DE BIOTECNOLOGIA – CDTec
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Caracterização molecular de isolados de Mycobacterium bovis de rebanhos de diferentes regiões do Brasil
DANIELA FERNANDES RAMOS
Tese apresentada ao Curso de Pós- Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, sob orientação do Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin, como parte das exigências do programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, para a obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia.
PELOTAS
RIO GRANDE DO SUL – BRASIL NOVEMBRO, 2012
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS NÚCLEO DE BIOTECNOLOGIA – CDTec
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DANIELA FERNANDES RAMOS
Caracterização molecular de isolados de Mycobacterium bovis de rebanhos de diferentes regiões do Brasil
Tese apresentada ao Curso de Pós- Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, sob orientação do Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin, como parte das exigências do programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, para a obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin Co-Orientador: Prof. Dr. Pedro Eduardo A. da Silva
PELOTAS
RIO GRANDE DO SUL – BRASIL NOVEMBRO, 2012
Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB 10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
N371a Ramos, Daniela Fernandes
Caracterização molecular de isolados de Mycobacterium bovis de rebanhos de diferentes regiões do Brasil / Daniela Fernandes Ramos. – 108f. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico, 2012. – Orientador Odir Antônio Dellagostin; co-orientador Pedro Eduardo A. da Silva.
1.Biotecnologia. 2.Mycobacterium bovis. 3.Tuberculose.
4.Genotipagem. I.Dellagostin, Odir Antônio. II.Silva, Pedro Eduardo A. da Silva. III.Título.
CDD: 636.20896995
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Caracterização molecular de isolados de Mycobacterium bovis de rebanhos de diferentes regiões do Brasil
DANIELA FERNANDES RAMOS
Comitê de orientação:
Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin (Orientador)
Prof. Dr. Pedro Eduardo A. da Silva (Co-Orientador)
Comissão Julgadora:
Profa. Dra. Andrea Von Groll
Profa. Dra. Claudia Hartleben
Profa. Dra. Sibele Borsuk
Dedico este trabalho a Deus, de onde provenho toda a minha força e determinação para ter chegado ao término desta etapa que hoje de um sonho torna-se realização.
AGRADECIMENTOS
Embora uma tese seja, pela sua finalidade acadêmica, um trabalho individual, há contributos de natureza diversa que não podem e nem devem deixar de ser realçados. Por essa razão, registro meus agradecimentos a todos os que compartilharam o trilhar de mais esse caminho percorrido, contribuindo, direta e indiretamente, para que eu realizasse este trabalho, auxiliando-me e dando-me forças nos momentos em que mais precisei.
Obrigada à Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade de realizar o curso de Pós-Graduação.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin por me colocar o desafio de fazer essa tese de doutoramento, pela competência científica, pela oportunidade, orientação e confiança no desenvolvimento deste trabalho.
Meu especial agradecimento ao meu co-orientador Profº Dr. Pedro Eduardo Almeida da Silva por acreditar no meu trabalho e me incentivar a seguir em frente sempre, parafraseando, muitas vezes o grande poeta Antonio Machado quando dizia:
“Caminante, no hay camino, se hace camino al andar”. Obrigada pela amizade e por todas as experiências compartilhadas nestes anos todos que me fizeram, hoje, uma
“caminante”.
Para todos os docentes e funcionários do programa de pós-graduação e a todos os pesquisadores que colaboraram para o desenvolvimento deste trabalho que, de maneira direta ou indireta, contribuíram para o meu aprendizado ao longo da execução desta tese.
A todos os meus amigos do laboratório, meu estagiário e as técnicas Kátia e Michele, pelos momentos que juntos pudemos compartilhar e que foram de constante aprendizado.
Para todos os meus amigos da FURG que sempre estiveram torcendo por mim e acreditaram no meu potencial.
Para meus pais que estiveram sempre ao meu lado, acreditando nos meus ideais e possibilitando que os meus sonhos se tornassem realidade.
A toda a minha família que me apoiou nos momentos mais difíceis desta jornada, especialmente, à minha irmã Rafaela.
Aqueles que chegaram ao meio do trajeto mas somaram muitíssimo para que eu pudesse chegar ao final da jornada. Muito obrigada ao Vagner e sua família pelo apoio incondicional nesse tempo em que estiveram convivendo com essa vida de doutoranda. Obrigada principalmente pela paciência, pelo apoio e por todo amor que dedicas sempre por mim Vagner.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
Muito Obrigada!
“É melhor lançar-se à luta em busca do triunfo mesmo expondo-se ao insucesso, que formar fila com os pobres de espírito, que nem gozam muito nem sofrem muito; E vivem nessa penumbra cinzenta sem conhecer nem vitória nem derrota.” (Franklin Roosevelt)
RESUMO
RAMOS, Daniela F. Caracterização molecular de isolados de Mycobacterium bovis de rebanhos de diferentes regiões do Brasil. 2012. 108 f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A tuberculose bovina (BTB) causada pelo Mycobacterium bovis é uma doença infecto-contagiosa de caráter zoonótico que acomete principalmente bovinos e bubalinos, e causa prejuízos econômicos na produção de carne e leite em muitos países. No Brasil, os índices oficiais estão em 1,3% do rebanho nacional infectado, correspondendo a, aproximadamente, 2,5 milhões de animais. Visando contribuir para o controle da BTB, muitas técnicas moleculares vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de diferenciar isolados e estabelecer correlações epidemiológicas entre eles. Dentre essas técnicas, as mais usadas são o Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP), Polymorphic Guanine-cytosine-Rich Sequence [1], Spoligotyping [2], Mycobacterial Interspersed Repetitive Units - Variable Number of Tandem Repeat (MIRU-VNTR) e Exact Tandem Repeat [3]. O spoligotyping e MIRU- VNTR são, hoje, considerados métodos padrões de técnicas moleculares para tipagem de M. bovis. Ambas são técnicas baseadas em PCR que avaliam o polimorfismo do número de sequências repetidas presentes no genoma. Levando em conta que a caracterização molecular possibilita aumentar nosso conhecimento na epidemiologia do M. bovis e no controle da tuberculose, este trabalho teve como objetivo a caracterização molecular de isolados de M. bovis da região norte e sul do Brasil, através do isolamento do agente, identificação de M. bovis pela amplificação da região RD7 por PCR Multiplex e genotipagem usando as técnicas de spoligotyping, MIRU-VNTR e ETR. Foram coletadas 99 linfonodos de bovinos de corte da região norte e 162 de bovinos de leite da região sul do Brasil, sendo que apenas 10 amostras foram positivas para M. bovis no norte e 85 na região sul.
Através da análise molecular da combinação de spoligotyping e VNTR foi possível identificar diferentes padrões genotípicos nas regiões estudas demonstrando a diversidade genética de M. bovis no nosso país.
Palavras-chave: Mycobacterium bovis, tuberculose, genotipagem.
ABSTRACT
RAMOS, DANIELA F. Molecular characterization of Mycobacterium bovis isolates from cattle from different regions of Brazil. 2012. 108 f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Bovine tuberculosis (BTB) caused by Mycobacterium bovis is an infectious disease of zoonotic which mainly affects cattle and buffaloes, and cause economic losses in the production of meat and milk in many countries. In Brazil, the official rates are at 1.3%
of the national herd infected, corresponding to approximately 2.5 million animals. To contribute to the control of BTB, many molecular techniques have been developed in order to differentiate isolates and establish epidemiological correlations between them. Among these techniques, the most used are the Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP), Polymorphic Guanine-cytosine-Rich Sequence [1], Spoligotyping [2], Mycobacterial Interspersed Repetitive Units - Variable Number of Tandem Repeat (MIRU-VNTR) and Exact Tandem Repeat [3]. The spoligotyping and MIRU-VNTR are today considered standard methods of molecular techniques for typing of M. bovis. Both are based on PCR techniques that evaluate polymorphism in the number of repeat sequences present in the genome. Taking into account that the molecular characterization enables to increase our knowledge on the epidemiology of M. bovis and in tuberculosis control, this study aimed at the molecular characterization of isolates of M. bovis in the north and south of the Brazil, by isolating agent, identification of M. bovis by amplification of the region RD7 Multiplex PCR and genotyping using the techniques of spoligotyping, MIRU-VNTR and ETR.
Nine-nine lymph nodes were collected from beef cattle in the north of the region and 162 dairy cattle in southern Brazil, and only 10 samples were positive for M. bovis in the north and 85 in the south region. Through analysis of molecular combination of spoligotyping and VNTR was possible to identify different genotypic patterns in the regions studied demonstrating the genetic diversity of M. bovis in our country.
Keywords: Mycobacterium bovis, tuberculosis, genotyping.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ácido Desoxirribonucléico - DNA
Bacilo Álcool Ácido Resistente – BAAR
Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Derivado Protéico Purificado – PPD
Diretamente repetitiva – DR
Exatamente repetitiva em série – ETR Hipersensibilidade Tardia - DTH
Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição – RFLP
Programa Nacional de Controle e Erradicação de Brucelose e Tuberculose – PNCEBT
Reação em Cadeia da Polimerase – PCR Região de Diferenciação 7 – RD7
Repetição em Série de Número Variável – VNTR
Sequência Polimórfica Rica em Guanine-Citocina – PGRS Tuberculose Bovina – BTB
Unidades Repetitivas Interespaçadas de Micobactéria / Repetições em Série de Número Variável – MIRU-VNTR
Unidades Repetitivas Interespaçadas de Micobactéria– MIRU
SUMÁRIO
RESUMO ... 10
ABSTRACT ... 11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... 12
INTRODUÇÃO GERAL ... 14
ARTIGO 1. Molecular typing of Mycobacterium bovis isolates: a review ... 22
ARTIGO 2. Diagnosis of bovine tuberculosis: review of main techniques and applications ... 45
ARTIGO 3. Molecular typing of Mycobacterium bovis isolated in the South of Brazil 72 Abstract ... 74
References ... 81
ARTIGO 4. Spoligotyping and variable number tandem repeat analysis of Mycobacterium bovis isolates in from cattle in the North of Brazil ... 85
Abstract ... 87
Inroduction ... 88
Material and methods ... 90
Results and Discussion ... 93
Conclusion ... 95
References ... 96
CONCLUSÕES ... 105
REFERÊNCIAS ... 106
INTRODUÇÃO GERAL
A tuberculose bovina (BTB) permanece sendo um importante problema econômico na América Latina com consequências zoonóticas potenciais, isso porque, o Mycobacterium bovis, possui potencialidades patogênicas frente a um amplo espectro de hospedeiros, incluindo o homem. Isso, portanto, vem favorecer a sua distribuição mundial e, portanto, contribui para o aumento nos problemas de saúde pública e na agropecuária (O´Reilly & Daborn 1995; Phillips et al. 2003).
O M. bovis is a um bacilo álcool ácido resistente (BAAR) que pretence ao complexo Mycobacterium tuberculosis, o qual inclui M. tuberculosis, M. bovis, M.
bovis BCG, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canettii e Mycobacterium bovis sbsp. caprae (van Soolingen et al., 1997; Aranaz et al., 1999; Niemann et al., 2002). A proximidade genética das espécies do complexo M. tuberculosis pode ser verificada pelo alto grau de similaridade em nível de DNA e pela sequência 16s rRNA idêntica, mas diferem enormemente em termos de hospedeiro preferencial, características fenotípicas e patogenicidade (Brosch et al., 2002). Além disso, Brosch et al. (2002), propuseram uma via evolutiva para as micobactérias do complexo M. tuberculosis, baseada na perda de regiões cromossômicas e no polimorfismo de sequências de genes relacionados, tais como as regiões de diferenciação (RD).
A BTB pode causar uma grande diversidade de sinais clínicos, tanto em bovinos, como em seres humanos. Na maioria dos rebanhos infectados por M. bovis a doença é inaparente, e a sua presença somente é detectada pelo teste tuberculínico (Palmer & Waters 2006). As possíveis vias de entrada para a infecção
por M. bovis são respiratórias, alimentares, congênitas, cutâneas e venéreas, mas na prática, a infecção nos bovinos em geral é adquirida quase exclusivamente pela via aerógena, pela inalação de gotículas infectadas de tosse ou secreção nasal de um animal com tuberculose pulmonar ativa (Neill et al. 1994). A maior parte das lesões nos bovinos está nos pulmões, linfonodos pulmonares e linfonodos craniais, onde frequentemente a calcificação é importante (Palmer & Waters 2006).
A existência de um amplo número de hospedeiros para M. bovis propicia a distribuição global do patógeno e dificulta a implementação de programas para sua erradicação, conduzindo a graves problemas de saúde pública e na economia agropecuária (Phillips et al. 2003). Além disso, mais que 94% da população mundial vive em países que não adotam estratégias para conter a propagação do bacilo. Nos países em desenvolvimento, onde o controle sanitário é precário, o M. bovis é agente causal de cerca de 3,1% dos casos de tuberculose em humanos (Cosivi et al.
1998).
A infecção apresenta consequências significantes para a pecuária local, nacional e mundial (Neill et al. 1994). Portanto, o conhecimento da real situação epidemiológica da tuberculose por estados e regiões é de extrema importância já que permite escolher as melhores estratégias para o controle e erradicação da doença, pois essas podem diferir dependendo da frequência e padrão de distribuição nas subpopulações estudadas.
A importância econômica atribuída à tuberculose bovina está baseada nas perdas diretas e indiretas resultantes da morte de animais, da queda no ganho de peso, da diminuição da produção de leite, do descarte precoce, da eliminação de animais de alto valor zootécnico e da condenação de carcaças no abate. Estima-se
que os animais infectados percam de 10% a 25% de sua eficiência produtiva. Existe ainda a perda de prestígio e credibilidade da unidade de criação onde a doença é constatada (Lilenbaum et al. 1998; Brasil 2006).
Nos dias atuais, os índices são maiores nos países em desenvolvimento, por isso, vem sendo alvo de intensas campanhas de erradicação onde vários programas foram estabelecidos. O seu controle, no Brasil e em outros países onde a enfermidade é comum, baseia-se no método de “teste-e-abate”, onde todos os animais, rotineiramente, devem ser testados através de testes cutâneos com Derivado proteico purificado (PPD), e, caso sejam positivos, enviados para o abate e descarte das carcaças.
O Programa Nacional de Controle e Erradicação de Brucelose e Tuberculose (PNCETB), instituído em 2001, visa combater essas enfermidades, muito semelhantes, na população bovina e bubalina, diminuindo a incidência e prevalência dessas, a fim de minimizar as perdas econômicas e oferecer garantias de inocuidade dos alimentos, tanto carne como leite e derivados, ao consumo interno e aumentar a competitividade dos nossos produtos no mercado internacional. Os índices oficiais, no Brasil, estão em 1,3% do rebanho nacional infectado, que representaria um número elevado, na ordem de 2,5 milhões de animais. Acredita-se que ocorra uma subnotificação dos casos reativos que, aliados a um menor número de testes do que seria realmente necessário, contribuem para a inexatidão dos dados oficiais (Brasil 2006).
Portanto, a tuberculose causada por M. bovis apresenta importância para saúde e produção animal e, ainda, saúde pública. Mesmo com a necessidade de muitos estudos futuros, a renovação do interesse científico na tuberculose nos anos
recentes, devido à necessidade de desenvolvimento de métodos mais eficazes de diagnóstico, prevenção, controle e erradicação da tuberculose bovina, têm esclarecido lacunas significantes na compreensão da patogenia e epidemiologia da doença. A implantação de programas de controle e erradicação eficazes é de extrema importância para reduzir a prevalência e a incidência desta, em países onde a tuberculose é disseminada, como no Brasil, e, ainda, para reduzir os riscos de transmissão de animais para seres humanos.
A tipificação de isolados de M. bovis pode contribuir para o controle da tuberculose bovina, indicando possíveis relações epidemiológicas entre animais doentes, detectando e comprovando a ocorrência de surtos, e até, revelando casos de contaminação laboratorial cruzada entre amostras e o papel dos animais silvestres como reservatórios (Hilty et al. 2006). No Brasil há poucos relatos de tipificação de isolados de M. bovis (Rodriguez et al. 2004; Zanini et al. 2005;
Figueiredo et al. 2011). Estes estudos revelaram a ocorrência de uma elevada diversidade genética, porém foram realizados com um número limitado de isolados.
Há a necessidade de ampliação no número de isolados caracterizados, bem como da utilização de técnicas mais modernas e com maior poder discriminatório.
A associação de métodos moleculares, principalmente aqueles baseados em reações de PCR, tais como o spoligotying (Kamerbeek et al. 1997) e Variable Number Tandem Repeat (VNTR) têm proporcionado grande impulso nos estudos moleculares do complexo M. tuberculosis. Estes métodos, portanto, auxiliam na identificação e discriminação das espécies, possibilitando estabelecer uma relação epidemiológica entre elas (Supply et al. 1997; Frothingham & Meeker-O’Connell 1998; Supply et al. 2000). O spoligotying é baseado na amplificação enzimática do
locus DR do complexo M. tuberculosis, detectando a presença ou ausência de espaçadores presentes neste locus. Esta detecção é feita pela hibridação destes espaçadores à uma membrana, usando um minibloter (Kamerbeek et al. 1997).
Supply et al. (Supply et al. 1997; Supply et al. 2000) identificaram vários loci de VNTR presentes no genoma dos membros do complexo M. tuberculosis, que denominaram de Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit (MIRU). Os MIRUS são elementos do DNA de normalmente 40-100pb, encontrados como repetições em tandem e dispersos em regiões intergênicas dos genomas. Além destes, outros loci, foram identificados contendo repetições em tandem de sequências de DNA idênticas, denominados como Exact Tandem Repeat (ETR) (Roring et al. 2002). A tipificação pelo MIRU e pelo ETR detecta, através da verificação do tamanho dos produtos amplificados, o número de repetição dos loci (Supply et al. 2006).
A tipificação molecular de isolados de M. bovis pode ser aprimorada com o uso combinado de dois ou mais métodos, pois a habilidade de cada método diferenciar entre isolados pode variar com a população estudada. Portanto, sendo a tuberculose bovina uma doença de considerável relevância econômica e de saúde pública, estudos de caracterização molecular de isolados de M. bovis dos rebanhos no Brasil são de extrema importância, já que a genotipagem pode ser utilizada para melhor compreender a epidemiologia da tuberculose bovina em uma população.
Neste contexto, as hipóteses deste trabalho foram: há uma diversidade genotípica dos isolados de M. bovis em animais com tuberculose bovina abatidos em frigoríficos de diferentes regiões no Brasil e/ou o método de diagnóstico utilizado não permite identificar corretamente todos os casos de tuberculose em bovinos,
além de, não favorecer um traçado epidemiológico completo para ser utilizado no controle da enfermidade.
Assim foram traçados os seguintes objetivos: (1) Coletar, durante o abate no frigorífico, amostras de linfonodos com ou sem lesão característica de tuberculose bovina em diferentes regiões do Brasil; (2) Isolar e identificar molecularmente as cepas de M. bovis causadoras da enfermidade nos animais analisados; (3) Genotipar estes isolados através spoligotying e VNTR; (4) Identificar, através da genotipagem, a dinâmica da tuberculose bovina em duas regiões extremas do Brasil.
Inicialmente são apresentadas duas revisões bibliográficas: uma sobre os métodos de genotipagem de M. bovis (artigo 1), onde são descritas as técnicas e apresentadas suas potencialidades e limitações na caracterização molecular de isolados de M. bovis. Este artigo foi aceito para publicação no periódico Brazilian Journal of Microbiology. E, outra, sobre o diagnóstico da tuberculose bovina (artigo 2), onde abordamos os diferentes métodos de diagnóstico da tuberculose bovina numa perspectiva cronológica levando em consideração sua utilização em diferentes contextos. Este artigo será submetido ao periódico Ciência Rural.
O artigo 3 descreve a genotipagem de isolados oriundos da região sul do Brasil e envolve a análise epidemiológica dos isolados, e será submetido ao periódico Brazilian Journal of Microbiology. Já o artigo 4, que será submetido ao periódico The Veterinary Journal, teve como objetivo a identificação molecular de isolados de M. bovis isolados em animais oriundos da região norte do país, a fim de estabelecer relações epidemiológicas que possam auxiliar no entendimento da dinâmica da doença nessa região além de definir os genótipos mais frequentes
nessa região. Os artigos foram adaptados para a formatação exigida por cada um dos periódicos científicos para os quais serão submetidos.
ARTIGO 1. Molecular typing of Mycobacterium bovis isolates: a review
(Revisão aceita para publicação no periódico Brazilian Journal of Microbiology)
MOLECULAR TYPING OF Mycobacterium bovis ISOLATES: A REVIEW Daniela Fernandes Ramosa, Lucas Tavaresa, Pedro Eduardo Almeida da Silvab, Odir Antônio Dellagostina
a Laboratório de Vacinologia, Núcleo de Biotecnologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil.
b Laboratório de Micobactérias, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande, RS, Brazil.
ABSTRACT
Mycobacterium bovis is the main causative agent of animal tuberculosis (TB) and it may cause TB in humans. Molecular typing of M. bovis isolates provides precise epidemiological data on issues of inter- or intra-herd transmission and wildlife reservoirs. Techniques used for typing M. bovis have evolved over the last two decades, and PCR-based methods such as spoligotyping and mycobacterial interspersed repetitive unit–variable number tandem repeat (MIRU–VNTR) have been extensively used. These techniques can provide epidemiological information about isolates of M. Bovis that may help control bovine TB by indicating possible links between diseased animals, detecting and sampling outbreaks, and even demonstrating cases of laboratory cross-contamination between samples. This review will focus on techniques used for the molecular typing of M. bovis and discuss their general aspects and applications.
KEYWORDS: tuberculosis, diagnosis, genotyping, Mycobacterium bovis Introduction
Bovine tuberculosis (BTB) has been detected in cattle throughout the world.
According to disease timelines available in the Worldwide Animal Health Information Database [34], 109 countries reported the presence of Mycobacterium bovis infections and/or clinical diseases in their cattle herds at some time in 2005–2010. In developed countries that have a tradition of cattle farming, the prevalence of BTB has reached very low levels because of strict control policies. In several of these countries, the disease has been eradicated. Conversely, in developing countries,
despite recently implanted control measures, considerable economic losses consistently occur in regions such as Brazil and Argentina, where there is intense cattle breeding [43].
The first attempt to differentiate M. bovis isolates based on DNA sequence polymorphism was done by Collins and de Lisle in 1985 [11]. They performed restriction digestion and agarose gel electrophoresis of genomic DNA. Identification of insertion sequences in M. tuberculosis and M. bovis genomes led to the development of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) typing method [49], a technique still in use nowadays and it is the gold standard to samples with more than six IS6110. Knowledge of the genomic sequence of M. bovis and M.
tuberculosis has facilitated the development of high-throughput molecular typing techniques that allow greater insight into the epidemiology, evolution, and population structure of M. bovis. Polymorphic GC Repeat Sequence [39, 41], direct repeats (DR) regions [25], and variable number of tandem repeats (VNTR) [46] have all been exploited as typing methods.
These tools can help to determine the source of infection and outbreaks, understand the relationship between different outbreaks, and identify wild animal reservoir of M. bovis. In addition, they can provide insight into the risk factors for BTB transmission by allowing identification of the dynamics of this disease [8, 20, 61][4-6].
In this review, we describe the main techniques used for genotyping and their application in characterizing M. bovis isolates.
1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Strain differentiation by using RFLP analysis has proven to be a very useful tool for epidemiologic studies of tuberculosis. RFLP based on the presence of the insertion sequence IS6110 has been widely used as a genetic marker [35]. IS6110 fingerprinting via RFLP has been standardized by using PvuII as the restriction enzyme of choice to digest mycobacterial genomic DNA (Figure 1) [8, 23, 49]. After electrophoresis of digested DNA on agarose gel, Southern blotting is carried out.
Polymorphic banding patterns is revealed after hybridization by using a fragment of IS6110 as a probe [16, 49]. This insertion sequence is present in up to 20 copies in M. tuberculosis, thus enabling the application of IS6110-RFLP as the gold standard
genotyping technique for this organism. In contrast, only 1–5 copies of IS6110 are found in M. bovis, which limits the ability of this element to discriminate between different M. bovis strains [3, 4, 53, 54].
One additional limitation of the RFLP-based typing systems is that they require a well-grown culture for DNA extraction. The time lag between isolation of M. bovis from a clinical sample and the growth of a mycobacterial culture is often too long.
This problem can be circumvented with the use of several complementary biomarkers such as those based in the polymorphic IS6110 region, and by using direct repeats (DR) and polymorphic GC-rich repeat sequences as probes (PGRS) [14, 51]
Figure 1. Representation of the M. bovis chromosome with the IS6110 region (red), PvuII (arrow) restriction sites and the 245 bp (green) IS6110 probe used for Southern blotting, based on Barnes &
Cave 2003. Different banding patterns result from the number and position of IS6110 copies, as well as polymorphism in the adjacent region where the PvuII site is located. Different strains produce distinct banding patterns as shown in this example with strains A and B .
2. Polymorphic GC-Rich Repeat Sequence (PGRS)
The PGRS method is similar to standardized IS6110 fingerprinting in that it requires purified DNA for Southern blot hybridization and banding pattern analysis.
PGRS fingerprinting has proven to be useful for differentiating strains with fewer than 6 copies of IS6110 that could not readily be differentiated by IS6110 fingerprinting [52, 56].
The PGRS-based RFLP probe is the single most discriminatory of the probes currently available for M. bovis strain typing and can be present in up to 30 copies in members of the M. tuberculosis complex. PGRS is present in multiple copies interspersed throughout the genome and it exhibits a high level of polymorphism between unrelated isolates. However, the result of a PGRS DNA fingerprint is relatively complex because it contains many bands, making it potentially difficult to interpret. For the same reason, computer-assisted band analysis, particularly when the final image is less than ideal [33], can also be difficult.
3. Polymerase Chain Reaction (PCR) Based Techniques
Techniques based on DNA amplification via PCR, such as spoligotyping and MIRU–VNTR [9], have become tools for epidemiological studies of bovine tuberculosis transmission, and have given prominence to a modern field of research known as molecular epidemiology. The agility and speed in detecting M. bovis can be decisive in the choice of these methods, which differentiate the species and different isolates of the same species at the DNA level. Beyond the speed of detection, methods based in PCR techniques require less DNA and may be made directly from clinical samples.
3.1 Spoligotyping
Spoligotyping (from “spacer oligotyping”) is based on the direct repeat region (DR), a DNA polymorphism present in a particular chromosomal locus that was first described by Hermans et al (1991). This chromosomal region contains a large number of DRs of 36 bp each, interspersed with a spacer DNA of 35–41 bp in length.
When DR regions of several isolates are compared, it is observed that the order of the spacers is about the same in all isolates; however, deletions and insertions of
DRs occur (Figure 2). Polymorphisms in various isolates comprise the presence or absence of spacers of known sequence. This characteristic is used to determine genetic similarity among strains [28]. Spoligotyping can easily distinguish between M.
tuberculosis and M. bovis, can be used with DNA extracted from a bacterial culture as well as directly from a specimen, and has been used to identify the clonal nature of the isolates [33, 57, 60].
Figure 2 (A) Structure of the DR locus in the mycobacterial genome. Multiple DRs in the chromosomes of M. tuberculosis and M. bovis (depicted as rectangles) are interspersed with unique spacers varying in length from 35 to 41 bp. The (numbered) spacers used correspond to 37 spacers from M.
tuberculosis H37Rv and 6 from M. bovis BCG. The site of integration of insertion element IS6110 is depicted. (B) Principle of in vitro amplification of the DR region by using PCR. Any DR in the DR region may serve as a target for these primers; therefore, the amplified DNA is composed of a mixture of a large number of different-size fragments [26].
Spoligotyping is reportedly useful for identifying sources of infection, transmission of tuberculosis (TB) between species, and the stability of tuberculosis strains for long periods of time in closed populations, indicating that Mycobacterium is clonal [14]. In an ecological setting, spoligotyping is a rapid and inexpensive option that can be used to search for a relationship between strains [62]. Because strains of M. bovis from cattle usually contain few copies of IS6110, IS6110-RFLP is not the best method for distinguishing strains of M. bovis [2]. Spoligotyping has proven to be a practical and discriminatory method for large-scale studies of the epidemiology of M. bovis as well as for the differentiation of M. bovis from M. tuberculosis, because the former lacks spacers 39–43 [26]. Furthermore, there is an international database holding over 1900 spoligotype patterns from around the world [30].
The study of a new spacers microbead-based spoligotyping format provides an increase in discriminatory power and was shown to have a better sensitivity due to proper detection of some spacers that can be misinterpreted by the classical method, and a lower error rate due to automated interpretation and transcription [1, 59].
The main disadvantage of spoligotyping is that all genetic polymorphisms are restricted to a single genomic locus, the DR cluster, which limits the resolution. While having the advantages of being considerably faster and less labor-intensive than RFLP analysis, spoligotyping alone does not usually provide sufficient discrimination among strains of M. bovis to be used as a sole typing method, and is thus often combined with supplementary techniques [13, 14, 31, 39].
3.2 Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
Tandemly repeated sequences are dispersed by thousands of copies in virtually all higher eukaryote genomes. Loci with short sequence repeats of 1 ± 13 bp are generally referred to as microsatellites, and those with 10 ± 100 bp sequence repeats as minisatellites (Figure 3). Many of these loci show hypervariability in their repeat numbers in humans and in animals, and are therefore called VNTR loci [46].
VNTR sequences are also found in bacteria, and have been used to genotype many species. Polymorphism at a tandem repeat (TR) locus can occur either as a result of nucleotide sequence changes between individual repeat units or as a result of variations in the number of repeat units, thereby creating allelic variants. VNTR typing is based upon repeat number polymorphisms within these tandemly arranged repetitive DNA sequences.
There are several VNTR loci in the genome of M. bovis, and hence VNTR typing provides a greater resolution than spoligotyping alone [40]. Many of these TR loci display hypervariability, enabling their exploitation for strain typing in numerous bacterial species. Originally, 6 VNTR loci, described as exact TR A through F (ETR- A, -B, -C, -D, -E, and -F), were reported and applied to M. tuberculosis isolates [18].
However, the level of discrimination found in M. tuberculosis or M. bovis isolates using the 5 ETRs (A through E) was not as good as that achieved with either spoligotyping or IS6110-RFLP typing [12, 21]. Therefore, another set of polymorphic
repeats, termed as mycobacterial interspersed repetitive units (MIRU–VNTR) [40, 46, 48] has been proposed. Initially, these involved a 12-loci set, which was considered efficient for epidemiological purposes [47], but some limitations were found with regard to the discriminatory power [19, 45]. Furthermore, a 15- or 24-loci subset has been shown to ensure better discrimination [48].
The challenge is to compile standardized molecular fingerprinting patterns originating from highly networked, multi-centric, genotypic analysis in databases for inter-laboratory use and for further references. Rapid genotyping methods are needed to overcome low reproducibility, not proven application—less discriminatory methods such as MIRU–VNTR [55]. By analyzing the intended purpose and possibilities for each method (Table 1), it is possible to use a combination of typing methods and thus accurately identify differences among strains.
Figure 3. Scheme of the M. bovis chromosome with VNTR (green) loci, a variation in the number of short, repeated segments contained in a specific locus, based on Barnes & Cave 2003. Amplification of a specific PCR primer (red) flanking the locus produces DNA fragments whose lengths vary within strains. The number of repeats per locus varies among strains.
Table 1. Molecular typing methods for Mycobacterium bovis 1
Method Advantages Disadvantages
IS6110- RFLP
The number of copies and their positions in the genome may vary from isolate to isolate [50], providing identical profiles of isolates from animals involved in recent transmission chains, and different genetic patterns in isolates from animals not associated with infection [4].
Requires large amounts of DNA (1–2 µg) and technical skills; it is slow and has little discriminating power in isolates with less than 6 IS6110 copies [7];
there is difficulty in reproducing results and comparing them among different laboratories [22];
and the majority of M. bovis isolates have a low number of IS6110 copies—in general, only 1 or 2 [24].
PGRS Higher discriminating power in isolates with 6 or less IS6110 copies [42]; useful tool for confirming the identity of strains matched by IS6110 or to type low- copy number stains [27]; for the majority of M. bovis strains, except those originating from certain animal species like goats, PGRS sequences, in terms of copy number, much more polymorphic than the DR region, which is more polymorphic than the IS6110;
it is considered more stable than the IS6110-RFLP patterns and shows 100% reproducibility.
Requires large amounts of high quality DNA [5, 15]
and technical skills; it has lower discriminating power in isolates with multiple copies [6]; the large number of bands produced by this technique makes interpretation of the gels difficult, limiting its application as a primary typing technique [27].
Spoligotyping This technique is fast, robust, low cost and can differentiate strains of M. bovis and M. tuberculosis;
the results can be fully expressed in a simple, digital format, which facilitates inter- and intra-laboratory results comparisons, as has been demonstrated for VNTR; this method may differentiate better when the
The discriminatory power of this method is lower than IS6110-RFLP typing when high copy number strains are being analyzed.
location of more spacers is investigated; it can potentially be applied directly to pathological samples [26].
VNTR Powerful approach to high-resolution genotyping of isolates [47]; it is reproducible, fast and specific for M. tuberculosis complex isolates [47]; potential approach to detect and genotype bacteria of the M.
tuberculosis complex directly in a range of clinical samples [40]; the results can be fully expressed in a simple, digital format, which facilitates inter- and intra-laboratory results comparisons; it has shown 100% reproducibility.
The discriminatory power of this method is lower than IS6110-RFLP (for high copy number strains) and spoligotyping [29]; detection via electrophoresis is inexpensive, but automated detection involving fluorescence is not.
1
4. Implications of molecular typing in epidemiology
Within the last 10 years, many techniques have been developed or adapted for typing M. tuberculosis complex isolates. In this review, we have presented an overview of the main techniques used for the differentiation of M. bovis isolates. For the majority of them, a specific and polymorphic genetic region is involved. In comparison to the majority of other bacterial groups, the genome of mycobacteria has a high GC content (GC% is 65%), and its polymorphism is very limited compared to its genome size (4.4 Mb) [10]. However, some regions are highly polymorphic, either due to variations in number and/or position, or because of variations in primary structure. These areas of higher polymorphism appear to correspond essentially to segments of genes encoding proteins where variability provides a selective advantage to the bacteria, such as antibiotic-resistance proteins, antigens involved in escaping the immune response, or non-coding sequences (insertion sequences or repeated sequences) that are probably involved in inducing variability in neighboring genetic areas.
Implementation of molecular methods for M. bovis typing requires an analysis of their advantages and disadvantages with regard to tuberculosis surveillance and control programs. Their use enables the detection of epidemiological links among samples [37], and contributes to better understanding of BTB transmission dynamics. Some studies have shown that laboratories should determine the discriminatory power for each molecular method to enable better selection, implementation, and combination according to specific conditions found in each laboratory and the particular features of a geographic region [42].
Genotyping of bacterial isolates or PCR products is increasingly becoming a standard tool for epidemiological disease control and eradication. Distinguishing M. bovis strains at the molecular level provides important insights into the sources of infection and identification of practices or environments, thereby aiding the spread and maintenance of tuberculosis [32]. More importantly,
transmission routes between livestock and wildlife may be identified by strain typing. In addition, transmission routes of BTB within livestock via animal movements become evident; this is a prerequisite for targeted disease control aiming at testing all potentially exposed animals [44].
PCR-based techniques used for strain fingerprinting have proven to be of useful in relating outbreaks of TB to sources of infection. Epidemiologically related isolates have similar fingerprints that differ from those that are epidemiologically unrelated. Therefore, a desirable characteristic for typing is related to its stability within a strain and diversity within a species.
DNA fingerprinting of M. bovis for molecular epidemiology has been used to study transmission of bovine tuberculosis in Latin America and other parts of the world [36]. However, there are a few reports in Brazil with regard to characterization of M. bovis [17, 36, 38, 58] that revealed the occurrence of a high genetic diversity using RFLP, spoligotyping and VNTR for genotyping;
however, these studies were conducted using a limited number of isolates, ranging from 12 to 61 samples [36, 60].
Conclusion
Whatever the epidemiological context, the need for techniques permitting differentiation of isolates at the molecular level is evident. These tools would help determine the origin of outbreaks, increase the understanding with regard to the link between different outbreaks, show the relationship between domestic TB and wild TB, and identify the source of infection. No typing technique developed so far can be used on its own. Each technique has its advantages and disadvantages that must be considered when choosing the one to be implemented in the laboratory. Using spoligotyping in combination with MIRU- VNTR seems to be the best choice as both have the advantages of being PCR- based, with improved discriminatory power when combined.
Hopefully, in the future we will have new and improved techniques for typing M. bovis. It is conceivable that a lab-on-a-chip approach will be capable
of not only detecting M. bovis from a clinical sample but also typing the pathogen at the same time. Regarding the target locus, it is likely that single nucleotide polymorphisms in specific genes will be used for molecular epidemiology.
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ARTIGO 2. Diagnosis of bovine tuberculosis: review of main techniques and applications
(Revisão a ser submetida ao periódico Ciência Rural)
Diagnosis of bovine tuberculosis: review of main techniques and applications
Diagnóstico de tuberculose bovina: revisão das principais técnicas e aplicações Daniela Fernandes Ramosa, Pedro Eduardo Almeida da Silvab, Odir Antônio
Dellagostina
ABSTRACT
Bovine tuberculosis (BTB) remains an important economic problem in Latin America with potential zoonotic consequences. Traditionally, the fight against bovine tuberculosis is initiated by the implementation of routine diagnostic tests for certification of free properties. The diagnosis of BTB can be made by direct and indirect methods, in which we can mention clinical, post mortem, histopathological, immunological, bacterial isolation and molecular diagnosis methods. Even with the need of futures studies, the renewal of scientific interest in tuberculosis in recent years, due to the need to develop more effective methods of diagnosis, prevention, control and eradication of bovine tuberculosis, has clarified significant gaps in understanding pathogenesis and epidemiology of the disease. The aim of this review is to present and discuss different diagnosis methods of M. bovis.
KEYWORDS: tuberculosis, bovine, diagnosis, Mycobacterium bovis
a* Laboratório de Vacinologia, Núcleo de Biotecnologia, CDTec, Universidade Federal de Pelotas. CP 354, 96010-900, Pelotas, RS, Brazil, Phone: +55 53 32757350. E-mail:
b Laboratório de Micobactérias, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande, RS, Brazil.
