Planejamento racional e síntese de inibidores para a enzima oxidase alternativa (AOX)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

PAULO CÉSAR DE SOUZA COSTA

PLANEJAMENTO RACIONAL E SÍNTESE DE INIBIDORES PARA A ENZIMA OXIDASE ALTERNATIVA (AOX)

CAMPINAS 2019

PLANEJAMENTO RACIONAL E SÍNTESE DE INIBIDORES PARA A ENZIMA OXIDASE ALTERNATIVA (AOX)

Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química, na Área de Química Orgânica.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda

O arquivo digital corresponde à versão final da Dissertação defendida pelo aluno Paulo César de Souza Costa e orientada pelo Prof. Dr. Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda.

CAMPINAS 2019

Prof. Dr. Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda

Profa. Dra. Anita Jocelyne Marsaioli

Dr. Fabrício Fredo Naciuk

A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.

Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno Paulo César de Souza Costa, aprovada pela Comissão Julgadora em 19 de fevereiro de 2019.

apoio e paciência para ouvir meus pesares. Eles tornaram possível a trilhagem deste caminho.

Ao Ângelo Luiz Santos por todo companheirismo, sabedoria, pelos sorrisos compartilhados e por sempre me impulsionar à fazer as coisas que amo.

A Professora Dra. Silvana A. Rocco, um anjo que encontrei neste caminho. Obrigado pela orientação, pela oportunidade, pela paciência e ensinamentos que levarei para a vida.

Ao Professor e orientador Dr. Paulo C. M. L. Miranda, por toda contribuição, orientação, paciência e dedicação. Suas orientações nunca se limitaram as paredes do laboratório.

Aos Amigos de laboratório Thiago Valdares, Joaquim Castro, Christian Rocque e Charbel Fontes por todos os momentos compartilhados, pelas horas do café, por me acompanharem nesta jornada e compartilhar suas experiências comigo. Obrigado a Rhannanda Copetti, Bruna Carolina, Gustavo, Germana, Amanda Silva, Mariane Roldão, Francis Larreal, Nubya Godinho, Jose Caruso, Renata Souza, Leticia Hotz e amigos que estão sempre presente e fazem parte da minha Caminhada.

Um muito obrigado a Ana Clara Fernandes, Juliana Carrilho, Juliana Ferreira, Itamara Rodrigues, Cintia Rodrigues, Jozé Mauro Sena, Bruno Santos, Mariana César, pessoas que apesar da distância acompanharam minha trajetória.

Um agradecimento especial a Prof. Dra. Dalva Ester Ferreira, pessoa que me apresentou a ciência, participou de minha formação, sempre me apoia e acompanha.

Ao Prof. Dr. Mauricio Luiz Sforça, Dr. Mario O. Barsottine e Prof. Dr. Gonçalo A. Guimarães pelas contribuições, ensinamentos e apoio.

Aos alunos João Ribeiro, Gabriel Zamboni Neto, Joel Evangelista, Maria Luiza pela amizade, companhia e paciência.

Agradeço ao Instituto de química e professores que estiveram envolvidos nesta etapa.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001.

O presente trabalho foi realizado com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP – Código do financiamento 2015/07653-5.

Um muito obrigado a aqueles que de alguma forma fizeram parte da caminhada e não foram citados acima.

vivos como fungos, plantas, algas, bactérias e protozoários. Ela possui um papel fundamental no processo de virulência e nos mecanismos de sobrevivência de alguns fungos de interesse agroeconômico. Os inibidores atualmente conhecidos para a AOX, ácido salicilidroxâmico (SHAM) e o galato de n-propila, não possuem características físico-químicas adequadas para serem aplicados como fungicidas. O presente trabalho estudou duas famílias de inibidores para a AOX: N-fenilbenzamidas e meroterpenoides com o esqueleto do ácido orcílico. A primeira parte do trabalho procurou viabilizar uma rota sintética para a coletoclorina D, um meroterpenoide inibidor da AOX. Em favor de contornar obstáculos encontrados na rota sintética clássica, foram testadas reações entre o acetoacetato de etila e crotonatos de etila substituídos. Para que desta forma se avaliasse influência do substituinte para a reação de adição de Michael. A seletividade da reação apresentou-se dependente do grupo de saída presente na posição 3 do crotonato. Quando este grupo é um alcóxi a reação produziu o diviniléster, enquanto que quando o grupo

p-toluenossulfonila a reação produziu a 2-pirona. Com a formação de uma das ligações C—C

necessárias para a formação do 2,4-diidroxi-6-metil-benzoato de etila, diversas condições de isomerização e modificação da 2-pirona foram testadas. Quando se utiliza meio básico e álcool como solvente, ocorre a desacetilação e a produção do 3-metil 2-pentenedioato de dietila. Usando a morfolina e aquecimento é formado o 2-acetil-3-metil-2-butenoato de etila, produto de descarboxilação da amida formada. A condição que obteve o melhor resultado usou LDA e forneceu 20 % de rendimento para a produção do 2,4-diidroxibenzoato de etila.

A segunda vertente do trabalho procurou sintetizar e avaliar a atividade e seletividade de uma biblioteca de derivados de N-fenilbenzamidas, obtidas através de um planejamento racional. Os derivados de N-fenilbenzamidas foram caracterizados através de técnicas de RMN de ¹H e ¹³C, e por ponto de fusão. Esta biblioteca foi testada, inicialmente, contra a levedura Pichia pastoris em ensaios de consumo de oxigênio e de crescimento celular para avaliação da atividade biológica. Em geral, os compostos testados apresentaram efeito mínimo sobre a respiração sensível a cianeto (cadeia principal), apresentando uma média de 8 ± 9% para os ensaios de consumo de oxigênio e 13 ± 18% para a taxa de crescimento. Entretanto, a respiração via AOX (insensível ao cianeto) foi inibida com uma média de 48 ± 28% e o crescimento médio mantido pela PpAOD na presença dos compostos 7J foi de 70,02 ± 29%. A molécula 7J-41 apresentou os melhores resultados e foi caracterizada contra a AOX de M. perniciosa, fungo de interesse, apresentando valor de IC50 para crescimento de 40,7 µM.

AOX is an enzyme involved in the respiratory chain of organisms like fungi, plants, algae, bacteria e protozoa. AOX has a fundamental role in the process of virulence and the survival mechanism of some fungi of agroeconomical interest. Salicylhydroxamic acid (SHAM) and n-propyl galate are known AOX inhibitors, but they don’t have adequate physicochemical properties required to be applied as a fungicide. In this work, we studied families do AOX inhibitors: N-phenylbenzamides (NPB) and orcilic acid meroterpenoids. In the first part of this work, a new synthetic approach to colletochlorin D, was investigated. The key reaction for our approach is the coupling among ethyl acetoacetate and ethyl crotonates. In this way, we evaluated the substituent effect on the Michael reaction. The selectivity is dependent of the leaving group of the ethyl crotonate. Alcoxy groups produced a divinylester, but p-toluenessulfonyl lead to the production of a 2-pirone. We investigated different conditions to isomerize or modify the 2-pyrone, and when basic catalysis and alcohol as solvent was used, we obtained the desacetylated product: diethyl 3-methyl-2-pentendienoate. Conversely, when morpholine was used, the of descarboxylation product, ethyl 2-acetyl-3-methyl-2-butenoate, was obtained. The best condition to isomerize 2-pyrone to ethyl 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoate uses LDA and furnished the desired product in 20% yield.

The second part of this work aimed to prepare and evaluate the activity and selectivity of N-phenylbenzamides library. This class of compounds had been selected by a rational planning study. Synthetized compounds were characterized by ¹H and ¹³C RMN spectroscopy and melting point. The compounds library was tested against Pichia pastoris using oxygen consumption and growth assays. In general, NPBs showed minimum effect on the cyanide sensitive respiration, with average inhibition of 8 ± 9%, at oxygen consumption assays and 13 ± 18% growth inhibition assays. However, NPBs reduced by 48 ± 28% the rate of AOX dependent oxygen consumption (insensitive to the cyanide) and the growth was maintained at the presence of 7J compounds with an average of 70.02 ± 29%. The compound 7J-41 showed 7the best results and was selected for further characterization against M. perniciosa’s AOX. M

perniciosa is the fungus of interest, and the compound 7J-41 showed an IC50 for growth

Esquema 1: Esquema de síntese clássico para a coletoclorina D ...16 Esquema 2: Esquema sintético aplicado por Barrett e colaboradores na obtenção dos fenóis prenilados (COOKSON et al., 2015). ...17 Esquema 3: Rota sintética desenvolvida por Grabovyi e Mohr para a síntese de fennois prenilados (GRABOVYI & MOHR, 2016)...17 Esquema 4: Estrutura dos dois produtos possíveis a partir da aromatização de um 3,5,7-tricetoácidos. a) O ácido orcílico, produto formado da condensação aldólica. b) O acetilfloroglucinol, produzido a partir da condensação de Claisen. ...18 Esquema 5: Condições aplicadas na isomerização da 7-metil-pirano[4,3-b]piran-2,5-diona e os produtos majoritários de cada caso: (a) KOH aquoso; (b) KOH/metanol (c) KOH/MeOH diluído. ...21 Esquema 6: Condições empregadas na aromatização de 2-pironas e seus respectivos produtos principais. a) KOH/H2O; b) KOH/MeOH; c) Mg(OMe)2/MeOH ...22

Esquema 7: Isomerização da 2-pirona em metoxifloroglucinol empregando NaOMe/MeOH e aquecimento...23 Esquema 8: Condições para a produção do fenol aromático em diferentes condições experimentais: a) aplicação de 1 equivalente de LHMDS, e b) adição do segundo equivalente de LHMDS. ...24 Esquema 9: Mecanismo da ação catalítica da AOX sobre a transferência de elétrons do ubiquinol para o oxigênio (MENZIES et al., 2016). ...26 Esquema 10: Mecanismo reacional para produção do 2,4-diidroxibenzaldeído e o produto principal obtido. ...30 Esquema 11: Mecanismo reacional para a formação do 5-cloro-2,4-diidroxibenzaldeído ...31 Esquema 12: Possível mecanismo de reação e produto reacional com a aplicação do 2,4-diidroxibenzaldeído e Br2. ...33

Esquema 13: Mecanismo reacional e estrutura de dois possíveis produtos da reação. ...35 Esquema 14: Mecanismo reacional proposto para a reação de prenilação em meio ácido. ...36 Esquema 15: Mecanismo reacional proposto para a reação catalisada por um metal oxofílico. Onde MXa, nas condições testadas, é o cloreto de zinco, índio ou níquel. ...37 Esquema 16: Condições empregadas para a autocondensação do acetoacetato de etila produzindo o resorcilato de etila. ...38 Esquema 17: Esquema reacional para a formação do 3-tosilcrotonato de etila...42 11Esquema 18: Mecanismo reacional simplificado para a produção da 2-pirona em condições básicas. ...43 Esquema 19: Esquema reacional da tentativa de isomerização da 2-pirona e o produto obtido ...45

Figura 2: Biossíntese do ácido dauricromênico. Este é sintetizado pela dauricromeno sintase pela

ciclo-oxidação da porção farnesílica do ácido grifólico (TAURA, IIJIMA & KUROSAKI, 2018)...20

Figura 3: Representação esquemática da cadeia respiratória principal e a localização da enzima Oxidase Alternativa (LIU & GUO, 2017) ...25

Figura 4: Interações entre o sítio sativo da AOX e a coletoclorina B. (MOORE et al, WO 2015110820 A1, 2015)...27

Figura 5: formação da ponte de hidrogênio intramolecular. ...31

Figura 6: Condições para realizar a carboxilação do resorcinol. ...33

Figura 7: Bromação do ácido 2,4 diidroxibenzóico em ácido acético. ...34

Figura 8: Prenilação do acetoacetato utilizando NaH e n-BuLi. ...39

Figura 9: Possíveis produtos a serem obtidos com a aplicação das condições de condensação entre dois -cetoésteres diferentes. ...40

Figura 10: Produto obtido da reação entre o aceto acetato de etila e 3-etóxi-2-butenoato de etila em meio aprótico e meio prótico. ...41

11Esquema 18: Mecanismo reacional simplificado para a produção da 2-pirona em condições básicas. ...43

Figura 12: Fragmentações observadas na 2-piranona. ...44

Figura 13: Fragmentação do diéster para a formação do íon de m/z igual a 127 ...46

Figura 14: Esquema reacional aplicado para a produção da amida e o produto obtido. Nesta figura esta omitido os equilíbrios de prototropismo...46

Figura 15: Mecanismo proposto para a fragmentação do para o íon de maior intensidade. ...47

Figura 16: Equilíbrio e reações paralelas que podem ocorrer com a aplicação da dietilamina para a obtenção da amida. ...48

Figura 17: (a) Estrutura da N-fenilbenzamida (B) estrutura geral dos derivados da N-fenilbenzamida onde R1 pode ser H, F, Cl, Br, I, CN, CH3 ou OCH3; e R2 pode ser H, Br, Cl, CF3, F, I, NH2, NO2, CH3, OCH3, piperonilamina ou 4-imidazoil. ...49

Figura 18: (A) Contribuição relativa da respiração sensível e insensível a cianeto no consumo de oxigênio em P. pastoris após o tratamento com Azoxistrobina. As barras representam a taxa de consumo residual de oxigênio (Média ± desvio padrão; n=3). Antes da adição dos compostos indicados anteriormente (grupo não tratado) e depois (grupo AZO-tratado) de 4h do tratamento com 5mg/L de AZO. A respiração alternativa é induzida pela AZO. KCN: 2.5 mM. SHAM (ácido salicil hidroxâmico) e PG (galato de n-propila): inibidores da AOX em 5 mM e 1 mM respectivamente. (B) Ensaios de crescimento de P. pastoris em meio de cultura sólido. As células de P. pastoris foram pré-cultivadas, diluídas e transferidas para o meio YPG com a presença de 5 mg/L de AZO, 5 mM de SHAM ou ambos. A densidade de células são indicas acima. As placas de cultura foram observadas até o aparecimento de colônias visíveis e como é mostrado a respiração alternativa mantem o

espectrofotometria. (D) Taxas máximas de crescimento (µMax) determinada a partir de (C) (BARSOTTINI et al., 2018). ...51 Figura 19: Caracterização funcional dos NPDs em P. pastoris. (A) Medida da taxa de consumo de oxigênio e (B) Medida da taxa de crescimento mantida pela respiração principal (azul, tratado com DMSO) e a respiração alternativa (tratada com AZO, laranja). Os símbolos são a média acompanhados dos seus respectivos desvios padrões (3 < n < 6) para a taxa residual de respiração (A) ou para a capacidade de crescimento de P. pastoris (B) após a adição de cada derivado de N-fenilbenzamidas (BARSOTTINI et al., 2018). ...53 Figura 20: Ensaios de dose vs resposta com SHAM e a 7J-41. (A) O consumo de oxigênio do conjunto de células de P. pastoris após a adição de SHAM ou da 7J-41 com variação das concentrações, antes (NT) ou após (AZO) a indução da via alternativa de respiração. (B) Crescimento relativo da P. pastoris em meio de cultura líquido, as medidas foram realizadas após 72h de crescimento e normalizadas pela condição controle (tratadas com DMSO). (C) Taxa de consumo de oxigênio para a cultura de células E. coli transformadas com vetor de expressão (pET) pET28a vazio ou o pET28a-rMpAOX para a expressão da AOX. Apesar de SHAM e 7J-41 exibirem perfis de atividade similares em P. pastoris, há uma clara diferença na potência (IC50) na rMpAOX. Os símbolos representam a média e ± o desvio padrão para as medidas em triplicatas (BARSOTTINI et al., 2018)...54 Figura 21: Experimentos de germinação de esporos de M. perniciosa. Os esporos foram germinados na presença do inibidor da AOX 7J-41 e do derivado inativo 7J-48 como controle. Após 21 dias o micélio totalmente desenvolvido foi observado, para cada condição de tratamento com a 7J-48. Entretanto a 7J-41 exibiu atividade inibitória na germinação dos esporos a partir da concentração de 62,5 µM. As setas indicam os esporos não germinados e as setas brancas os micélios parcialmente desenvolvidos (BARSOTTINI et al., 2018). ...55 Figura 22: Tratamento do tomateiro, sistema biologico de teste in planta, em a) a morfologia da planta inoculada e não inoculada com os esporos do Moniliophtora perniciosa. Em b) a morfologia da planta inoculada sem e com a aplicação da 7J-45. Em c) morfologia dos ramos da planta para cada um dos testes biológicos. Em d) o diâmetro da raiz em função dos dias, um importante fator da doença (BARSOTTINI et al., 2018). ...56 Figura 23: Posicionamento das moléculas 7J-13 e 7J-45 no sítio ativo da enzima obtido pelos ensaios de Docking molecular. Estas moléculas possuem os mesmos substituintes, entretanto em anéis aromáticos diferentes. ...57 Figura 24: Espectro de STD em a) STD Off- resonace com o mimético da membrana; b) espectro de STD On-resonance com o mimético de membrana; c) STD off-resonace com o mimético de membrana e a AOX; d) STD On-resonace com o mimético de membrana e enzima AOX. ...60 Figura 25: Gráfico mostrando comparação entre os valores da ação de inibição do crescimento de P. pastoris em relação ao calculado teoricamente para o conjunto de 58 compostos específicos da biblioteca de N-fenil benzamida ...62 Figura 26: Gráfico mostrando comparação entre os valores da ação da inibição da respiração em P. pastoris em relação ao calculado teoricamente para o conjunto de 58 compostos específicos da biblioteca de N-fenilbenzamidas. ...64 Figura 27: Estrutura dos fragmentos gerados a partir das análises de QSAR, em azul

P. pastoris e suas contribuições. Tabela gerada com a análise do conjunto de 36 compostos da biblioteca de N-fenilbenzamida específicos para a AOX. ... 62

Tabela 2: Principais fragmentos que governam a ação da inibição da respiração celular em P.

pastoris e suas contribuições. Tabela gerada com a análise do conjunto de 58 compostos específicos da biblioteca de N-fenilbenzamidas para os ensaios de respiração. ... 65

1. Introdução ...13

1.1 Produtos naturais e o desenvolvimento de fármacos ...13

1.2 Fenóis prenilados ...15

1.3 Biossíntese de resorcinóis e meroterpenoides ...18

1.4 2-Pironas como intermediários sintéticos para produção de fenóis...20

1.5 Coletoclorinas como inibidores da oxidase alternativa ...24

1.6 QSAR ...27

2. Objetivos ...28

2.1 Objetivos específicos ...29

3. Resultados e discussão...29

3.1 Estabelecimento da rota sintética para a coletoclorina B e seus derivados ...29

3.2 Rota sintética alternativa à clássica ...37

3.3 LBDD - Ligand-Based Drug Desing: Síntese e caracterização físico-química das N-fenilbenzamidas (NPB) ...48

3.4 Caraterização funcional das N-fenilbenzamidas ...50

3.5 Modelagem estrutural da PpAOX, Docagem e Determinação da Relação Estrutura-Atividade dos derivados das N-fenilbenzamidas (NPB) ...57

3.6 Ensaios de STD ...59 3.7 QSAR-2D ...61 4. Conclusão ...66 5. Referências Bibliográficas ...67 APÊNDICE ...71 Parte Experimental ...72

1. Introdução

O Moniliophthora perniciosa é um fungo basidiomiceto que possui ciclo de vida hemibiotrófico. Ele é o agente causador da doença conhecida como vassoura de bruxa que ataca principalmente o cacaueiro. Em seu estágio biotrófico o fungo infecta o meristema do hospedeiro crescendo intersticialmente entre suas células. O principal sintoma do cacaueiro contaminado nesta fase é o crescimento de galhos amorfos semelhantes a vassouras, o que origina o nome da doença. Em sua fase necrotrófica o fungo apresenta grampos de conexão crescendo entre as células mortas do hospedeiro. A vassoura de bruxa não ocasiona a morte do cacaueiro, entretanto ela reduz drasticamente a qualidade e a quantidade dos frutos produzidos pela planta (MEINHARDT et al., 2008).

O cacaueiro é uma planta de clima tropical com origem na bacia amazônica. Sendo o estado da Bahia o principal produtor de cacau no Brasil. O surgimento da vassoura de bruxa no sul da Bahia em 1989 acarretou diversos prejuízos econômicos. Desta forma o Brasil passou de exportador para importador desta commodity, o que vem acarretando prejuízos comerciais desde então (MEINHARDT et al., 2008).

Apesar dos esforços empregados, ainda não se encontrou uma forma efetiva de combate ao M. perniciosa, que atualmente é o principal fator limitante da produção cacaueira no Brasil. Resultados preliminares indicam que a aplicação dos inibidores da oxidase alternativa juntamente com inibidores da via principal de respiração é uma possível fórmula para o controle da Vassoura de Bruxa uma vez que a Oxidase Alternativa (AOX) é principal fator de resistência aos fungicidas comerciais e aos mecanismos de defesa do cacaueiro no

M. perniciosa (THOMAZELLA et al., 2012). Neste contexto, o desenvolvimento de

inibidores para AOX é de extrema importância para o controle deste e de outros fitopatógenos.

1.1 Produtos naturais e o desenvolvimento de fármacos

Os produtos naturais (PN) são os conjuntos de compostos produzidos pelos organismos vivos que não estão envolvidos com o metabolismo primário (BAKER et al., 2007). Estes compostos geralmente são geneticamente codificados, produzidos pelas vias

metabólicas secundárias e estão relacionados diretamente com a adaptação do organismo ao ambiente no qual está inserido (DEWICK, 2009; COLEGATE & MOLYNEUX, 2008).

Os produtos naturais, por possuírem grande variabilidade estrutural e estereoquímica específica, são uma importante fonte de padrões estruturais e de compostos para o desenvolvimento de compostos biologicamente ativos (HARVEY et al. 2015; CRAGG & NEWMAN, 2016). Contudo, um problema envolvido no desenvolvimento de fármacos baseados em produtos naturais é justamente o rendimento de seu isolamento. A fonte do PN deve ser segura e de fácil acesso, além disso, os isolamentos dos compostos devem ocorrer em um rendimento apreciável. A determinação estrutural do PN deve ser realizada de forma inequívoca e muitas vezes, é necessária a síntese total para a certificação da estrutura correta (COLEGATE & MOLYNEUX, 2008).

Os compostos biologicamente ativos baseados nos produtos naturais são obtidos através do que é chamado molecular editing, que nada mais é que a síntese e modificação do composto natural. Isso permite modular propriedades químicas e a ação biológica do composto, moldando as características moleculares de acordo com o interesse em cada caso: mais lipossolúvel, polar, específico, potente, etc. (REBECCA & DANISHEFSKY, 2007).

Outra forma de identificar um composto com atividade biológica é utilizando o

screening de uma grande variedade de estruturas (high troughput screening). Nesta

metodologia busca-se identificar funções e padrões estruturais que produzem o efeito biológico desejado (BLEICHER et al, 2003). Uma vez selecionadas as estruturas privilegiadas, os compostos são modificados para realização de experimentos que permitem deixá-lo mais específico, a potencialização do efeito almejado e a minimização de possíveis efeitos indesejados.

Utilizando a síntese combinatória é possível obter um grande número de compostos para abastecer o high troughput screening. Entretanto, a variabilidade estrutural dos produtos produzidos por esta abordagem é baixa se comparada com o estudo de quimiotecas de PNs e seus derivados (LIU et al, 2017). Apesar disso, vale ressaltar que ambas as metodologias são complementares e apresentam resultados satisfatórios.

1.2 Fenóis prenilados

Compostos aromáticos polissubstituídos são padrões estruturais recorrentes em uma grande variedade de produtos naturais. (GRIBBLE & BERTHEL, 1993; BERGMAN, JANOSIK & WAHLSTROM, 2001; LEE et al., 1987; LOOK et al., 1986). Entre eles, pode-se citar os resorcinóis polissubstituídos que podem conter grupo o prenila, geranila ou outros terpenoides. Compostos com este padrão de substituição são metabólitos secundários de biossíntese mista (meroterpenoides) comuns provenientes de plantas, algas, fungos, bactérias e ascídia. Geralmente resorcinóis prenilados podem apresentar efeitos biológicos diversos incluindo citotoxidade, antibiótico, fungicida, antioxidante e anti-inflamatório. (JAYASINGHE et al., 2004; ELSOHLY et al., 2001; KUMAZAWA et al., 2007; HAYASHI et

al., 1999; CHEN et al., 2008; TSUDA et al., 1999; AIELLO et al., 2005).

Um conjunto de produtos naturais que apresenta este tipo de padrão estrutural são as coletoclorinas (compostos 1a–1d). Elas são um conjunto de compostos aromáticos hexassubstituídos onde é possível identificar o sistema orcílico (o ácido 2,4-diidróxi-6-metilbenzoico) com um grupo terpênico na posição 3 e um átomo de cloro na posição 5 (Figura 1). 1 6 5 4 3 2 OH OH O Cl R OH OH O OH R a) b) c) d) 1

Figura 1: Estrutura das coletoclorinas A (1a), B (1b), C (1c) e D (1d)

Em 1974 Yoshiaki e colaboradores identificaram as coletoclorinas A, D e C (compostos 1a, 1b e 1c respectivamente) como metabólitos do fungo Colletotrichum

nicotianae (KOSUGE et al., 1973 e 1974). Em 2005 Margarita Gutierrez identificou a

coletoclorina B e outros compostos meroterpenoides como metabólitos do fungo Nectria

galligena (GUTIERREZ, 2005).

Em razão de apresentarem efeitos biológicos apreciáveis, estes compostos têm sido alvos de estudos sintéticos. Entretanto, as metodologias sintéticas usualmente utilizam a química tradicional do benzeno. Estas metodologias partem do resorcinol ou do orcinol (composto 2) passando por etapas de acilação (composto 3), halogenação (composto 4) e por último prenilação do anel aromático (Esquema 1) (composto 1d) (GUTHRIE et al., 1982; MORI & SATO 1982; SAIMOTO & HIYAMA, 1986). A última etapa destas metodologias usualmente possui baixos rendimentos e/ou exige duas etapas extras, uma etapa de proteção e outra de desproteção dos grupos fenólicos. Este fato resulta normalmente em uma síntese com baixo rendimento global (TALHI & SILVA, 2013).

OH OH OH OH O OH OH O Cl OH OH O Cl 2 3 4 1 d)

Esquema 1: Esquema de síntese clássico para a coletoclorina D

Anthony G. M. Barrett e colaboradores desenvolveram uma metodologia sintética para evitar a química tradicional do benzeno. Eles buscaram desenvolver uma rota de síntese biomimética dos resorcilatos usando a química da dioxinona (composto 6). Isso permite a formação de um policetídeo linear como intermediário (composto 8), que posteriormente é submetido a uma reação de aromatização (Esquema 2) (COOKSON et al., 2015, NAVARRO, 2008).

OH O O O O O O O O O O OAc O O O O O O O O OAc O O OAc O OH 5 6 7 + 8 9

Esquema 2: Esquema sintético aplicado por Barrett e colaboradores na obtenção dos fenóis prenilados (COOKSON et al., 2015).

O O O OTBS OH OH Cl OH OH Cl O 10 11 13 ₁₂ a b c

Esquema 3: Rota sintética desenvolvida por Grabovyi e Mohr para a síntese de fennois prenilados (GRABOVYI & MOHR, 2016).

Alternativamente, Mohr parte da 6-metil-2,4-diexanona (composto 10) com uma etapa de acoplamento do grupo farnesil e posteriormente etapas de redução e oxidação para a formação do produto aromático (Esquema 3) (GRABOVYI & MOHR, 2016).

1.3 Biossíntese de resorcinóis e meroterpenoides

Compostos aromáticos como resorcinol, floroglucinol e seus derivados são sintetizados biologicamente a partir de policetídeos lineares que sofrem reações de aromatização. Os primeiros passos para a compreensão da biossíntese destes compostos foram dados por J. N. Collie em 1907 (COLLIE, 1907). Posteriormente Birch e Donavan postularam que a ocorrência natural de fenóis derivados do acetato ocorreria via formação de 3-cetoácidos, 3,5-dicetoácidos ou 3,5,7-tricetoácidos, entre outros compostos carbonilados (Esquema 4) (BIRCH & DONOVAN, 1953).

OH O O O OH O O O OH 8 7 O 6 5 O 4 3 O 2 1 O OH OH OH HO O OH HO OH O 14 15 16 17 18 19 a) b)

Esquema 4: Estrutura dos dois produtos possíveis a partir da aromatização de um 3,5,7-tricetoácidos. a) O ácido orcílico, produto formado da condensação aldólica. b) O acetilfloroglucinol, produzido a partir da condensação de Claisen.

Eles sugeriram que a ciclização de 3,5,7-tricetoácidos (composto 17) ocorre de duas formas distintas podendo formar diferentes compostos aromáticos. A primeira rota de

ciclização ocorreria envolvendo uma condensação aldólica dando origem aos ácidos -resorcílicos (composto 18). A condensação aldólica é resultado do ataque intramolecular do carbono 2 ao carbono 7 do composto 17. A segunda rota envolve uma condensação de Claisen intramolecular o que produz os acilfloroglucinóis (composto 19). A condensação de Claisen ocorre quando há um ataque, também intramolecular, do carbono 6 ao carbono 1 no composto 17.

Os policetídeos são sintetizados através da condensação de ácidos carboxílicos por enzimas chamadas policetídeo sintases (PKSs) e são classificados de acordo com a sua origem biossintética. Estas enzimas são divididas em três grupos de acordo com a sua estrutura primária e mecanismo catalítico. As PKSs do tipo I são enzimas responsáveis pelo crescimento da cadeia carbônica de alguns compostos, através da acetilação dos mesmos. Segundo Hertweck, as enzimas cetossintase (KS), aciltransferase (AT), proteína carregadora de grupo ácido (ACP), cetorredutase (KR) e deidratase (DH) fazem parte deste conjunto. Uma gama de PKSs interativas do tipo I tem sido identificada em fungos como ácido orcilico sintases (WEITRAUER et al., 2001; AHLERT et al., 2002; SANCHEZ et al., 2010; JORGENSEN et al., 2014; LI et al., 2016).

Diferentemente do tipo I as PKSs do Tipo II são um conjunto de enzimas com funções particulares. Elas usualmente catalisam a formação de compostos que requerem aromatização e ciclização, entretanto não realizam redução ou processos de desidrogenação. Esta classe de PKS é responsável pela síntese de policetídeos aromáticos como tetraciclinas e pradimicinas (WEITRAUER et al., 2001; AHLERT et al., 2002; SANCHEZ et al., 2010; JORGENSEN et al., 2014; LI et al., 2016).

As PKSs do tipo III são enzimas encontradas na forma de homodímeros. O seu sítio ativo catalisa a formação, extensão e ciclização de policetídeos. Apesar de sua simplicidade estrutural, as PKSs do tipo III são responsáveis pela produção de uma grande gama de compostos como chalconas, pironas, acridonas, floroglucinol, estibenos, e lipídeos resorcilados. Este tipo de PKSs está presente em plantas, bactérias e mais recentemente foram identificadas em fungos (WEITRAUER et al., 2001; AHLERT et al., 2002; SANCHEZ et al., 2010; JORGENSEN et al., 2014; LI et al., 2016).

Os meroterpenoides, como colocado anteriormente, são compostos de origem biossintética mista possuindo uma porção fenólica e uma terpênica. O caminho proposto para a sua formação consiste em três etapas: a formação do policetídeos, sua prenilação e por

último podendo ou não ocorrer a ciclização da cadeia terpênica lateral (TAURA et al., 2007; VICKERY et al., 2016). A porção terpênica é transferida para o fenol através de enzimas conhecidas como prenil transferase, geranil transferase e farnesil transferase que transferem o respectivo grupo terpênico.

Figura 2: Biossíntese do ácido dauricromênico. Este é sintetizado pela dauricromeno sintase pela ciclo-oxidação da porção farnesílica do ácido grifólico (TAURA, IIJIMA & KUROSAKI, 2018).

A exemplo o ácido dauricromênico (composto 21) produzido pelo microrganismo

Rhididendron dauricum, um meroterpenoide composto por um sesquiterpeno e o ácido

orcílico (Figura 2). Em sua biossíntese primeiramente é sintetizado o ácido grifólico (composto 20) e este por sua vez é substrato da dauricromeno sintase que faz a oxidação da cadeia lateral e sua ciclização (TAURA, IIJIMA & KUROSAKI, 2018).

1.4 2-Pironas como intermediários sintéticos para produção de fenóis

2-Pirona é uma lactona insaturada formada por um anel de seis membros. Este composto possui um caráter levemente aromático pela deslocalização do par de elétrons do oxigênio no sistema . Compostos derivados da 2-pirona não são encontrados em apenas um dos sete reinos biológicos: o Archaea. Todos os demais reinos (Bacteria, Protozoa,

Chromista, Fungi, Plantae e Animalia) possuem exemplos de 2-pironas em seu metaboloma.

Entre as mais diversas funções as pironas participam de processos de defesa dos organismos, além de ser um intermediário biossintético chave de diversos produtos naturais (MCGLACKEN & FAIRLAMB, 2005; WILK et al., 2009).

Algumas lactonas como a 4-hidroxi-6-metil-2-pirona e a 3-acetil-4-hidróxi-6-metil-2-pirona são usadas como percursores de compostos biológicos como feromônios,

solanopironas, coumarinas e análogos. Seu padrão estrutural mono e polissubstituído pode ser reconhecido em diversos compostos como, por exemplo, esteroides do tipo bufadienolídeos, coumarinas, peripiridonas entre vários outros produtos naturais (MCGLACKEN & FAIRLAMB, 2005).

As 2-pironas, assim como alguns fenóis, são provenientes da rota biossintética do acetato. Uma das primeiras sugestões da formação de policetídeos lineares a partir da condensação de unidades de ácidos acéticos foi realizada em 1907 por J. N. Collie. Esta consideração está diretamente relacionada com a reatividade dos policetídeos lineares, que podem reagir por uma condensação do tipo aldol ou por tipo Claisen gerando compostos aromáticos com padrões estruturais recorrentes na natureza.

A utilização de pironas como intermediários convertíveis em aromáticos tem sido desenvolvida e aplicada como forma de contornar a química do benzeno e de reduzir o número de etapas envolvidas na síntese de fenóis.

T. Money e colaboradores realizaram em 1966 um estudo da reatividade do sistema contendo dois anéis 2-pironas “condensados” (composto 22, Esquema 5).

Esquema 5: Condições aplicadas na isomerização da 7-metil-pirano[4,3-b]piran-2,5-diona e os produtos majoritários de cada caso: (a) KOH aquoso; (b) KOH/metanol (c) KOH/MeOH diluído.

Foi utilizado neste estudo uma extensão da 4-hidroxi-6-metil-2-pirona formada pela condensação de três moléculas de ácido acético, a TAL (Triacetic Acid Lactone). O uso deste sistema tem como objetivo a formação de um policetídeo linear in situ e controlar sua reatividade para a produção de fenóis. Variando as condições reacionais para o mesmo substrato é possível produzir o ácido orcílico o orcilato de metila o ácido 2-hidroxi-4-metóxi-6-metil benzoico e o 2,4-diidroxi-3-carboximetil-2-hidroxi-4-metóxi-6-metil benzoato de etila (Esquema 5) (compostos 23, 24, 25 e 26 respectivamente) (MONEY et al, 1967; MONEY, 1970).

T. M. Harris e M. P. Watchter em 1970 estudaram um sistema semelhante ao sistema utilizado por T. Money. Ao invés de utilizarem a 7-metilpirano[4,3-b]pirano-2,5-diona eles utilizaram a 4-hidroxipirano[3,2-c]pirano-2,5-diona (composto 27). Eles identificaram algumas variações no perfil reacional dos derivados dessas duas pironas. Uma das diferenças e uma característica interessante é a formação de produtos diferentes com a utilização de hidróxido de potássio em metanol ou metóxido de magnésio em metanol. Utilizando hidróxido de potássio em metanol a reação processa-se praticamente via aldol. Enquanto que a reação utilizando metóxido de magnésio no mesmo solvente se processa via Claisen formando produtos diferentes. Eles procuraram explicar a reatividade destes compostos pela formação de um complexo entre o policetídeo produzido em meio básico com o cátion divalente Mg2+ _{(composto 30) (Esquema 6) (HARRIS & WATCHTER, 1970).}

Esquema 6: Condições empregadas na aromatização de 2-pironas e seus respectivos produtos principais. a) KOH/H2O; b) KOH/MeOH; c) Mg(OMe)2/MeOH

Na mesma linha de raciocínio, C. A. Handsen e J. W. Frost em 2002 realizaram um estudo da isomerização da 4-metóxi-6-metil-2-pirona (composto 32) no metil éter do floroglucinol (composto 34). A reação realizada pelos autores consiste na abertura da 4-metóxi-6-metil-2-pirona por uma molécula de metanol formando um éster de cadeia aberta que sofre uma desprotonação em seguida da reação de aromatização (Esquema 7) (HANDSEN & FROST, 2002).

Esquema 7: Isomerização da 2-pirona em metoxifloroglucinol empregando NaOMe/MeOH e aquecimento. Estes primeiros trabalhos se concentraram na produção de um policetídeo linear no meio reacional para a formação do fenol desejado. Entretanto, as conectividades usadas entre as pironas não permite a síntese de derivados substituídos mais complexos. Além de haver restrições na modificação de suas estruturas, os policetídeos formados in situ geralmente sofrem descarboxilação e desacetilação, aumentando a gama de subprodutos que podem ser formados.

Ceglia e colaboradores demonstraram que também é possível realizar reações de aromatização em pironas que geram compostos carbonilados ramificados. Seu estudo focou na produção de 2,4-dialquil resorcinóis a partir da 3-carboxietil-5-(n-propil)-6-(n-butil)-2-pirona (composto 39). Em seu trabalho o autor testou diversos solventes e estequiometrias de base necessários para a formação do 2,4-diidróxi-3,5-di(n-propil)benzoato de etila (composto 40). Utilizando etóxido sódio em solventes apróticos e LHMDS ele conseguiu formar uma espécie bidesprotonada que leva à formação do fenol desejado (Esquema 8) (CEGLIA et al., 2005).

Esquema 8: Condições para a produção do fenol aromático em diferentes condições experimentais: a) aplicação de 1 equivalente de LHMDS, e b) adição do segundo equivalente de LHMDS.

1.5 Coletoclorinas como inibidores da oxidase alternativa

A AOX é uma enzima presente na cadeia respiratória de alguns organismos que são insensíveis à presença de cianeto e outros inibidores da via principal de respiração (Figura 3) (MCDONALD & VANLERBERGHE, 2006; MCDONALD, 2009). Esta enzima promove plasticidade ao metabolismo da mitocôndria de plantas, fungos, algas e de algumas espécies de bactérias. Ela é capaz de desviar o fluxo de elétrons da cadeia principal da respiração diretamente para o seu aceptor final: o oxigênio (Figura 3) (ROGOV et al., 2014, SHIBA, 2013). O substrato natural desta enzima é o ubiquinol, que tem uma disposição central na rede de vias respiratórias da mitocôndria. Esta coenzima liga diferentes caminhos, destacando-se a função de transferir os elétrons provenientes do complexo II para o complexo III. Se a AOX for acionada, os elétrons do ubiquinol são transferidos diretamente para o oxigênio, e assim

várias etapas de fosforilação oxidativa são contornadas e a produção de ATP reduzida (SLUSE & JARMUSZKIEWICZ,1998; ROGOV et. al, 2014; GUPTA et al, 2015; TAIZ & ZEIGER, 2003; DEL-SAZ et. al., 2017).

Figura 3: Representação esquemática da cadeia respiratória principal e a localização da enzima Oxidase Alternativa (LIU & GUO, 2017)

A AOX é uma enzima de membrana formada por seis domínios longos e quatro domínios curtos de -hélice, sendo estes últimos responsáveis pela sua fixação na membrana mitocondrial. Geralmente encontrada na sua forma dimérica, a AOX, possui em seu sítio ativo dois íons ferro(II). Os átomos de ferro estão coordenados por quatro resíduos de glutamato e uma ponte de hidróxido formando uma geometria bipiramidal trigonal distorcida. Ainda no sítio catalítico da enzima há dois resíduos de histidina e um de tirosina altamente conservados que possuem um papel importante para catalise enzimática.

O mecanismo de ação da AOX ainda se encontra desconhecido, entretanto estudos cinéticos e cristalográficos lançam luz sobre os primeiros modelos propostos. De forma geral, um mecanismo da atividade catalítica foi proposto por Moore (MOORE et al., 2013) começando com o centro metálico em sua forma reduzida com os dois átomos de ferros em seu estado de oxidação 2+ (Esquema 9). O ciclo inicia-se com a ligação do oxigênio molecular ao centro de Fe (II/II), e em seguida uma sequência de reações e produção de intermediários que dão origem a duas moléculas de água e duas de ubiquinona. Ao final do ciclo catalítico o ubiquinol reduz o centro metálico à sua composição inicial Fe(II/II) ativo para sua ação catalítica (MENZIES et al., 2016).

UQ-H2+ O O 2+_Fe O Fe 3+ O O H O OH O O H R 2+_Fe O Fe 3+ O OH H O O O O R O O Fe3+ 2+_Fe O Tyr H O O O O R O Tyr H Fe2+ O Fe3+ OH Fe3+ O Fe3+ OH O Fe 3+ 3+ Fe OH O Fe 2+ 2+_Fe H UQ-H2 UQ + H2O A B C D E

Esquema 9: Mecanismo da ação catalítica da AOX sobre a transferência de elétrons do ubiquinol para o oxigênio (MENZIES et al., 2016).

Estudos recentes têm caracterizado as coletoclorinas B e D, além da ascofuranona, como inibidores da Oxidase Alternativa (AOX). Estes estudos indicam que os inibidores em questão exibem uma composição de dois tipos de ação. O primeiro é uma inibição competitiva, e o outro é por desativação do sítio ativo. Estas moléculas foram cristalografadas no sítio ativo da enzima apresentando diversas interações com grupos polares importantes para a atividade catalítica, como o resíduo de tirosina 275 (numeração para a AOX de tripanossoma), além de um dos átomos de ferro e com o grupo hidróxi em ponte entre estes átomos de ferro. Além disso, há interações apolares realizadas pela cauda terpênica orientada para a entrada do sítio ativo (Figura 4) (MOORE et al., 2013 e MENZIES et al., 2016).

Modificações estruturais na cadeia carbônica das coletoclorinas B e D (molecular

editing) poderia modular a afinidade desta classe de compostos pela enzima, levando à

descoberta de um inibidor mais potente e seletivo.

Figura 4: Interações entre o sítio sativo da AOX e a coletoclorina B. (MOORE et al, WO 2015110820 A1, 2015)

1.6 QSAR

O desenvolvimento de uma nova entidade farmacológica é uma tarefa complexa, cara, e que exige um dispêndio grandioso de tempo, não havendo atalhos para esta tarefa. Há, literalmente, milhões de moléculas candidatas e experimentos individuais um a um não são viáveis. O planejamento racional de fármacos, principalmente baseados em ensaios in-silico. surgem como ferramentas promissoras complementares ao screening dos compostos. Dentre as técnicas utilizadas destaca-se o QSAR, pela sua simplicidade e aplicabilidade.

A relação quantitativa entre estrutura e atividade (QSAR do inglês) são regressões lineares que relacionam uma determinada estrutura química a uma atividade biológica (HANSCH & LEO, 1995; HANSCH, TELZER & ZHANG, 1995). Seu pressuposto básico é

que a atividade biológica é modulada por variações na estrutura química de uma série de compostos que possuem o mesmo alvo biológico e mecanismo de ação (JOHNSON & MAGGIORA, 1990). O QSAR e outros métodos relacionados são aplicados em uma gama de áreas científicas incluindo química, biologia e toxicologia. Além disso, trata-se de uma ferramenta essencial e amplamente utilizada no desenvolvimento de novas entidades farmacológicas. Sua utilização agiliza o processo de screening além de permitir o planejamento de compostos com melhores características farmacológicas (HOPFINGER, 1997; KUBINYI, FOLKERS & MARTIN, 1998).

Análises de QSAR são empregadas com objetivo de: (a) predizer análogos químicos com melhor atividade biológica; (b) aprimorar o entendimento e a investigação do modo de ação de fármacos; (c) otimizar um composto lead e seus derivados reduzindo sua toxicidade; (d) racionalização da experimentação laboratorial; (e) redução do tempo, custo e recursos humanos requeridos para o desenvolvimento de um fármaco; e (f) desenvolver uma alternativa a testes em animais (CRONIN et al., 2003; WORTH et al., 2007).

O modelo Free-Wilson é um modelo matemático desenvolvido conjuntamente por estes dois autores em 1964 (FREE & WILSON, 1964). O mesmo é baseado na medida da contribuição de diversos substituintes em posições específicas de uma série de compostos com o mesmo grupo farmacológico. Estes métodos de quantificação da relação estrutura X atividade é baseado aditividade dos efeitos dos substituintes para atividade biológica, sem o uso de qualquer propriedade físico-química da molécula ou do cálculo de qualquer descritor associado à estrutura molecular que não a sua conectividade (JOHNSON & MAGGIORA, 1990). Para a aplicação desta técnica é necessário preencher diversos pré-requisitos. Sendo eles os seguintes: (a) os compostos estudados devem possuir o mesmo grupo farmacológico e o mesmo mecanismo de ação, (b) os dados de atividade biológica devem ser acurados e medidos nas mesmas condições, e (c) os parâmetros dos substituintes devem ser essencialmente aditivos (SMITHFIELD & PURCELL 1967).

Atualmente quase todas as técnicas são baseadas no uso de descritores moleculares, que servem como informações físico-químicas úteis que possibilitam a correlação entre estrutura e atividade biológica.

• Síntese, caracterização físico-química e biológica de uma biblioteca de

N-fenilbenzamidas (NPB) substituídas nas posições meta e para.

• Estabelecimento de um sistema biológico viável para triagem dos compostos sintetizados e avaliação das moléculas sintetizadas como novos inibidores da enzima Oxidase Alternativa (AOX).

• Estudos para o estabelecimento de uma rota sintética viável para a coletoclorina D.

2.1 Objetivos específicos

• Síntese e caracterização dos intermediários e produtos da rota sintética planejada.

• Aplicação das moléculas sintetizadas em modelos biológicos adequados e determinação da atividade inibitória das mesmas contra a AOX in vivo;

• Ensaios de inibição da respiração celular em P. pastoris (AOX endógena) e em

M. perniciosa e ensaios de inibição do crescimento da população de P. pastoris

e M. perniciosa.

3. Resultados e discussão

3.1 Estabelecimento da rota sintética para a coletoclorina B e seus derivados

Inicialmente foi selecionada a rota sintética clássica para a obtenção das coletoclorinas B e D e seus derivados. Esta metodologia parte do resorcinol e utiliza de reações clássicas de acilação de fenóis, halogenação, e prenilação de anéis aromáticos e foi desenvolvida pelo grupo da Joullie (SAFARYN et al., 1986).

Partindo do resorcinol foram utilizadas as condições de Vilsmeier–Haack para realizar a formilação do anel aromático. Para esta reação, o agente acilante é o produto da reação entre o POCl3 e a DMF. A densidade eletrônica π do anel aromático ataca o agente acilante produzindo um intermediário (composto 46, Esquema 10), que é hidrolisado ao se adicionar água ao meio reacional. A reação realizada em acetonitrila e acompanhada por TLC,

apresentando boa especificidade e rendimento (80%), além da facilidade de isolamento do produto desejado. H O N Cl P O Cl Cl + H Cl N Cl H Cl N Cl OH HO OH HO H N Cl OH HO H N Cl 3 4 5 6 1 2 OH HO O 40 41 43 44 45 46 47 H2O 42

Esquema 10: Mecanismo reacional para produção do 2,4-diidroxibenzaldeído e o produto principal obtido. O aldeído foi caracterizado por espectroscopia de RMN de ¹H e espectrometria de massas. O 2,4diidroxibenzaldeído apresenta alguns sinais de hidrogênios aromáticos abaixo de 7 ppm devido ao efeito dos dois grupos OH presente em sua estrutura. Os pares de elétrons não ligantes destes grupos podem entrar em ressonância com o anel aromático, aumentando assim a densidade eletrônica das posições 3 e 5. Desta forma elas possuem um efeito global de blindagem, abaixando o deslocamento químico dos hidrogênios nestas posições. O hidrogênio na posição 3 ainda possui o efeito estéreo da nuvem eletrônica destes grupos OH. O hidrogênio da posição 6 não sofre efeito de ressonância dos grupos fenólicos, embora sofra influência da carbonila do aldeído na posição 1. Desta forma ele é o hidrogênio aromático mais desblindado. Por sua vez, o sinal do hidrogênio da função aldeído localizado na posição 1 aparece em 9,70 ppm. Um dos hidrogênios fenólicos aparece 11,41 ppm, enquanto que o segundo hidrogênio não é mostrado no espectro. Isso ocorre devido a formação de uma ponte de hidrogênio intramolecular entre o grupo OH da posição 2 e o aldeído (Figura 5).

Figura 5: formação da ponte de hidrogênio intramolecular.

O espectro de massas apresenta-se o íon molecular do 2,4-diidroxibenzaldeído com razão carga massa de 138,2. O íon de maior intensidade é o da perda de um H pela molécula e possui razão carga massa 137,2. Os demais íons, devido outras fragmentações, possuem baixa intensidade.

A reação de cloração do 2,4-diidroxibenzaldeído foi realizada utilizando hipoclorito de sódio e piperidina, em meio ácido. Dois produtos foram obtidos: o 2,4-diidroxi-3,5-diclorobenzaldeído e o 2,4-diidroxi-5-clorobenzaldeído. Estes dois produtos possuem polaridades semelhantes e não são separáveis por coluna cromatográfica. O agente halogenante desta etapa é o produto da reação entre o cloro e a piperidina (composto 49, Esquema 11). Quando ele é adicionado ao meio ácido (solução de ácido sulfúrico/água 50% v/v contendo o substrato) a piperidina clorada é protonada ocasionando a polarização da ligação N-Cl. Neste momento a densidade eletrônica π do anel aromático realiza um ataque ao cloro com carga parcial positiva, renovando a piperidina no meio reacional. O principal produto é a e o aldeído monoclorado, enquanto que o composto diclorado é produzido em menor quantidade. N Cl OH N Cl H + H2O OH OH O N ClH + H+ - H+ 1 6 5 4 3 2 OH OH O Cl 1 6 5 4 3 2 OH OH O Cl Cl 48 49 50 51 + 47

O 5-cloro-2,4-diidroxibenzaldeído foi caracterizado por espectroscopia de RMN de ¹H e espectrometria de massas. A inserção de um cloro no anel aromático quebra o padrão de acoplamento aromático apresentado pelo 2,4-diidroxibenzaldeído, que passa a apresentar apenas singletos para os hidrogênios aromáticos. No espectro também é apresenta alguns sinais de menor intensidade devido à presença do 3,5-dicloro-2,4-diidroxibenzaldeído. A principal diferença entre os espectros destas duas substâncias é devido à ausência do sinal em 6,63 ppm referente ao hidrogênio na posição 3 do anel aromático. Os demais sinais possuem deslocamento semelhante. Para o espectro de massas do 5-cloro-2,4-diidroxibenzaldeído apresenta-se o mesmo padrão de fragmentação que o aldeído, sendo o sinal referente aos íons molecular e o resultante da perda de um H os picos base. Devido à presença do cloro os íons apresentam seu perfil isotópico sendo possível observar os íons m e m+2.

Com o objetivo de produzir derivados com outros átomos de halogênio na posição 5, foi planejada a bromação do resorcinol. O resorcinol apresenta as posições 2, 4 e 6 ativadas para a halogênação, sendo a 4 e a 6 as mais reativas. Para reduzir a produção de produtos polibromados optou-se, previamente, por realizar a carboxilação do resorcinol. A formação do ácido resorcílico tem como objetivo não somente a redução da reatividade do resorcinol, mas também a proteção de uma de suas posições. Neste caso o material de partida utilizado não foi 2,4-diidroxibenzaldeído, uma vez que o aldeído é uma função orgânica sensível a meios oxidantes. A aplicação de Br2 neste substrato poderia não somente ocasionar a oxidação do aldeído á ácido carboxílico, mas também proporcionar a produção de outros subprodutos devido à presença de radicais no meio reacional. Isso ocorre devido à baixa energia necessária para a dissociação homolítica da ligação Br—Br. O bromo radical formado no meio reacional estaria, desta forma, hábil para abstrair o H da função aldeído (Esquema 12). A produção de radical nesta posição levaria a formação não somente de ácido carboxílico (reação do radical com a água), mas também a subprodutos indesejados. Como o ácido carboxílico não é reativo frente ao bromo radical, ele foi utilizado como substituinte/proteção. A reação de cloração eletrofílica supracitada é uma ração polar e não envolve radicais, por isso é possível a sua aplicação ao substrato contendo o aldeído.

Esquema 12: Possível mecanismo de reação e produto reacional com a aplicação do 2,4-diidroxibenzaldeído e Br2.

O resorcinol foi carboxilado utilizando carbonato de potássio, água e uma fonte externa de CO2, ao final da reação a mistura reacional foi extraída com acetato de etila. Em seguida o produto desejado foi precipitado com NH3 pela formação do 2,4-diidroxibenzoato de amônio. Apesar das tentativas de otimizar as condições reacionais, esta reação apresentou baixos rendimentos (~20%) (Figura 6).

6 1 2 3 4 5 HO OH 5 4 3 2 1 6 HO OH O OH K2CO3/ CO2  43 53

Figura 6: Condições para realizar a carboxilação do resorcinol.

O ácido 2,4-diidroxibenzoico foi caracterizado por espectroscopia de RMN através do seu espectro de ¹H. Seu padrão de acoplamento e deslocamento químico dos prótons aromáticos é semelhante ao padrão apresentado pelo resorcinaldeído. Como foi utilizado D2O os hidrogênios dos fenóis e do ácido carboxílico não apareceram no espectro de hidrogênio, isso devido ao prototropismo entre o solvente deuterado e a molécula. Apesar disso é o padrão de acoplamento dos hidrogênios aromáticos o fator determinante para sua caracterização. Foi utilizado água deuterada como solvente para esta análise devido à metodologia de isolamento, sendo isolado na sua forma de sal de amônio.

Logo após a reação de carboxilação a reação de bromação foi executada. Esta reação utiliza ácido acético como solvente e Br2 como agente halogenante. Nesta reação o produto majoritário obtido foi o ácido 2,4-diidroxi-3,5-dibromobenzoico (Figura 7).

5 4 3 2 1 6 HO OH O OH Br2/Ácido Acético 5 4 3 2 1 6 HO OH O OH Br Br 53 54

Figura 7: Bromação do ácido 2,4 diidroxibenzóico em ácido acético.

Para a monoalogenação do ácido 2,4-diidroxibenzoico era esperado obter um espectro de ¹H com dois sinais de hidrogênio aromáticos. Entretanto ao se realizar a obtenção do espectro do composto obtido após a reação com Br2, observou-se apenas um hidrogênio aromático com deslocamento de 7,90 ppm. O deslocamento observado e a ausência de outro sinal de hidrogênio aromático indicaram a formação preferencial do produto dibromado.

Para obter o primeiro derivado, no qual não haveria substituição na posição cinco do anel aromático, planejou-se a prenilação do anel. Alguns problemas relatados já eram esperados, como por exemplo, baixa seletividade e dificuldade de isolamento. O 2,4-diidroxibenzaldeído possui dois hidrogênios fenólicos, que são muito mais ácidos que o hidrogênio aromático da posição 3. Quando submetido às condições básicas de prenilação estes hidrogênios são desprotonados preferencialmente. Logo, quando a reação se processa, a maior parte do eletrófilo é atacada por um dos oxigênios fenólicos dada a carga negativa concentrada neles (Esquema 13). Apenas uma parte mínima do eletrófilo consegue atacar o anel aromático levando à formação do produto desejado. Metodologias que utilizam meio básico ou algum metal oxofílico são reportadas para este tipo de reação, mas os rendimentos obtidos são semelhantes.

1 6 5 4 3 2 OH OH O OH -O OH O Br OH O O Br O OH O OH O O 47 55 56 + Br -+ Br

-Esquema 13: Mecanismo reacional e estrutura de dois possíveis produtos da reação.

A reação de prenilação reportada por Joullie e colaboradores, utiliza água, hidróxido de sódio e o 1-bromo-3-metil-2-buteno a 0°C, entretanto o rendimento é baixo e a principal produto desta reação é o produto O-alquilado (Esquema 14).

Uma tentativa para contornar o problema da O-alquilação foi a utilização do 1-bromo-3-metil-2-buteno e o resorcinaldeído em meio básico, com álcool butílico terciário como solvente e iodeto de potássio como catalisador. Apesar destas modificações nenhum resultado diferente foi obtido.

Tentando reduzir a quantidade de produtos O-alquilados, foram testadas reações tanto com o 1-bromo-3-metil-2-buteno como com o 3-metil-2-buten-1-ol. Além do meio básico procurou-se utilizar também o meio ácido para tentar reduzir a O-alquilação. Uma primeira tentativa foi a utilização do 2,4-diidroxibenzaldeído em ácido trifluoroacético na presença do álcool 3-metil-2-buten-1-ol. Esta metodologia tem como objetivo propiciar a formação de um carbocátion através da protonação do álcool 3-metil-2-buten-1-ol e a subsequente perda de uma molécula de água. Este carbocátion poderia ser atacado pela nuvem  do 2,4-diidroxibenzaldeído preferencialmente, uma vez que os grupos hidroxila dos fenóis estariam comprometidos com o solvente em função das ligações hidrogênio, formando assim o produto desejado. Apesar de termos conseguido aumentar a proporção de ataque do eletrófilo no anel aromático, a protonação da dupla ligação no produto formado levou à produção de um segundo carbocátion. Este, por sua vez, sofreu ataque de um dos oxigênios fenólicos vizinhos formando os respectivos cromanos. Desta forma, houve a formação de três cromanos diferentes dependendo de qual carbono do anel aromático foi prenilado e de qual oxigênio fenólico atacou o carbocátion produzido na segunda etapa. Variações destas condições na tentativa de minimizar a força ácida do meio foram tentadas, entretanto resultados semelhantes foram obtidos.

OH CF₃COOH  OH2 + H2O 1 6 5 4 3 2 OH OH O OH OH O OH OH O OH OH O 1 6 5 4 3 2 OH O O 1 6 5 4 3 2 O OH O + + H+ - H+ - H+ 57 58 60 ₆₁ 47

Esquema 14: Mecanismo reacional proposto para a reação de prenilação em meio ácido.

Baseado nos trabalhos de George Buchi, Jae-Hong Min e colaboradores, foi testada a catálise ácida por metais oxofílicos (GLUSENKAMP & BUCHI, 1986; MIN et al.., 2003). As condições utilizadas foram realizadas com o auxílio do aparato de Dean-Stark e realizadas em refluxo de p-xileno. Os sais de metais utilizados como catalisadores foram: cloreto de zinco, cloreto de índio, nitrato de bismuto e cloreto de níquel. Esta metodologia tem como objetivo a complexação do metal pelo fenol, desta forma dificultar que o ataque ocorresse pelo oxigênio e favorecer o ataque pela nuvem eletrônica π do anel aromático. Entretanto, resultados similares aos anteriores foram encontrados.

1 6 5 4 3 2 OH O OH MXa/Xileno  OH O OH M OH OH O OH M OH 1 6 5 4 3 2 OH O OH M + H2O 47 58

Esquema 15: Mecanismo reacional proposto para a reação catalisada por um metal oxofílico. Onde MXa, nas condições testadas, é o cloreto de zinco, índio ou níquel.

3.2 Rota sintética alternativa à clássica

A fim de simplificar a rota sintética e deixá-la mais seletiva e viável buscou-se reações que partissem de substratos mais simples. Os trabalhos de Chen e colaboradores exemplificam a produção do 2,4-diidroxi-6-metil benzoato de etila usando o acetoacetato de etila (composto 59) como matéria de partida. Para proceder a reação emprega-se um equivalente de hidreto de sódio e 0,9 equivalente de n-BuLi. Nestas condições o aceto acetato duplamente desprotonado é capaz de reagir com o 0,1 eq. mono desprotonado, levando a formação do 3,5,7-triceto éster que sofre ciclização com a perda de uma molécula de água (Esquema 16). (HOWARTH et. al., 1969; ISMAILOV et. al., 2017; CHEN et al., 2014). A condensação do acetato de etila em meio básico foi realizada e o produto esperado foi isolado com sucesso, obtendo-se neste estudo do modelo 60% de rendimento.

1 2 O 3 4 O O 1 6 5 4 3 2 OH O OH 11 i) NaH II) n-BuLi  O 59 61 O O O O O O ₁ 2 O 3 4 O 5 6 O 7 8 O O 60

Esquema 16: Condições empregadas para a autocondensação do acetoacetato de etila produzindo o resorcilato de etila.

O orcilato de etila (composto 61) é um éster orgânico com o anel aromático tetrasubstituído, espera-se para seu padrão de acoplamento a presença de dois hidrogênios aromáticos, cada um deles com uma constante de acoplamento há quatro ligações de distância de aproximadamente 2 Hz. Espera-se também um singleto por volta de 2,5 ppm para a metila ligada ao anel aromático e os sinais clássicos da etoxila, um pouco deslocada por ser um éster aromático. Em seu fragmentograma o éster orcílico apresenta seu íon molecular com razão massa caga de 196, o íon com razão m/z igual a 151 que é produzido a partir da perda da etoxila, em seguida este pela perda de um H este íon produz o sinal de maior intensidade e razão m/z igual a 150. A perda da acetila pode levar a um rearranjo na estrutura, que produz o íon tropílio correspondente com razão m/z igual a 122.

Desta forma passou-se a realizar análises retrossintéticas do produto desejado de forma a desmembrá-lo em um policetídeo intermediário e assim tentarmos sua aromatização. A partir deste estudo passou-se a investigar a reação de prenilação do acetoacetato (composto 59) em sua posição 4. A reação de prenilação foi realizada com sucesso utilizando hidreto de sódio na primeira desprotonação do substrato e n-butilítio na segunda desprotonação (Figura 8). A alquilação subsequente ocorre no carbono primário, pois este é o que possui a maior concentração de carga, coeficiente no HOMO da molécula, além de ser o que possui o menor impedimento estéreo. Obtivemos um rendimento de 80% para esta reação, que é um valor semelhante ao descrito na literatura. (RESEK, 2008; CHEN et. al., 2003).

4 3 O 2 1 O O i) NaH ii) n-BuLi

iii) Brometo de Prenila

4 3 O 2 1 O O 5 6 7 8 THF 0°C 59 62

Figura 8: Prenilação do acetoacetato utilizando NaH e n-BuLi.

Para confirmar a alquilação do aceto acetato em sua posição 4, o foi obtido o espectro de ¹H do produto isolado. Para isso, observou-se além do padrão de acoplamento entre os hidrogênios a razão ente o hidrogênio alílico e os hidrogênios da posição 2 do substrato. Se houvesse a alquilação desta posição a razão 1:2 deveria ser alterada e indicaria alteração estrutural. O 7-metil-3-oxo-6-octenoato possui um singleto de integral 2 por volta de 3,5 ppm, o singleto que integraria para três e estava por volta de 2 ppm no aceto acetato de etila, no produto apresenta-se como um tripleto. Este é um forte indício da produção do composto desejado. As duas metilas do 1-bromo-3-metil-2-buteno estão separadas por volta de 1,6 ppm e não alteram seu padrão de acoplamento ou seu deslocamento. Entretanto, o carbono 1, no qual o bromo estava ligado, no produto apresenta-se como um quarteto devido ao acoplamento com o CH2 e o CH vizinhos e reduz seu deslocamento químico devido a mudança de ambiente químico. Em CG/EM o composto apresenta o íon molecular com m/z igual a 198, o segundo íon é o da perda da etoxila e possui m/z igual a 153. Por ser um composto com poucas insaturações e heteroátomos os íons supracitados possuem baixa intensidade.

A ideia inicial seria realizar a condensação do 7-metil-3-oxo-6-octenoato de etila (composto 62) com o acetoacetato de etila. Entretanto, com o emprego das condições de condensação seria possível a obtenção de, pelo menos, quatro produtos diferentes a partir da simples combinação estatística entre os reagentes (Figura 9).

4 3 O 2 1 O O 1 6 5 4 3 2 OH O OH i) NaH II) n-BuLi  O 59 8 7 6 5 4 3 2 O 1 _O O 1 6 5 4 3 2 OH O OH O 1 6 5 4 3 2 OH O OH O 1 6 5 4 3 2 OH O OH O 63 64 ₆₅

Figura 9: Possíveis produtos a serem obtidos com a aplicação das condições de condensação entre dois -cetoésteres diferentes.

A fim de obter uma e uma reação com maior especificidade e mais limpa iniciou-se o estudo das reações entre o acetoacetato e crotonatos de etila. O primeiro a ser estudado foi o 3-etóxi-2-butenoato de etila. Isso visava modificar a reatividade dos reagentes e predispô-los a reagirem de forma específica. Desta forma, ao realizar a reação entre o 3-etóxi-2-butenoato de etila (composto 66) e o acetoacetato de etila (composto 59) em meio básico, esperava-se obter o produto de adição de Michael seguida da eliminação do grupo etóxido (Figura 10). Assim, estar-se-ia apto a submeter o policetídeo ramificado nas condições especificas de produção do 2,4-diidroxi-6-metil-benzoato de etila. Para confirmar a identidade do produto foram realizados ensaios de espectrometria de RMN ¹H e ¹³C. Diferenças significativas entre o espectro de ¹H do 3-etóxi-2-butenoato de etila e seu percussor eram esperadas. A formação da dupla ligação entre o carbono 2-3 do aceto acetato e a modificação do grupo na posição 3 faz com que no espectro de ¹H do produto esteja ausente os dois hidrogênios por volta de 3,5 ppm e como resultado ele apresenta um sinal de hidrogênio alílico e um sinal extra de etoxila. O espectro de RMN ¹³C também é alterado pela reação, o sinal do carbono 3 onde antes possuía uma carbonila e no espectro de ¹³C estaria por volta de 200 ppm no produto o seu sinal apresenta-se por volta de 160 ppm, concordando com os valores de carbono alílico ligado a átomos eletronegativos (Figura 10). Em seu CG/EM é observado o íon molecular com m/z igual 158, e o resultante da perda de uma de suas etoxilas com m/z igual a 113.

Para a obtenção do enol éter primeiramente foi sintetizado o cetal etílico do acetoacetato. Para a produção deste substrato foi utilizado ortoformiato de etila em etanol na presença de ácido p-toluenossulfônico em quantidades catalíticas. O solvente foi evaporado e